KR20130111550A

KR20130111550A - ＴＧＦ－β 길항제를 이용한 심근경색증의 치료

Info

Publication number: KR20130111550A
Application number: KR1020137008326A
Authority: KR
Inventors: 제프리 와이. 아키타; 스콧 로닝; 리차드 씨. 주니어 그레고리; 어밀리아 비. 쿠데
Original assignee: 젠자임 코포레이션
Priority date: 2010-09-01
Filing date: 2011-09-01
Publication date: 2013-10-10
Also published as: NZ608813A; EP2611831A1; ES2715177T3; MY165160A; SG10201506909PA; RU2637088C2; IL225018A; KR101939965B1; PL2611831T3; NZ624382A; SG187953A1; CN103201292B; US10633437B2; EP2611831B1; CL2013000586A1; BR112013004850B1; CA2809568C; RU2013114365A; TR201903101T4; JP2013542179A

Abstract

본 발명은 심근경색증의 급성기 중에 TGF-β 길항제를 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 심근경색증, 특히 급성 심근경색증을 앓는 환자의 치료방법 또는 환자에서 심근경색증의 부정적인 결과를 줄이는 방법이다.

Description

ＴＧＦ－β 길항제를 이용한 심근경색증의 치료{TREATMENT OF MYOCARDIAL INFARCTION USING TGF-β ANTAGONISTS}

본 발명은 심근경색증의 부정적인 결과(adverse consequence)를 줄이는 방법에 관한 것이다.

심장 질환의 문제와 건강상의 결과는 광범위한 영향을 미치고 있다. 심장 질환은 미국 남성과 여성 모두에 있어 사망의 주된 원인이다[참조: 문헌(Kung HC, Hoyert DL, Xu J, Murphy SL. Deaths: final data for 2005. National Vital Statistics Reports. 2008;56(10))]. 미국에서는 34초마다 1명 꼴로 심장 질환으로 사망한다. 매일 2,500명을 초과하는 미국인이 심장 질환으로 죽는다. 2005년에는 652,091명이 심장 질환으로 사망했다(그 중 50.5%가 여성). 이는 전체 미국 사망자의 27.1%에 해당했다. 심장 질환은 미국 인디언과 알래스카 원주민, 흑인, 히스패닉계 및 백인에 있어 주된 사망 원인이다. 아시아와 태평양 섬 주민의 경우, 암이 사망의 주요 원인이고(전체 사망의 27.5%를 차지함), 심장 질환이 근소한 차이로 2위이다(25.0%)(CDC. Deaths: leading causes for 2004. National Vital Statistics Reports. 2007;56(5)). 매년 거의 6백만 건의 입원 치료(미국)가 심혈관 질환으로 말미암은 것이다.

2009년 기준, 심장 질환은 의료 서비스, 의약품 및 생산성 상실을 포함하여, 3천46억 달러를 초과하는 비용이 드는 것으로 예상된다(American Heart Association. Heart Disease and Stroke Statistics -2009 Update. Dallas; AHA: 2009. Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 2008 Dec 15). 전 세계적으로 관상 동맥성 심장 질환은 2005년 760만 명이 넘는 사람들을 사망케 했다(World Health Organization. The Global Burden of Disease : 2004 Update. Geneva; WHO:2008). 2003년에는 성인의 대략 37%가 심장 질환 및 뇌졸중의 여섯 가지 위험 요인(고혈압, 고콜레스테롤, 당뇨병, 현재 흡연, 신체활동 부족 및 비만) 가운데 두 가지 이상을 보유하고 있다고 보고되었다(Hayes DK, et al., Disparities in multiple risk factors for heart disease and stroke, 2003 MMW,. 2005;54:113~116).

심근경색증(MI)은 허혈에 의한 심장 조직의 사망이다. "허혈"은 일반적으로 혈관 수축 또는 국소적인 혈류 장애에 의해 발생된, 혈액 공급의 국소적인 부족을 나타낸다. 심장과 같은 이전의 허혈성 조직이나 기관에 혈류를 복원하는 것을 "재관류"라 한다.

급성 심근경색증(AMI) 또는 "심장마비"는 국소화된 심근 허혈이 한정된 부위의 조직 사망 발달을 유발할 때 발생한다. 급성 심근경색증은 가장 흔히 관상 동맥 내 죽상경화성 병변의 파열에 의한다. 이는 동맥을 막는 혈전을 형성시켜, 그 동맥에 의해 혈액을 공급받는 심장 부위로의 혈액 공급을 막는다.

심각하고 장기화된 허혈은 심근 벽의 전체 두께에 걸쳐 괴사 영역을 생산한다. 그러한 전층 경색증은 보통 ST분절 상승을 초래한다. 덜 심각하고 지연되는 허혈은, 관상 동맥 폐색증 후에 자발적인 재관류가 이어질 때; 경색증이 관련된 동맥이 완전히 폐쇄되지 않을 때; 폐쇄는 완전하지만 기존의 부수적인 혈액 공급이 완전한 허혈을 방지할 때; 또는 영향을 받은 심근 영역의 산소 수요가 더 적을 때 발생할 수 있다. 이러한 상태 하에서, 괴사성 영역은 주로 심장 내막 밑에 한정되어, 전형적으로 비ST분절 상승 심근경색증을 유발할 수 있다.

경색된 심근 영역과 영향을 받지 않은 심근 영역 둘 다는 허혈성 사건 후 몇 시간, 며칠 그리고 몇 주에 걸쳐 점진적인 변화를 겪는다. 이러한 경색 후 심근 변화의 과정은 초기 사건 이후 예측 가능한 시기에 특징적인 변화의 발생으로 이어진다. 급성 허혈은 영향 받은 심근에 즉각적인 수축성 상실인 운동감소증이라는 병태를 초래한다. 괴사는 급성 허혈 발병 후 약 15 내지 30분에 심장 내막 밑에서 발달하기 시작한다. 다음 3 내지 6시간에 걸쳐 괴사성 영역은 심장 바깥 막을 향해 밖으로 퍼져나가 종국에는 전체 심실 벽에 이른다. 경색부 가장자리에서, 심근이 기절(가역적으로 손상됨)할 수 있고, 혈류가 복원되면 결국에는 회복될 것이다. 나머지 살 수 있는 심근의 수축성은 운동과다증이라는 과정을 증가시킨다.

세포적, 조직학적 및 총체적인 변화의 진행이 경색부 내에 발달한다. 경색 조직의 총체적인 외관 변화는 세포 사망 개시 후 적어도 6시간 동안은 명백하지 않다. 그러나 세포 생화학 및 초미세구조는 20분 이내에 비정상을 나타내기 시작한다. 세포 손상은 점진적이며, 약 12시간에 걸쳐 제대로 점차적으로 비가역적이게 된다.

세포 사망 개시 후 4시간 내지 12시간 사이에, 경색 심근은 세포 팽윤, 세포 기관 파괴 및 단백질 변성을 특징으로 하는 과정인 응고괴사를 겪기 시작한다. 약 18시간 후, 중성구(식균성 림프구)가 경색부로 들어간다. 그 수는 약 5일 후 정점에 이르고, 그런 다음 감소한다. 3 내지 4일 후, 육아조직이 경색 지역의 가장자리에 나타난다. 이것은 대식세포, (흉터조직의 기초를 세우는) 섬유모세포 및 새 모세혈관으로 이루어진다. 경색 심근은 4일 내지 7일 사이에 특히 유연해서, 파열되기가 가장 쉽다. 몇 주에 걸쳐 육아조직이 경색부 중심을 향해 안쪽으로 이동함에 따라, 괴사성 조직은 대식세포에 삼켜져 소화된다. 그런 다음, 육아조직은 결합조직(흉터조직) 증가와 모세혈관 손실 증가와 함께 점진적으로 성숙한다. 2 내지 3개월 후, 경색부는 치유되어, 얇아지고 굳어진, 창백한 회색의 비수축성 심실 벽 영역을 남긴다.

미세한 형태학적 변화는 시간이 경과함에 따라 다음과 같이 발전한다; 허혈 발병 후 1 내지 3시간 경과 시, 파동형의 심근 섬유가 나타난다. 허혈 발병 후 2 내지 3시간 경과 시, 테트라졸륨 또는 염기성 푹신 염료를 이용한 염색 결함이 나타난다. 허혈 발병 후 4 내지 12시간 경과 시, 가로무늬의 상실과 함께 응고괴사, 수축대, 부종, 출혈 및 조기 중성구성 침윤물이 나타난다. 허혈 발병 후 18 내지 24시간 경과 시, 계속적인 응고괴사와 핵 농축, 미미한 수축대가 뚜렷하다. 허혈 발병 후 24 내지 72시간 경과 시, 많은 중성구성 침윤물과 함께 핵과 가로무늬의 완전한 상실이 나타난다. 허혈 발병 후 3 내지 7일 경과 시, 대식세포 및 단핵구 침윤과 섬유 혈관 반응이 시작된다. 허혈 발병 후 10 내지 21일 경과 시, 현저한 육아조직과 함께 섬유 혈관 반응이 뚜렷하다. 허혈성 사건 후 7주 또는 그 전에 섬유화가 쉽게 눈에 띈다.

합병증은 부정맥과 전도 장애, 경색증 확대 또는 재경색, 울혈성 심부전, 심장성 쇼크, 심낭염, 가능성 있는 색전 형성을 동반한 벽 혈전증, 가능성 있는 눌림증을 포함한 심근 벽 파열, 가능성 있는 판막 부전증을 포함한 유두근 파열 및 심실류 형성을 포함할 수 있다.

본 발명은 심근경색증의 급성기 동안 환자에게 TGF-β 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 심근경색증의 부정적인 결과를 줄이는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 심근경색증은 급성 심근경색증이다. TGF-β 길항제 투여는 급성 심근허혈 발병 120시간 이내에 시작될 수 있다. 다양한 구현예에서, TGF-β 길항제 투여는 급성 심근허혈 발병 약 72시간 이내, 약 48시간 이내, 약 24시간 이내 또는 약 12시간 이내에 시작된다. TGF-β 길항제 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 상당한 대식세포 및 단핵구 침윤 전에 시작될 수 있다. 일부 구현예에서, TGF-β 길항제 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 중성구 침윤을 특징으로 하는 기간 중에 시작된다. 다른 구현예에서, TGF-β 길항제 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 괴사를 특징으로 하는 기간 중에 시작된다. 일반적으로, 환자는 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있다.

일부 구현예에서, TGF-β 길항제는 (i) TGF-β의 하나 이상의 이소형에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, (ii) TGF-β 수용체 또는 이의 가용성 단편, (iii) 하나 이상의 TGF-β 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 (iv) 안티센스 또는 간섭 RNA 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 방법은 바람직한 TGF-β의 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 화합물을 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, TGF-β의 바람직한 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 화합물은 항염증제 또는 TNF-α의 길항제일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 ACE 억제제를 환자에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. ACE 억제제는 베나제프릴, 캅토프릴, 포시노프릴, 모엑시프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 트랜스도라프릴, 리시노프릴, 에날라프릴 및 람파릴로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 안지오텐신 II 수용체 길항제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 안지오텐신 II 수용체 길항제는 에프로사르탄, 텔미사르탄, 로사르탄, 이르베사르탄, 올메사르탄, 칸데사르탄 및 발사르탄으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

TGF-β 길항제는 하나 이상의 TGF-β 이소형에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있으며, 인간 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 중 하나 이상을 중화할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1073G12 VH 도메인(서열번호 2) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1074B9 VH 도메인(서열번호 12) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1287A10 VH 도메인(서열번호 22) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1073G12 VL 도메인(서열번호 7) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1074B9 VL 도메인(서열번호 17) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1287A10 VL 도메인(서열번호 27) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 PET 1073G12 VH 도메인(서열번호 2) 및 PET 1073G12 VL 도메인(서열번호 7)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 PET 1074B9 VH 도메인(서열번호 12) 및 PET 1074B9 VL 도메인(서열번호 17)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 PET 1287A10 VH 도메인(서열번호 22) 및 PET 1287A10 VL 도메인(서열번호 27)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 CDR 세트(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)를 포함하며, 상기 HCDR3는 서열번호 5, 서열번호 15 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고 있다. 일부 구현예에서, VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 중쇄 골격 내에 있다. 일부 구현예에서, VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 아미노산 서열로부터 12개까지 돌연변이를 포함하는 골격 내에 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 CDR 세트(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)를 포함하며, 상기 LCDR3는 서열번호 10, 서열번호 20 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고 있다. 일부 구현예에서, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 생식계열 중쇄 골격 내에 있다. 일부 구현예에서, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 생식계열 아미노산 서열로부터 5개까지 돌연변이를 포함하는 골격 내에 있다.

도 1은 1D11-D3과 1D11D-5과 13C4의 투여로 섬유증이 감소하였음을 나타낸다.
도 2는 심장초음파상 분석에서 앞벽 비후와 뒤벽 비후를 나타낸다.
도 3은 심장초음파상 분석에서 국소 벽운동 스코어를 나타낸다.
도 4는 1D11 및 13C4의 투여로 섬유증이 감소하였음을 나타낸다.
도 5는 13C4-D0, 1D11-D0, 13C4-D1, 1D11-D1, 13C4-D5 및 1D11-D5 처리군에 대한 심장초음파상 분석에서 앞벽 비후와 뒤벽 비후를 나타낸다.
도 6은 비히클, 13C4-D0, 1D11-D0, 13C4-D1, 1D11-D1, 13C4-D5 및 1D11-D5 처리군에 대한 심장초음파상 분석에서 국소 벽운동 스코어를 나타낸다.
도 7은 비히클 처리군과 비교할 때 LV 흉터 용적을 나타낸다.
도 8은 흉터 주변 영역에서 TUNEL 양성 세포의 수를 나타낸다.
도 9는 관상동맥 폐색/관상동맥 재관류(CAO/CAR) 후 4주차에 측정한 LV 박출률(LVEF)를 나타낸다.
도 10은 CAO/CAR 후 2 내지 4주에 측정한 LVEF를 나타낸다.
도 11은 LV 등량적 완화 시간을 나타낸다.
도 12는 비히클과 비교할 때의 국소 벽비후를 나타낸다.
도 13은 LV 말단 이완기 혈압-용적 관계 기울기를 나타낸다.
도 14는 두 가지 상이한 제형으로부터 1mg/kg 및 5mg/kg의 용량으로 1D11을 투여했을 때, LV의 섬유증이 감소하였음을 나타낸다.
도 15는 두 가지 상이한 제형으로부터 1mg/kg 및 5mg/kg의 용량으로 1D11을 투여했을 때, 위험 지역에서 섬유증이 감소하였음을 나타낸다.
도 16은 두 가지 상이한 제형으로부터 1mg/kg 및 5mg/kg의 용량으로 1D11을 투여했을 때, 위험 지역에서 심근이 증가하였음을 나타낸다.
도 17은 두 제형에 대해 1mg/kg 및 5mg/kg의 용량의 비히클, 13C4 및 1D11에 대한 심장초음파상 분석에서 국소 벽운동 스코어를 나타낸다.
도 18은 항체의 IV 투여 후의 용량 의존적인 혈청 1D11 수준을 나타낸다.
도 19는 I/R 후 1D11을 투여했을 때, 혈청 오스테오폰틴의 감소를 나타낸다.
도 20은 IR 후의 TGF-β1 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 TGF-β1의 감소를 나타낸다.
도 21은 IR 후의 TGF-β2 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 TGF-β21의 감소를 나타낸다.
도 22는 IR 후의 TGF-β3 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 TGF-β3의 감소를 나타낸다.
도 23은 IR 후의 콜라겐 3의 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 콜라겐 3의 감소를 나타낸다.
도 24는 IR 후의 엔도텔린-1의 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 엔도텔린-1의 감소를 나타낸다.
도 25는 IR 후의 플라스미노겐 활성인자 억제제-1의 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 플라스미노겐 활성인자 억제제-1의 감소를 나타낸다.
도 26은 IR 후의 스네일1(Snail1) 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 스네일1의 감소를 나타낸다.
도 27은 IR 후의 스네일2(Snail2) 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 스네일2의 감소를 나타낸다.
도 28은 IR 후의 α-평활근 액틴 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 α-평활근 액틴의 감소를 나타낸다.
도 29는 IR 후의 피브로넥틴의 유도와 I/R 후의 용량 의존적인 1D11 매개성 피브로넥틴의 감소를 나타낸다.
도 30은 Bax 발현에 대한 5mg/kg 1D11 투여의 효과를 나타낸다.

심근경색증 또는 심장마비 후, 심장은 스스로를 회복시키기 시작한다. 이러한 심장 회복 과정은 서로 중복되는 기간들로 분리될 수 있다. 첫 단계는 염증기로 알려져 있다. 염증기 이후는 증식기이다. 궁극적으로, 성숙기가 심장 회복의 마지막 기간이다(Bujak, M. and Frangogiannis, NG Cariovasc Res. 74:184-195 (2007)).

심장마비 직후, 염증기는 심근세포 사망, 사이토카인과 케모카인 유도 및 죽어가는 조직을 제거하기 위한 염증 세포 유입을 특징으로 한다. 증식기 중에는 결합조직 섬유, 섬유모세포 및 내피세포 형성의 원인이 되는 세포들의 경색 지역으로의 유입뿐만 아니라, 염증성 매개인자의 억제가 있다. 섬유모세포는 세포외 기질을 분비한다. 내피세포는 발달 중인 느슨한 섬유성 결합조직 또는 육아조직 내에서 미세혈관 망 형성의 원인이 된다. 그런 다음, 침투한 염증 세포는 세포 사망 또는 세포 자멸(apoptosis)로 알려진 것을 겪기 시작한다. 마지막으로, 성숙기에서, 증식기로부터의 육아조직이 체계화되어 조밀한 섬유성 결합조직인 흉터로 성숙한다. 이러한 심근에서의 섬유증 반응의 재형성(remodeling)은 연장될 수 있다. 일반적으로, 염증기는 경색 때부터 심근경색 후 1 내지 7일까지 일어난다. 증식기는 심근경색 후 약 5 내지 14일부터 일어난다. 마지막으로, 성숙기는 심근경색 후 약 10 내지 14일부터 시작하여, 심장 재형성(remodeling)이 일어나는 한 지속된다.

TGF-β는 경색 심근에서 유도되어 심근경색 후 모든 회복 기간에 참여하는데, 이는 심장 회복에서 이 사이토카인의 역할을 정의하려는 시도들을 복잡하게 만들었다. 따라서 심근경색 후 심장 회복에서 TGF-β의 정확한 역할은 제대로 해명되지 않았다. TGF-β는 본래, 정상적인 섬유모세포를 비부착 증식할 수 있는 세포로 전환하는 능력 때문에 원래 이름이 붙여진 다기능 사이토카인이다. 현재 밝혀진 TGF-β에는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 및 TGF-β5의 적어도 다섯 가지 형태가 있다. 이러한 TGF-β 패밀리를 인간, 마우스, 녹색 원숭이, 돼지, 소, 닭 및 개구리를 포함한 다양한 종에서 정제할 수 있다. 또한, 이러한 TGF-β 패밀리를 재조합 세포 배양물에서 생산하기 위해, 그리고 그 활성을 결정하기 위해, 뼈, 혈소판, 또는 태반을 포함한 다양한 신체 공급원으로부터 정제할 수도 있다.

인간에는 세 가지 이소형인 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3가 존재하는 것으로 알려져 있다((각각) Swiss Prot 수탁번호 P001137, P08112 및 P10600). 이들이 생물학적으로 활성인 상태에서, 이러한 세 가지 이소형은 사슬 간 이황화물 다리로 연결된 두 개의 112개 아미노산 모노머를 포함하는 25kDa 호모다이머이다. TGF-β1은 TGF-β2와는 27개 아미노산이, TGF-β3와는 22개 아미노산이 상이하다. 이러한 차이는 주로 보존적인 아미노산 변화이다. TGF-β의 3차원 구조는 X선 결정학에 의해 결정되었고, 수용체 결합 부위가 밝혀졌다. 인간 TGF-β와 마우스 TGF-β 둘 다는 비슷하다. 인간 TGF-β1은 마우스 TGF-β1과 한 개의 아미노산 차이가 있다. 인간 TGF-β2 는 마우스 TGF-β2 와 겨우 세 개의 아미노산 차이가 있으며, 인간 TGF-β3 와 마우스 TGF-β3는 동일하다.

용어 "TGF-β" 또는 "형질전환 성장인자-베타"는 임의의 인간 TGF-β 이소형 중 전체 길이의 자연 아미노산 서열을 가지고 있다고 기술된 분자들의 패밀리를 나타낸다. 이들은 잠재형("잠재 TGF-β")과 회합 또는 비회합된 전구체 복합체 및 성숙한 TGF-β를 포함한다. 그러한 TGF-β에 대한 참조는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 및 TGF-β5와 이의 잠재형 버전을 포함하는, 현재 밝혀진 형태들뿐만 아니라, 임의의 공지된 TGF-β의 서열로부터 유래되어, 서열과 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95% 상동성이 있는 폴리펩티드를 포함하는, 미래에 밝혀지는 인간 TGF-β 종 중 임의의 한 형태에 대한 참조로 이해될 것이다. 구체적인 용어 "TGF-β1", "TGF-β2" 및 "TGF-β3"뿐만 아니라, "TGF-β4"와 "TGF-β5"는 문헌(예컨대, Derynck et al., Nature, supra, Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262, supra, and deMartin et al., supra)에 정의된 TGF-β를 나타낸다. 용어 "TGF-β"는 인간 TGF-β를 암호화하는 유전자를 나타낸다.

TGF-β 패밀리의 구성원은 분자의 성숙 부분에 아홉 개의 시스테인 잔기를 가지고 있으며, 성숙 부위에서 다른 공지된 TGF-β 서열과 적어도 65% 상동성을 공유하며, 동일한 수용체에 대해 경쟁할 수 있는 단백질이다. 또한, 그들 모두는, N-말단 근처에 높은 상동성 부위를 공유하며 나중에 프로세싱에 의해 제거될 전구체 부분에 세 개의 시스테인 잔기 보존을 나타내는, 더 큰 전구체로 암호화되는 것으로 보인다. TGF-β 패밀리 구성원은 또한 넷 또는 다섯 개의 아미노산이 있는 프로세싱 부위를 가지고 있는 것으로 보인다.

TGF-β 활성 수준의 증가는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다수의 병리학적 상태와 관련이 있다: (i) 섬유증, 흉터, 및 상처 치유 중의 부착; (ii) 심장, 폐, 간 및 신장의 섬유증 질환; (iii) 죽상동맥경화증 및 동맥경화증; (iv) 전립선암, 소화계의 신경내분비종, 자궁경부암, 교모세포종 및 위암을 포함한 특정 유형의 암; (v) 혈관병증(angiopathy), 혈관병증(vasculopathy), 신장병증; (vi) 전신 경화증; (vii) C형 간염 및 HIV와 같은 바이러스 감염; 및 (viii) 류마티스 관절염과 같은 면역성 및 염증성 장애 및 결핍.

심장 손상에서 TGF-β의 역할에 관한 초기 연구는 보호 역할이 심근경색증 후 심장 회복의 제1기 또는 염증기에서 일어난다는 점을 보여 준다. 이러한 초기 연구에서, TGF-β는 허혈 손상 후 몇 시간 이내의 심근 허혈 손상 모델에서 투여되었다. Lefer는 분리한 쥐 심장에서, 허혈성 심장 손상 전, 또는 직후의 TGF-β의 투여가 관상 순환에서 수퍼옥사이드 음이온을 감소시키고, 내피 의존성 관상 이완을 유지하며, 외인성 종양 괴사 인자(TNF)로부터 매개된 손상을 줄이고, 심각한 심장 손상을 막는다는 것을 보여 주었다[참조: 문헌(Lefer, et al. Science, 249:61, 1990)]. Lefer와 동료들은 계속해서 TGF-β가 특히, 내피에 의한 내피 유래 이완 인자(EDRF, 그러나 현재는 산화질소 또는 NO로 알려져 있음) 형성 유지에 의해, 내피 기능을 보호함을 증명하였다(Lefer, AM. Biochem Pharmacol. 42: 1323-1327, 1991). 분리된 심근세포 또는 분리된 심장 표본을 이용한 다른 연구는 TGF-β 매개성 심장 보호의 메커니즘을 추가로 해명하였다.

Keller 등[참조: 문헌(Journal of Cardiovascular Pharmacology, 30:197-204, 1997)]은 개의 심장 I/R 모델에서, TGF-β를 허혈/재관류 30분 전에 투여했을 때, 비처리 대조군에 비해, 재관류 직후 경색 구역에서 단백질 유출 지수(PLI)의 50% 감소가 있었음을 보여 주었다. 그러나 재관류 48시간 후에는 PLI의 향상이 관찰되지 않았다. 또한, TGF-β는 재관류 후 1시간 또는 48시간의 개에서 내피 의존성 이완을 향상시키지 않았다. 이러한 결과는 TGF-β가 재관류 초기에는 증가된 관상 동맥의 혈관 투과성을 억제할 수 있으나, 나중의 관상 동맥 혈관 손상을 막지 못할 수 있음을 시사하였다[참조: 문헌(Keller, et al., J Cardiovasc Pharmcol. 30:197-204, 1997)].

더욱 최근에는, TGF-β 신호전달을 방해하기 위한 TGF-β 수용체 길항제를 이용하여, 심근경색 회복에서 TGF-β의 역할이 조사되었다. 한 연구에서, Ikeuchi 등[참조: 문헌(Cardiovascular Research, 64:526-35, 2004)]은 마우스에서 심근경색 7일 전에 TGF-β II형 수용체(TβIIR)의 세포외 도메인을 암호화하는 플라스미드를 근육 내 주사하여 심근경색 시 TGF-β 신호전달을 차단하였다. 그들은 비처리 마우스와 비교할 때, 경색부 크기 증가가 없었음에도 심근경색 후 24시간 동안 사망률 증가, 염증 증가, 좌심실(LV) 확장 증가 및 수축성 기능장애를 관찰하였다. 심근경색 후 후기 기간에서 TGF-β를 차단하기 위하여, 0일 또는 심근경색 7일 후 마우스에 TβIIR를 근육 내 주사하였다. 심근경색 4주 후, TβIIR 처리는 LV 확장, 수축성 기능장애, 심근세포 비대 및 비경색 심근에서 간질 섬유증을 억제하였다. TGF-β는 초기 기간에서 유익하지만, 유익함은 지속된 발현과 함께 상실되었고, LV 재형성 및 기능부전으로 이어졌다.

다른 연구에서, Okada 등[참조: 문헌(Circulation, 11:2430-37, 2005)]은 심근경색 3일 후에 가용성 TGF-β II형 수용체를 암호화하는 아데노바이러스(Ad.CAGsTβRII)를 마우스에 근육 내 주사하였다. 심근경색 후 처리 마우스에서 생존율이 상당히 향상되었다. 이는 심근경색 후 4주에 혈관 확장의 상당한 약화 및 향상된 심장 기능에 의해 달성되었다. 심근경색부 크기는 대조군과 차이가 없었지만, 심근경색부 두께와 둘레가 처리된 동물에서 더 작았다. 경색 지역 근섬유모세포들 사이의 세포자멸은 처리된 동물에서 빈도가 더 낮았다. 심근경색 후 4주 차에서의 Ad.CAG-sTβRII 투여는 효과가 없었다. Okada 등은 TGF-β 억제를 위한 결정적인 창이 3일 후 내지 4주 전에 발생된다고 생각했다. 그들의 연구에서, 처리가 심근세포의 급성 허혈성 사망에 영향을 미치지 않으리라고 생각될 때, 고의로 주사를 놓았다. Okada 등은 심근경색의 급성기 중 TGF-β의 억제는 해롭게 여겨진다고 믿었다.

이러한 연구 이후, TGF-β1, 2 및 3에 대해 효과적인 길항제 항체를 이용한 TGF-β 길항작용이 심근경색 회복에서 조사되었다. Frantz 등[참조: 문헌(Basic Research in Cardiology, 103:485-502, 2008)]은 관상 동맥 결찰에 의한 심근경색 유도 7일 전 또는 5일 후에 시작하는 TGF-β 길항제 항체 또는 음성 대조군 항체를 마우스에 투여하였다. 항체는 8주간의 연구 기간 동안 이틀마다 투여되었다. 항-TGF-β 항체를 투여 받은 군에서 사망률이 상당히 높았다. 또한, 항-TGF-β 항체 처리군은 좌심실 확장 증가를 나타냈다. 이 저자들은 관상 동맥 결찰 전 또는 후의 항-TGF-β 처리가 사망률을 증가시키고, 좌심실 재형성을 악화시킨다고 결론지었다. 저자들은 TGF-β 길항작용의 지속과 TGF-β 길항제 농도가 그들의 연구와 Ikeuchi 등(2004) 및 Okada 등(2005)이 보고한 연구내용 사이의 결과 차이를 설명할 수 있다고 제안한다.

본 발명은 TGF-β 길항제를 심근경색증의 급성기 중에 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 심근경색증, 특히 급성 심근경색증을 앓는 환자를 치료하는 방법, 또는 환자에서 심근경색증의 부정적인 결과를 줄이는 방법에 관한 것이다. TGF-β 길항제 투여가 급성 심근 허혈 발병 후 120시간 미만의 시기에 유리하게 시작될 수 있다는 발견은 놀라운 것이다. 일부 예에서, 본원에 기술된 방법은 TGF-β 길항제 투여가 급성 심근 허혈 발병 후 약 72시간 이내, 약 48시간 이내, 약 24시간 이내 또는 약 12시간 이내에 시작될 수 있음을 고려한다. 일반적으로, 본원에 개시된 방법에서, TGF-β 길항제는 심근경색증의 급성기 도중에 투여된다. TGF-β 길항제의 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 상당한 대식세포 및 단핵구 침윤 전에 시작될 수 있다. 일부 구현예에서, TGF-β 길항제의 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 중성구 침윤을 특징으로 하는 기간에 시작된다. 다른 구현예에서, TGF-β 길항제의 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 괴사를 특징으로 하는 기간 중에 시작된다.

"치료"는 치료적 치료와 예방을 위한 또는 예방적 조치 모두를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 치료할 수 있는 장애가 있는 사람들뿐만 아니라, 장애가 예방될 사람들을 포함한다. 치료는 완전한 치유 또는 정상적인 기능의 완전한 회복을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다. 치료는 또한 원하지 않는 증상의 개선 및/또는 장애의 부정적인 결과의 감소를 포함할 수 있다. "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물 및 개, 말, 고양이, 소 등과 같은 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완동물을 포함하는, 포유동물로서 분류되는 임의의 동물일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 예를 들어, 원숭이, 유인원 또는 인간과 같은 영장류이다. 용어 "유효량"은 포유동물의 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 약물의 양을 나타낸다.

특정 TGF-β 기능이 심근경색 후 초기 기간에서 바람직할 수 있지만, 급성기 및 그 이후의 TGF 길항작용은 향상된 심장 재형성 및 기능을 가져올 수 있다. 그러나 TGF-β의 하나 이상의 선택된 기능을 복원하고자 할 경우, TGF-β 길항제와 TGF-β의 바람직한 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 다른 화합물을 공동 투여하는 것을 원할 수 있다. 예를 들어, TGF-β의 바람직한 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 화합물은 항염증제, 또는 TNF-α의 길항제일 수 있다. 또한, 다른 치료제를 공동 투여하는 것이 바람직할 수 있는데, 예를 들어, 방법은 환자에 ACE 억제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. ACE 억제제는 베나제프릴, 캅토프릴, 포시노프릴, 모엑시프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 트랜스도라프릴, 리시노프릴, 에날라프릴 및 람파릴로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 방법은 안지오텐신 II 수용체 길항제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 안지오텐신 II 수용체 길항제는 에프로사르탄, 텔미사르탄, 로사르탄, 이르베사르탄, 올메사르탄, 칸데사르탄 및 발사르탄으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

중화항체는 TGF-β 길항제로 이용될 수 있다. "항체"는 천연 면역글로불린 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성하여 생산된 면역글로불린이다. 용어는 또한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편은 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd 및 다이아바디(diabody)와 같은 분자이다. 용어 "항체"는 광범위한 의미로 이용되며, 구체적으로 온전한 단일클론항체, 다클론항체, 적어도 두 개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편도 포함한다. 단일클론항체는 매우 특이적이며, 단일 항원 부위를 대상으로 한다. 나아가, 상이한 결정기(에피토프)를 대상으로 하는 상이한 항체를 포함하는 다클론항체 제제와는 대조적으로, 각 단일클론항체는 항원의 단일 결정기를 대상으로 한다. 그들의 특이성 이외에도, 단일클론항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "단일클론(monoclonal)"은 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 획득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산할 것을 요구한다고 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 단일클론항체는 문헌(Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(예컨대, 미국 특허번호 제4,816,567호 참조). "단일클론항체"는 또한 예를 들어, 문헌(Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991))에 기술된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 포함하며, 바람직하게는 항원결합부위 또는 이의 가변부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편(들)로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는 데 이용된다. 바람직한 FcR은 고유-서열 인간 FcR이다.

항체 또는 항체 단편의 맥락에서 용어 "가변(variable)"은, 가변 도메인의 특정 일부분이 항체들 사이의 서열에서 광범위하게 상이하고 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 나타낸다. 그러나 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 과가변영역(hypervariable region)이라는 세 개의 분절들에 집중된다. 더욱 높게 보존된 가변 도메인 부분은 골격영역(FR)이라 한다. 고유 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 네 개의 FR을 포함하고, 대체로, 루프 연결을 형성하는 세 개의 과가변영역에 의해 연결되는 β-시트 구성을 채택하며, 일부 사례에서는 β-시트 구조의 일부분을 형성한다. 용어 "과가변영역"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 과가변영역은 일반적으로 "상보성 결정영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 과가변영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합부위를 함유하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비공유 회합으로 이루어진 이량체로 이루어진다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 세 개의 과가변영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 위에 항원 결합부위를 정의한다. 전체적으로, 여섯 개의 과가변영역은 항체에 항원결합 특이성을 부여한다. 그러나 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 세 개의 과가변영역만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합부위보다 더 낮은 친화도이긴 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가지고 있다.

Fab 단편 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은, 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 항체 경첩영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 소수의 잔기 첨가에 의해 Fab 단편과 차이가 있다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 유리 티올 기를 가지고 있는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은 본래 Fab' 단편들로 이루어진 쌍 사이에 경첩 시스테인을 가지고 있는, Fab'의 쌍으로 생산되었다. 다른 항체 단편들의 화학적 결합 또한 알려져 있다.

임의의 척추동물 종의 항체의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 한, 두 개의 뚜렷이 구분되는 카파(κ)와 람다(λ)라는 유형들 중 하나로 정해질 수 있다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH와 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다.

비인간(예컨대, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분은 인간화 항체는, 수용체의 과가변영역의 잔기가 마우스, 랫트, 토끼, 또는 원하는 특이성, 친화도 및 수용력을 가지고 있는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여체 항체)의 과가변영역의 잔기로 교체되는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 골격영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 나아가, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 수정은 항체 성능을 더욱 개선하기 위하여 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 그리고 전형적으로는 두 개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이며, 여기서 과가변 루프의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 그것들에 대응하며, FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열의 그것들이다. 또한, 인간화 항체는 임의로, 전형적으로 인간 면역글로불린의, 면역글로불린 불변부위의 적어도 일부분(Fc)을 포함할 것이다[참조: 문헌(Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol,. 2: 593-596 (1992))].

"TGF-β 항체"는 임의의 TGF-β 이소형에 결합하는 항체로서, 바람직하게는 TGF-β1, TGF-β2, 또는 TGF-β3에 또는 이의 임의의 조합에 결합하고, 더욱 바람직하게는 적어도 TGF-β1 또는 적어도 TGF-β2에, 가장 바람직하게는 TGF-β1, 또는 TGF-β2와 함께 TGF-β1에 결합한다. 임의로, 항체는 적어도 TGF-β3에 결합할 수 있다.

TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 이소형과 결합하는 하나의 중화 마우스 단일클론항체는 1D11로 알려져 있고, ATCC(수탁번호 HB 9849)를 통해 R&D Systems (카탈로그 번호 MAB-1835)에서 구입할 수 있다. 인간 TGF-β1을 대상으로 하는 마우스 단일클론항체 또한 R&D Systems에서 구입할 수 있다. 또한, 중화 마우스 단일클론항체는 아미노산 위치 48번에서 60번(TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3와 반응하는 항체) 및 아미노산 위치 86번에서 101번(TGF-β1에 대해 특이적인 항체)를 포함하는 인간 TGF-β1 펩티드로 면역화한 마우스로부터 생성되었다(Hoefer and Anderer, Cancer Immunol. Immunother., 41: 302-308 (1995)). GC1008은 모든 TGF-β 이소형을 중화하며, 인간에서 치료적 용도로 적합한 인간화 단일클론 IgG4 항체이다.

1D11은 다양한 범위의 시험관 내 검사에서 마우스 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3와 인간 TGF-β1 및 TGF-β2를 중화하는 뮤린(murine)의 전체 특이적(pan-specific) 항-TGF-β 항체이다(미국 특허번호 제5,571,714호; MAB1835에 대한 R&D System 제품 설명서). 섬유증의 동물 모델에서, 1D11은 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 1D11은 뮤린 단일클론항체로, 인간의 치료적 용도로는 부적합할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서는 인간 서열 요소를 포함하는 인간 항체 또는 수정된 항체가 바람직할 수 있다.

일부 구현예에서, 심근경색증의 치료방법은 TGF-β 관련 질환에서 TGF-β의 과잉 생산과 연관이 있는 급성 섬유증을 치료하기 위하여 TGF-β에 대한 항체 투여를 포함할 수 있다. 신체는 파괴된 조직을 재생하여 상처 또는 질환에 반응한다. 상처가 오래되거나 광범위할 때, 파괴된 조직은 특수화된 섬유증 결합조직에 의해 교체될 수 있다. 이러한 섬유증 조직의 축적은 환자의 영향 받은 조직 또는 기관 기능의 장애를 초래할 수 있다. 급성기 동안 유효량의 항-TGF-β 항체의 투여는 섬유증의 이후의 발달을 줄일 수 있다. 나아가, 유효량의 항-TGF-β 항체는 TGF-β의 생물학적 활성을 중화하기 위하여, 전형적으로 섬유증을 특징으로 하는 심근경색 후 회복 기간 동안에도 투여되어, 섬유증 발달을 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, TGF-β 길항제는 (i) 하나 이상의 TGF-β 이소형에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; (ii) TGF-β 수용체 또는 이의 가용성 단편; (iii) 하나 이상의 TGF-β 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; 및 (iv) 안티센스 또는 간섭 RNA 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특이적으로 결합하여 TGF-β 분자를 중화시키는 항-TGF-β 항체는 특히 TGF-β 길항제로 유용하다. 그러한 항체의 예는 미국 특허출원공개번호 제2006/0251658호에 기술되어 있다. 항-TGF-β 항체는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3를 대상으로 하는 특이적인 항체를 포함하는, TGF-β, 특히 인간 TGF-β에 대한 특이적인 항체를 포함한다.

항체는 여러 가지 방식으로 수정될 수 있으므로, 용어 "항체 분자"는 필요한 특이성을 나타내는 항체의 항원결합부위가 있는, 임의의 항체 또는 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이 용어는 천연이든 전체적으로 또는 부분적으로 합성된 것이든, 항원결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함하는 항체 단편과 유도체를 포함한다. 따라서, 항체의 항원결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 다른 폴리펩티드에 융합된 균등물이 포함된다. 키메라 항체의 클로닝과 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 그리고 많은 양의 후속 문헌에 기술되어 있다. 이는, 특별히 한정되지 않는 한, 용어 항-TGF-β 항체가 본원에서 전체 항체(예컨대, IgG1 또는 IgG4와 같은 IgG), 항체 단편(예컨대, scFv, Fab, dAb) 또는 항-TGF-β 항체 또는 이의 구성성분으로부터 유래된 항-TGF-β 항원결합부위를 포함하는 분자를 포함하고자 광범위하게 이용되는 이유이다.

TGF-β 길항제는 하나 이상의 아미노산 잔기가 있고, 비인간 공급원으로부터 그것에 도입하는, 인간화 단일클론 항-TGF-β 항체를 포함한다. 인간화는 Winter와 동료들의 방법(Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라, 인간 항체의 상응하는 서열을 과가변영역 서열로 치환하여 이루어질 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 비인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적게 치환된, 키메라 항체(예컨대, 미국 특허번호 제4,816,567호에 기술된 항체)일 수 있다. 실제는, 인간화 항체는 전형적으로, 일부 과가변영역 잔기와 아마도 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 상동 부위의 잔기로 치환되는 인간 항체이다.

소위 "최적" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열이 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝 된다. 그런 다음, 설치류의 그것과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 골격영역(FR)으로 수락된다(Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위 집단으로 이루어진 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 골격영역을 이용한다. 동일한 골격이 몇 가지 상이한 인간화 항체에 이용될 수 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

바람직하게는, 인간화 항체는 항원에 대한 높은 친화도와 기타 유리한 생물학적 성질들을 보유한다. 이러한 목표의 달성을 위해, 인간화 항체는 어버이(parental) 서열과 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여, 어버이 서열과 다양한 개념의 인간화 생성물 분석을 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 흔히 구입할 수 있고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 도해로 나타내 전시하는 컴퓨터 프로그램을 구입할 수 있다. 이러한 전시 내용을 검사하면, 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 예상 역할 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기 분석이 가능하다. 이러한 식으로, 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가와 같은 원하는 항체 특성이 달성되도록 수용체 및 도입된 서열로부터 FR 잔기가 선택되어 결합될 수 있다. 일반적으로, 과가변영역 잔기는 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 데 관여한다.

항-TGF-β 항체는 전형적으로 항체 VH 및 VL 도메인을 포함한다. VH 및 VL 도메인 내에는 경우에 따라 VH 또는 VL 도메인을 형성하기 위하여 상이한 골격영역 FR' 내에 포함될 수 있는 상보성 결정부위인 CDR이 있다. 항원결합부위는 항체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 또는 이의 항원결합 부분들로 이루어질 수 있다.

항-TGF-β 항체는 HCDR 세트, LCDR 세트, 또는 둘 다 및/또는 인간 항체 VH 도메인, VL 도메인, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.

HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 일 세트는 다음과 같은 세트로부터 선택되는 서열을 가지고 있을 수 있다:

HCDR1 서열번호 3, HCDR2 서열번호 4, HCDR3 서열번호 5 (본원에서 "HCDR PET1073G12 세트"라 함);

HCDR1 서열번호 13, HCDR2 서열번호 14, HCDR3 서열번호 15 (본원에서 "HCDR PET1074B9 세트"라 함);

HCDR1 서열번호 23, HCDR2 서열번호 24, HCDR3 서열번호 25 (본원에서 "HCDR PET1287A10 세트"라 함).

LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 일 세트는 다음과 같은 세트로부터 선택되는 서열을 가지고 있을 수 있다:

LCDR1 서열번호 8, LCDR2 서열번호 9, LCDR3 서열번호 10 (본원에서 "LCDR PET1073G12 세트"라 함);

LCDR1 서열번호 18, LCDR2 서열번호 19, LCDR3 서열번호 20 (본원에서 "LCDR PET1074B9 세트"라 함);

LCDR1 서열번호 28, LCDR2 서열번호 29, LCDR3 서열번호 30 (본원에서 "LCDR PET1287A10 세트"라 함).

HCDR PET1073G12 세트는 LCDR PET1073G12 세트와 함께 본원에서 CDR PET1073G12 세트라 한다. HCDR PET1074B9 세트는 LCDR PET1074B9 세트와 함께 본원에서 CDR PET1074B9 세트라 한다. HCDR PET1287A10 세트는 LCDR PET1287A10 세트와 함께 본원에서 CDR PET1287A10 세트라 한다. 본원에 개시된 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인은 본원에 개시된 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 별도로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 그러한 VH 도메인은 그러한 VL 도메인과 짝을 이루고, 가장 바람직하게는 VH 및 VL 도메인 쌍은 본원에 나타낸 클론에서와 같다.

항-TGF-β 항체의 VH 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 일 세트를 함유할 수 있고, 이때, HCDR 세트는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이 있는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10에 대한 HCDR 세트에 상응한다.

항-TGF-β 항체는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 LCDR 일 세트를 포함하는 VL 도메인을 포함할 수 있고, 이때, CDR 세트는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이 있는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10에 대한 CDR 세트에 상응한다.

다변량 데이터 분석 기법을 구조/성질-활성 관계에 적용하는 컴퓨터 화학의 선례(Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics--Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)) 를 따라, 통계적 회귀, 패턴 인식 및 분류[참조: 문헌(Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998) ISBN: 0471170828; Abraham Kandel, Eric Backer. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR; (May 11, 1995), ISBN: 0133418847; Wojtek Krzanowski. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000), ISBN: 0198507089; Ian H. Witten, Eibe Frank. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (Oct. 11, 1999), ISBN: 1558605525; David G. T. Denison (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369; Arup K. Ghose, Vellarkad N. Viswanadhan. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8)]와 같은 주지의 수학적 기법을 이용하여 항체의 정량적 활성-성질 관계가 유도될 수 있다. 항체의 성질은 항체 서열, 기능적 구조 및 3차원 구조의 경험적 및 이론적 모델(예를 들어, 예상 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 성질의 분석)로부터 유도될 수 있으며, 이러한 성질들은 단독으로 또는 조합하여 고려될 수 있다.

공지의 원자 구조의 항체 분석은 항원결합부위의 서열과 3차원 구조 사이의 관계를 해명했다(Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948). 이러한 관계는 VH 도메인의 제3 부위(루프)를 제외하고, 결합부위 루프가 소수의 주사슬 형태 중 한 가지인 기본형 구조를 가지고 있음을 시사한다. 특정 루프에 형성된 기본형 구조는 그 크기와 루프와 골격영역 모두에 있는 핵심 부위에서 특정 잔기의 존재 여부에 의해 결정되는 것으로 나타났다(Chothia et al. and Al-Lazikani et al., supra).

CDR 루프의 3차원 구조를 유지하여, 결합 특이성을 유지하는 데 중요한 미지의 3차원 구조의 항체 외에 공지의 서열의 항체에서 그러한 잔기를 예측하는 데 서열-구조의 관계를 이용할 수 있다. 이러한 예측은 선례의 최적화 실험의 산출물과 예측 내용을 비교하여 확인할 수 있다. 구조적 접근법에서, 항체 분자(Chothia, et al. Science, 223, 755-758 (1986))의 이론적 모델은 WAM(Whitelegg, N.R.u. and Rees, A. R (2000) Prot. Eng., 12, 815-824)과 같은, 임의의 자유롭게 이용 가능하거나 상용화된 패키지를 이용하여 만들 수 있다. 그런 다음, Insight II(Accelerys, Inc.) 또는 Deep View(Guex, N. and Peitsch, M. C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723)와 같은 단백질 시각화 및 분석 소프트웨어 패키지를 이용하여 CDR과 FR의 각 위치에서 가능성 있는 치환을 평가할 수 있다. 그런 다음, 이런 정보를 활성에 최소한의 영향 또는 유익한 영향을 미칠 가능성이 있는 치환으로 만드는 데 이용할 수 있다. 일반적으로 CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 특이적 항체의 아미노산 서열 내에 치환을 만들기 위해 필요한 기법은 당해 분야에서 이용 가능하다. 활성에 최소한의 영향 또는 유익한 영향을 나타내리라고 예상할 수 있거나 예상되지 않을 수 있는 치환에 의해 다양한 서열들을 제조할 수 있다.

따라서, 항-TGF-β 항체는 정해진 CDR 세트, 특히 PET1073G12, PET1074B9 및 PET1287A10의 CDR 세트와 CDR 세트 내에 하나 또는 두 개의 치환이 있는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 관련 있는 CDR 세트는 항체 골격영역 또는 다른 단백질 스캐폴드, 예컨대, 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 내에 제공된다. 바람직하게는 항체 골격영역이 이용된다.

항-TGF-β 항체의 중쇄는 인간 V_H1 패밀리 유전자를 이용할 수 있다. 다양한 구현예에서, 중쇄 골격 아미노산 서열은 인간 V_H1 패밀리 유전자의 생식계열 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 12개, 바람직하게는 3 내지 12개, 더욱 바람직하게는 3 내지 8개의 아미노산 차이를 나타낸다. 일부 구현예에서, 중쇄 골격 서열은 생식계열 서열이다. 특히 바람직한 구현예에서, 중쇄에 대한 항체 골격영역은 V_H1 패밀리에서 인간 DP-10(V_H 1-69) 또는 인간 DP-88(V_H 1-e)일 수 있다. 인간 DP-10 유전자를 이용하는 일부 구현예는 27, 78 및 94번 잔기에 비생식계열 아미노산을 가지고 있다. 일부 구현예에서, 27번 잔기는 티로신이고, 78번 잔기는 트레오닌이며, 94번 잔기는 세린 또는 류신이다. 일부 구현예에서, 경쇄는 생식계열 아미노산 서열과 비교하여 1 내지 5개, 1 내지 4개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산 차이를 나타내는 인간 Vκ3 패밀리 유전자를 이용한다. 일부 구현예에서, 경쇄 골격 서열은 생식계열 인간 V_κ3 패밀리 유전자 서열이다. 특히 바람직한 구현예에서, 경쇄에 대한 골격영역은 인간 DPK-22(A27)일 수 있다. 일부 그러한 구현예에서, 2번 잔기는 비생식계열 아미노산이다. 일부 구현예에서, 2번 잔기는 트레오닌이다.

매우 바람직한 구현예에서, "PET1073G12 VH 도메인"이라는 서열번호 2, 또는"PET1074B9 VH 도메인"이라는 서열번호 12, 또는 PET1287A10 VH 도메인"이라는 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지고 있는 VH 도메인이 제공된다.

일부 구현예에서, VL 도메인은 "PET1073G12 VL 도메인"이라는 서열번호 7, 또는 "PET1074B9 VL 도메인"이라는 서열번호 17, 또는 "PET1287A10 VL 도메인"이라는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 항-TGF-β 항체의 한 예는 PET1073G12 VH 도메인인 서열번호 2와 PET1073G12 VL 도메인인 서열번호 7로 이루어져 있다. 다른 예는 PET1074B9 VH 도메인인 서열번호 12와 PET1074B9 VL 도메인인 서열번호 17로 이루어져 있다. 다른 예는 PET1287A10 VH 도메인인 서열번호 22와 PET1287A10 VL 도메인인 서열번호 27로 이루어져 있다. 이러한 또는 임의의 다른 항체 TGF-β 결합부위는 본원에 다른 곳에서 추가로 논의된 바와 같이, 임의의 원하는 항체 분자 포맷, 예컨대, scFv, Fab, IgG1, IgG4, dAb 등 내에 포함될 수 있다. 다른 예는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VH 도메인을 포함하며, 바람직하게는 상응하는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VL 도메인도 포함하는 IgG4 항체 분자이다.

PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VH 도메인, 및/또는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VL 도메인을 포함하는 다른 IgG4 또는 다른 항체 분자는, 항체 VH 도메인 내에 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10의 HCDR 세트 및/또는 항체 VL 도메인 내에 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10의 LCDR 세트를 포함하는 다른 항체 분자들과 마찬가지의, 추가적인 예이다.

항-TGF-β 항체는 세 가지 인간 TGF-β 이소형 모두에 결합하는 항체일 수 있다. 그러한 항-TGF-β 항체는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VH 및/또는 VL 도메인 또는 그러한 도메인의 항원결합 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상술한 것들 가운데 하나의 VH 도메인은 항원결합부위를 제공하고자 상술한 것들 가운데 하나의 VL 도메인과 짝을 이룬다. 예를 들어, PET1073G12 VH 도메인(서열번호 2)은 PET1073G12 VH 및 VL 도메인 모두를 포함하는 항원결합부위가 형성되도록 PET1073G12 VL 도메인(서열번호 7)과 짝지어질 수 있다. 다른 구현예에서, PET1074B9 VH 도메인(서열번호 12)은 PET1074B9 VH 및 VL 도메인 모두를 포함하는 항원결합부위가 형성되도록 PET1074B9 VL 도메인(서열번호 17)과 짝지어진다. 다른 구현예에서, PET1287A10 VH 도메인(서열번호 22)은 PET1287A10 VH 및 VL 도메인 모두를 포함하는 항원결합부위가 형성되도록 PET1287A10 VL 도메인(서열번호 27)과 짝지어진다. 다른 구현예에서, PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VH 도메인은 상응하는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VL 이외의 VL 도메인과 짝지어진다.

마찬가지로, 본원에 개시된 임의의 HCDR 세트는 특이적인 항체 단독으로 또는 VL 도메인과 조합하여 이용되는 VH 도메인 내에 제공될 수 있다. VH 도메인은 본원에 개시된 바와 같은 HCDR 세트와 함께 제공될 수 있으며, 그러한 VH 도메인이 VL 도메인과 짝을 이룬다면, VL 도메인은 본원에 개시된 LCDR 세트와 함께 제공될 수 있다. HCDR 세트와 LCDR 세트의 짝짓기는 PET1073G12, PET1074B9 및 PET1287A10 항체를 위해 본원에 개시된 바와 같을 수 있다. VH 및/또는 VL 도메인의 골격영역은 생식계열 골격일 수 있다. 중쇄 도메인의 골격영역은 VH-1 패밀리로부터 선택될 수 있으며, 바람직한 V_H _-1 골격은 DP-10 또는 DP-88 골격이다. 경쇄의 골격영역은 Vκ3 패밀리로부터 선택될 수 있고, 바람직한 그런 골격은 DPK-22이다.

하나 이상의 CDR이, 서열이 본원에 개시되어 있으며 적합한 골격에 도입되는 VH 또는 VL 도메인으로부터 얻어질 수 있다. 이는 본원에서 추가로 논의된다. 본원에 기술된 방법을 이용하여 얻은 바와 같이, 항체의 다른 CDR 및 CDR 세트의 경우에도 같다.

항체 VH 도메인, 항체 VL 도메인, HCDR 세트, LCDR 세트, CDR 세트, 하나 이상의 HCDR, 예컨대, HCDR3, 및/또는 하나 이상의 LCR, 예컨대, LCDR3가 TGF-β 길항제에 이용될 수 있다.

아미노산 서열이 본원에 기재되어 있고, TGF-β에 대해 특이적인 항체에 이용될 수 있는 것들을 포함한, VH 및 VL 도메인과 CDR의 변이형은 서열 변경 또는 돌연변이 및 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있다.

서열이 구체적으로 본원에 개시되어 있는 임의의 VH 및 VL 도메인 중 가변 도메인 아미노산 서열 변이형은 본원에 개시된 방법에서 이용될 수 있다. 특정 변이형은 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 첨가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있고, 약 20개 미만의 변경, 약 15개 미만의 변경, 약 10개 미만의 변경 또는 약 5, 4, 3, 2개 미만 또는 1개의 변경일 수 있다. 변경은 하나 이상의 골격영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다.

항원에 대한 결합을 두고 항원과 결합하며, 특이적인 항체의 항원결합부위인 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인, 본원에 개시된 CDR 세트 또는 HCDR3, 또는 이들 중 임의의 어느 하나의 변이형을 포함하는 임의의 특이적인 항체와 경쟁하거나 교차 경쟁하는, 인간, 인간화, 키메라 및 합성형의 특이적 항체가 본원에 개시된 방법에 이용될 수 있다. 항체들 사이의 경쟁은 시험관 내에서, 예를 들어, 동일한 에피토프 또는 겹치는 에피토프와 결합하는 특이적인 항체들의 식별을 가능하게 하기 위하여, ELISA를 이용하여 및/또는 다른 꼬리표를 붙이지 않은 항체(들)이 존재할 때 검출될 수 있는 하나의 항체에 특이적인 리포터 분자라는 꼬리표를 붙임으로써 쉽게 분석할 수 있다. 항체들 사이의 교차 경쟁은 역 분석법을 진행하여, 예컨대, 양 방향에서 결합을 차단하는 쌍을 식별하기 위하여 꼬리표를 붙인 항체와 꼬리표를 붙이지 않은 항체를 뒤바꾸어 쉽게 분석할 수 있다.

PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 항체 분자, 특히 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 scFv 및/또는 IgG4와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 항체의 항원결합부위를 포함하는 항체는 TGF-β를 중화하는 데 이용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 인간, 인간화, 키메라 또는 합성형 항체이다. 추가적인 양상에서, TGF-β에 결합하기 위하여 본원에 기술된 항원결합부위와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 인간, 인간화, 키메라 또는 합성형 항체의 항원결합부위를 포함하고, 인간, 인간화, 키메라 또는 합성형 항체의 항원결합부위는 VH 도메인과 VL 도메인으로 이루어져 있으며, VH 및 VL 도메인은 본원에 개시된 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 항체가 이용될 수 있다.

본원에 개시된 정보를 고려해 볼 때, TGF-β에 대한 인간, 인간화, 키메라 또는 합성형 항체로서, TGF-β에 대한 길항제로서 이용하기 위한, PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 항체 분자; PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10의 CDR 세트가 있는 항체 분자; PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 HCDR의 세트가 있는 항체 분자; 또는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 LCDR의 세트가 있는 항체 분자와 경쟁하거나 교차 경쟁할 수 있는 항체를 제조하는 다양한 방법이 당해 분야에서 이용 가능하다.

TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3에 결합할 수 있는 하나 이상의 특이적인 항체는 항체 라이브러리를 TGF-β와 접촉시키는 단계, 및 상기 TGF-β 중 모두와 결합할 수 있는, 라이브러리 중 하나 이상의 특이적인 항체를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 라이브러리는 박테리오파지 입자의 표면 위에 표시될 수 있는데, 이때 각 입자는 그 표면에 표시된 항체 VH 가변 도메인과, 임의로, 만일 존재한다면, 표시된 VL 도메인도 암호화하는 핵산을 함유한다. 항원과 결합할 수 있고, 박테리오파지 입자 위에 표시된 특이적인 항체 선별 후, 상기 선별된 특이적인 항체를 표시하는 박테리오파지 입자로부터 핵산을 얻을 수 있다. 그러한 핵산은 이후에 상기 선별된 특이적인 항체를 표시하는 박테리오파지 입자로부터 얻어진 핵산 서열이 있는 핵산으로부터 발현에 의해 특이적인 항체 또는 항체 VH 가변 도메인(및 임의로 항체 VL 가변 도메인)을 생산하는 데 이용될 수 있다.

상기 선별된 특이적인 항체의 항체 VH 도메인 아미노산 서열이 있는 항체 VH 도메인은 그러한 VH 도메인을 포함하는 특이적인 항체로서 분리된 형태로 제공될 수 있다. TGF-β의 세 가지 이소형 전부와 결합하는 능력을 추가적으로 시험할 수 있고, 세 가지 인간 이소형 TGF-β 전부와의 결합을 두고, PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10(예컨대, scFv 포맷 및/또는 IgG 포맷으로, 예컨대, IgG4로)과 경쟁 또는 교차 경쟁하는 능력도 추가로 시험할 수 있다.

TGF-β 길항제로 이용하기 위한 항체는 PET1073G12, PET1074B9 또는PET1287A10 항체 분자, 예컨대, scFv, 또는 바람직하게 IgG4의 친화도로, 또는 상술한 분자들 중 하나보다 더 큰 친화도로 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3와 결합할 수 있다. 유용한 항체는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 항체 분자, 예컨대, scFv, 또는 바람직하게는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 IgG4의 효능으로, 또는 상술한 분자들 중 하나보다 더 큰 효능으로 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3를 중화시킬 수 있다.

TGF-β 길항제로 이용하기 위한 항체는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 항체 분자, 예컨대, scFv, 또는 바람직하게는 IgG4의 효능으로, 또는 상술한 분자들 중 하나보다 더 큰 효능으로 자연 발생적인 TGF-β를 중화시킬 수 있다. 상이한 특이적인 항체들의 결합 친화도 및 중화 효능은 적절한 조건 하에서 비교될 수 있다.

TGF-β 길항제로 이용하기 위한 항체는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VH 도메인 및 상응하는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VL 도메인에 의해 형성된 TGF-β 항원결합부위의 효능과 동일하거나 더 큰 효능으로 자연 발생적인 TGF-β를 중화시킬 수 있는 인간, 인간화, 키메라 또는 합성형 항체를 포함한다.

항체 서열 이외에도, TGF-β 길항제로 이용하기 위한 항체는 다른 아미노산, 예컨대, 접힌 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는 아미노산, 또는 항원과 결합하는 능력 이외에 다른 기능적 특성을 분자에 부과하기 위한 아미노산을 포함할 수 있다. 특이적인 항체는 검출 가능한 표지를 동반할 수 있고, 또는 (예컨대, 펩티드 결합 또는 링커를 통하여) 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 콘쥬게이트 될 수 있다.

항원 결합 항체는 항원결합부위를 포함한다. 항원결합부위는 또한 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등과 같은 비항체 단백질 스캐폴드 상의 CDR 정렬에 의해 제공될 수 있다(Koide et al., (1998) Journal of Molecular Biology, 284:1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, Vol. 7:463-469). 단백질에 신규 결합부위를 설계하기 위한 스캐폴드는 문헌(Nygren et al., supra)에 상세히 검토된 바 있다. 항체 모방체(antibody mimic)를 위한 단백질 스캐폴드는 국제 특허 출원 공보 제WO 00/34784호에 개시되어 있는데, 이는 적어도 하나의 임의 추출된 루프를 가지고 있는 피브로넥틴 III형 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)를 기술한다. 하나 이상의 CDR, 예컨대, HCDR 세트를 이식하기 위한 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리의 임의의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비인간 단백질일 수 있다.

비인간 단백질 스캐폴드의 장점은 그것이 적어도 일부의 항체 단백질보다 작고/작거나 제조하기 쉬운, 보존된 골격영역 내 항원결합부위를 제공할 수 있다는 점이다. 항체의 작은 크기는 세포로 들어가 조직 깊숙이 침투하거나 다른 구조 내의 표적에 도달할 수 있는 능력, 또는 표적 항원의 단백질 공동(cavity) 내에 결합하는 능력과 같은 유용한 생리학적 성질을 부여할 수 있다.

안정적인 백본과 하나 이상의 가변 루프를 가지고 있는 단백질로서, 루프 또는 루프들의 아미노산 서열이, 표적 항원과의 결합에 대해 특이성을 나타내는 항원결합부위를 만들기 위하여 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이 되는 단백질이 전형적이다. 그러한 단백질은 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)의 단백질 A의 IgG 결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴(예컨대, 10번째 피브로넥틴 III형 도메인) 및 리포칼린을 포함한다. 다른 접근법은 분자 내 이황화결합을 가지고 있는 작은 단백질인 시클로티드(cyclotide)를 기초로 하는 합성형 "마이크로바디(Microbodies)"(Selecore GmbH)를 포함한다.

항체 서열 및/또는 항원결합부위 이외에도, 항체는 다른 아미노산, 예컨대, 접힌 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는 아미노산, 또는 항원에 결합하는 능력 이외에 다른 기능적인 특성을 분자에 부과하기 위한 아미노산을 포함할 수 있다. 항체는 검출 가능한 표지를 동반할 수 있고, 또는 (예컨대, 펩티드 결합 또는 링커를 통하여) 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 콘쥬게이트 될 수 있다. 예를 들어, 항체는 항원결합부위뿐만 아니라, 촉매 자리(예컨대, 효소 도메인 내에)를 포함할 수 있으며, 이때, 항원결합부위는 항원과 결합하므로, 항원에 대한 촉매 자리를 표적으로 한다. 촉매 자리는 항원의 생물학적 기능을 예컨대, 분할에 의해 억제할 수 있다.

지적한 바와 같이, CDR은 피브로넥틴 또는 시토크롬 B와 같은 스캐폴드에 의해 전달될 수 있지만(Haan & Maggos, 2004 BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al., supra; Nygren et al., supra), CDR 또는 CDR 세트를 전달하기 위한 구조는 일반적으로, CDR 또는 CDR 세트가 재정렬된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 자연 발생적인 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 자리하는, 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 상당한 부분의 구조일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 Kabat 등(1987)과 현재 인터넷에서 이용할 수 있는 이의 업데이트 내용(URL: immuno.bme.nwu.edu 또는 임의의 검색 엔진을 이용하여 "Kabat"을 찾을 것)을 참조하여 결정할 수 있다.

단일클론항체 또는 다른 항체들을 획득하여 본래 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산하는 재조합 DNA 기술의 기법들을 이용하는 것이 가능하다. 그러한 기법들은 면역글로불린 가변부위를 암호화하는 DNA를 불변부위에 연결하거나, 항체의 상보성 결정부위(CDR)를 상이한 면역글로불린의 불변부위와 골격영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400 및 많은 양의 후속 문헌을 참고. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포가, 생산되는 항체의 결합 특이성을 변경할 수 있거나 변경하지 않을 수 있는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화의 대상이 될 수 있다.

항체 공학의 분야에서 이용할 수 있는 추가적인 기법들은 인간 및 인간화 항체의 단리를 가능하게 하였다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 Kontermann 등이 기술한 바와 같이 제조될 수 있다(Kontermann R and Dubel Stefan; Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545). 항체 생성을 위한 다른 확립된 기술인 파지 디스플레이는 Kontermann 등(위와 같음)과 W0 92/01047(아래에서 추가로 논의)과 같은 여러 출판물에 상세하게 기술되어 있다. 마우스 면역 체계의 다른 성분들은 온전히 둔 채, 마우스 항체 유전자를 불활성화시켜 인간 항체 유전자로 기능적으로 교체한 형질전환 마우스는 인간 항원에 대한 인간 항체를 분리하는 데 이용될 수 있다(Mendez et al., 1997). 단일클론 또는 다클론의 인간 항체 또한 염소, 소, 양, 토끼 등의 다른 형질전환 동물에서 제조될 수 있다.

예를 들어, Knappik 등(위와 같음) 또는 Krebs 등(Journal of Immunological Methods 254:67-84 (2001))이 기술한 바와 같이, 적합한 발현 벡터 내에 합성되고 조립된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 생성되는 유전자로부터 발현에 의해 만들어지는 합성형 항체 분자들은 TGF-β 길항제로 이용될 수 있다.

전체 항체의 단편은 항원 결합의 기능을 수행할 수 있다. 결합 단편의 예는 (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554); (v) 분리된 CDR 부위; (vi) F(ab')2 단편, 두 개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (vii) VH 도메인과 VL 도메인이 두 도메인을 회합시켜 항원결합부위를 형성할 수 있게 하는 펩티드 링커에 의해 연결된, 단일 사슬 Fv 분자(scFv) (Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85, 5879-5883; 1998); (viii) 이중특이성 단일 사슬 Fv 이량체(PCT/US92/09665); 및 (ix) "다이아바디", 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이성 단편(WO/13804; F. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)이다. Fv, scFv 또는 다이아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화결합을 도입하여 안정화시킬 수 있다(Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(minibody) 또한 제조될 수 있다(S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).

dAb(도메인 항체)는 항체의 작은 단량체 항원결합 단편, 즉, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변부위이다(Holt et al., 2003). VH dab는 낙타과(예컨대, 낙타, 라마)에서 자연적으로 발생하며, 낙타과를 표적 항원으로 면역화하고, 항원 특이적인 B 세포를 분리하여, 개별 B 세포로부터 dAb 유전자를 직접적으로 클로닝하여 생산할 수 있다. dAb는 또한 세포 배양에서 생산 가능하다. 작은 크기, 우수한 용해도 및 온도 안정성 덕분에 dAb는 특별히 생리적으로 유용하고, 선별 및 친화도 성숙에 적합하다. 항체는 본원에 실질적으로 기술된 바와 같은 VH 또는 VL 도메인을 포함하거나, 본원에 실질적으로 기술된 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.

이중특이적 항체가 이용되는 경우, 이들은 다양한 방식(Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993))으로 제조될 수 있는, 예컨대, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는, 종래의 이중특이적 항체일 수 있거나, 위에 언급된 임의의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 이중특이적 항체의 예로, 상이한 특이성이 있는 두 개의 항체의 결합 도메인이 이용되어 짧은 유연한 펩티드를 통해 직접 연결될 수 있는, BiTE^TM 기술의 그것들을 포함한다. 이것은 짧은 단일 폴리펩티드 사슬 위에 두 개의 항체를 연결한다. 다이아바디와 scFv는 가변 도메인만을 이용하여 Fc 부위 없이 구축되어, 잠재적으로 항-유전자형(anti-idoitypic) 반응의 효과를 감소시킬 수 있다.

또한, 이중특이적 전체 항체와는 반대로, 이중특이적 다이아바디는 용이하게 구축되어 대장균에서 발현될 수 있으므로, 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성을 나타내는 다이아바디(및 항체 단편과 같은 여러 다른 폴리펩티드)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(참조: 국제 특허 출원 공보 제WO94/13804호)를 이용하여 용이하게 선택될 수 있다. 다이아바디의 한 팔이, 예를 들어, TGF-β를 대상으로 하는 특이성으로 불변 상태를 유지하게 된다면, 다른 팔이 다양한 경우, 라이브러리가 제조될 수 있고 적절한 특이성을 나타내는 항체가 선택될 수 있다. 이중특이적인 전체 항체는 knobs-into-holes 공학(C. E. B. Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996)에 의해 제조될 수 있다.

항체는 자연적으로 또는 다양한 진핵세포(예컨대, CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있거나, 항체는 (예를 들어, 원핵세포에서 발현에 의해 생산된다면) 글리코실화되지 않을 수 있다. 글리코실화는 또한, 예를 들어, 푸코실화를 억제하여, 의도적으로 변경하여, 그 결과로 얻어지는 항체의 ADCC 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 푸코실화를 최소화하거나 제거하기 위하여 항체를 발현시킬 수 있다.

일부 구현예에서, CDR 또는 VH 또는 VL 도메인은 서열이 본원에 기술되어 있는 특정 부위와 동일하거나 매우 유사할 것이다. CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인 내에서 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 또는 1 내지 2개, 또는 3개, 또는 4개의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다는 점이 고려된다. 본원에 실질적으로 기재되어 있는 서열이 있는 그것들처럼, 서열이 본원에 주어진 것들과 매우 유사한 VH 또는 VL 도메인과 CDR 및 CDR 세트는 양상에 포함된다.

CDR 또는 CDR 세트를 전달하기 위한 구조는 일반적으로, CDR 또는 CDR 세트가, 재정렬된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 자연 발생적인 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR 세트에 해당하는 위치에 자리한, 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 상당한 부분일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌(Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987)과 현재 인터넷에서 이용할 수 있는 이의 업데이트 내용(URL: immuno.bme.nwu.edu 또는 임의의 검색 엔진을 이용하여 "Kabat"을 찾을 것)을 참조하여 결정될 수 있다. CDR은 Kabat 등에 따라 정의된다. CDR은 또한 피브로넥틴 또는 시토크롬 B와 같은 다른 스캐폴드에 의해 전달될 수 있다.

바람직하게는, 본원에 실질적으로 기재된 CDR 아미노산 서열은 인간 가변 도메인 또는 이의 상당한 부분에 CDR로서 전달된다. 본원에 실질적으로 기재된 HCDR3 서열은 바람직한 구현예를 나타내며, 이들 중 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 이의 상당한 부분에 HCDR3로 전달되는 것이 바람직하다.

이용되는 다양한 도메인은 임의의 생식계열 또는 재정렬된 인간 가변 도메인으로부터 획득되거나 유도될 수 있거나, 공지의 인간 가변 도메인의 공통 서열 또는 실제 서열을 기초로 한 합성 가변 도메인일 수 있다. CDR 서열(예컨대, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 이용하여, CDR(예컨대, CDR3)이 없는 가변 도메인의 레퍼토리로 도입될 수 있다. 바람직한 생식계열 골격을 이미 본원에서 밝힌 바 있다.

Marks 등(Bio/Technology, 1992, 10:779-783)은 CDR2가 없는 Vκ 가변 도메인 레퍼토리를 제공하고자, 가변 도메인 영역의 5' 말단 또는 그 근처를 향하게 한 공통 프라이머가 인간 VH 유전자의 제3 골격영역에 대한 공통 프라이머와 함께 이용되는 항체 가변 도메인의 레퍼토리 생산방법을 기술하고 있다. Marks 등은 또한 어떻게 이러한 레퍼토리가 특정 항체의 CDR2와 결합될 수 있는지를 기술하고 있다. 유사한 기법을 이용하여, 항체를 제공하기 위하여 CDR3 유래 서열이, CDR3가 없는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 및, 관련이 있는 VL 또는 VH 도메인과 결합된, 셔플된 완전한 VH 또는 VL 도메인과 셔플(shuffle)될 수 있다. 그런 다음, 레퍼토리는 WO92/01047 또는 Kay, B. K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press를 포함한 많은 양의 임의의 후속 문헌의 파지 디스플레이 시스템과 같은 적절한 숙주 시스템에 디스플레이될 수 있으며, 그 결과 적절한 항체가 선별될 수 있다. 레퍼토리는 10⁴개 이상의 개별 구성원, 예를 들어, 10⁶ 내지 10⁸ 또는 10¹⁰개 구성원으로 이루어질 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템은 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 공유적 디스플레이 등을 포함한다.

유사한 셔플링 또는 조합 기법 또한 Stemmer(Nature, 1994, 370:389-391)가 개시하고 있는데, 그는 기법을 β-락타마제 유전자와 관련하여 기술하고 있으나, 그 접근법이 항체 생성을 위해 이용될 수 있음을 관찰하였다.

추가적인 대안은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 발생시키기 위하여 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이화를 이용하여 CDR 유래를 전달하는 신규한 VH 또는 VL 부위를 발생시키는 것이다. 그러한 기법은 실수 유발(error-prone) PCR을 이용한, Gram 등(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580)이 기술하였다. 바람직한 구현예에서, 하나 또는 두 개의 아미노산 치환이 HCDR 및/또는 LCDR 세트 내에 이루어진다. 이용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 부위에 돌연변이화를 유도하는 것이다. 그러한 기법은 Barbas 등(1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813)과 Schier 등(J. Mol. Biol. 263:551-567)에 의해 개시되었다. 본원에 제공된 개시내용을 고려할 때, 당업자는 당해 분야에서 일상적인 방법을 이용하여 추가적인 항체를 획득하는 데 그러한 기법을 이용할 수 있을 것이다. PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 VH 도메인은 하나 이상의 VL 도메인과 결합될 수 있는 하나 이상의 VH 도메인 아미노산 서열 변이형을 제공하기 위한 돌연변이의 대상이 될 수 있다.

VH 도메인은 생식계열 서열을 가지고 있을 수 있고, 바람직한 구현예에서는 DP-10 또는 DP-88이다. VL 도메인 서열은 생식계열 서열을 가지고 있을 수 있고, 바람직한 구현예에서는 DPK-22이다. 하나 이상의 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10의 HCDR 세트가 이용될 수 있고/있거나 하나 이상의 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 또는 PET1073G12, PET1074B9 또는 PET1287A10의 LCDR 세트가 이용될 수 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 상당한 부분은 적어도 세 개의 CDR 부위를, 그들 사이에 있는 골격영역과 함께 포함할 것이다. 바람직하게는, 부분은 또한 제1 및 제4 골격영역 중 어느 하나 또는 둘 다의 적어도 50%를 포함할 것이고, 그 50%는 제1 골격영역의 C-말단 50%와 제4 골격영역의 N-말단 50%일 것이다. 가변 도메인의 상당한 부분의 N-말단 또는 C-말단 측의 추가적인 잔기는 자연 발생적인 가변 도메인 부위와 정상적으로 회합되지 않은 것들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의해 제조되는 항체의 구축은 클로닝 또는 기타 조작 단계를 촉진시키기 위해 도입된 링커에 의해 암호화되는 N-말단 또는 C-말단 잔기의 도입을 초래할 수 있다. 기타 조작 단계는, 면역글로불린 중쇄, 기타 가변 도메인(예를 들어, 다이아바디의 생산에서) 또는 단백질 표지를 포함하는 추가적인 단백질 서열에 가변 도메인을 연결하기 위한 링커를 도입하는 것을 포함한다.

한 쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체가 바람직하고, VH 또는 VL 도메인 서열 중 어느 하나를 기초로 한 단일 결합 도메인 또한 이용될 수 있다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인은 특이적인 방식으로 표적 항원과 결합할 수 있다는 점은 알려져 있다. 단일 특이적 결합 도메인 중 어느 하나의 경우, 이러한 도메인들은, 세 가지의 인간 TGF-β 이소형과 결합할 수 있는 두 개의 도메인 항체를 형성할 수 있는 상보적인 도메인을 스크리닝하는 데 이용될 수 있다.

이것은 WO92/01047에 개시된 바와 같은, 소위 계층적 이중 조합 접근법을 이용한 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있는데, 이 방법에서는 H 또는 L 사슬 클론 중 어느 하나를 함유하는 개별적인 콜로니가 다른 사슬(L 또는 H)을 암호화하는 클론들의 완전한 라이브러리를 감염시키는 데 이용되며, 그 결과로 얻어지는 두 개 사슬 항체가 그 참조에 기술된 것들과 같은 파지 디스플레이 기법에 따라 선택된다.

항-TGF-β 항체는 항체 불변부위 또는 이의 일부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그 C-말단 측에서 인간 C_κ 또는 C_λ 사슬, 바람직하게는 C_κ 사슬을 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 마찬가지로, VH 도메인을 기초로 한 항체는 그것의 C-말단 측에서 임의의 항체 이소형, 예컨대, IgG, IgA, IgE 및 IgM, 그리고 이소형의 임의의 하위 클래스, 특히 IgG1 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부(예컨대, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. IgG4가 바람직하다. IgG4는 보체를 결합하고 있지 않아서, 감소된 효과인자 기능을 나타내기 때문에, 일부 응용을 위해 바람직하다. 효과인자 기능이 바람직한 경우, IgG1이 바람직하다. 효과인자 기능은 또한, 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 푸코스 함량을 감소시키는 것과 같은, 항체의 글리코실화 상태를 조작하여, 증가시킬 수 있다. 중쇄는 C-말단 리신 잔기를 가지고 있을 수 있거나, 가지고 있지 않을 수 있다. 이러한 성질들을 가지고 있고, 가변 부위를 안정화시키는 임의의 합성형 또는 기타 불변부위 변이형 또한 일부 구현예에서 이용될 수 있다.

항체의 이종 제제(preparation) 또는 이의 항원결합단편이 유용할 수 있다. 예를 들어, 그러한 제제는 전체 길이의 중쇄가 있는 항체와, C-말단 리신이 없는 중쇄가 있는 항체, 다양한 글리코실화도를 나타내는 항체, 피로글루탐산 잔기 형성을 위한 N-말단 글루탐산의 고리화와 같은, 유도체화된 아미노산이 있는 항체, 및/또는 중쇄 또는 경쇄의 탈아미드화된 형태의 항체의 혼합물일 수 있다.

TGF-β 항체를 포함하는 조성물은 그것을 필요로 하는 개체에, 바람직하게는 "치료적으로 유효한 양"으로 투여될 수 있고, 이는 환자에게 유익을 나타내기에 충분하다. 그러한 유익은 특정 질환 또는 장애의 적어도 한 가지 증상의 적어도 개선일 수 있다. 투여되는 실제 양, 투여속도 및 투여의 시간 경로는 처리되는 질환의 속성 및 중증도에 달려 있을 것이다. 치료의 처방, 예컨대, 투여량에 대한 결정 등은 당업자의 수준으로 충분히 할 수 있는 설계의 전임상 및 임상 연구를 기초로 결정될 수 있다.

항체는 주사(예를 들어, 피하, 정맥 내, 공동 내(예컨대, 종양 절제 후), 병소 내, 복강 내 또는 근육 내)에 의해, 흡입에 의해, 또는 국소적으로(예를 들어, 안구 내, 비강 내, 직장, 상처 안으로, 피부 위에) 또는 경구로 투여될 수 있다. 투여 경로는 제품의 물리화학적 특성에 의해, 질환에 대한 특별한 고려사항에 의해, 용량 또는 투여 간격에 의해, 또는 효능을 최적화하거나 부작용을 최소화하기 위한 요건에 의해 결정할 수 있다.

항-TGF-β 치료는 의료 전문가에 의한 투여에만 한정될 필요가 없다고 예상된다. 따라서, 피하 주사, 특히 바늘이 없는 장치를 이용한 피하 주사가 적당할 수 있다.

정확한 용량은 환자의 상태와 병력, 항체의 정확한 속성(예컨대, 전체 항체, 단편 또는 다이아바디), 및 임의의 검출 가능한 표지 또는 표지에 부착된 다른 분자의 속성을 포함한 여러 가지 인자들에 달려 있을 것이다. 전형적인 항체 용량은 전신 적용의 경우, 100μg 내지 1gm, 국소 적용의 경우, 1μg 내지 1mg의 범위일 것이다. 전형적으로, 항체는 전체 항체, 바람직하게는 IgG4 이소형일 것이다. 이는 성인 환자의 단일 치료를 위한 용량으로, 아동 및 유아를 위해 비례적으로 조정될 수 있으며, 또한, 분자량과 활성에 비례하여 다른 항체 포맷을 위해서도 조정될 수 있다. 치료는 의사의 재량에 따라, 매일, 주 2회, 매주, 매달, 또는 다른 간격으로 반복될 수 있다.

항체는 일반적으로, 항체 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 제약 조성물의 형태로 투여될 것이다. 급성 심근경색증을 치료하는 방법에 사용하기 위한 제약 조성물은 활성 성분 이외에도 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충액, 안정제, 또는 당업자에게 잘 알려져 있는 기타 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 무독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해해서는 안 된다. 그러한 물질은 예를 들어, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 작용제, 및 생리적으로 적합한 기타를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 일부 예는 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 이의 조합이다. 여러 사례에서, 조성물 내에 등장성 작용제, 예를 들어, 당류, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 물질의 추가적인 예는 습윤제 또는, 항체의 보존기간 또는 효과를 향상시키는 소량의 보조 물질(예컨대, 습윤 또는 유화용 제제, 보존제 또는 완충액)이다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 속성은 흡입에 의해 또는 주사, 예컨대, 정맥 내 주사에 의해 경구, 국소가 될 수 있는, 투여 경로에 달려 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 정맥 내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 바람직한 구현예에서, 항체는 근육 내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.

경구 투여를 위한 제약 조성물은 예를 들어, 비활성 희석제 또는 동화할 수 있는 식용 담체가 들어 있는, 정제, 캡슐제, 산제 또는 액제 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴과 같은 고체 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 유 또는 식물성 유, 광유 또는 합성유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스 또는 기타 당류 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 항체(그리고 원한다면, 다른 성분)는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐제 내로 동봉, 정제로 압축, 또는 대상자의 식이에 직접적으로 포함될 수도 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 활성 성분은 부형제와 함께 포함되어, 섭취할 수 있는 정제, 구강정제(buccal tablet), 구내정(troch), 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼제 등의 형태로 이용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 방법에 의해 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 그것의 불활성화를 막는 물질로 코팅하거나, 화합물의 불활성화를 막는 물질과 화합물을 공동 투여하는 것이 필수적일 수 있다.

정맥 내 주사 또는 환부에서의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 없고, 적합한 pK, 등장성 및 안정성을 나타내는, 비경구적으로 허용 가능한 수성 용액의 형태일 수 있다. 관련 있는 당업자는 염화나트륨 주사제, 링거 주사제 및/또는 젖산 링거 주사제와 같은, 예를 들어, 등장성 비히클을 이용하여 적합한 용액을 충분히 제조할 수 있다. 보존제, 안정제, 완충액, 항산화제 및/또는 기타 첨가제는 필요한 만큼 포함될 수 있다.

조성물은 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하여, 치료될 병태에 따라 동시에 또는 연속하여, 투여될 수 있다.

항체는 액체 용액(예컨대, 주사 가능한 및 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제와 같은 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제형화될 수 있다. 바람직한 형태는 의도한 투여방식, 치료적 적용, 분자의 물리화학적 성질 및 전달경로에 달려 있다. 제형은 부형제, 또는 부형제의 조합을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 당류, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제형은 다양한 항체 농도와 pH를 포함할 수 있다. 고체 제형은 예를 들어, 동결 건조, 분무 건조, 또는 초임계 유체 기술에 의한 건조에 의해 생산될 수 있다.

치료적 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균되어 있고, 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 정돈된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균의 주사 가능한 용액은 필요한 양의 항체를, 위에서 열거한 성분들 중 하나 또는 조합을 필요한 만큼 함유하는 적당한 용매에 포함시킨 후, 여과 멸균에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산매와 위에서 열거한 것들 중 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 포함시켜 제조한다. 멸균의 주사 가능한 용액 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전의 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 원하는 성분을 얻는 진공 건조법 및 동결 건조법이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 이용하여, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 연장 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아르산 염 및 젤라틴을 포함시켜 이룰 수 있다.

특정 구현예에서, 항체 조성물의 활성 화합물은, 임플란트, 경피성 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같은, 빠른 방출로부터 항체를 보호하는 담체를 이용하여 제조할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스테르 및 폴리락트산과 같은, 생분해성, 생체적합성 중합체가 이용될 수 있다. 그러한 제형의 제조를 위한 여러 방법들이 특허를 받았거나 당업자에게 일반적으로 알려져 있다. 예컨대, 문헌(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)) 참조.

다양한 구현예에서, 다른 치료 계획이 항-TGF-β 항체의 투여와 함께 조합될 수 있다. 조합 투여는 별도의 제형 또는 단일 제약 제형을 이용한 공동 투여 및, 바람직하게는 두 개의 (또는 모든) 활성제가 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있는 경우, 어느 한 가지 순서로의 연속적인 투여를 포함한다.

심근경색증 결과의 예방 또는 치료를 위해, TGF-β 길항제의 적당한 투여량은 환자의 상태, 경색의 중증도 및 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 환자의 임상적 이력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 달려 있다. 길항제는 1회 또는 허혈성 사건 이후 0일(예컨대, 8시간, 12시간, 또는 24시간 이내), 1일, 2일, 3일, 4일, 또는 5일 중에, 바람직하게는 0일, 3일, 또는 5일에 시작하는 일련의 치료에 걸쳐 환자에 투여될 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, TGF-β 길항제 투여는 급성 심근 허혈 발병 약 120시간 이내, 약 96시간 이내, 약 72시간 이내, 약 48시간 이내, 약 24시간 이내, 약 12시간 또는 심지어 약 8시간 이하의 시간 이내에 시작된다. 상태의 유형 및 중증도에 따라, 약 5mg/kg의 항체가, 예를 들어, 하나 이상의 별도의 투여에 의해서든 또는 심근경색 후 연속적인 주입에 의해서든, 환자에 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 위에 언급된 요인들에 따라 5mg/kg 이하일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 상태에 따라, 원하는 질환 증상의 억제가 일어날 때까지 치료가 지속된다. 정맥 내로 투여되는 바람직한 항체의 투여량은 5mg/kg 이하이다. 따라서, 약 5mg/kg 이하의 하나 이상의 용량(또는 이의 임의의 조합)이 환자에 투여될 수 있다. 그러나 다른 투여량 계획이 유용할 수 있다. 이러한 치료의 진행은 종래의 기법 및 분석법에 의해 쉽게 모니터링 된다.

항-TGF-β 항체는 레닌 억제제, 안지오텐신 전환효소(ACE) 억제제, Ang II 수용체 길항제("Ang II 수용체 차단제"라고도 알려져 있음) 및 알도스테론 길항제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템의 길항제와 조합될 때, 급성 심근경색증을 치료하는 데 유용하다. 항-TGF-β 항체는 또한, 알프레놀롤, 부신돌롤, 카르테올롤, 카르베디롤, 라베타롤, 나돌롤, 옥스프레놀롤, 펜부토롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 소타롤, 티모롤, 아테놀올, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 셀리프롤롤, 에스몰롤, 메토프롤롤 및 네비보롤로 이루어진 군을 포함하나, 이에 한정되지 않는 베타 아드레날린성 시스템의 길항제와 조합될 때, 급성 심근경색증을 치료하는 데 유용하다. 나아가, 항-TGF-β 항체는 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 레수바스타틴(resuvastatin)으로 이루어진 스타틴 군, 클레스티라민, 셀레스티폴, 콜레세발람으로 이루어진 담즙산 결합수지 군, 겜피브로질, 페노피브레이트, 클로피브레이트로 이루어진 피브린산 군, 니코틴산과 니아스판을 포함하는 군, 콜레스테롤 저하제 에제티미브 및 에제티미브와 심바스타틴의 조합을 포함하는 군을 포함하나, 이에 한정되지 않는 지질 관리제와 조합될 때, 급성 심근경색증을 치료하는 데 유용하다. 다른 양상에서, 항-TGF-β 항체는 아스피린; 클로피도그렐, 프라수그렐, 티카그렐러, 티클로피딘으로 이루어진 ADP 수용체 억제제 군; 및 항응고제 와파린을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항혈소판제/항응고제와 조합될 때, 급성 심근경색증을 치료하는 데 유용하다.

치료에 이용되는 항체의 치료적 제형은 정맥 내 치료를 위해 이용할 수 있는 용기 내에 제공될 수 있다. 제형은 또한, 원하는 순도를 나타내는 항체를 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)의 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 함께 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 보관하기 위해 제조될 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 독성을 나타내지 않으며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; (옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸과 같은) 보존제; 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 소듐과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.

제형은 또한 치료되고 있는 특정 지표에 필요한 하나를 초과하는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 상보적인 활성을 나타내는 화합물은 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 조성물은 사이토카인, 성장억제제, 항호르몬제, TGF-β 표적화제, 항혈관신생제 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 분자들은 의도한 목적을 위해 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.

"사이토카인"은 하나의 세포 집단이 분비하는 단백질로, 세포간 매개자로 다른 세포에 작용하는 단백질에 대한 일반 용어이다. 그러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토젠; 종양괴사인자- α, β; 물러관 억제물질; 마우스 생식샘자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-.β.와 같은 신경성장인자; 혈소판 성장인자; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리스로포이에틴(EPO); 뼈전도성 인자; 인터페론-α, β, 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 집락자극인자(CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨(IL); TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양괴사인자; LIF와 키트 리간드(KL)을 포함하는 기타 폴리펩티드 인자가 사이토카인에 포함된다. 본원에 사용된 용어 사이토카인은 천연 공급원에서 유래한 단백질 또는 재조합 세포 배양에서 유래한 단백질 및 자연 서열의 사이토카인의 생물학적으로 활성이 있는 균등물을 포함한다.

"심장보호제"는 항-TGF-β 항체와 같은 약물을 환자에 투여하는 것과 관련된 심근 기능장애(즉, 심근증 및/또는 울혈성 심부전)를 예방하거나 줄이는 화합물 또는 조성물이다. 심장보호제는 예를 들어, 자유 라디컬 매개성 심장 독성 효과를 차단하거나 줄일 수 있고/있거나 산화적 스트레스 손상을 예방하거나 줄일 수 있다.

활성 성분은 또한 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해, 또는 계면 중합반응에 의해, 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 포착될 수 있다. 이러한 기법은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.

지속 방출성 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 고분자의 반투과성 매트릭스를 포함할 수 있고, 이때 매트릭스는 성형된 물품, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드, L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루탐산염의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생체 내 투여를 위해 이용될 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

위에서 기술한 심근경색증 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품으로, 일반적으로 용기와 표지 또는, 용기 위의 또는 용기와 관련된 포장 인쇄물(package insert)을 포함하는 제조 물품이 제공될 수 있다. "포장 인쇄물"은 치료용 제품의 상업적인 포장 내에 관례상 포함시킨 설명을 포함하며, 이 설명은 그러한 치료용 제품의 이용에 관련된 지시, 용도, 투여량, 투여방법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유한다.

적절한 용기는 병, 바이알, IV 용액 주머니, 통, 주사기 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 TGF-β 신호전달 저해에 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가지고 있을 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼를 가지고 있는 정맥 내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성 성분은 항-TGF-β 항체일 수 있다. 표지 또는 포장 인쇄물은 조성물이 심근경색증, 급성 심근경색증의 치료 또는 심근경색증 결과의 감소를 위해 이용됨을 지시할 수 있다. 일구현예에서, 표지 또는 포장 인쇄물은 항체를 포함하는 조성물이 심근경색증의 급성기 중에 투여될 수 있음을 지시한다.

나아가, 제조 물품은 항-TGF-β 항체 및 항체 이외의 치료제로 이루어진 조성물을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 제조 물품은 제1 조성물 및 제2 조성물이 심근경색증을 치료하기 위해 조합하여 이용될 수 있음을 지시하는 포장 인쇄물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 치료제는 앞의 섹션에 기술한 임의의 부가 치료제(예컨대, 항신생혈관제, 항호르몬성 화합물, 심장보호제 및/또는 사이토카인을 포함한, 포유동물의 면역기능 조절제)일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 항균주사용수(bacteriostatic water for injection: BWFI), 인산 완충 식염수, 링거용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 또한, 다른 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘 및 주사기를 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

편의상, 항-TGF-β 항체는 키트로, 즉, 설명과 함께 소정의 양의 시약들의 포장된 조합물로 제공될 수 있다. 나아가, 안정제, 완충액(예컨대, 차단 완충액 또는 용균 완충액)과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 특히, 항체는 용해 시, 적당한 농도를 나타내는 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 보통 동결건조된, 건조 분말로 제공될 수 있다.

위의 개요 및 상세한 설명에 기술된 방법 이외에, 다음과 같은 구현예 또한 고려되는 것들이다. 심근경색증, 급성 심근경색증을 앓는 환자를 치료하는 방법 또는 환자의 급성 심근경색증의 부정적인 결과를 줄이는 방법은 심근경색증의 급성기 도중 환자에 TGF-β 길항제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. TGF-β 길항제는 하나 이상의 TGF-β 이소형을 대상으로 한 항체 단편을 포함하는 항체 또는 단백질; TGF-β 수용체; 하나 이상의 TGF-β 수용체를 대상으로 한 항체 단편을 포함하는 항체 또는 단백질; 잠복기 관련 펩티드; 큰 잠복성 TGF-β인 TGF-β 저해성 프로테오글리칸; 소마토스타틴; 만노스-6-인산염; 만노스-1-인산염; 프로락틴; 인슐린 유사 성장인자 II; IP-10; arg-gly-asp 함유 펩티드; 식물, 곰팡이 또는 세균 추출물; 안티센스 또는 간섭 RNA 올리고뉴클레오타이드; 및 TGF-β 신호전달과 관련된 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직한 구현예에서, TGF-β 길항제는 인간화 항-TGF-β 항체 또는 항-TGF-β 항체의 단편 또는 항원결합부위이다. TGF-β 길항제는 TGF-β의 1개 초과 이소형과 결합하여 중화시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체는 TGF-β 결합부분과 나머지 부분을 포함하는 키메라 단일클론항체로서, 상기 TGF-β 결합부분은 단일클론항체 1D11.16의 항원결합 부분 및 하나 이상의 인간 항체로부터 유래된 나머지 부분을 포함하는 키메라 단일클론항체일 수 있다. TGF-β의 1개 초과 이소형을 대상으로 하는 항체는 단일클론항체 1D11.16의 인간 또는 인간화 형태일 수 있다. TGF-β 길항제는 인간 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3를 중화시키는 항체 또는 항체 단편일 수 있다.

TGF-β 길항제의 투여는 급성 심근 허혈의 발병 약 120시간, 약 80시간, 약 72시간, 약 48시간 또는 약 24시간 이내에 개시될 수 있다. 일부 예에서, TGF-β 길항제 투여는 급성 심근 허혈의 발병 약 12시간 이내에 개시된다. TGF-β 길항제 투여는 심근 경색증에 의해 영향 받는 조직의 상당한 대식세포 및 단핵구 침윤 전에 개시될 수 있다. 다른 예에서, TGF-β 길항제 투여는 심근경색증에 의해 영향 받은 조직의 중성구 침윤을 특징으로 하는 기간 중에 개시된다. 나아가, 일부 예에서, TGF-β 길항제 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 괴사를 특징으로 하는 기간 중에 개시된다.

발명은 또한 급성 심근경색증을 진단받은 환자에게 심근경색증의 급성기 중에 TGF-β의 바람직한 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 화합물, 예를 들어, 항염증제 및/또는 TNF-α의 길항제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 환자가 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있도록 의료용 및 수의과용으로 이용될 수 있다.

TGF-β 길항제와 관련하여, 일부 구현예에서 길항제는 인간 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3를 중화시키고, 항체의 항원결합 도메인을 포함하는 항체로서, 상기 항원결합 도메인은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하고, 상기 항원결합 도메인은 인간 VH1 패밀리 유전자를 이용하며, 상기 HCDR3는 서열번호 5, 서열번호 15 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고 있다. 인간 VH1 패밀리 유전자는 인간 VH1-2 유전자일 수 있고, 일부 구현예에서 이것은 DP-10 또는 DP-88 유전자일 수 있다. 항원 결합 도메인은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR 세트를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 상기 항원결합 도메인은 인간 Vκ3 패밀리 유전자를 이용하고, 상기 LCDR3는 서열번호 10, 서열번호 20 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고 있다. HCDR3 및 LCDR3은 (a) 각각 서열번호 5 및 서열번호 10; (b) 각각 서열번호 15 및 서열번호 20; 및 (c) 각각 서열번호 25 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 인간 Vκ3 패밀리 유전자는 인간 VK DPK22 유전자일 수 있다. VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 중쇄 골격 내에 포함될 수 있거나, VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 아미노산 서열로부터 12개까지의 돌연변이를 포함하는 골격 내에 있다. Vκ 도메인의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 생식계열 중쇄 골격 내에 포함될 수 있다. 일부 예에서, Vκ 도메인의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 생식계열 Vκ 아미노산 서열로부터 5개까지의 돌연변이를 포함하는 골격 내에 있을 수 있다.

TGF-β 길항제는 인간 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3를 중화시키고, 항체의 항원결합 도메인을 포함하는 항체로서, 상기 항원결합 도메인은 인간 VH DP-10 유전자 또는 인간 VH DP-88 유전자를 이용하고, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 FR4 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 항원결합 도메인은 인간 VH DP-10 유전자 또는 인간 VH DP-88 유전자를 이용할 수 있고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하며, 상기 HCDR3는 서열번호 5, 서열번호 15 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고 있고, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 FR4 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 항원결합 도메인은 인간 Vκ3 패밀리 유전자와 인간 Jκ5 유전자를 추가로 이용할 수 있다. 인간 Vκ3 패밀리 유전자와 인간 Jκ5 유전자를 이용하는 항원결합 도메인은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함할 수 있고, 이때 상기 LCDR3는 서열번호 10, 서열번호 20 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지고 있다.

일부 구현예에서, TGF-β 길항제는 인간 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3를 중화시키고, 항체의 항원결합 도메인을 포함하며, 이때 상기 항원결합 도메인은 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열번호 4의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열번호 5의 아미노산 서열의 HCDR3; (b) 서열번호 13의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열번호 15의 아미노산 서열의 HCDR3; 또는 (c) 서열번호 23의 아미노산 서열의 HCDR1, 서열번호 24의 아미노산 서열의 HCDR2, 서열번호 25의 아미노산 서열의 HCDR3를 포함한다. 항원결합 도메인은 항체 VL 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 항원결합 도메인은 (a) 서열번호 8의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열번호 9의 아미노산 서열의 LCDR2, 서열번호 10의 아미노산 서열의 LCDR3; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열번호 19의 아미노산 서열의 LCDR2, 서열번호 20의 아미노산 서열의 LCDR3; 및 (c) 서열번호 28의 아미노산 서열의 LCDR1, 서열번호 29의 아미노산 서열의 LCDR2, 서열번호 30의 아미노산 서열의 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR을 포함할 수 있다. 일부 예에서, VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 중쇄 골격, 예를 들어, 인간 VH1 패밀리 골격 내에 포함될 수 있다. VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 인간 중쇄 골격 VH1 DP-10 또는 DP-88 내에 있을 수 있다. VL 도메인의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 생식계열 경쇄 골격 내에 있을 수 있다. 생식계열 경쇄 골격은 인간 Vκ3 패밀리 골격일 수 있다. 항원결합 도메인은 인간 Jκ5 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 인간 Vκ3 패밀리 유전자는 Vκ DPK22 유전자일 수 있다.

일부 변형에서, TGF-β 길항제는 5개까지의 돌연변이가 있는 PET1073G12 VH 도메인(서열번호 2) 또는 이의 항원결합 부분을 포함하는 항체일 수 있다. TGF-β 길항제는 5개까지의 돌연변이가 있는 PET1074B9 VH 도메인(서열번호 12) 또는 이의 항원결합 부분을 포함하는 항체일 수 있다. TGF-β 길항제는 5개까지의 돌연변이가 있는 PET1287A10 VH 도메인(서열번호 22) 또는 이의 항원결합 부분을 포함하는 항체일 수 있다. TGF-β 길항제는 5개까지의 돌연변이가 있는 PET1073G12 VL 도메인(서열번호 7) 또는 이의 항원결합 부분을 포함하는 항체일 수 있다. TGF-β 길항제는 5개까지의 돌연변이가 있는 PET1074B9 VL 도메인(서열번호 17) 또는 이의 항원결합 부분을 포함하는 항체일 수 있다. TGF-β 길항제는 5개까지의 돌연변이가 있는 PET1287A10 VL 도메인(서열번호 27) 또는 이의 항원결합 부분을 포함하는 항체일 수 있다. TGF-β 길항제는 PET 1073G12 VH 도메인(서열번호 2) 및 PET 1073G12 VL 도메인(서열번호 7)을 포함하는 항체일 수 있다. TGF-β 길항제는 PET 1074B9 VH 도메인(서열번호 12) 및 PET 1074B9 VL 도메인(서열번호 17)을 포함하는 항체일 수 있다. 대안적으로, TGF-β 길항제는 PET 1287A10 VH 도메인(서열번호 22) 및 PET 1287A10 VL 도메인(서열번호 27)을 포함하는 항체일 수 있다. 본원에 기술된 추가적인 변이형 또한 고려된다.

SEQ ID NO는 본 개시의 일부분을 형성하는 첨부된 서열목록에서 발견되는 서열을 나타낸다. 방법이 이의 특정 구현예와 관하여 상세하게 기술되었지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 본 개시 또는 다음과 같은 청구항의 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있고, 균등물이 이용될 수 있음이 명백할 것이다. 나아가, 다음과 같은 실시예는 본 발명의 양상의 예시로서 제시된 것으로 제한적으로 해석되어서는 안 된다.

실시예 1. 항체 정제

단일클론항체 1D11 및 GC 1008를 배양 상층액 또는 복수로부터 단백질 A-세파로오스 크로마토그래피에 의해 정제하였다(Goding, J Immunol Meth (1976) 42;17) (Pharmacia Fien Chemicals, Uppsala, Sweden). 단일클론항체 1D11 및 GC 1008의 감마(γ)1 하위 클래스 및 감마(γ)4 하위 클래스의 단백질 A에 대한 결합을 상업적으로 제조된 결합 완충액(BioRad, Richmond, 미국 캘리포니아 주)의 첨가로 향상시켰다. 단백질 A-세파로오스로부터 0.05 M 글리신-HCl과 0.15 M NaCl 완충액(pH 2.3)을 이용하여 항체를 용리시키고, PBS와 NaCl 완충액(pH 2.3)으로 밤새 투석시키고, PBS로 밤새 투석하여, 섭씨 -20도에 보관하였다. 상층액으로부터 정제된 감마(γ) 1 및 감마(γ) 4 하위 클래스의 항체를 농축하여, 단백질 A 크로마토그래피 전에 황산암모늄 침전(50%포화)에 의해 부분적으로 정제하였다.

실시예 2. 심장 허혈 재관류의 랫트 모델에서 TGF -β 억제제의 영향

12주령 내지 14주령의 암컷 루이스 랫트를 5개의 처리군으로 할당하였다. 0일차(D0), 모든 동물들은 심장 허혈 후 재관류 과정(I/R)을 거쳤다. 심장 허혈은 심장의 좌심실 위의 좌전하방 관상동맥을 60분간 일시적으로 결찰시켜 발생시켰다. 그런 다음, 결찰을 풀어 심장의 허혈 부분의 재관류를 허용했다. I/R 후 3일 또는 5일에 시작하여, 5mg/kg의 1D11 또는 대조군 물품(음성 대조군 항체 13C4 또는 비히클)을 정맥 내(IV) 주사에 의해 투여한 다음, 28일차까지 3일마다 재투여하였다.

위험 지역(AAR)을 분석하기 위하여, 황색 형광 색소로 표지한 15μm 지름의 마이크로스피어를, 좌하방 관상동맥의 일시적인 결찰을 풀어주기 직전에 심장의 좌심실에 주사하였다(D0). 마이크로스피어는 혈액 내에 균일하게 분포되어, 심장의 모세혈관 및 다른 기관과 조직에 박혔다. 심장 내의 위험 지역은 결찰 기간 동안 임의의 마이크로스피어(또는 혈액)을 받지 못한 심근 조직의 영역으로 정의되었다. 28일차, 동물을 이소플루란으로 가볍게 마취시키고, 심박수를 350 ± 50bpm으로 유지시켰다. 그런 다음, 국소 및 전체 심장 기능을 평가하기 위하여 장축면상에서 심장초음파검사를 수행하였다. 심장초음파검사 후, 동물을 과량의 펜토바비탈 나트륨으로 안락사시켰다. 그런 다음, 심장을 조직학적 분석을 위해 적출하였다.

위험 지역을 평가한 다음, 질적 스코어를 부여하였다. 적은 위험 지역(좌심실의 < 약 20%)을 가지고 있거나 또는 위험 지역이 없는 동물을 연구 분석에서 제외시켰다. 좌심실의 심장 섬유증을 조직학적으로 평가하고, 심장 무게를 이용하여, 섬유증 무게/전체 좌심실 무게의 백분율로 나타내었다. 그런 다음, 위험 지역에서 뒤벽 비후(PWT)와 비교한 앞벽 비후(AWT)를 평가하여 국소 심장 기능을 평가하였다. 벽 비후는 수축기의 벽 두께와 이완기의 벽 두께의 차이이다. 박출률(EF)과 분획 단축률(FS)을 평가하여 전체 기능도 평가하였다.

일일 시각적 임상 관찰내용은 연구 지속기간에 걸쳐 일반적이었다. 도 1에서, 비히클 및 음성 대조군 항체 13C4와 비교할 때, 1D11 투여는 좌심실의 섬유증의 백분율을 현저하게 감소시켰다. 1D11 처리를 I/R 3일 후(D3)[1D11-D3]에 시작하든, I/R 5일 후(D5)[1D11-D5]에 시작하든, 이러한 섬유증의 감소가 발생하였다. D5에 1D11 처리를 시작한 군은 대조군인 13C4 처리군과 비교하였을 때, 통계적인 유의성(P<0.05)에 도달하였다.

표 1에서 보는 바와 같이, I/R 후 4주차에 심장초음파검사에 의해 심장 기능 매개변수를 평가하였다. 박출률과 분획 단축률은 전체 심장 기능을 나타낸다. AWT, PWT 및 AWT/PWT(국소 벽운동 스코어)는 국소 심장 기능을 나타낸다. 정상적인 설치류에서, AWT는 대략 PWT와 동일하고, PWT보다 클 수 있다. 그렇다면, 본 발명자들이 국소 벽운동 스코어라 한 AWT/PWT 비율은 정상 동물에서 ≥1이 된다. 표 1에서, 정상 동물군은 PWT보다 큰 AWT를 나타내어, 국소 벽운동 스코어(AWT/PWT)가 1.7 ± 0.2였다.

4주 심장초음파검사 결과
	비히클	1 D11 - D3	1 D11 - D5	13 C4	정상
박출률(%)	61.3±3.4	57.1±2.9	59.9±3.8	66.3±2.7	83.9±0.7
분획 단축률(%)	27.7±2.0	24.9±1.7	27.1±2.3	30.9±2.0	45.9±0.7
AWT(cm)	0.04±0.01	0.06±0.01	0.07±0.13	0.07±0.01	0.12±0.004
PWT(cm)	0.097±0.01	0.08±0.01+	0.07±0.01+	0.1±0.01	0.09±0.004
AWT/PWT	0.51±0.2	0.91±0.20	1.01±0.15	0.7±0.1	1.7±0.2

+ 13C4 대비 p<0.05

I/R 후 4주차에, I/R을 거친 모든 군의 심장 기능은 정상 동물군에서 관찰된 것보다 적었다. AWT와 PWT는 1D11-D3 및 1D11-D5 군(표 1 및 도 2)과 비슷하였고, 국소 벽운동 스코어는 1D11-D3 및 1D11-D5 군 각각에서 0.91 ± 0.2 및 1.01 ± 0.15였다(표 1 및 도 3). 국소 벽운동 스코어는 정상 동물의 ≥1의 값과 비교하였을 때, 국소적 기능의 최소한의 장애와 모순이 없음이 추가로 밝혀졌다. 이와 대조적으로, AWT는 음성 대조군 13C4군 및 비히클 군에서 PWT보다 현저히 낮게 나타났고(표 1 및 도 2), 13C4군 및 비히클 군 각각에서 국소 벽운동 스코어가 0.7 ± 0.1 및 0.51 ± 0.2여서, 1D11 처리군 및 정상 동물과 비교하였을 때, 상당한 장애와 모순이 없었다. 특히, 1D11 처리군에서의 국소 심장 기능 장애의 상대적인 결여는 비히클 군 및 음성 대조군 항체 13C4군과 비교하였을 때, 이들 군들에서 관찰된 섬유증의 감소와 일치하였다.

1D11 처리군의 국소 기능은 비히클 군 및 13C4군과 비교하여 향상되었지만, 박출률과 분획 단축률은 이들 군 간에 비슷하였다. 이는 13C4군과 비히클 군에서 경색되지 않은 좌심실의 기능 보상이 원인일 가능성이 높다. 이들 군에서 관찰된, 비대와 잘 맞는 PWT의 증가는 이러한 해석과 일치한다. 이 실시예는 I/R 후 3일 또는 5일차에 TGF-β 길항작용의 개시가 경색 및 향상된 심장 기능의 섬유증 감소를 초래하는지 여부를 평가할 수 있게 하였다. 비히클 군 및 13C4 처리군과 비교하였을 때, 1D11 처리군 모두의 좌심실에서 섬유증의 백분율에 눈에 띄는 감소가 있었다. 1D11-D3군과 1D11-D5군의 섬유증 수준은 비슷하였지만, 1D11-D5군은 음성 대조군 13C4군과 비교하여 통계적인 유의성에 도달하였다(p<0.05). 심근경색증 후 섬유증의 발달은 TGF-β의 상향 조절, smad 경로를 통한 TGF-β 신호저달 및 TGF-β 조절된 유전자와 관련이 있다는 점이 심근경색증 모델에서 밝혀졌다. 설치류 심장 I/R 모델에서 1D11의 투여는 I/R 후 TGF-β의 상향 조절 및 섬유증과 관련된 콜라겐 3 및 피브로넥틴을 포함한 TGF-β 관련된 유전자를 둔화시킨다. 1D11 투여로 관찰된 섬유증의 감소는 이러한 모델에서 1D11의 TGF-β 매개성 섬유증의 둔화와 일치한다.

1D11 처리군에서의 섬유증 감소는 심장 국소 기능의 최소한의 장애에 해당한 반면, 음성 대조군, 13C4 및 비히클 군은 국소 기능의 현저한 장애를 나타냈다. AWT, PWT, 및 국소 벽운동 스코어는 1D11-D3 및 1D11-5군 모두에서 비슷하였다. 이는 1D11 처리 동물에서의 섬유증 감소가 심근경색증 후 국소적인 심장 기능 절약의 원인이 되는, 심근 절약 또는 구조를 가져 왔음을 시사한다. 1D11 처리군은 13C4군 및 비히클 군과 비교하여 향상된 국소 기능을 나타냈지만, 박출률과 분획 단축률은 군별로 비슷하였다. 이는 13C4군 및 비히클 군에서 국소 기능의 장애를 기능적으로 보상하는 심장의 능력과 일치한다. 이번 연구의 종점은 I/R 후 28일이었다. 13C4군 및 비히클 군에서의 보상은 이러한 모델에서 오랜 기간 동안 유지되지 않으며, 1D11, 13C4 및 비히클 처리된 동물들 사이의 전체적 기능의 차이는 오랜 기간에 걸쳐 분명해질 수 있다.

I/R 후 3일 또는 5일에 시작하는 1D11 매개성 TGF-β 길항작용은 1D11-D5군에서 유의성에 도달하는 심장 섬유증의 감소를 초래하였다. 섬유증 감소는 음성 대조군 항체, 13C4, 또는 비히클을 받은 동물들과 비교할 때, 향상된 국소 심장 기능에 해당하며, 1D11 처리된 동물들에서 심근 절약 또는 구조를 시사하였다.

실시예 3. 심장 허혈 재관류의 랫트 모델에서 TGF -β 억제제 투여 시기의 영향

TGF-β 억제제 항체인 1D11의 상이한 투여 시간이 심장 허혈 후 재관류(I/R)의 랫트 모델에서 심근 섬유증에 미치는 영향을 관찰하였다. 1D11 투여는 심장 I/R 후 0일, 1일 또는 5일에 개시되었다. 심근 섬유증 감소의 효과는 심장초음파검사에 의해 측정한 바와 같이 향상된 심장 기능을 가져 왔다.

12주령 내지 14주령의 암컷 루이스 랫트를 일곱 개의 상이한 처리군으로 할당하였다. 모든 동물들은 심장 허혈 후 재관류 과정(I/R)을 거쳤다. 심장 허혈은 심장의 좌심실 위의 좌전하방 관상동맥을 60분간 일시적으로 결찰시켜 발생시켰다. 그런 다음, 결찰을 풀어 심장의 허혈 부분의 재관류를 허용했다. I/R 후 0일(재관류 후 2시간), 1일 또는 5일에 시작하여, 5mg/kg의 1D11 또는 대조군 물품(음성 대조군 항체 13C4 또는 비히클)을 정맥 내(IV) 주사에 의해 투여한 다음, 28일차까지 3일마다 재투여하였다.

위험 지역을 분석하기 위하여, 15μm 지름의 마이크로스피어를 황색 형광 색소로 표지하고, 이후 심장의 좌심실에 주사하였다. 이를 좌하방 관상동맥의 일시적인 결찰을 풀어주기 직전에 하였다. 마이크로스피어는 혈액 내에 균일하게 분포되어, 심장의 모세혈관 및 다른 기관과 조직에 박혔다. 심장 내의 위험 지역은 결찰 기간 동안 임의의 마이크로스피어(또는 혈액)을 받지 못한 심근 조직의 영역으로 정의되었다.

28일차, 동물을 이소플루란으로 가볍게 마취시키고, 심박수를 350 ± 50bpm으로 유지시켰다. 그런 다음, 국소 및 전체 심장 기능을 평가하기 위하여 장축면상에서 심장초음파검사를 수행하였다. 심장초음파검사 후, 동물을 과량의 펜토바비탈 나트륨으로 안락사시켰다. 그런 다음, 심장을 적출하여, 무게를 잰 다음, 조직학적 분석을 위해 처리하였다. 위험 지역에 질적 스코어를 부여하였다. 적은 위험 지역(좌심실의 < 약 20%)을 가지고 있거나 또는 위험 지역이 없는 동물을 연구 분석에서 제외시켰다.

좌심실의 심장 섬유증을 조직학적으로 평가하고, 심장 무게를 이용하여, 섬유증 무게/전체 좌심실 무게의 백분율로 나타내었다. 위험 지역에서 뒤벽 비후(PWT)와 비교한 앞벽 비후(AWT)를 평가하여 국소 심장 기능을 평가하였다. 벽 비후는 수축기의 벽 두께와 이완기의 벽 두께의 차이이다. 박출률(EF)과 분획 단축률(FS)을 평가하여 전체 기능을 평가하였다.

비히클 군 및 음성 대조군 항체인 13C4 처리군과 비교할 때, 0일 또는 5일에 시작하는 1D11 투여는 좌심실에서 섬유증의 백분율을 현저하게 감소시켰다(도 4). D1에 시작하는 1D11투여는 대응되는 13C4군 또는 비히클 대조군과 비교할 때, 섬유증의 감소 경향을 나타냈다.

표 2는 I/R 후 4주차에 심장초음파검사에 의해 평가한 심장 기능 매개변수를 나타낸다. 박출률과 분획 단축률은 전체 심장 기능을 나타낸다. AWT, PWT 및 AWT/PWT(국소 벽운동 스코어)는 국소 심장 기능을 나타낸다. 정상적인 설치류에서, AWT는 대략 PWT와 동일하고, PWT보다 클 수 있다. 그렇다면, 본 발명자들이 국소 벽운동 스코어라 한 AWT/PWT 비율은 정상 동물에서 ≥1이 된다. 표 2에서, 정상 동물군은 PWT보다 큰 AWT를 나타내어, 국소 벽운동 스코어(AWT/PWT)가 1.7 ± 0.2였다.

4주 심장초음파검사 결과
	EF (%)	FS (%)	AWT( cm )	PWT( cm )	AWT / PWT
비히클	50.5 ±2.6	21.1 ±1.4	0.03 ±0.01	0.06 ±0.01$	0.6 ±0.13+
1 D11 - D0	51.2 ±2.9	21.5 ±1.5	0.06 ±0.01^*+	0.04 ±0.01^*	1.38 ±0.2^*
1 D11 - D1	52.3 ±3.3	22.3 ±1.9	0.05 ±0.01^*	0.07 ±0.01$	0.79 ±0.1
1 D11 - D5	59.2 ±2.7^*	26.1 ±1.7^*	0.06 ±0.01^*+	0.06 ±0.01	0.92 ±0.18
13 C4 - D0	48.4 ±1.1	19.8 ±0.6	0.04 ±0.01	0.06 ±0.01$	0.52 ±0.08
13 C4 - D1	53.0 ±2.9	22.5 ±1.6	0.04 ±0.01	0.06 ±0.01	0.58 ±0.19
13 C4 - D5	52.9 ±2.3	22.3 ±1.2	0.04 ±0.01	0.08 ±0.01$	0.54 ±0.12
정상	83.9 ±0.7	45.9 ±0.7	0.12 ±0.004	0.09 ±0.004	1.7 ±0.2

* 비히클군 대비 p<0.05, + 13C4 대비 p<0.05, $ AWT 대 PWT p<0.05

I/R 후 4주차에, I/R을 거친 모든 군의 심장 기능은 정상 동물군에서 관찰된 것보다 적었다. AWT와 PWT는 1D11-D0, 1D11-D3 및 1D11-D5 군과 비슷하였다(표 2 및 도 5). 국소 벽운동 스코어는 1D11-D0, 1D11-D1 및 1D11-D5 군 각각에서 1.38 ± 0.2, 0.79 ± 0.1 및 0.92 ± 0.18이었다(표 2 및 도 3). 국소 벽운동 스코어는 정상 동물의 ≥1의 값과 비교하였을 때, 국소적 기능의 최소한의 장애와 모순이 없었다. 이와 대조적으로, AWT는 음성 대조군 13C4군 및 비히클 군에서 PWT보다 현저히 낮게 나타났다(표 2 및 도 5). 국소 벽운동 스코어는 13C4-D0군, 13C4-D1군, 13C4-D5군 및 비히클 군 각각에서 0.52 ± 0.08, 0.58 ± 0.19, 0.54 ± 0.12 및 0.6 ± 0.13이었으며(표 2 및 도 6), 1D11 처리군 및 정상 동물과 비교하였을 때, 상당한 장애와 모순이 없었다. 1D11 처리군에서의 국소 심장 기능 장애의 상대적인 결여는 비히클 군 및 대응되는 음성 대조군 항체 13C4군과 비교하였을 때, 이들 군에서 관찰된 섬유증의 감소와 일치하였다.

1D11-D5 처리군은 또한 비히클 대조군과 비교하였을 때, 박출률과 분획 단축률이라는 전체 심장 기능 매개변수의 상당한 향상을 나타내었으며(표 2), 이는 섬유증 및 국소 심장 기능 평가결과와 일치한다. 그러나, 다른 1D11 처리군은 비히클 군 및 대응하는 13C4군과 비교하여 전체 기능의 변화를 나타내지 않았다. 1D11 처리된 동물에서, 전체 심장 기능의 상당한 향상 없이 국소 기능 장애의 상대적인 결여와 함께 섬유증의 감소 또한 이전 연구에서 관찰되었으며, 이는 대응되는 13C4군 및 비히클 군에서 경색되지 않은 좌심실의 기능 보상이 원인일 가능성이 높고, 이러한 좌심실의 기능 보상이 이 시점에서 군별 변화를 검출하기 어렵게 한다. 이들 군에서 관찰된, 비대와 모순되지 않는, PWT 증가는 이러한 해석과 일치한다.

이 실시예는 동물이 심장 허혈 후 재관류를 거치는 심근경색증의 랫트 모델에서, 심근경색 후 상이한 시점에서 시작하는 항-TGF-β 항체, 1D11의 생체활성을 비교하였다. TGF-β는 D0, D1 및 D5에서의 회복 반응에 상이한 역할을 하고, 이렇게 다른 시점에서 시작하는 TGF-β 길항작용은 차별적인 반응을 초래할 수 있다. 1D11-D1군은 섬유증 감소 및 심장 기능의 향상 경향을 나타냈다.

I/R 후 0일, 1일, 또는 5일에 시작하는 1D11 매개성 TGF-β 길항작용은, 비히클 군 및 대응하는 13C4 대조 항체군과 비교할 때 1D11-D0군 및 1D11-D5군에서 유의성에 도달한, 심장 섬유증의 감소를 가져왔다. 1D11-D0군 및 1D11-D5군에서, 섬유증의 감소는 음성 대조군 항체인 13C4 또는 비히클을 받은 동물들과 비교할 때 유의미하게 향상된 국소 심장 기능뿐만 아니라, 1D11-D5군에서 비히클 대조군과 비교하여 유의미하게 향상된 전체 심장 기능과 부합한다. 이들 결과는 1D11 처리된 동물에서 심근의 절약 또는 구조를 시사한다.

실시예 4. 심근 허혈 후 심근 재형성의 설치류 모델에서 TGF -β 억제제 1 D11 의 영향

TGF-β 억제제인 1D11의 투여는 섬유증의 발달을 줄였고, 후속적으로 용량 의존적인 방식으로 심장 기능을 향상시켰다. 0일차, 좌하방관상동맥을 60분 동안 결찰시켰고(관상동맥 폐색 또는 CAO), 그런 다음 풀어주어 재관류를 허용하였다(관상동맥 재관류 또는 CAR). 5일차에, 비히클, 1D11 및 13C4(대조군 항체)를 IV로 투여하였고, 28일차(4주)에 희생시키기 전까지 매 3일마다 투여를 계속하였다. 좌심실 기능을 결정하기 위하여 CAR 후 2주 및 4주에 심장초음파검사를 하였다. CAR 후 4주차에, 압력-용적(PV) 혈류역학을 이용한 좌심실 기능을 직접적으로 측정하기 위해 말기 외과 수술을 하였다. 도부타민 스트레스 시험도 수행하였다. 상술한 절차를 모두 마친 후, 랫트를 안락사시키고, 병리학적 분석을 위해 허혈 지역과 비허혈 지역으로부터 심근 조직을 수집하였다. 아홉 마리 랫트로 이루어진 하위 집단을 경색 크기 평가를 위해 이용하였고, CAO/CAR 후 7일차에 안락사시켰다. 그런 다음, 심장을 관류시키고 염색하였다. 위험 영역과 경색 크기를 측정하여, 비히클 군과 1D11(25mg/kg)군을 비교하였다.

이러한 실시예의 결과는 비히클 군과 비교할 때, 1D11은 5mg/kg 용량에서 좌심실 흉터 용적을 유의미하게 감소시켰음을 보여준다. 흥미롭게도, 25mg/kg 용량에서, 좌심실 흉터 용적은 대조군과 비교할 때, 증가하였다(도 6). 조직학적 분석은 1D11을 5mg/kg 용량으로 처리하였을 때, 흉터 근처의 영역에서 세포 자멸의 유의미한 감소를 보여주었다. 25mg/kg의 1D11을 받은 군에서는 세포 자멸이 증가하였다(도 7). 모든 군에서 흉터 근처의 영역에서 심장 바깥막밑 간질 섬유화는 차이가 없었다(데이터 미도시).

전체 수축기 기능의 척도인 좌심실 박출률(LVEF)이 2주차와 4주차에 보고되었다(도 8). 비히클 처리 동물과 비교하였을 때, 4주차의 LVEF는 5mg/kg 용량의 1D11로 유의미하게 향상되었다. 그러나 25mg/kg의 1D11 처리는 EF의 유의미한 감소를 초래했다. 이것은 도 6에 보고된 흉터 용적 데이터와 일치한다. 2주에서 4주까지 1D11 5mg/kg 군에서 LVEF의 백분율 변화에 유의미한 향상이 있었다(도 9).

이완기 기능의 척도인 좌심실 등용성 이완기(IVRT) 또한 대조군 및 높은 용량의 1D11과 비교하였을 때, 1D11 5mg/kg 군에서 유의미하게 향상되었다. 겉보기 수술 동물(sham animal)과 비교하였을 때, 이완기 기능의 명백한 정상화가 있었다(도 10). 앞벽에서의 비후 백분율로 나타낸 국소 벽운동은 비히클 군과 비교하여 1D11 5mg/kg 군에서 유의미한 향상을 나타냈다(도 11).

PV 혈류역학에 의해 평가한 이완기 기능의 척도인 좌심실 말단 이완기 혈압 용적 관계는, 데이터가 겉보기 수술 동물과 비슷한 경우인 1D11 5mg/kg 군에서 유의미한 향상을 나타냈다(도 12). 도부타민 스트레스 시험 결과, 1D11 5mg/kg 군에서 향상되는 경향이 있었다(데이터 미도시).

낮은 용량(5mg/kg)의 1D11은 분명하고 유의미한 유익한 효과를 나타냈다. 첫째, 4주차의 좌심실 흉터 용적이 가장 낮아, 경색으로부터 더 적은 잔여 손상이 있었음을 나타냈다. 둘째, 다른 군과 비교할 때, 흉터 근처의 영역에서 유의미하게 더 적은 세포 자멸이 있었다. 셋째, 좌심실 박출률로 평가된 좌심실 기능은 다른 군에서보다 이 군에서 유의미하게 높았으며, 이는 최고의 좌심실 기능 구조를 나타낸다. 마지막으로, 이 군은 좌심실 박출률에서 2주와 4주 사이에 향상을 나타냈다는 점에서 독특하였다. 4주차의 좌심실 말단 이완기 혈압-용적 관계 기울기는 이 군에서 가장 낮아, 감소된 좌심실 견고성 및 향상된 좌심실 이완기 기능을 나타냈다. 이는 이완기 기능의 심장초음파상 척도인 IVRT 결과를 확실하게 하였는데, 이 군이 4주차에서 이완기 기능의 보존을 증명한 유일한 것이었음을 보여주었다. 마취 및 카테터 삽입의 본질적인 문제들은 초음파 데이터와는 반대로 가변성 및 이 데이터에 대한 낮은 신뢰도의 원인이 되었지만, 도부타민 스트레스 시험은 심장 기능의 향상 경향을 보여주었다. 대조군 항체 실험은 비히클 처리 랫트와 큰 차이를 나타내지 않았다.

한편, 높은 용량의 1D11은 부정적인 영향을 나타냈다. 4주차의 흉터는 비히클 처리군을 포함한 다른 군보다 컸다. 인접 영역에는 세포 자멸이 더 많았다. 좌심실 기능을 좌심실 박출률로 평가하였을 때, 4주차에 다른 모든 군보다 더 낮았다. 따라서, 5mg/kg 용량의 1D11을 이용한 TGF-β 길항작용이 랫트의 심근경색증 후의 재형성의 부정적인 영향을 예방하는 데 효과적이었다. 좌심실 흉터 용적과 세포 자멸의 유의미한 감소는 이 모델에서 심장 수축기 및 이완기 기능의 향상과 일치했다. 그러나 높은 용량의 약물은 조직학적 및 기능적 종점에 반대되는, 부정적인 영향을 불러일으켰다.

실시예 5. 심근 허혈 후 재관류의 설치류 모델에서 TGF -β 억제제 1 D11 의 심근 보존에 미치는 영향

TGF-β 억제제인 1D11의 투여는 2가지 상이한 용량들에서 섬유증을 감소시키고, 심근을 보존하였으며, 심장 기능을 향상시켰다. 0일차, 좌하방 관상동맥을 60분 동안 결찰시킨 후 풀어주어 재관류를 허용하였다(I/R). 5일차에, 두 개의 상이한 용량들(1mg/kg 또는 5mg/kg)의 두 가지 상이한 1D11 제형들(제1 제형 및 제2 제형) 중 어느 하나, 비히클 및 13C4(음성 대조군 항체)를 IV로 투여하였고, 28일까지 매 3일마다 투여를 계속하였다.

위험 지역을 분석하기 위하여, 황색 형광 색소로 표지한 15μm 지름의 마이크로스피어를 심장의 좌심실에 주사하였다. 이를 좌하방 관상동맥의 일시적인 결찰을 풀어주기 직전에 하였다. 마이크로스피어는 혈액 내에 균일하게 분포되어, 심장의 모세혈관 및 다른 기관과 조직에 박혔다. 심장 내의 위험 지역은 결찰 기간 동안 임의의 마이크로스피어(또는 혈액)을 받지 못한 심근 조직의 영역으로 정의되었다.

28일차, 동물을 이소플루란으로 가볍게 마취시키고, 심박수를 350 ± 50bpm으로 유지시켰다. 그런 다음, 국소 심장 기능을 평가하기 위하여 장축면상에서 심장초음파검사를 수행하였다. 심장초음파검사 후, 동물을 과량의 펜토바비탈 나트륨으로 안락사시켰다. 그런 다음, 심장을 적출하여, 무게를 잰 다음, 조직학적 분석을 위해 처리하였다. 위험 지역을 심장 박편에서 계량 형태적으로 평가하였고, 심장 무게를 이용하여, 위험 지역 무게/전체 좌심실 무게의 백분율로 나타내었다. 적은 위험 지역(<20%)을 가지고 있거나 또는 위험 지역이 없는 동물을 연구 분석에서 제외시켰다.

좌심실의 심장 섬유증을 조직학적으로 평가하고, 심장 무게를 이용하여, 섬유증 무게/전체 좌심실 무게의 백분율로 나타내었다. 위험 지역에서 뒤벽 비후(PWT)와 비교한 앞벽 비후(AWT)를 평가하여 국소 심장 기능을 평가하였다. 벽 비후는 수축기의 벽 두께와 이완기의 벽 두께의 차이이다.

이 실시예의 결과는 I/R 후 4주차에, 두 가지 상이한 제형들의 1mg/kg 및 5mg/kg 용량의 1D11이 13C4군 및 비히클 대조군과 비교하여 좌심실의 섬유증 백분율을 유의미하게 감소시켰음을 보여준다(도 14). 또한, 두 가지 제형들의 두 가지 1D11 용량들은 모두 13C4군 및 비히클 대조군과 비교하여 위험 지역에서 섬유증 백분율을 유의미하게 감소시켰다(도 15). 중요하게도, 두 가지 제형들의 두 가지 1D11 용량들은 대조군과 비교하여 위험 지역에서 심근의 백분율을 유의미하게 증가시켰다(도 16). 이 결과는 I/R 후 1D11 처리가 섬유증을 감소시킬 뿐만 아니라, 위험 지역에서 심근을 보존하였음을 나타낸다.

I/R 후 4주차에, 국소 벽운동 스코어(AWT/PWT)로 표현된 심장 기능은 13C4군 및 비히클 대조군과 비교하여 모든 1D11 처리군(두 제형의 1mg/kg 및 5mg/kg 용량)에서 더 적은 손상을 나타냈다(도 17).

이번 실시예는 TGF-β 길항제 항체인 1D11의 두 가지 용량들(1mg/kg 및 5mg/kg)과 두 가지 상이한 제형들에서의 생체활성을 평가하였으며, 심근 허혈 후 재관류 이후 5일에 개시하였다. 두 가지 제형으로부터 1mg/kg과 5mg/kg의 1D11 용량들 둘 다는 모두 음성 대조군과 비교하여 섬유증을 유의미하게 감소시켰으며, 더욱 중요하게는, 위험 지역에서 심근을 보존하였다. 이러한 향상과 일치되게, 국소 심장 기능 또한 음성 대조군과 비교하여 향상되었다.

실시예 6. 심근 허혈 후 재관류의 설치류 모델에서 TGF -β 억제제 1 D11 의 TGF-β 및 관련 유전자의 심장 발현에 미치는 영향

TGF-β 억제제인 1D11의 투여는 TGF-β 및 관련된 유전자의 심장 발현을 감소시켜, 이전 실시예에서 관찰된 바와 같은 심근 재형성, 심근 보존 및 심근 기능에 미치는 그 영향들과 일치하였다. 0일차, 좌하방 관상동맥을 60분 동안 결찰시킨 후 풀어주어 재관류를 허용하였다(I/R). 3일차에, 두 개의 상이한 용량들(5mg/kg 또는 50mg/kg)의 1D11을 IV로 투여하였고, 5mg/kg 1D11을 받은 동물들의 경우, 7일차 또는 12일차까지, 또는 50mg/kg 1D11을 받은 동물들의 경우 12일까지 3일마다 투여를 계속하였다. I/R을 거친 다른 군의 동물들은 어떠한 처리도 받지 않았다.

연구 군에 따라, 7일차 또는 12일차에, 동물을 과량의 펜코바비탈 나트륨으로 안락사시켰다. 혈액을 혈청 분리기 튜부로 수집하고, 각각 1D11 ELISA 또는 오스테오폰틴 ELISA를 이용한 1D11 및 오스테오폰틴(섬유증 감소에 대한 1D11의 영향의 잠재적인 혈청 바이오마커) 수준의 분석을 위해 혈청을 수집하였다. 그런 다음, 심장을 적출하고, 심방과 우심실을 제거하고, 좌심실을 위험 지역(좌하방 관상동맥의 결찰 기간 중에 혈액을 받지 못한 심장 지역)의 중심부 사이로 세로로 절개하였다. 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR)으로 TGF-β 및 관련된 유전자 발현 분석을 위해 심실의 절반을 급속 냉동시켰다. RT-PCR 분석을 위해, 심실의 이 부분은 위험 지역을 포함한 심첨부 부분과 허혈의 대상이 되지 않았던 기저부로 더 세분하였다. 심실의 나머지 절반은 나중에 분석하기 위하여 포르말린에 고정시켰다. 정상적인 랫트들로 이루어진 군을 과량의 펜토바비탈 나트륨으로 안락사시키고, 위에서 기술한 바와 같이 혈청 및 심장 채취의 대상으로 하였다.

1D11을 받은 동물들은 혈청에서 1D11을 나타냈지만, 1D11을 받지 못한 I/R군은 혈청에서 검출할 수 있는 1D11을 가지고 있지 않았다(도 18). 5mg/kg 1D11을 받은 동물 중, 7일차에 안락사한 동물은 12일차에 안락사한 동물에서 관찰된 1D11 혈청 수준보다 높은 1D11 혈청 수준을 가지고 있었다. 7일차에 안락사한 동물들은 1D11을 마지막으로 투여하고 하루 후에 혈청을 채취했지만, 12일차에 안락사한 동물들은 1D11을 마지막으로 투여하고 3일 후에 혈청을 채취하였으므로, 이는 예상했던 것이었다. 50mg/kg 1D11 용량을 받고, 12일차에 안락사한 동물에서의 혈청 1D11 수준은 5mg/kg 1D11을 받고, 같은 날에 안락사한 동물의 혈청 1D11 수준의 대략 1.5배였다. 용량과 비교한 1D11 혈청 수준의 비례성 부족은 고용량(50mg/kg)의 1D11을 받은 동물에서 1D11의 더 빠른 제거율이 원인일 수 있다. 이러한 데이터는 1D11의 정맥 내(IV) 전달이 순환에서의 용량 의존적인 1D11 수준으로 이어지며, 아마도 심장에의 1D11 노출로 이어짐을 나타낸다.

오스테오폰틴은 심장 I/R에서 섬유증의 1D11 매개성 조절의 잠재적인 혈청 마커이다. 혈청 오스테오폰틴 수준은 정상 동물, 어떠한 처리도 받지 않고 12일차에 안락사한 I/R 동물 및 두 번의 5mg/kg 용량의 1D11을 받고 7일차에 안락사한 I/R 동물에서 비슷하였다(도 19). 세 번의 5mg/kg 1D11 용량을 받고 12일차에 안락사한 I/R 동물, 또는 세 번의 50mg/kg 용량의 1D11을 받고 12일차에 안락사한 I/R 동물에서 오스테오폰틴 수준의 감소 경향이 있었다.

위험 지역을 포함한 좌심실의 심첨부와 허혈의 대상이 아니었던 좌심실의 기저부에서 TGF-β 및 관련 유전자들의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 좌심실의 기저부에서 평가된 모든 유전자들의 발현 수준은 정상 동물에서 관찰했던 것과 비슷하였다. 심장 유전자 발현을 기술한 나머지는 심실의 심첨부에서 관찰한 변화에 초점을 두고 있다.

모든 TGF-β 이소형인 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 심장 발현은 어떠한 처리도 받지 않고 12일차에 안락사한 I/R 동물에서 상승하였다. 정상 동물에 비해, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 발현은 각각 대략 2.3배, 5배 및 6배 증가하였다(도 20 내지 도 22). 5mg/kg의 1D11 투여는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 발현을 감소시켰다(도 20 내지 도 22). 세 차례의 5mg/kg 용량의 1D11을 받고 12일차에 안락사한 동물은 두 차례의 용량을 받고 7일차에 안락사한 동물과 비교하여, TGF-β1 및 TGF-β2의 발현이 크게 감소하였다(도 20 및 도 21). 두 차례 또는 세 차례의 5mg/kg 용량의 1D11을 받은 동물에서, TGF-β3 발현 감소는 비슷했다(도 22). 세 차례의 50mg/kg 1D11 용량을 받고 12일차에 안락사한 동물 또한 세 가지 TGF-β 이소형 모두의 발현에 있어서 감소를 나타냈다. 그러나 TGF-β1 및 TGF-β2 발현의 감소는 두 차례의 5mg/kg 용량의 1D11을 받고 7일차에 안락사한 동물에서 관찰된 것보다 다소 덜 강력하였다(도 19 내지 도 21). 이러한 결과는 1D11에 의한 모든 TGF-β 이소형 발현의 용량 의존적인 억제를 보여준다. 흥미롭게도, 더 높은 1D11 용량(50mg/kg)은 5mg/kg 용량과 비교하여 TGF-β 발현을 덜 억제하는 것으로 보였다.

콜라겐은 섬유증의 두드러진 성분으로 그 발현은 TGF-β에 의해 조절된다고 알려져 있다. 콜라겐 3의 심장 발현은 정상 동물과 비교하여 어떠한 치료도 받지 않은 I/R 동물에서 대략 14배 상승하였다. 5 mg/kg의 1D11 투여는 콜라겐 3의 발현을 감소시켰는데, 세 번의 1D11 용량을 받은 동물들은 두 번의 1D11 용량을 받은 동물에 비해 콜라겐 3 발현 감소가 더 컸다(도 23). 50 mg/kg 1D11을 받은 동물 또한 두 번의 5 mg/kg 1D11 용량을 받은 동물에서 관찰된 것과 비슷한 콜라겐 3 발현 감소를 나타냈다. I/R 후 심장 섬유증에서 1D11 매개성 감소와 일치하게, 1D11 매개성 용량 의존적인 심장 콜라겐 3 발현의 감소가 있었다. 1D11 매개성 TGF-β 발현의 억제와 마찬가지로, 더 높은 1D11 용량(50mg/kg)은 5mg/kg 용량과 비교하여 콜라겐 3를 덜 억제하는 것으로 보였다.

엔도텔린-1(ET-1)은 그 발현이 TGF-β에 의해 조절되는 강력한 혈관수축제이다. ET-1의 심장 발현은 정상 동물과 비교하여 어떠한 치료도 받지 않은 I/R 동물에서 대략 5.5배 증가하였다. 5 mg/kg 1D11 투여는 ET-1 발현을 감소시켰는데, 세 번의 1D11 용량을 받은 동물들은 두 번의 1D11 용량을 받은 동물에 비해 ET-1 발현 감소가 더 컸다(도 24). 세 차례의 5mg/kg 1D11 용량은 ET-1 발현을 거의 정상화하였다. 50 mg/kg 1D11을 받은 동물 또한 두 번의 5 mg/kg 1D11 용량을 받은 동물에서 관찰된 것과 비슷한 ET-1 발현 감소를 나타냈다. I/R 후 1D11 매개성 ET-1 발현 억제는 손상된 심근에서 향상된 관류의 원인일 수 있고, 심근 보존과 I/R 후 감소된 재형성의 원인일 수 있다. 흥미롭게도, 50mg/kg 1D11은 5mg/kg 용량과 비교하여 ET-1 발현을 덜 억제했던 것으로 보였다.

플라스미노겐 활성인자 억제제-1(PAI-1)은 조직 유형 플라스미노겐 활성인자의 주요한 억제제로서 TGF-β에 의해 조절된다. PAI-1의 상승된 수준은 증가된 죽상혈관 사건 및 혈관 질환과 관련이 있었다. PAI-1의 심장 발현은 정상 동물과 비교하여 어떠한 치료도 받지 않은 I/R 동물에서 대략 6배 증가하였다. 5 mg/kg 1D11 투여는 PAI-1 발현을 감소시켰는데, 세 번의 1D11 용량을 받은 동물들은 두 번의 1D11 용량을 받은 동물에 비해 PAI-1 발현 감소가 더 컸다(도 25). 50mg/kg 1D11을 받은 동물들은 PAI-1 발현에서 미미한 감소를 나타냈다. I/R 후 1D11 매개성 PAI-1 발현 감소는 재형성 향상과 심근 보존의 원인이 되었을 가능성이 높다. 50mg/kg 1D11 용량은 5mg/kg 용량과 비교하여 PAI-1 발현을 낮추는 데 훨씬 덜 강력한 효과를 나타내는 것으로 보였다.

최근, 내피세포-중간엽세포로의 이환이 심장 섬유증의 원인이 될 수 있음을 알게 되었다. 전사인자 스네일1과 스네일2(Slug)가 내피세포-중간엽세포로의 이환에 관여하며, 이들 전사인자는 TGF-β에 의해 유도된다. 스네일1과 스네일2의 심장 발현은 정상 동물과 비교하여 어떠한 치료도 받지 않은 I/R 동물에서 각각 대략 4배와 3배 증가하였다. 5 mg/kg 1D11 투여는 스네일1과 스네일2 모두의 발현을 감소시켰는데, 세 번의 1D11 용량을 받은 동물들은 두 번의 1D11 용량을 받은 동물에 비해 스네일1과 스네일2 발현 감소가 훨씬 더 컸다(도 26 및 도 27). 세 차례의 5mg/kg 1D11 용량은 스네일2 발현을 명백히 정상화하였다. 50 mg/kg 1D11을 받은 동물 또한 두 번의 5 mg/kg 1D11 용량을 받은 동물에서 관찰된 것과 비슷한 스네일1과 스네일2 발현 감소를 나타냈다. I/R 후 스네일1과 스네일2의 증가된 발현은 내피세포-중간엽세포로의 이환이 I/R에 대한 회복 반응에서 심장 섬유증의 원인이 됨을 강력하게 시사한다. I/R 후의 1D11 매개성 스네일1과 스네일2 발현의 감소는 관찰된 심장 섬유증의 감소 및 재형성 향상에 대해 원인이 되는 메커니즘일 수 있다. 흥미롭게도, 50mg/kg 1D11 용량은 5mg/kg 용량과 비교하여 스네일1과 스네일2 발현을 감소시키는 데 덜 강력한 효과를 나타내는 것으로 보였다.

내피세포-중간엽세포로의 이환에서 관찰되는 중간엽세포의 마커 α-평활근 액틴(α-SMA). 심장 발현 α-SMA는 정상 동물과 비교하여 어떠한 치료도 받지 않은 I/R 동물에서 대략 4배 상승하였다. 5 mg/kg 1D11 투여는 α-SMA 발현을 감소시켰는데, 세 번의 1D11 용량을 받은 동물들은 두 번의 1D11 용량을 받은 동물에 비해 α-SMA 발현 감소가 훨씬 더 컸다(도 28). 50 mg/kg 1D11을 받은 동물 또한 두 번의 5 mg/kg 1D11 용량을 받은 동물에서 관찰된 것과 비슷한 α-SMA 발현 감소를 나타냈다. I/R 후 1D11 매개성 스네일1 및 스네일2 감소와 일치하게, 1D11은 α-SMA 발현을 감소시켰다. 50mg/kg 1D11 용량은 5mg/kg 용량과 비교하여 α-SMA 발현을 감소시키는 데 덜 강력한 효과를 나타내는 것으로 보였다.

피브로넥틴은 내피세포-중간엽세포로의 이환의 마커로 여겨지고 있으며, 마커 내피세포-중간엽세포로의 이환일 가능성이 크다. 심장 발현 피브로넥틴은 정상 동물과 비교하여 어떠한 치료도 받지 않은 I/R 동물에서 대략 16배 증가하였다. 5 mg/kg 1D11 투여는 피브로넥틴 발현을 감소시켰는데, 세 번의 1D11 용량을 받은 동물들은 두 번의 1D11 용량을 받은 동물에 비해 피브로넥틴 발현 감소가 훨씬 더 컸다(도 29). 50 mg/kg 1D11을 받은 동물 또한 두 번의 5 mg/kg 1D11 용량을 받은 동물에서 관찰된 것과 비슷한 피브로넥틴 발현 감소를 나타냈다. 1D11 매개성 피브로넥틴의 감소는 내피세포-중간엽세포로의 이환 마커인 스네일1, 스네일2 및 α-SMA의 1D11 매개성 감소와 모순되지 않았다. 50mg/kg 1D11 용량은 5mg/kg 용량과 비교하여 피브로넥틴 발현을 감소시키는 데 덜 강력한 효과를 나타내는 것으로 보였다.

세포 자멸은 심장 재형성 중 심장 심근세포 소실의 원인이 된다. Bax는 잘 인식된 세포 자멸 촉진 유전자로서 심장 발현 Bax는 정상 동물과 비교하여 어떠한 치료도 받지 않은 I/R 동물에서 대략 1.8배 증가하였다. 5 mg/kg 1D11 투여는 Bax 발현을 감소시켰는데, 세 번의 1D11 용량을 받은 동물들은 두 번의 1D11 용량을 받은 동물에 비해 Bax 발현 감소가 컸다(도 30). 시료의 한계 때문에, 50 mg/kg 1D11를 받은 동물들의 심장은 Bax 발현에 대해 분석의 대상이 되지 못했다. 1D11 매개성 Bax 발현의 감소는 5 mg/kg 1D11를 받은 I/R 동물의 심장에서 세포 자멸 감소가 있었고, 1mg/kg 및 5mg/kg 1D11을 받은 I/R 동물에서 심근 보존이 증가되었던 이전 실시예의 관찰 결과와 일치한다.

본 실시예에 기술된 결과는 TGF-β 길항제(예컨대, 항-TGF-β 항체)의 IV 투여가 1D11의 용량 의존적인 순환 수준을 가져오며, 아마도 심장에의 노출로 이어진다는 점을 보여준다. 오스테오폰틴의 혈청 수준은 1D11 매개성 심장 섬유증 감소의 마커일 수 있다. TGF-β 및 관련된 유전자들은 I/R에서 유도되고, 심장 섬유증과 I/R 후에 일어나는 재형성의 추진 요인이다. I/R 후의 TGF-β 길항체 항체인 1D11 투여는 이러한 유전자들의 발현 감소를 매개하며, 이는 심장 섬유증의 감소, 심근 보존, 재형성 향상 및 1D11 처리에서 관찰되었던 심장 기능의 향상을 위한 메커니즘을 제공한다. 또한, 결과는 내피세포-중간엽세포로의 이환에 관여하는 유전자들이 I/R 후에 유도되었으며, 내피세포-중간엽세포로의 이환은 I/R 후 심장 섬유증의 원인이 될 수 있음을 보여주었다. 본 발명자들이 아는 바로는, 이것은 신규한 발견이다. I/R 후 1D11 처리는 이러한 유전자들을 하향 조절하였고, 내피세포-중간엽세포로의 이환이 I/R 후 심장 섬유증에 임의의 원인을 제공하는 것을 하향 조절하였다. 흥미롭게도, 5 mg/kg 1D11 용량은 50 mg/kg 1D11 용량과 비교하였을 때, I/R 후의 TGF-β 및 관련된 유전자들의 발현을 더욱 강력하게 감소시키는 것으로 보였다.

SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORPORATION <120> TREATMENT OF MYOCARDIAL INFARCTION USING TGF-β ANTAGONISTS <130> 0076524-000003 <150> US 61/379,315 <151> 2010-09-01 <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide sequence encoding PET1073G12 VH <400> 1 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcagt agcaatgtta tcagctgggt gcgccaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatggggggg gtcatcccta ttgttgatat tgcgaactac 180 gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccactag tacaacttac 240 atggagttga gcagcctgag gtctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcacactt 300 ggtctcgtcc tggatgctat ggactactgg ggtcagggta cgttggtcac cgtctcctca 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1073G12 VH <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser 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<220> <223> Synthetic Nucleotide sequence encoding PET1073G12 VL <400> 6 gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120 cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc gacttcactc tcaccatcag ccgactggag 240 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagtatgctg actcaccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1073G12 VL <400> 7 Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1073G12 LCDR1 <400> 8 Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1073G12 LCDR2 <400> 9 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1073G12 LCDR3 <400> 10 Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 11 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide sequence encoding PET1074B9 VH <400> 11 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcagt agcaatgtta tcagctgggt gcgccaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatggggggg gtcatcccta ttgttgatat tgcgaactac 180 gcacagagat tcaagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccactag tacaacttac 240 atggagttga gcagcctgag gtctgaggac acggccgtgt attactgtgc gctgccacgc 300 gctttcgtcc tggatgctat ggactactgg ggtcagggta cgttggtgac cgtctcctca 360 <210> 12 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 VH <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30 Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Pro Arg Ala Phe Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 HCDR1 <400> 13 Ser Asn Val Ile Ser 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 HCDR2 <400> 14 Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 HCDR3 <400> 15 Pro Arg Ala Phe Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide sequence encoding PET1074B9 VL <400> 16 gaaacggtac tcacgcagtc tccaggtacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtcttggc agcagctact tagcctggta tcagcagaaa 120 cctggtcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcacc tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctggtacc gacttcactc tcaccatcag ccgactggag 240 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagtatgctg actcaccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 VL <400> 17 Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 LCDR1 <400> 18 Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 LCDR2 <400> 19 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1074B9 LCDR3 <400> 20 Gln Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 21 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide sequence encoding PET1287A10 VH <400> 21 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaagtg 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc acctctttca tcaattgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttgatat aacaaactac 180 gcacagaaat ttcagagcag agtcactatt accgcggaca aatccacgag caccgcctac 240 atggagctga gcagcctgcg ctctgaggac acggctgtgt attactgcgc acgcggaaat 300 ggtaactacg ccctggatgc tatggactac tggggtcagg gtacgttggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 VH <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Ser 20 25 30 Phe Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Ile Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 HCDR1 <400> 23 Thr Ser Phe Ile Asn 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 HCDR2 <400> 24 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Ile Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ser <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 HCDR3 <400> 25 Gly Asn Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Nucleotide sequence encoding PET1287A10 VL <400> 26 gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact ttgcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccct 180 gacagattca gtggcagcgg gtctgggaca gatttcactc tcaccatcag ccgcctggag 240 cctgaagatt tcgcagttta ttactgtcag caatattatg atagtcccat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 VL <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asp Ser Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 LCDR1 <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 LCDR2 <400> 29 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of PET1287A10 LCDR3 <400> 30 Gln Gln Tyr Tyr Asp Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Amino acid sequence of FR4 <400> 31 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

Claims

심근경색증의 급성기 중에 환자에게 TGF-β 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 심근경색증의 부정적인 결과(adverse consequence)를 줄이는 방법.
제1항에 있어서,
심근경색증은 급성 심근경색증인, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근 허혈 발병의 120시간 이내에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근 허혈 발병의 약 72시간 이내에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근 허혈 발병의 약 48시간 이내에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근 허혈 발병의 약 24시간 이내에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근 허혈 발병의 약 12시간 이내에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 상당한 대식세포 및 단핵구 침윤 전에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 중성구 침윤을 특징으로 하는 기간 중에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제의 투여는 심근경색증에 의해 영향 받는 조직의 괴사를 특징으로 하는 기간 중에 시작되는, 방법.
제1항에 있어서,
환자는 인간 또는 비인간 포유동물인, 방법.
제1항에 있어서,
환자에서 심근경색증의 부정적인 결과를 줄이는 방법은 심근을 보존하는 방법인, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β 길항제는
i) 하나 이상의 TGF-β 이소형에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
ii) TGF-β 수용체 또는 이의 가용성 단편;
iii) 하나 이상의 TGF-β 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; 및
iv) 안티센스 또는 간섭 RNA 올리고뉴클레오타이드
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서,
TGF-β의 바람직한 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 화합물을 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제14항에 있어서,
TGF-β의 바람직한 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 화합물은 항염증제인, 방법.
제14항에 있어서,
TGF-β의 바람직한 기능을 선택적으로 복원할 수 있는 화합물은 TNF-α의 길항제인, 방법.
제1항에 있어서,
환자에게 ACE 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
ACE 억제제는 베나제프릴, 캅토프릴, 포시노프릴, 모엑시프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 트랜스도라프릴, 리시노프릴, 에날라프릴 및 람파릴로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서,
환자에게 안지오텐신 II 수용체 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제19항에 있어서,
안지오텐신 II 수용체 길항제는 에프로사르탄, 텔미사르탄, 로사르탄, 이르베사르탄, 올메사르탄, 칸데사르탄 및 발사르탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서,
환자에게 베타 아드레날린성 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
베타 아드레날린성 길항제는 알프레놀롤, 부신돌롤, 카르테올롤, 카르베디롤, 라베타롤, 나돌롤, 옥스프레놀롤, 펜부토롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 소타롤, 티모롤, 아테놀올, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 셀리프롤롤, 에스몰롤, 메토프롤롤 및 네비보롤로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제13항에 있어서,
상기 TGF-β 길항제는 하나 이상의 TGF-β 이소형에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편인, 방법.
제23항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 인간 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3를 중화하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1073G12 VH 도메인(서열번호 2) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1074B9 VH 도메인(서열번호 12) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1287A10 VH 도메인(서열번호 22) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1073G12 VL 도메인(서열번호 7) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1074B9 VL 도메인(서열번호 17) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 5개까지 돌연변이가 있는 PET1287A10 VL 도메인(서열번호 27) 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 PET 1073G12 VH 도메인(서열번호 2) 및 PET 1073G12 VL 도메인(서열번호 7)을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 PET 1074B9 VH 도메인(서열번호 12) 및 PET 1074B9 VL 도메인(서열번호 17)을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 PET 1287A10 VH 도메인(서열번호 22) 및 PET 1287A10 VL 도메인(서열번호 27)을 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 CDR들의 세트 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 포함하며, 상기 HCDR3는 서열번호 5, 서열번호 15 및 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고 있는, 방법.
제34항에 있어서,
VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 중쇄 골격 내에 있는, 방법.
제35항에 있어서,
VH 도메인의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 생식계열 아미노산 서열로부터 12개까지 돌연변이를 포함하는 골격 내에 있는, 방법.
제24항에 있어서,
상기 항체 또는 항체 단편은 CDR들의 세트 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3를 포함하며, 상기 LCDR3는 서열번호 10, 서열번호 20 및 서열번호 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고 있는, 방법.
제37항에 있어서,
상기 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 생식계열 중쇄 골격 내에 있는, 방법.
제38항에 있어서,
상기 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 생식계열 아미노산 서열로부터 5개까지 돌연변이를 포함하는 골격 내에 있는, 방법.
제24항에 있어서,
심근경색증의 급성기 중에 환자에게 TGF-β 길항제를 투여하는 단계는 환자 신체 질량 킬로그램당 약 1mg의 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제24항에 있어서,
심근경색증의 급성기 중에 환자에게 TGF-β 길항제를 투여하는 단계는 환자 신체 질량 킬로그램당 약 5mg의 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.