JP2017193543A - TGF−βアンタゴニストを使用する心筋梗塞の処置 - Google Patents
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Abstract
【課題】心筋梗塞、特に急性心筋梗塞に罹患した患者を処置する方法、又は患者において心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法の提供。
【解決手段】心筋梗塞の急性期の間に患者にTGF−βのアンタゴニストを投与するステップを含む、患者における心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法。心筋梗塞が急性心筋梗塞であり、TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋虚血の発生の120時間以内に開始され、TGF−βアンタゴニストが:i)TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;ii)TGF−β受容体又はその可溶性フラグメント;iii)1つ又はそれ以上のTGF−β受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;及びiv)アンチセンス又は干渉RNAオリゴヌクレオチドから選択される、方法。
【選択図】なし
【解決手段】心筋梗塞の急性期の間に患者にTGF−βのアンタゴニストを投与するステップを含む、患者における心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法。心筋梗塞が急性心筋梗塞であり、TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋虚血の発生の120時間以内に開始され、TGF−βアンタゴニストが:i)TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;ii)TGF−β受容体又はその可溶性フラグメント;iii)1つ又はそれ以上のTGF−β受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;及びiv)アンチセンス又は干渉RNAオリゴヌクレオチドから選択される、方法。
【選択図】なし
Description
背景
開示の分野
本開示は、心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法に関する。
開示の分野
本開示は、心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法に関する。
関連技術の説明
心疾患の問題及び健康上の影響は広範囲に及ぶ。心疾患は、米国において女性及び男性の両方について死亡原因の第一位である(非特許文献1)。米国では34秒毎に一人が心疾患で死亡する。2,500人より多くの米国人が毎日心疾患で死亡する。2005年には、652,091人の人々が心疾患で死亡した(それらの50.5%が女性)。これは全ての米国の死亡の27.1%であった。心疾患はアメリカ先住民及びアラスカ先住民、黒人、ヒスパニック、及び白人での死亡原因の第一位である。アジア人及び太平洋諸島系については、癌が死亡原因の第一位であり(全ての死亡の27.5%を占める)、心疾患はほとんど差のない第二位である(25.0%)。(非特許文献2)。毎年ほとんど6百万の入院(米国において)が心血管疾患に起因するものである。
心疾患の問題及び健康上の影響は広範囲に及ぶ。心疾患は、米国において女性及び男性の両方について死亡原因の第一位である(非特許文献1)。米国では34秒毎に一人が心疾患で死亡する。2,500人より多くの米国人が毎日心疾患で死亡する。2005年には、652,091人の人々が心疾患で死亡した(それらの50.5%が女性)。これは全ての米国の死亡の27.1%であった。心疾患はアメリカ先住民及びアラスカ先住民、黒人、ヒスパニック、及び白人での死亡原因の第一位である。アジア人及び太平洋諸島系については、癌が死亡原因の第一位であり(全ての死亡の27.5%を占める)、心疾患はほとんど差のない第二位である(25.0%)。(非特許文献2)。毎年ほとんど6百万の入院(米国において)が心血管疾患に起因するものである。
2009年には、心疾患は、健康管理サービス、薬物、及び生産性の損失を含めて3046億ドルを超える費用がかかったと見積もられている(非特許文献3)。世界中で、冠動脈心疾患により760万人が2005年に死亡した(非特許文献4)。2003年には成人の約37%が心疾患及び脳卒中に関する6つの危険因子(高血圧、高コレステロール、糖尿病、現在の喫煙、運動不足、及び肥満)のうちの2つ又はそれ以上を有すると報告した(非特許文献5)。
心筋梗塞(MI)は虚血により引き起こされる心臓組織の死である。「虚血」は、一般的に血管狭窄又は血流に対する局所的障害により生じる血液供給の局所的な欠乏を指す。以前に虚血下にあった組織又は心臓のような器官への血流の回復は「再灌流」と呼ばれる。
急性心筋梗塞(AMI)、又は「心臓発作」は、局在的な心筋虚血が明確な領域の組織死の発生を引き起こす場合に起きる。AMIは冠動脈における動脈硬化病変の破断により最も頻繁に引き起こされる。これは動脈を塞ぐ血栓の形成を引き起こし、その動脈が血液を供給する心臓領域への血液供給を止める。
重篤かつ長期の虚血は、心筋壁の厚さ全体にわたる壊死の領域を生じる。このような貫壁性の梗塞は通常、ST部分上昇を引き起こす。より低い重症度で持続性の虚血は、冠動脈閉塞の後に自発性の再潅流が起こる場合;梗塞に関連する動脈が完全に閉塞されていない場合;閉塞は完全であるが、既存の副行血液供給が完全な虚血を防ぐ場合;又は心筋の患部帯における酸素要求量が小さい場合に起こり得る。これらの状態下では、壊死部は主に心内膜下に限定され得、典型的には非ST部分上昇型MIを引き起こす。
梗塞心筋領域及び無影響の心筋領域の両方が、虚血事象の後に数時間、数日及び数週間にわたって進行性の変化を受ける。梗塞後の心筋のこの進展の過程は、最初の事象の後の予測可能な時点の特徴的な変化の発生をもたらす。急性虚血は、患部心筋における収縮性の即時の喪失、運動低下と呼ばれる状態を引き起こす。壊死は急性虚血の発生後約15〜30分で心内膜下で発生し始める。壊死領域は、次の3〜6時間で心外膜に向かって外側に増大し、最終的には心室壁全体に及ぶ。梗塞の縁では心筋は気絶し得(可逆的損傷)、
そして血流が回復した場合には最終的に回復する。生存可能なままである心筋における収縮性は増加する(運動亢進と呼ばれる過程)。
そして血流が回復した場合には最終的に回復する。生存可能なままである心筋における収縮性は増加する(運動亢進と呼ばれる過程)。
細胞の変化、組織の変化及び全体の変化の進行は梗塞内で発生する。梗塞組織の肉眼的外観の変化は、細胞死の開始後少なくとも6時間は明白でない。しかし、細胞生物化学及び超微細構造は20分以内に異常を示し始める。細胞損傷は進行性であり、約12時間の間に徐々に不可逆的になる。
細胞死の開始後4時間と12時間の間に、梗塞心筋は、細胞膨潤、小器官崩壊及びタンパク質変性を特徴とするプロセスである凝固壊死を受ける。約18時間後には、好中球(貪食性リンパ球)が梗塞に進入する。それらの数は約5日後にピークに達し、その後減少する。3〜4日後に、肉芽組織が梗塞部の縁に現れる。これはマクロファージ、線維芽細胞(瘢痕組織にある)、及び新しい毛細管からなる。梗塞心筋は4日と7日の間は特に柔らかく、従って最大限に破断しやすい。肉芽組織が数週間にわたって梗塞の中心部に向かって内側に移動するにつれて、壊死組織はマクロファージにより貪食され、そして消化される。次いで肉芽組織は、結合(瘢痕)組織の増加及び毛細管の喪失を伴って徐々に成熟する。2〜3ヶ月後には梗塞は治癒し、薄くて堅い、薄灰色の心室壁の非収縮領域が残る。
微視的な形態変化が時間とともに以下のように発生する:波状心筋線維が虚血発生の1〜3時間後に現れる。テトラゾリウム又は塩基性フクシン色素での異常の染色が虚血発生の2〜3時間後に現れる。横紋の喪失、収縮帯、浮腫、出血、及び初期の好中球浸潤を伴う凝固壊死が虚血発生の4〜12時間後に現れる。凝固壊死の継続、核濃縮、及び辺縁収縮帯が虚血発生の18〜24時間後には明らかである。重い好中球浸潤とともに核及び横紋(striations)の全損失が虚血発生の24〜72時間後に現れる。マクロファージ及び単核細胞浸潤、並びに線維血管性(fibrovascular)応答が虚血発生の3〜7日後に始まる。顕著な肉芽組織を伴う線維血管性応答は虚血発生後10〜21日後に明らかである。線維症は虚血事象後7週又はそれより早くに容易に見られるようになる。
合併症としては:不整脈及び伝導障害、梗塞の延長又は再梗塞、うっ血性心不全、心原性ショック、心膜炎、塞栓形成の可能性を伴う壁在血栓症、タンポナーデの可能性を伴う心筋壁断裂、弁閉鎖不全の可能性を伴う乳頭筋断裂、及び心室瘤形成が挙げられ得る。
Kung HC, Hoyert DL, Xu J, Murphy SL.Deaths: final data for 2005.National Vital Statistics Reports.2008;56(10)
CDC.Deaths: leading causes for 2004.National Vital Statistics Reports.2007;56(5)
American Heart Association.Heart Disease and Stroke Statistics−2009 Update.Dallas; AHA: 2009.Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.Circulation.2008 Dec 15.
World Health Organization.The Global Burden of Disease: 2004 Update.Geneva; WHO:2008.
Hayes DK, et al., Disparities in multiple risk factors for heart disease and stroke, 2003 MMW,.2005;54:113−116
要旨
心筋梗塞の急性期の間に患者にTGF−βのアンタゴニストを投与することを含む、患者において心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法が本明細書において開示される。いくつかの実施態様において、心筋梗塞は急性心筋梗塞である。TGF−βのアンタゴニストの投与は急性心筋虚血の発生の120時間以内に開始され得る。様々な実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、急性心筋虚血の発生の約72時間以内、約48時間以内、約24時間以内、又は約12時間以内に開始される。TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織のマクロファージ及び単核の実質的な浸潤の前に開始され得る。いくつかの実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の好中球の浸潤を特徴とする期間中に開始される。他の実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の壊死を特徴とする期間中に開始される。一般に、患者はヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
心筋梗塞の急性期の間に患者にTGF−βのアンタゴニストを投与することを含む、患者において心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法が本明細書において開示される。いくつかの実施態様において、心筋梗塞は急性心筋梗塞である。TGF−βのアンタゴニストの投与は急性心筋虚血の発生の120時間以内に開始され得る。様々な実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、急性心筋虚血の発生の約72時間以内、約48時間以内、約24時間以内、又は約12時間以内に開始される。TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織のマクロファージ及び単核の実質的な浸潤の前に開始され得る。いくつかの実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の好中球の浸潤を特徴とする期間中に開始される。他の実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の壊死を特徴とする期間中に開始される。一般に、患者はヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
いくつかの実施態様において、TGF−βアンタゴニストは、i)TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;ii)TGF−β受容体又はその可溶性フラグメント;iii)1つ又はそれ以上のTGF−β受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;及びiv)アンチセンス又は干渉RNAオリゴヌクレオチドからなる群より選択され得る。
いくつかの実施態様において、本方法は、TGF−βの望ましい機能を選択的に回復させることができる化合物を患者に投与することをさらに含む。例えば、TGF−βの望ましい機能を選択的に回復させることができる化合物は抗炎症薬、又はTNF−αのアンタゴニストであり得る。いくつかの実施態様において、本方法は、ACE阻害剤を患者に投与することをさらに含み得る。ACE阻害剤は、ベナゼプリル、カプトプリル、ホシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランスドラプリル(transdolapril)、リシノプリル、エナラプリル及びランパリル(ramparil)からなる群より選択され得る。他の実施態様において、本方法は、アンギオテンシンII受容体アンタゴニストを患者に投与することをさらに含み得る。アンギオテンシンII受容体アンタゴニストは、エプロサルタン、テルミサルタン、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、及びバルサルタンからなる群より選択され得る。
TGF−βアンタゴニストは、TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに特異的に結合し、かつヒトTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3の1つ又はそれ以上を中和し得る抗体又は抗体フラグメントであり得る。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、5個までの変異を有するPET1073G12 VHドメイン(配列番号2)、又はその抗原結合部分を含み得る。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、5個までの変異を有するPET1074B9 VHドメイン(配列番号12)、又はその抗原結合部分を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、5個までの変異を有するPET1287A10 VHドメイン(配列番号22)、又はその抗原結合部分を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、5個までの変異を有するPET1073G12 VLドメイン(配列番号7)、又はその抗原結合部分を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、5個までの変異を有するPET1074B9 VLドメイン(配列番号17)、又はその抗原結合部分を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、5個までの変異を有するPET1287A10 VLドメイン(配列番号27)、又はその抗原結合部分を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、PET 1073G12 VHドメイン(配列番号2)及びPET 1073G12 VLドメイン(配列番号7)を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、PET 1074B9 VHドメイン(配列番号12)及びPET 1
074B9 VLドメイン(配列番号17)を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、PET 1287A10 VHドメイン(配列番号22)及びPET 1287A10 VLドメイン(配列番号27)を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは一組のCDR(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)を含み、ここでこのHCDR3は、配列番号5、配列番号15及び配列番号25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列重鎖フレームワーク内にある。いくつかの実施態様において、VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列アミノ酸配列からの12個までの変異を含むフレームワーク内にある。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントはCDRのセット(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)を含み、ここでこのLCDR3は、配列番号10、配列番号20及び配列番号30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は生殖系列重鎖フレームワーク内にある。いくつかの実施態様において、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、生殖系列アミノ酸配列からの5個までの変異を含むフレームワーク内にある。
074B9 VLドメイン(配列番号17)を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、PET 1287A10 VHドメイン(配列番号22)及びPET 1287A10 VLドメイン(配列番号27)を含む。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは一組のCDR(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)を含み、ここでこのHCDR3は、配列番号5、配列番号15及び配列番号25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列重鎖フレームワーク内にある。いくつかの実施態様において、VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列アミノ酸配列からの12個までの変異を含むフレームワーク内にある。いくつかの実施態様において、抗体又は抗体フラグメントはCDRのセット(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)を含み、ここでこのLCDR3は、配列番号10、配列番号20及び配列番号30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は生殖系列重鎖フレームワーク内にある。いくつかの実施態様において、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、生殖系列アミノ酸配列からの5個までの変異を含むフレームワーク内にある。
詳細な説明
MI、又は心臓発作後に、心臓はそれ自身で修復し始める。この心臓の修復過程は重複している段階に分けることができる。第一の段階は炎症期として知られる。炎症期の後は増殖期である。最終的に、成熟期が心臓修復の最後の段階である。(Bujak、M.and Frangogiannis、NG Cariovasc Res.74:184−195(2007))。
MI、又は心臓発作後に、心臓はそれ自身で修復し始める。この心臓の修復過程は重複している段階に分けることができる。第一の段階は炎症期として知られる。炎症期の後は増殖期である。最終的に、成熟期が心臓修復の最後の段階である。(Bujak、M.and Frangogiannis、NG Cariovasc Res.74:184−195(2007))。
心臓発作の直後、炎症期は、心筋細胞死、サイトカイン及びケモカインの誘導、並びに死にかけの組織を除去する炎症細胞の流入を特徴とする。増殖期の間には、炎症メディエーターの抑制、さらには結合組織線維の形成に寄与する細胞、線維芽細胞、及び内皮細胞の梗塞領域への流入がある。線維芽細胞は細胞外マトリックスを分泌する。内皮細胞は、発達中の緩い線維性の結合組織内の微小血管ネットワーク、又は肉芽組織の形成に寄与する。次いで、浸潤した炎症細胞は細胞死(すなわちアポトーシスとして知られるもの)を起こし始める。最後に、成熟期の間に、増殖期からの肉芽組織が密な繊維状結合組織瘢痕を組織化し成熟する。心筋におけるこの線維性応答のリモデリングは長期になり得る。一般に、炎症期は梗塞の時点からMIの1〜7日後までに発生する。増殖期はMIの約5〜14日後から発生する。最後に、成熟期はMIの約10〜14日後に始まり、そして心臓リモデリングが起こる限り継続する。
TGF−βは梗塞心筋において誘導され、そしてMI後修復の全ての段階に関与しており、このことが心臓修復におけるこのサイトカインの役割を明確にしよう釣る試みを複雑にしている。従って、MI後の心臓修復におけるTGF−βの正確な役割は十分に理解されていない。TGF−βは、元々は、通常の線維芽細胞を足場依存性増殖をすることができる細胞へと変換するその能力に関して名付けられた多機能サイトカインである。TGF−βの少なくとも5つの形態が現在同定されている:TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、及びTGF−β5。TGF−βのこのファミリーを、ヒト、マウス、ミドリザルブタ、ウシ、ニワトリ、及びカエルを含む様々な種から精製することが可能である。TGF−βのこのファミリーを、組み換え細胞培養でそれを産生するため、及びその活性を決定するために、骨、血小板又は胎盤を含む様々な身体源から精製することも可能である。
ヒトでは3つのアイソフォーム、TGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3が存在することが知られている。(Swiss Prot受入番号P001137、P08112及びP10600(それぞれ))。それらの生物学的活性状態において、これら3つのアイソフォームは、鎖間ジスルフィド架橋により結合された2つの112アミノ酸のモノマーを含む25kDaのホモダイマーである。TGF−β1はTGF−β2と27アミノ酸だけ異なり、そしてTGF−β3とは22アミノ酸だけ異なる。これらの差異は主に保存的アミノ酸変化である。TGF−βの三次元構造はX線結晶学により決定されており、そして受容体結合領域が明確にされている。ヒトTGF−β及びマウスTGF−βは両方とも類似している。ヒトTGF−β1はマウスTGF−β1と1つのアミノ酸の差異を有する。ヒトTGF−β2はマウスTGF−β2と3つのアミノ酸しか異なっておらず、そしてヒト及びマウスのTGF−β3は同一である。
用語「TGF−β」又は「トランスホーミング増殖因子ベータ」は、ヒトTGF−βアイソフォームのいずれかの全長天然アミノ酸配列を有すると説明される分子のファミリーを指す。これらには潜在形態(「潜在型TGF−β」)並びに前駆体及び成熟TGF−βの結合複合体又は非結合複合体が含まれる。このようなTGF−βへの言及は、いずれかの公知のTGF−βの配列から誘導され、かつその配列と少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、なおより好ましくは少なくとも約90%、そしてなおより好ましくは少なくとも約95%相同であるポリペプチドを含む、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、及びTGF−β5並びにそれらの潜在型を含む現在同定されている形態のいずれか1つ、さらには将来同定されるヒトTGF−βへの言及であることが理解されるだろう。具体的な用語「TGF−β1」、「TGF−β2」、及び「TGF−β3」、さらには「TGF−β4」及び「TGF−β5」は、文献で定義されるTGF−βを指す(例えば、Derynck et al.、Nature、前出、Seyedin et al.、J.Biol.Chem.、262、前出、及びdeMartin et al.、前出)。用語「TGF−β」はヒトTGF−βをコードする遺伝子を指す。
TGF−βファミリーのメンバーは、分子の成熟部分において9つのシステイン残基を有するタンパク質であり、成熟領域において他の公知のTGF−β配列と少なくとも65%の相同性を共有し、かつ同じ受容体に対して競合し得る。さらに、それらは全て、より大きな前駆体としてコードされていると思われ、この前駆体は、N末端に近い高相同性の領域を共有し、かつプロセシングにより後に除去される前駆体の部分において3つのシステイン残基の保存を示す。TGF−βファミリーメンバーはまた、4つ又は5つのアミノ酸を含むプロセシング部位を有すると思われる。
TGF−β活性レベルの増加は多数の病的状態に関与し、これらとしては、限定されないが以下が挙げられる:(i)線維症、瘢痕、及び創傷治癒の間の癒着;(ii)心臓、肺、肝臓、及び腎臓の線維性疾患;(iii)アテローム性硬化症及び動脈硬化症;(iv)前立腺癌、消化器系の神経内分泌腫瘍、頸部の癌、神経膠芽腫、及び胃癌を含む特定の型の癌;(v)血管障害、血管症、腎症;(vi)全身性硬化症;(vii)ウイルス感染症、例えばC型肝炎及びHIV;並びに(viii)免疫障害及び免疫不全、例えば関節リウマチ。
心臓傷害におけるTGF−βの役割に関する初期の研究は、保護的役割がMI後心臓修復の第一の段階すなわち炎症期に現れることを示す。これらの初期研究において、TGF−βは、虚血傷害の後数時間以内に心筋虚血傷害のモデルに投与された。Leferは、単離されたラット心臓において、虚血心臓傷害の前、又は直後のTGF−βの投与が、冠循環におけるスーパーオキシドアニオンを減少させ、内皮依存性冠動脈弛緩を維持し、外
因性腫瘍壊死因子(TNF)により媒介される傷害を減少させ、そして重篤な心臓傷害を防止することを示した(Lefer、et al.Science、249:61、1990)。Lefer及び共同研究者らは、特に、内皮による内皮由来弛緩因子(EDRF、しかし現在では一酸化窒素すなわちNOと知られている)形成の維持により、TGF−βが内皮機能を保存するということの証明を続けた(Lefer、AM.Biochem
Pharmacol.42:1323−1327、1991)。単離された心筋細胞又は単離された心臓調製物を用いた他の研究はさらに、TGF−β媒介心臓保護の機構を解明した。
因性腫瘍壊死因子(TNF)により媒介される傷害を減少させ、そして重篤な心臓傷害を防止することを示した(Lefer、et al.Science、249:61、1990)。Lefer及び共同研究者らは、特に、内皮による内皮由来弛緩因子(EDRF、しかし現在では一酸化窒素すなわちNOと知られている)形成の維持により、TGF−βが内皮機能を保存するということの証明を続けた(Lefer、AM.Biochem
Pharmacol.42:1323−1327、1991)。単離された心筋細胞又は単離された心臓調製物を用いた他の研究はさらに、TGF−β媒介心臓保護の機構を解明した。
Kellerら(Journal of Cardiovascular Pharmacology、30:197−204、1997)は、イヌ心臓I/RモデルにおいてTGF−βが虚血/再灌流の30分前に投与された場合、未処置コントロールと比較して、再灌流の直後に梗塞部分におけるタンパク質漏出指数(PLI)の50%の減少があるということを示した。しかし、PLIの改善は再灌流の48時間後に観察されなかった。さらに、TGF−βは再灌流の1時間後又は48時間後のイヌにおいて内皮依存性弛緩を改善しなかった。これらの結果は、TGF−βは再灌流の初期に冠血管透過性の増加を防止し得るが、その後の冠血管傷害を防止しないかもしれないということを示唆した。(Keller、et al.、J Cardiovasc Pharmcol.30:197−204、1997)。
より最近では、MI修復におけるTGF−βの役割が、TGF−βシグナル伝達を妨害するためにTGF−β受容体アンタゴニストを使用して調べられた。1つの研究では、Ikeuchiら(Cardiovascular Research、64:526−35、2004)は、MIの7日前にマウスにおいてTGF−β II型受容体の(TβIIR)細胞外ドメインをコードするプラスミドを筋内注射することにより、MIの時点でのTGF−βシグナル伝達を遮断した。彼らは、未処置のマウスと比較して、梗塞サイズの増加がないにもかかわらず、MIの後24時間の間の増加した死亡率、増加した炎症、増加した左心室(LV)拡張及び収縮不全を観察した。MI後のより遅い段階でTGF−βを遮断するために、マウスにTβIIRをMIの0日後又は7日後のいずれかに筋内注射した。MIの4週間後、TβIIR処置はLV拡張、収縮不全、心筋細胞肥大、及び非梗塞心筋における間質性線維症を防止した。TGF−βは初期段階において有益であったが、その利益は持続した発現と共に失われ、LVのリモデリング及び不全をもたらした。
別の研究において、Okadaら(Circulation、11:2430−37、2005)は、可溶性TGF−β II型受容体をコードするアデノウイルス(Ad.CAGsTβRII)をMIの3日後にマウスに筋内注射した。MI後に処置されたマウスにおいて、生存は有意に改善された。これには心室拡張の有意な減衰及びMIの4週間後の改善された心機能が伴っていた。MIサイズはコントロールと変わらなかったが、MIの厚さ及び周囲は処置された動物においてより小さかった。梗塞領域の筋線維芽細胞の間のアポトーシスは処置された動物において頻度がより低かった。MIの4週後のAd.CAG−sTβRIIの投与は無効であった。Okadaらは、TGF−βの阻害のために決定的な時間帯は3日後かつ4週の前にあると考えた。かれらの研究において注射は、処置が心筋細胞の急性虚血死に影響を及ぼさないだろうと考えられる時点に意図的に行われた。Okadaらは、MIの急性期の間のTGF−βの阻害は有害であると判断されると考えた。
これらの研究の後で、TGF−β1、2及び3に対して有効なアンタゴニスト抗体を使用したTGF−β拮抗がMI修復において調べられた。Frantzら(Basic Research in Cardiology、103:485−502、2008)は、TGF−βアンタゴニスト抗体又はネガティブコントロール抗体を、冠動脈結紮による
MIの誘導の7日前、又は5日後のいずれかに開始して、マウスに投与した。抗体を、8週の研究期間を通じて一日おきに投与した。抗TGF−β抗体を投与されたグループにおいて死亡率は有意に高かった。 さらに、両方の抗TGF−β抗体処置グループが増加した左心室拡張を示した。これらの著者らは、冠動脈結紮の前又は後の抗TGF−β処置が、死亡率を増加させ、そして左心室リモデリングを悪化させると結論を出した。著者らは、TGF−β拮抗の期間及びTGF−βアンタゴニストの濃度における差異が、彼らの研究とIkeuchiら(2004)及びOkadaら(2005)により報告された研究との間の結果の差異の原因であるかもしれないということを示唆した。
MIの誘導の7日前、又は5日後のいずれかに開始して、マウスに投与した。抗体を、8週の研究期間を通じて一日おきに投与した。抗TGF−β抗体を投与されたグループにおいて死亡率は有意に高かった。 さらに、両方の抗TGF−β抗体処置グループが増加した左心室拡張を示した。これらの著者らは、冠動脈結紮の前又は後の抗TGF−β処置が、死亡率を増加させ、そして左心室リモデリングを悪化させると結論を出した。著者らは、TGF−β拮抗の期間及びTGF−βアンタゴニストの濃度における差異が、彼らの研究とIkeuchiら(2004)及びOkadaら(2005)により報告された研究との間の結果の差異の原因であるかもしれないということを示唆した。
心筋梗塞、特に急性心筋梗塞に罹患した患者を処置する方法、又は患者において心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法が本明細書において開示され、本方法は、TGF−βのアンタゴニストを、心筋梗塞の急性期の間に患者に投与することを含む。TGF−βのアンタゴニストの投与が急性心筋虚血の発生後120時間未満の時点で有利に開始され得るという発見は驚くべきことである。いくつかの場合において、本明細書に記載される方法は、急性心筋虚血の発生の約72時間以内、約48時間以内、約24時間以内、又は約12時間以内に開始され得るということを考慮する。一般に、本明細書に開示される方法において、TGF−βアンタゴニストはMIの急性期の間に投与される。TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織のマクロファージ及び単核の実質的な浸潤の前に開始され得る。いくつかの実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の好中球の浸潤を特徴とする期間中に開始される。他の実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の壊死を特徴とする期間中に開始される。
「処置」は、治療的処置及び予防的(prophylactic)又は予防的な(preventative)手段の両方を指す。処置を必要とするものには、処置可能な障害を既に有するものに加えて、その障害が予防されるべきものが含まれる。処置は正常な機能の完全な治癒又は回復を含むかもしれないし、含まないかもしれない。処置は、望ましくない症状の改善及び/又は障害の有害な結果の減少も含み得る。「哺乳動物」は、哺乳動物として分類されるいずれかの動物であり得、これにはヒト、家畜及び農業動物、並びに動物園、スポーツ、又はペットの動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどが含まれる。好ましくは哺乳動物は霊長類、例えばサル、類人猿、又はヒトである。用語「有効量」は、哺乳動物において疾患又は障害を処置するために有効な薬物の量を指す。
特定のTGF−β機能はMI後の初期段階で望ましいかもしれないが、急性期の間及びそれを超えるTGFの拮抗は、改善された心臓リモデリング及び機能を生じ得る。しかし、TGF−βの1つ又はそれ以上の選択された機能を回復させることが望ましい場合、TGF−βの所望の機能を選択的に回復し得る別の化合物を、TGF−βアンタゴニストと同時投与することが望まれるかもしれない。例えば、TGF−βの所望の機能を選択的に回復することができる化合物は、抗炎症薬、又はTNF−αのアンタゴニストであり得る。別の処置を同時投与することも望ましいかもしれず、例えば、本方法は、ACE阻害剤を患者に投与することを含み得る。ACE阻害剤は、ベナゼプリル、カプトプリル、ホシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランスドラプリル(transdolapril)、リシノプリル、エナラプリル及びランパリル(ramparil)からなる群より選択され得る。他の実施態様において、本方法はさらに、アンギオテンシンII受容体アンタゴニストを患者に投与することを含み得る。アンギオテンシンII受容体アンタゴニストは、エプロサルタン、テルミサルタン、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、及びバルサルタンからなる群より選択され得る。
中和抗体はTGF−βアンタゴニストとして使用され得る。「抗体」は、天然であるか
部分的若しくは全体的に合成により製造されるかにかかわらず、免疫グロブリンである。この用語は、抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質も含む。抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントは、Fab、scFv、Fv、dAb、Fd及び二特異性抗体(diabodies)のような分子である。用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そしてそれらが所望される生物学的活性を示す限りは、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体フラグメントを具体的に含む。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、単一の抗原部位に向けられたものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対して特異的な異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して特異的である。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体で汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とするとは解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al.、Nature、256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造され得、又は組み換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)により製造され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えばClackson et al.、Nature、352:624−628(1991)及びMarks et al.、J.Mol.Biol.、222:581−597(1991)に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
部分的若しくは全体的に合成により製造されるかにかかわらず、免疫グロブリンである。この用語は、抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質も含む。抗原結合ドメインを含む抗体フラグメントは、Fab、scFv、Fv、dAb、Fd及び二特異性抗体(diabodies)のような分子である。用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そしてそれらが所望される生物学的活性を示す限りは、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体フラグメントを具体的に含む。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、単一の抗原部位に向けられたものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対して特異的な異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して特異的である。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体で汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とするとは解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al.、Nature、256:495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造され得、又は組み換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)により製造され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えばClackson et al.、Nature、352:624−628(1991)及びMarks et al.、J.Mol.Biol.、222:581−597(1991)に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
「抗体フラグメント」は、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFvフラグメント;二特異性抗体;線状抗体(linear antibodies);単鎖抗体分子;及び抗体フラグメント(単数又は複数)から形成された多重特異性抗体が挙げられる。用語「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体を記載するために使用される。好ましいFcRは天然の配列のヒトFcRである。
抗体又は抗体フラグメントの文脈における用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列が広く異なるという事実を指し、かつその特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用される。しかし、その変動性は抗体の可変ドメイン全体を通して一様に分布していない。それは軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインにおける超可変領域と呼ばれる3つの部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβ−シート構造を取り、3つの超可変領域により接続された4つのFRを含み、これらはβ−シート構造を接続しそしていくつかの場合はβ−シート構造の一部を形成するループを形成する。用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的に、「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク領域」又は「FR」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「Fv」は、完全抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、1つの重鎖と1つの軽鎖可変ドメインとの、非共有結合で密接に結合した二量体からなる。各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用してVH−VL二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのはこの配置の状態である。集合的に、6つの超可変領域は抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つの超可変領域のみを含むFvの半分)でも抗原を認識及び結合する能力を有するが、結合部位全体よりもより低い親和性である。
Fabフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン(CH
1)を含む。Fab'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つ又はそれ以上のシステ
インを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端において少数の残基の付加によりFabフラグメントと異なる。Fab'−SHは、定常ドメインのシステイン残基(単数又は複
数)が少なくとも1つの遊離チオール基を有するFab'についての本明細書における名
称である。F(ab')2抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを有するFa
b'フラグメント対として作製された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公
知である。
1)を含む。Fab'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの1つ又はそれ以上のシステ
インを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端において少数の残基の付加によりFabフラグメントと異なる。Fab'−SHは、定常ドメインのシステイン残基(単数又は複
数)が少なくとも1つの遊離チオール基を有するFab'についての本明細書における名
称である。F(ab')2抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを有するFa
b'フラグメント対として作製された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公
知である。
脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明らかに異なる型の1つに帰属され得る。「単鎖Fv」又は「scFv」抗体フラグメントは、抗体のVH及びVLドメインを含み、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。
非ヒト(例えば齧歯動物)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最少の配列を含有するキメラ抗体である。大部分についてはヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、ここでレシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)、例えばマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域由来の残基と置き換えられている。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基と置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの改変は抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、及び典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンに対応し、そしてFRの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFRである。ヒト化抗体はまた、(典型的にはヒト免疫グロブリンの)免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含む。(Jones et al.、Nature、321:522−525(1986);Riechmann et al.、Nature、332:323−329(1988);及びPresta、Curr.Op.Struct.Biol,.2:593−596(1992))。
「TGF−β抗体」はTGF−βのアイソフォームのいずれかに結合する抗体を指し、好ましくはTGF−β1、TGF−β2、若しくはTGF−β3のいずれか、又はそれらのいずれかの組み合わせ、より好ましくは少なくともTGF−β1、又は少なくともTGF−β2、そして最も好ましくはTGF−β1、又はTGF−β2と共にTGF−β1に結合する抗体である。場合により、この抗体は少なくともTGF−β3に結合し得る。
TGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3アイソフォームに結合する1つの中和マウスモノクローナル抗体が1D11として知られており、これはATCC(受入番号HB
9849)を通じてR&D Systems(カタログ番号MAB−1835)から入手可能である。ヒトTGF−β1に特異的なマウスモノクローナル抗体もまたR&D Systemsから入手可能である。中和マウスモノクローナル抗体はまた、アミノ酸48〜60位(TGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3に反応性の抗体)及びアミノ酸86〜101位(TGF−β1に特異的な抗体)を含むヒトTGF−β1ペプチドで免役されたマウスから生成された(Hoefer and Anderer、Cancer Immunol.Immunother.、41:302−308(1995))。GC1008は、全てのTGF−βアイソフォームを中和し、かつヒトにおける治療上の使用に適したヒト化モノクローナルIgG4抗体である。
9849)を通じてR&D Systems(カタログ番号MAB−1835)から入手可能である。ヒトTGF−β1に特異的なマウスモノクローナル抗体もまたR&D Systemsから入手可能である。中和マウスモノクローナル抗体はまた、アミノ酸48〜60位(TGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3に反応性の抗体)及びアミノ酸86〜101位(TGF−β1に特異的な抗体)を含むヒトTGF−β1ペプチドで免役されたマウスから生成された(Hoefer and Anderer、Cancer Immunol.Immunother.、41:302−308(1995))。GC1008は、全てのTGF−βアイソフォームを中和し、かつヒトにおける治療上の使用に適したヒト化モノクローナルIgG4抗体である。
1D11は、広範囲のインビトロアッセイにおいてマウスTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3及びヒトTGF−β1及びTGF−β2を中和するマウスpan特異的
抗TGF−β抗体である(米国特許第5,571,714号;MAB1835についてのR&D System製品シート)。線維症の動物モデルにおいて1D11が有効であることが分かっている。しかし、1D11はマウスモノクローナル抗体であり、ヒトにおける治療上の使用には不適切であるかもしれない。従って、いくつかの実施態様では、ヒト抗体又はヒト配列要素を含む改変抗体が望ましいかもしれない。
抗TGF−β抗体である(米国特許第5,571,714号;MAB1835についてのR&D System製品シート)。線維症の動物モデルにおいて1D11が有効であることが分かっている。しかし、1D11はマウスモノクローナル抗体であり、ヒトにおける治療上の使用には不適切であるかもしれない。従って、いくつかの実施態様では、ヒト抗体又はヒト配列要素を含む改変抗体が望ましいかもしれない。
いくつかの実施態様において、MIを処置する方法は、TGF−β関連疾患におけるTGF−βの過剰産生に関連する急性線維症を処置するためにTGF−βに対する抗体を投与することを含み得る。身体は破壊された組織を再生することにより傷害又は疾患に対して反応する。傷害が長期にわたるか又は広範囲に及ぶ場合、破壊された組織は特殊な線維性結合組織で置き換えられ得る。この線維性組織の沈着は、患者における罹患した組織又は器官の機能の障害を生じ得る。急性期の間の有効量の抗TGF−β抗体の投与は、その後の線維症の発生を減少させ得る。さらに、有効量の抗TGF−β抗体はまた、TGF−βの生物学的活性を中和し、それにより線維症の発生を減少させるために、典型的に線維症を特徴とするMI後回復期の間に投与され得る。
いくつかの実施態様において、TGF−βアンタゴニストは、(i)TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;(ii)TGF−β受容体又はその可溶性フラグメント;(iii)1つ又はそれ以上のTGF−β受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;及び(iv)アンチセンス又は干渉RNAオリゴヌクレオチドからなる群より選択され得る。TGF−β分子に特異的に結合して中和する抗TGF−β抗体はTGF−βアンタゴニストとして特に有用である。このような抗体の例は米国特許出願公開第2006/0251658号に記載される。抗TGF−β抗体はTGF−β、特にヒトTGF−βに対して特異的な抗体を含み、これにはTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3に対して特異的な抗体が含まれる。
抗体は多数やり方で改変され得るので、用語「抗体分子」は、必要な特異性を備えた抗体の抗原結合部位を有するいずれの抗体又は物質も含むと解釈されるべきである。従って、この用語は、天然でも全体的若しくは部分的に合成でも、抗原結合ドメインを含むいずれのポリペプチドも含めて、抗体フラグメント及び誘導体を含む。従って抗体の抗原結合ドメイン、又は等価物を含み、別のポリペプチドに融合されたキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現はEP−A−0120694及びEP−A−0125023、並びにその後の大量の文献に記載される。これは、具体的に限定されていなければ、用語抗TGF−β抗体が全抗体(例えばIgG1又はIgG4のようなIgG)、抗体フラグメント(例えば、scFv、Fab、dAb)、又は抗TGF−β抗体若しくはその構成要素から誘導された抗TGF−β抗原結合部位を含む分子を含むように本明細書において広義に使用される理由である。
TGF−βのアンタゴニストは、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基を有し、そして非ヒトである供給源からそれに導入したヒト化モノクローナル抗TGF−β抗体を含む。ヒト化は、Winter及び共同研究者らの方法(Jones et al、Nature、321:522−525(1986);Riechmann et al.、Nature、332:323−327(1988);Verhoeyen et al.、Science、239:1534−1536 (1988))にしたがって、超可変領域配列を、ヒト抗体の対応する配列の代わりに用いることにより行われ得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列で置き換えられているキメラ抗体であり得る(例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるもの)。実際面ではヒト化抗体は、典型的にはいくつかの超可変領域残基及び場合によりいくつかのFR残基が齧歯動物抗体における類似した部位からの残基で置き換えられているヒト抗体である。
いわゆる「ベストフィット」法にしたがって、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで齧歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域(FR)として認める(Sims et al.、J.Immunol.、151:2296(1993);Chothia et al、J.Mol.Biol.、196:901(1987))。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導された特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る(Carter et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4285(1992);Presta
et al.、J.Immunol.、151:2623(1993))。
et al.、J.Immunol.、151:2623(1993))。
好ましくは、ヒト化抗体は抗原に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性を保持する。この目的を達成するために、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の3次元モデルを使用して親配列及び様々な概念のヒト化産物の分析を含む方法により製造され得る。3次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、そして、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定3次元コンホメーション構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込みのある役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、FR残基が選択され、そしてレシピエントから組み合わせられ、そして標的抗原(単数又は複数)に対する増加した親和性のような抗体の所望の特徴が達成されるように配列を取り込み得る。一般に、超可変領域の残基は、直接的かつ最も実質的に、抗原結合への影響に関与する。
抗TGF−β抗体は、典型的に抗体のVH及びVLドメインを含む。VH及びVLドメイン内に相補性決定領域(CDR)があり、これらは異なるフレームワーク領域(FR)内に含まれ得、場合によりVH又はVLドメインを形成する。抗原結合部位は、抗体のVHドメイン及び/若しくはVLドメイン又はその抗原結合部分からなり得る。
抗TGF−β抗体は、HCDRセット、LCDRセット、若しくはその両方、及び/又はヒト抗体VHドメイン、VLドメイン若しくはその両方を含み得る。
HCDR1、HCDR2及びHCDR3のセットは、以下のセットから選択される配列を有し得る:
HCDR1 配列番号3、HCDR2 配列番号4、HCDR3 配列番号5(本明細書では「HCDRのPET1073G12セット」と呼ばれる);
HCDR1 配列番号13、HCDR2 配列番号14、HCDR3 配列番号15(本明細書では「HCDRのPET1074B9セット」と呼ばれる);
HCDR1 配列番号23、HCDR2 配列番号24、HCDR3 配列番号25(本明細書では「HCDRのPET1287A10セット」と呼ばれる)。
HCDR1 配列番号3、HCDR2 配列番号4、HCDR3 配列番号5(本明細書では「HCDRのPET1073G12セット」と呼ばれる);
HCDR1 配列番号13、HCDR2 配列番号14、HCDR3 配列番号15(本明細書では「HCDRのPET1074B9セット」と呼ばれる);
HCDR1 配列番号23、HCDR2 配列番号24、HCDR3 配列番号25(本明細書では「HCDRのPET1287A10セット」と呼ばれる)。
LCDR1、LCDR2及びLCDR3のセットは、以下のセットから選択される配列を有し得る:
LCDR1 配列番号8、LCDR2 配列番号9、LCDR3 配列番号10(本明細書では「LCDRのPET1073G12セット」と呼ばれる);
LCDR1 配列番号18、LCDR2 配列番号19、LCDR3 配列番号20(本明細書では「LCDRのPET1074B9セット」と呼ばれる);
LCDR1 配列番号28、LCDR2 配列番号29、LCDR3 配列番号30(本明細書では「LCDRのPET1287A10セットと呼ばれる)。
LCDR1 配列番号8、LCDR2 配列番号9、LCDR3 配列番号10(本明細書では「LCDRのPET1073G12セット」と呼ばれる);
LCDR1 配列番号18、LCDR2 配列番号19、LCDR3 配列番号20(本明細書では「LCDRのPET1074B9セット」と呼ばれる);
LCDR1 配列番号28、LCDR2 配列番号29、LCDR3 配列番号30(本明細書では「LCDRのPET1287A10セットと呼ばれる)。
HCDRのPET1073G12セットは、LCDRのPET1073G12セットと一緒に本明細書でCDRのPET1073G12セットと呼ばれる。HCDRのPET1074B9セットはLCDRのPET1074B9セットと一緒に本明細書でCDRのPET1074B9セットと呼ばれる。HCDRのPET1287A10セットはLCDRのPET1287A10セットと一緒に本明細書でCDRのPET1287A10セットと呼ばれる。本明細書において開示されるHCDRのセットを含むVHドメインは、本明細書において開示されるLCDRのセットを含むVLドメインを別々に含み得る。好ましくはこのようなVHドメインは上記VLドメインと対になっており、そして最も好ましくはVHドメイン及びVLドメインの組み合わせは本明細書に記載されるクローンにおけるものと同じである。
抗TGF−β抗体のVHドメインは、1つ又は2つのアミノ酸置換を有するPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10のセットに対応するHCDRのセット(HCDR1、HCDR2及びHCDR3)を含有し得る。
抗TGF−β抗体は、CDRのセットが1つ又は2つのアミノ酸置換を有するPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10のセットに対応するLCDRのセット(LCDR1、LCDR2及びLCDR3)を含むVLドメインを含み得る。
多変量データ解析技術を構造/特性−活性相関に適用する際のコンピュータ化学(Wold、et al.Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics−−Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.:B.Kowalski)、D.Reidel Publishing Company、Dordrecht、Holland、1984 (ISBN 90−277−1846−6))に倣って、抗体の定量的活性−特性相関を、周知の数学技術、例えば統計的回帰、パターン認識及び分類を使用して導き出すことができる(Norman et al.Applied Regression Analysis.Wiley−Interscience;3rd edition (April 1998) ISBN:0471170828;Abraham Kandel、Eric Backer.Computer−Assisted
Reasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR;(May 11、1995)、ISBN:0133418847;Wojtek Krzanowski.Principles of Multivariate Analysis:A User's Perspective (Oxfor
d Statistical Science Series、No 22 (Paper)).Oxford University Press;(December 2000)、ISBN:0198507089;Ian H.Witten、Eibe Frank.Data Mining:Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations.Morgan Kaufmann;(Oct.11、1999)、ISBN:1558605525;David G.T.Denison (Editor)、Christopher C.Holmes、Bani K.Mallick、Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics).John Wiley & Sons;(July 2002)、ISBN:0471490369;Arup K.Ghose、Vellarkad N.Viswanadhan.Combinatorial Library Design and Evaluation Principles、Software、Tools、and A
pplications in Drug Discovery.ISBN:0−8247−0487−8)。抗体の特性は、抗体の配列、機能及び3次元構造の経験的及び理論的モデルから導くことができ(例えば、可能性のある接触残基の分析又は計算された物理化学的特性)、そしてこれらの特性は単独で、及び組み合わせて考慮され得る。
Reasoning in Cluster Analysis.Prentice Hall PTR;(May 11、1995)、ISBN:0133418847;Wojtek Krzanowski.Principles of Multivariate Analysis:A User's Perspective (Oxfor
d Statistical Science Series、No 22 (Paper)).Oxford University Press;(December 2000)、ISBN:0198507089;Ian H.Witten、Eibe Frank.Data Mining:Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations.Morgan Kaufmann;(Oct.11、1999)、ISBN:1558605525;David G.T.Denison (Editor)、Christopher C.Holmes、Bani K.Mallick、Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics).John Wiley & Sons;(July 2002)、ISBN:0471490369;Arup K.Ghose、Vellarkad N.Viswanadhan.Combinatorial Library Design and Evaluation Principles、Software、Tools、and A
pplications in Drug Discovery.ISBN:0−8247−0487−8)。抗体の特性は、抗体の配列、機能及び3次元構造の経験的及び理論的モデルから導くことができ(例えば、可能性のある接触残基の分析又は計算された物理化学的特性)、そしてこれらの特性は単独で、及び組み合わせて考慮され得る。
公知の原子構造の抗体の解析は、抗体結合部位の配列と3次元構造との間の関係を解明した(Chothia C.et al.Journal Molecular Biology (1992) 227、799−817;Al−Lazikani、et al.Journal Molecular Biology (1997) 273(4)、927−948)。これらの関係は、VHドメインにおける第3の領域(ループ)を除いて、結合部位ループが少数の主鎖コンホメーション:基準(canonical)構造のうちの1つを有するということを示唆した。特定のループにおいて形成される基準構造は、そのサイズ、並びにループ及びフレームワーク領域の両方における鍵となる部位における特定の残基の存在により決定されることが示された(Chothia et al.and Al−Lazikani et al.、前出)。
配列−構造相関は、配列が既知であるが3次元構造は未知である抗体における残基の予測に使用され得、これはそのCDRループの3次元構造の維持、従って結合特異性の維持において重要である。これらの予測は、先例となる最適化実験からの出力とそれらの予測を比較することにより裏付けられ得る。構造的アプローチにおいて、抗体分子の理論的モデルが、いずれかの自由に利用可能であるか市販のパッケージ、例えばWAM(Whitelegg、N.R.u.and Rees、A.R(2000)Prot.Eng.、12、815−824)を使用して作成され得る(Chothia、et al.Science、223,755−758(1986))。次いで、タンパク質視覚化及び分析ソフトウェアパッケージ、例えばInsight II(Accelerys、Inc.)又はDeep View(Guex、N.and Peitsch、M.C.Electrophoresis(1997) 18、2714−2723)を使用して、CDR及びFRにおける各位置での可能な置換を評価し得る。次いでこの情報を使用して、活性に対して最少又は有利な効果を有する可能性のある置換を作製し得る。CDR、抗体VH又はVLドメイン及び特定の抗体のアミノ酸配列内に置換を作製するために必要な技術は一般的に当該分野において利用可能である。活性に対して最少又は有利な効果を有すると予測されるかもしれないし予測されないかもしれない置換を有する変異体配列が作製され得る。
従って、抗TGF−β抗体は、CDRの規定されたセット、特にPET1073G12、PET1074B9及びPET1287A10のCDRのセット、並びにCDRのセット内に1つ又は2つの置換を有するPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10のCDRのセットを含み得る。CDRの関連するセットは、抗体フレームワーク領域又は他のタンパク質足場、例えばフィブロネクチン又はシトクロムB内にもたらされる。好ましくは抗体フレームワーク領域が使用される。
抗TGF−β抗体の重鎖はヒトVH1ファミリー遺伝子を利用し得る。様々な実施態様
において、重鎖フレームワークアミノ酸配列は、ヒトVH1ファミリー遺伝子の生殖系列
アミノ酸配列と比較して、1〜12、好ましくは3〜12、そしてより好ましくは3〜8個のアミノ酸の差異を含有する。いくつかの実施態様において、重鎖フレームワーク配列は生殖系列配列である。特に好ましい実施態様において、重鎖についての抗体フレームワーク領域はVH1ファミリーからのヒトDP−10(VH1−69)又はヒトDP−88(VH1−e)であり得る。ヒトDP−10遺伝子を利用するいくつかの実施態様は、非生
殖系列アミノ酸を残基27、78及び94に有する。いくつかの実施態様において、残基27はチロシンであり、残基78はスレオニンであり、そして残基94はセリン又はロイ
シンである。いくつかの実施態様において、軽鎖は、生殖系列アミノ酸配列と比較して1〜5、1〜4、より好ましくは1〜3個のアミノ酸の差異を有するヒトVκ3ファミリー遺伝子を利用する。いくつかの実施態様において、軽鎖フレームワーク配列は生殖系列ヒトVκ3ファミリー遺伝子配列である。特に好ましい実施態様において、軽鎖についてのフレームワーク領域はヒトDPK−22(A27)であり得る。いくつかのこのような実施態様において、残基2は非生殖系列アミノ酸である。いくつかの実施態様において残基2はスレオニンである。
において、重鎖フレームワークアミノ酸配列は、ヒトVH1ファミリー遺伝子の生殖系列
アミノ酸配列と比較して、1〜12、好ましくは3〜12、そしてより好ましくは3〜8個のアミノ酸の差異を含有する。いくつかの実施態様において、重鎖フレームワーク配列は生殖系列配列である。特に好ましい実施態様において、重鎖についての抗体フレームワーク領域はVH1ファミリーからのヒトDP−10(VH1−69)又はヒトDP−88(VH1−e)であり得る。ヒトDP−10遺伝子を利用するいくつかの実施態様は、非生
殖系列アミノ酸を残基27、78及び94に有する。いくつかの実施態様において、残基27はチロシンであり、残基78はスレオニンであり、そして残基94はセリン又はロイ
シンである。いくつかの実施態様において、軽鎖は、生殖系列アミノ酸配列と比較して1〜5、1〜4、より好ましくは1〜3個のアミノ酸の差異を有するヒトVκ3ファミリー遺伝子を利用する。いくつかの実施態様において、軽鎖フレームワーク配列は生殖系列ヒトVκ3ファミリー遺伝子配列である。特に好ましい実施態様において、軽鎖についてのフレームワーク領域はヒトDPK−22(A27)であり得る。いくつかのこのような実施態様において、残基2は非生殖系列アミノ酸である。いくつかの実施態様において残基2はスレオニンである。
非常に好ましい実施態様において、VHドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を備え、これは「PET1073G12 VHドメイン」と呼ばれ、又は配列番号12のアミノ酸配列を備え、これは「PET1074B9 VHドメイン」と呼ばれ、又は配列番号22のアミノ酸配列を備え、これは「PET1287A10 VHドメイン」と呼ばれる。
いくつかの実施態様において、VLドメインは、配列番号7のアミノ酸配列を含み、これは「PET1073G12 VLドメイン」と呼ばれ、又は配列番号17のアミノ酸配列を含み、これは「PET1074B9 VLドメイン」と呼ばれ、又は配列番号27のアミノ酸配列を含み、これは「PET1287A10 VLドメイン」と呼ばれる。抗TGF−β抗体の一例は、PET1073G12 VHドメイン、配列番号2、及びPET1073G12 VLドメイン、配列番号7から構成される。別の例は、PET1074B9 VHドメイン、配列番号12、及びPET1074B9 VLドメイン、配列番号17から構成される。別の例は、PET1287A10 VHドメイン、配列番号22、及びPET1287A10 VLドメイン、配列番号27から構成される。これら又はいずれかの他の抗体TGF−β結合部位は、本明細書の別の箇所でさらに考察されるように、いずれかの望ましい抗体分子形式(例えばscFv、Fab、IgG1、IgG4、dAbなど)内に含まれ得る。別の例は、PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VHドメインを含み、好ましくは対応するPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VLドメインも含むIgG4抗体分子である。
他のIgG4又はPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10 VHドメイン、及び/若しくはPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10 VLドメインを含む他の抗体分子はさらなる例であり、抗体VHドメイン内にHCDRのPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10セットを含み、かつ/又は抗体VLドメイン内にLCDRのPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10セットを含む他の抗体分子も同様である。
抗TGF−β抗体は、ヒトTGF−βの3つのアイソフォーム全てに結合する抗体であり得る。このような抗TGF−β抗体は、PET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10 VH及び/若しくはVLドメイン、又はそれらのドメインの抗原結合部分を含み得る。いくつかの実施態様において、上記のうちの1つからのVHドメインは、上記のうちの1つからのVLドメインと対になって抗原結合部位を生じる。例えば、PET1073G12 VHドメイン(配列番号2)はPET1073G12 VLドメイン(配列番号7)と対になり得、その結果、PET1073G12 VH及びVLドメインの両方を含む抗原結合部位が形成される。別の実施態様において、PET1074B9 VHドメイン(配列番号12)はPET1074B9 VLドメイン(配列番号17)と対になり、その結果、PET1074B9 VH及びVLドメインの両方を含む抗原結合部位が形成される。別の実施態様において、PET1287A10 VHドメイン(配列番号22)はPET1287A10 VLドメイン(配列番号27)と対になり、その結果、PET1287A10 VH及びVLドメインの両方を含む抗原結合部
位が形成される。他の実施態様において、PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VHドメインは、対応するPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VL以外のVLドメインと対になる。
位が形成される。他の実施態様において、PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VHドメインは、対応するPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VL以外のVLドメインと対になる。
同様に、本明細書において開示されるHCDRのいずれかのセットは、特異的抗体として使用されるVHドメイン中に単独で、又はVLドメインと組み合わせて備えられ得る。VHドメインは、本明細書において開示されるHCDRのセットを備え得、そしてこのようなVHドメインがVLドメインと対になる場合、そのVLドメインは本明細書において開示されるLCDRのセットを備え得る。HCDRのセットとLCDRのセットの組み合わせは、PET1073G12、PET1074B9及びPET1287A10抗体について本明細書において開示されるとおりであり得る。VH及び/又はVLドメインのフレームワーク領域は生殖系列フレームワークであり得る。重鎖ドメインのフレームワーク領域はVH−1ファミリーから選択され得、そして好ましいVH-1フレームワークはDP−
10又はDP−88フレームワークである。軽鎖のフレームワーク領域はVκ3ファミリーから選択され得、そして好ましいこのようなフレームワークはDPK−22である。
10又はDP−88フレームワークである。軽鎖のフレームワーク領域はVκ3ファミリーから選択され得、そして好ましいこのようなフレームワークはDPK−22である。
1つ又はそれ以上のCDRが、その配列が本明細書に開示されているVH又はVLドメインから選択され得、そして適切なフレームワーク中に組み込まれ得る。このことは本明細書においてさらに考察される。同じことが、本明細書に記載される方法を使用して得られる抗体の他のCDR及びCDRのセットに当てはまる。
抗体VHドメイン、抗体VLドメイン、HCDRのセット、LCDRのセット、CDRのセット、1つ若しくはそれ以上のHCDR、例えばHCDR3、及び/又は1つ若しくはそれ以上のLCR、例えばLCDR3がTGF−βアンタゴニストにおいて使用され得る。
本明細書において示されるアミノ酸配列のものを含めて、TGF−βに対する特異的抗体において使用され得る、VH及びVLドメイン並びにCDRの変異体は、配列の変更又は変異及びスクリーニングの方法を用いて得ることができる。
その配列が本明細書に具体的に開示されるVH及びVLドメインのいずれかの可変ドメインアミノ酸変異体は、本明細書に開示される方法において使用され得る。特定の変異体は、1つ又はそれ以上のアミノ酸配列変更(アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び/又は挿入)を含み得、約20未満の変更、約15未満の変更、約10未満の変更、又は約5未満、4、3、2、若しくは1つの変更であり得る。変更は1つ若しくはそれ以上のフレームワーク領域及び/又は1つ若しくはそれ以上のCDRにおいて行われ得る。
抗原に結合し、かつ特異的抗体抗原結合領域、本明細書に開示されるVH及び/若しくはVLドメイン、CDRのセット若しくは本明細書に開示されるHCDR3を含む、いずれかの特異的抗体、又はこれらのいずれかの変異体と、抗原への結合について競合若しくは交差競合する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は合成抗体が本明細書において開示される方法において使用され得る。抗体間の競合は、例えばELISAを使用して、かつ/又は他のタグ化されていない抗体(単数又は複数)の存在下で検出されて同じエピトープ若しくは重複するエピトープに結合する特異的抗体の同定を可能にし得る1つの抗体に対する特異的レポーター分子をタグ化することにより、インビトロで容易にアッセイされ得る。抗体間の交差競合は、例えば、両方向で結合を遮断する対を同定するためにタグ化抗体と非タグ化抗体とを逆にすることにより逆アッセイを行うことにより、容易にアッセイされ得る。
PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10抗体分子、特に
PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 scFv及び/又はIgG4と競合又は交差競合する抗体の抗原結合部位を含む抗体はTGF−βを拮抗するために使用され得る。様々な実施態様において、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は合成抗体である。さらなる局面において、TGF−βへの結合について本明細書に記載される抗原結合部位と競合又は交差競合する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は合成抗体の抗原結合部位を含む抗体が使用され得、ここでこのヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は合成抗体の抗原結合部位は、VHドメイン及びVLドメインから構成され、かつこのVH及びVLドメインは、本明細書に開示されるCDRのセットを含む。
PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 scFv及び/又はIgG4と競合又は交差競合する抗体の抗原結合部位を含む抗体はTGF−βを拮抗するために使用され得る。様々な実施態様において、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は合成抗体である。さらなる局面において、TGF−βへの結合について本明細書に記載される抗原結合部位と競合又は交差競合する、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は合成抗体の抗原結合部位を含む抗体が使用され得、ここでこのヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は合成抗体の抗原結合部位は、VHドメイン及びVLドメインから構成され、かつこのVH及びVLドメインは、本明細書に開示されるCDRのセットを含む。
本明細書に開示される情報を考慮すると、PET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10抗体分子、CDRのPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10セットを有する抗体分子、HCDRのPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10セットを有する抗体分子、又はLCDRのPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10セットを有する抗体分子と競合又は交差競合し得る、TGF−βに対するヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は合成抗体を製造するため、TGF−βアンタゴニストとして使用するための、様々な方法が当該分野において利用可能である。
TGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3に結合することができる1つ又はそれ以上の特異的抗体は、抗体のライブラリーとTGF−βとを接触させること、及び上記TGF−βの全てに結合することができる、ライブラリーのうちの1つ又はそれ以上の特異的抗体を選択することを含む方法により得られ得る。ライブラリーは、バクテリオファージ粒子の表面上に提示され得、各粒子は、その表面上に提示される抗体VH可変ドメイン、及び存在する場合は提示されるVLドメインも場合によりコードする核酸を含有する。抗原に結合することができ、かつバクテリオファージ粒子上に提示される特異的抗体の選択の後、この選択された特異的抗体を提示するバクテリオファージ粒子から核酸を採取し得る。このような核酸は、上記選択された特異的抗体を提示するバクテリオファージ粒子から採取された核酸の配列を有する核酸からの発現による、特異的抗体又は抗体VH可変ドメイン(及び場合により抗体VL可変ドメイン)のその後の製造において使用され得る。
上記選択された特異的抗体の抗体VHドメインのアミノ酸配列を有する抗体VHドメインは、このようなVHドメインを含む特異的抗体と同様に、単離された形態で提供され得る。TGF−βの3つのアイソフォーム全てに結合する能力がさらに試験され得、TGF−βの3つのヒトアイソフォーム全てに対する結合についてPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10(例えば、scFv形式及び/又はIgG形式、例えばIgG4で)と競合又は交差競合する能力もまた試験され得る。
TGF−βアンタゴニストとしての使用のための抗体は、PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10抗体分子(例えば、scFv、又は好ましくはIgG4)の親和性で、又は上記分子のうちの1つより高い親和性で、TGF−β1、TGF−β2及び/又はTGF−β3に結合し得る。有用な抗体は、TGF−β1、TGF−β2及び/又はTGF−β3を、PET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10抗体分子(例えば、scFv)、又は好ましくはPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10 IgG4の効力で、又は上記分子のうちの1つより高い効力で中和し得る。
TGF−βアンタゴニストとしての使用のための抗体は、天然に存在するTGF−βを、 PET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10抗体分子(例えば、scFv、又は好ましくはIgG4)の効力で、又は上記分子のうちの1つよ
り高い効力で中和し得る。異なる特異的抗体の結合親和性及び中和効力は、適切な条件下で比較されたものであり得る。
り高い効力で中和し得る。異なる特異的抗体の結合親和性及び中和効力は、適切な条件下で比較されたものであり得る。
TGF−βアンタゴニストとしての使用のための抗体は、天然に存在するTGF−βを、PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VHドメイン及び対応するPET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VLドメインにより形成されるTGF−β抗原結合部位の効力と等しいかそれより高い効力で中和し得る、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は合成抗体を含む。
抗体配列に加えて、TGF−βアンタゴニストとしての使用のための抗体は、例えば折り畳みドメインのようなペプチド若しくはポリペプチドを形成する他のアミノ酸、又は抗原に結合する能力に加えて別の機能的特徴を分子に付与する他のアミノ酸を含み得る。特異的抗体は検出可能な標識を有していてもよく、又は毒素若しくは標的化部分若しくは酵素に(例えばペプチジル結合又はリンカーを介して)結合されていてもよい。
抗原に結合する抗体は抗原結合部位を含む。抗原結合部位はまた、フィブロネクチン又はシトクロムBなどのような非抗体タンパク質足場上にCDRを配置することによりもたらされ得る。Koide et al.、(1998)Journal of Molecular Biology、284:1141−1151;Nygren et al.(1997) Current Opinion in Structural Biology、Vol.7:463−469)。タンパク質における新規な結合部位を設計するための足場は、Nygrenら(前出)により詳細に概説されている。抗体模倣物のためのタンパク質足場はWO 00/34784に開示されており、これは少なくとも1つの無作為化ループを有するフィブロネクチンIII型ドメインを含むタンパク質(抗体模倣物)を記載する。それに(into which to)1つ又はそれ以上のCDR(例えばHCDRのセット)が接合されている適切な足場は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのいずれかのドメインメンバーによりもたらされ得る。足場はヒトタンパク質でも非ヒトタンパク質でもよい。
非抗体タンパク質足場の利点は、それが少なくともいくつかの抗体分子より小さくかつ/又は製造が容易な保存されたフレームワーク領域において抗原結合部位を生じ得るということである。抗体の小さなサイズは、細胞に進入し、組織に深く浸透し、若しくは他の構造内の標的に達する能力、又は標的抗原のタンパク質空洞内に結合する能力のような、有用な生理学的特性を与え得る。
安定な骨格及び1つ又はそれ以上の可変ループを有するタンパク質が典型的であり、このタンパク質において、ループ(単数又は複数)のアミノ酸配列は、標的抗原に結合するための特異性を有する抗原結合部位を作製するために特異的に又は無作為に変異される。このようなタンパク質は、黄色ブドウ球菌(S.aureus)由来のタンパク質AのIgG結合ドメイン、トランスフェリン、テトラネクチン(tetranectin)、フィブロネクチン(例えば、第10フィブロネクチンIII型ドメイン)及びリポカリンを含む。他のアプローチは合成「マイクロボディ」(Selecore GmbH)を含み、これは分子内ジスルフィド結合を有する小さいタンパク質であるサイクロチドに基づくものである。
抗体配列及び/又は抗原結合部位に加えて、例えば折り畳みドメインのようなペプチド若しくはポリペプチドを形成する他のアミノ酸、又は抗原に結合する能力に加えて別の機能的特徴を分子に付与する他のアミノ酸を含み得る。抗体は検出可能な標識を有していてもよく、又は毒素若しくは標的化部分若しくは酵素に(例えばペプチジル結合又はリンカーを介して)結合されていてもよい。例えば、抗体は、抗原結合部位に加えて(例えば酵
素ドメインに)触媒部位を含み得、ここで抗原結合部位は抗原に結合し、従って触媒部位が抗原を標的にする。触媒部位は、例えば切断により、抗原の生物学的機能を阻害し得る。
素ドメインに)触媒部位を含み得、ここで抗原結合部位は抗原に結合し、従って触媒部位が抗原を標的にする。触媒部位は、例えば切断により、抗原の生物学的機能を阻害し得る。
上述のように、CDRはフィブロネクチン又はシトクロムBのような足場により保持され得るが(Haan&Maggos、2004 BioCentury、12(5):A1−A6;Koide et al.、前出;Nygren et al.、前出)、CDR又はCDRのセットを保持するための構造は、一般的には、CDR又はCDRのセットが、再配列された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するVH及びVL抗体可変ドメインのCDR又はCDRのセットに対応する位置に位置している、抗体重鎖若しくは軽鎖配列又はその実質的な部分のものである。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、現在はインターネットで利用可能な(URL:immuno.bme.nwu.edu又はいずれかの検索エンジンを使用して「Kabat」を見つける)Kabat、et al.、1987、及びその更新の参照により決定され得る。
モノクローナル抗体及び他の抗体を選択し、組み換えDNA技術を使用して元の抗体の特異性を保有する他の抗体又はキメラ分子を製造することが可能である。このような技術は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAを定常領域に連結させること、又は抗体の相補性決定領域(CDR)を異なる免疫グロブリンの定常領域及びフレームワーク領域中に導入することを含み得る。例えば、EP−A−184187、GB 2188638A又はEP−A−239400、及びそれに続く大量の文献を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受けていてもよく、これは産生される抗体の結合特異性を変更するかもしれないし変更しないかもしれない。
抗体工学の分野において利用可能なさらなる技術は、ヒト抗体及びヒト化抗体を単離することを可能にした。例えば、ヒトハイブリドーマはKontermannらにより記載されるように製造され得る(Kontermann R and Dubel Stefan;Antibody Engineering、Springer−Verlag New York、LLC;2001、ISBN:3540413545)。抗体を生成するための別の確立された技術であるファージディスプレイは多くの刊行物、例えばKontermann et al.(前出)、及びW092/01047(以下でさらに考察される)において詳細に記載されている。マウス免疫系の他の構成要素はインタクトなままにして、マウス抗体遺伝子が不活化され、ヒト抗体遺伝子で機能的に置き換えられているトランスジェニックマウスが、ヒト抗原に対するヒト抗体を単離するために使用され得る(Mendez et al.、1997)。モノクローナル又はポリクローナルのいずれかのヒト抗体はまた、他のトランスジェニック動物、例えばヤギ、ウシ、ヒツジ、ウサギなどにおいて製造され得る。
例えばKnappik et al.、前出又はKrebs et al.、Journal of Immunological Methods 254:67−84(2001)に記載されるように、合成され、そして適切な発現ベクター内に構築されたオリゴヌクレオチドを用いて生成された遺伝子からの発現により生成された合成抗体分子は、TGF−βアンタゴニストとして使用され得る。
全抗体のフラグメントは抗原に結合する機能を果たし得る。結合フラグメントの例は、(i)VL、CL、VH及びCH1ドメインからなるFabフラグメント;(ii)VH及びCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iii)単一の抗体のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント;(iv)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward、E.S.et al.、Nature 341、544−546(1989)、McCafferty et al.(1990)Nature、348、552−5
54);(v)単離されたCDR領域;(vi)2つの連結されたFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab')2フラグメント;(vii)VHドメイン及び
VLドメインがペプチドリンカーにより連結され、これら2つのドメインが連合して抗原結合部位を形成することを可能にされた単鎖Fv分子(scFv)(Bird et al.、Science、242、423−426、1988;Huston et al.、Proc.Natl.Acad.Sci USA 85、5879−5883;1998;(viii)二重特異的単鎖Fvダイマー(PCT/US92/09665);並びに(ix)「二特異性抗体」、遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性フラグメント(WO/13804);F.Holliger et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444−6448、1993)である。Fv、scFv又は二特異性抗体分子は、VH及びVLドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化され得る(Y.Reiter et al.、Nature Biotech、14、1239−1245、1996)。CH3ドメインに結合されたscFvを含むミニ抗体(Minibodies)もまた作製され得る(S.Hu et al.、Cancer Res.、56、3055−3061、1996)。
54);(v)単離されたCDR領域;(vi)2つの連結されたFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab')2フラグメント;(vii)VHドメイン及び
VLドメインがペプチドリンカーにより連結され、これら2つのドメインが連合して抗原結合部位を形成することを可能にされた単鎖Fv分子(scFv)(Bird et al.、Science、242、423−426、1988;Huston et al.、Proc.Natl.Acad.Sci USA 85、5879−5883;1998;(viii)二重特異的単鎖Fvダイマー(PCT/US92/09665);並びに(ix)「二特異性抗体」、遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性フラグメント(WO/13804);F.Holliger et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444−6448、1993)である。Fv、scFv又は二特異性抗体分子は、VH及びVLドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化され得る(Y.Reiter et al.、Nature Biotech、14、1239−1245、1996)。CH3ドメインに結合されたscFvを含むミニ抗体(Minibodies)もまた作製され得る(S.Hu et al.、Cancer Res.、56、3055−3061、1996)。
dAb(ドメイン抗体)は抗体の小さい単量体抗原結合フラグメント、すなわち抗体重鎖又は軽鎖の可変領域である(Holt et al.、2003)。VH dabは天然でラクダ科動物(例えば、ラクダ、ラマ)に存在し、そして標的抗原でラクダ科動物を免疫し、抗原特異的B細胞を単離し、そして個々のB細胞からdAb遺伝子をクローンすることにより製造され得る。dAbは細胞培養でも製造可能である。それらの小さいサイズ、良好な溶解性、及び温度安定性が、それらを選択及び親和性成熟のために特に生理学的に有用かつ適切なものにしている。抗体は、実質的に本明細書に記載されるVH又はVLドメインを含むdAbであっても、実質的に本明細書に記載されるCDRのセットを含むVH又はVLドメインであってもよい。
二重特異性抗体を使用しようとする場合、これらは従来の二重特異性抗体であってもよく、様々な方法で製造され得(Holliger、P.and Winter G.Current Opinion Biotechnol.4、446−449(1993))、例えば化学的に、若しくはハイブリッドハイブリドーマから製造され得、又は上述の二重特異性抗体フラグメントのうちのいずれかであってもよい。二重特異性抗体の例としては、異なる特異性を有する2つの抗体の結合ドメインが使用され得、かつ短い可動性のペプチドを介して直接連結され得るBiTETM技術のものが挙げられる。これは短い単一のポリペプチド鎖で2つの抗体を結合する。二特異性抗体及びscFvは、可変ドメインのみを使用してFc領域を含めずに構築され得、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減させる。
二重特異性全抗体とは対照的に、二重特異性二特異性抗体はまた、それらが容易に構築され得、そしてE.coliで発現され得るので特に有用であり得る。適切な結合特異性の二特異性抗体(及び多くの他のポリペプチド、例えば抗体フラグメント)は、ファージディスプレイ(WO94/13804)を使用してライブラリーから容易に選択され得る。二特異性抗体の1つのアームが、例えばTGF−βに対する特異性によらず一定に維持されるべき場合、他方のアームを変化させて適切な特異性の抗体が選択されるライブラリーが作製され得る。二重特異性全抗体はノブ−イントゥ−ホール(knobs−into−holes)操作により作製され得る(C.E.B.Ridgeway et al.、Protein Eng.、9、616−621、1996)。
抗体は天然で、若しくは様々な真核生物細胞(例えばCHO又はNS0(ECACC 85110503)細胞)の系のいずれかによりグリコシル化され得、又はそれらはグリコシル化されていない(unglycosylated)ものであり得る(例えば、原核
細胞における発現により産生される場合)。グリコシル化はまた、例えばフコシル化を阻害することにより意図的に変更され得、生じた抗体のADCC活性を増加させる。従って、抗体はフコシル化を最小限にするか又は排除するように発現され得る。
細胞における発現により産生される場合)。グリコシル化はまた、例えばフコシル化を阻害することにより意図的に変更され得、生じた抗体のADCC活性を増加させる。従って、抗体はフコシル化を最小限にするか又は排除するように発現され得る。
いくつかの実施態様において、CDR又はVH若しくはVLドメインは、その配列が本明細書に記載される特定の領域と同一であるか又は高度に類似している。1から5、好ましくは1から4又は1若しくは2、又は3若しくは4つのアミノ酸置換がCDR及び/又はVH若しくはVLドメインにおいて作製され得るということが考慮される。その配列が本明細書において示されるものに高度に類似したVH又はVLドメイン並びにCDR及びCDRのセットは、本明細書に実質的に記載される配列を有するものと同様に局面により包含される。
CDR又はCDRのセットを保持するための構造は、CDR又はCDRのセットが、再配列された免疫グロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するVH及びVL抗体可変ドメインのCDR又はCDRセットに対応する位置に位置している、抗体重鎖若しくは軽鎖配列又はその実質的な部分の構造である。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、現在はインターネットで利用可能な(URL:immuno.bme.nwu.edu又はいずれかの検索エンジンを使用して「Kabat」を見つける)Kabat、et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and Human Services.1987、及びその更新の参照により決定され得る。CDRはKabatらに従って定義される。CDRはまた他の足場、例えばフィブロネクチン又はシトクロムBにより保持され得る。
好ましくは、本明細書において実質的に記載されるCDRアミノ酸配列は、ヒト可変ドメイン又はその実質的な部分においてCDRとして保持される。本明細書において実質的に記載されるHCDR3配列は好ましい実施態様を表し、そしてこれらの各々がヒト重鎖可変ドメイン又はその実質的な部分においてHCDR3として保持されることが好ましい。
使用される可変ドメインは、いずれかの生殖系列若しくは再配列されたヒト可変ドメインから得られるか若しくは誘導され得、又は公知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列若しくは実際の配列に基づく合成可変ドメインであり得る。CDR配列(例えばCDR3)は、組み換えDNA技術を使用して、CDR(例えばCDR3)を欠いている可変ドメインのレパートリー中に導入され得る。好ましい生殖系列フレームワークは本明細書において既に同定されている。
Marksら(Bio/Technology、1992、10:779−783)は、抗体可変ドメインのレパートリーを製造する方法を記載し、ここで 可変ドメイン領域の5’末端に向けられているか又は隣接するコンセンサスプライマーが、ヒトVH遺伝子の第3のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと併せて、CDR2を欠いたVκ可変ドメインのレパートリーを生じるために使用される。Marksらはさらに、このレパートリーが特定の抗体のCDR2とどのように組み合わせられ得るかを記載する。同様の技術を使用して、CDR3由来配列は、CDR3を欠いたVH又はVLドメインのレパートリーとシャッフルされ得、そしてシャッフルされた完全VH又はVLドメインは同族VL又はVHドメインと組み合わされて抗体を生じる。次いでレパートリーは適切な宿主系、例えばWO92/01047又はそれに続く大量の文献(Kay、B.K.、Winter、J.、and McCafferty、J.(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual、San Diego:Academic Pressを含む)
のいずれかのファージディスプレイ系において提示され得、その結果、適切な抗体が選択され得る。レパートリーは、104以上の個々のメンバー、例えば、106から108又は
1010のメンバーからなり得る。他の適切な宿主系としては、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、T7ディスプレイ、リボソームディスプレイ、共有結合ディスプレイなどが挙げられる。
のいずれかのファージディスプレイ系において提示され得、その結果、適切な抗体が選択され得る。レパートリーは、104以上の個々のメンバー、例えば、106から108又は
1010のメンバーからなり得る。他の適切な宿主系としては、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、T7ディスプレイ、リボソームディスプレイ、共有結合ディスプレイなどが挙げられる。
同様のシャッフリング又はコンビナトリアル技術はまたStemmerにより開示され(Nature、1994、370:389−391)、β−ラクタマーゼ遺伝子に関連した技術を記載するが、このアプローチが抗体の生成のために使用され得るという意見を述べている。
さらなる代替は、可変ドメイン全体内に変異を生成するために1つ又はそれ以上の選択されたVH及び/又はVL遺伝子のランダム変異誘発を使用して誘導された、CDRを保持する新規なVH又はVL領域を生成することである。このような技術はGramら(Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、89:3576−3580)により記載され、誤りがちの(error−prone)PCRが使用された。好ましい実施態様において、1つ又は2つのアミノ酸置換がHCDR及び/又はLCDRのセット内に作成される。使用され得る別の方法は、変異誘発をVH又はVL遺伝子のCDR領域に向けることである。このような技術はBarbasら(1994、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、91:3809−3813)及びSchierら(J.Mol.Biol.263:551−567)により開示される。本明細書において提供される開示を考慮して、当業者は、当該分野における通常の方法論を使用してさらなる抗体を得るためにこのような技術を使用することができるだろう。PET1073G12、PET1074B9又はPET1287A10 VHドメインは、変異を受けて、1つ又はそれ以上のVLドメインと組み合わせられ得る1つ又はそれ以上のVHドメインアミノ酸配列を生じ得る。
VHドメインは生殖系列配列を有し得、そして好ましい実施態様ではDP−10又はDP−88である。VLドメイン配列は生殖系列配列を有し得、そして好ましい実施態様ではDPK−22である。PET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10 HCDR1、HCDR2及びHCDR3の1つ又はそれ以上、又はHCDRのPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10セットが使用され得、かつ/又はPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10 LCDR1、LCDR2及びLCDR3の1つ若しくはそれ以上、若しくはLCDRのPET1073G12、PET1074B9若しくはPET1287A10セットが使用され得る。
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、それらの介在フレームワーク領域と一緒に、少なくとも3つのCDR領域を含む。好ましくは、この部分は第一及び第4のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約50%を含み、50%は第一のフレームワーク領域のC末端50%及び第4のフレームワーク領域のN末端50%である。可変ドメインの実質的な部分のN末端又はC末端におけるさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域と通常は関連していない残基であり得る。例えば、組み換えDNA技術により作製される抗体の構築は、クローン化又は他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによりコードされるN末端又はC末端残基の導入を生じ得る。他の操作工程は、可変ドメインを、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン(例えば、二特異性抗体の製造において)又はタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に結合するためのリンカーの導入を含む。
一対のVH及びVLドメインを含む抗体が好ましく、VH又はVLドメイン配列のいず
れかに基づく単一の結合ドメインも使用され得る。単一の免疫グロブリンドメイン、特にVHドメインは、特異的様式で標的抗原に結合することができるということが知られている。単一の特異的結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインは、ヒトTGF−βの3つのアイソフォームに結合することができる2ドメイン抗体を形成することができる相補的ドメインについてスクリーニングするために使用され得る。
れかに基づく単一の結合ドメインも使用され得る。単一の免疫グロブリンドメイン、特にVHドメインは、特異的様式で標的抗原に結合することができるということが知られている。単一の特異的結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインは、ヒトTGF−βの3つのアイソフォームに結合することができる2ドメイン抗体を形成することができる相補的ドメインについてスクリーニングするために使用され得る。
これはWO92/01047に開示されるようないわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを使用するファージディスプレイスクリーニング方法により達成され得、この方法では、H又はL鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを使用して、他の鎖(L又はH)をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、そして生じた二重鎖抗体を、この参考文献に記載されるようなファージディスプレイ技術にしたがって選択する。
抗TGF−β抗体は抗体定常領域又はその部分をさらに含み得る。例えば、VLドメインはそのC末端において、ヒトCκ又はCλ鎖(好ましくはCκ鎖)を含む抗体軽鎖定常ドメインに結合され得る。同様に、VHドメインに基づく抗体は、そのC末端において、いずれかの抗体アイソタイプ、例えばIgG、IgA、IgE及びIgM並びにアイソタイプサブクラス、特にIgG1及びIgG4由来の免疫グロブリン重鎖の全て又は一部(例えばCH1ドメイン)に結合され得る。IgG4が好ましい。IgG4は、補体に結合せず、減少したエフェクター機能を有するので、いくつかの適用に好ましい。エフェクター機能が所望される場合、IgG1が好ましい。エフェクター機能はまた、当該分野で公知の方法により、例えばフコース含有量を減少させることにより、抗体のグリコシル化状態を操作することにより増加され得る。重鎖はC末端リジン残基を有するかもしれないし有していないかもしれない。これらの特性を有し、かつ可変領域を安定化するいずれかの合成又は他の定常領域変異体もまたいくつかの実施態様において使用され得る。
抗体又はその抗原結合フラグメントの不均質調製物が有用であり得る。例えば、このような調製物は、全長重鎖を有する抗体及びC末端リジンを欠いた重鎖を有する抗体、様々な程度のグリコシル化を有する抗体、誘導体化アミノ酸(例えばN末端グルタミン酸を環化してピログルタミン酸残基を形成する)を有する抗体並びに/又は重鎖及び/若しくは軽鎖の脱アミド形態を有する抗体の混合物であり得る。
TGF−β抗体を含む組成物は、それを必要とする個体に、好ましくは「治療有効量」で投与され得、これは患者に対する利益を示すために十分である。このような利益は、特定の疾患又は障害の少なくとも1つの症状の少なくとも改善であり得る。投与される実際の量、及び投与の速度及び時間経過は、処置される疾患の性質及び重症度に依存する。処置の処方、例えば投薬量の決定などは、前臨床及び臨床研究に基づいて決定され、その研究設計は十分に当該分野における技術レベル内である。
抗体は、注射(例えば、皮下、静脈内、腔内(例えば、腫瘍切除後)、病巣内、腹腔内又は筋内)により、吸入により、又は局所的に(例えば、眼内、鼻腔内、直腸、創傷内、皮膚上)、又は経口的に投与され得る。投与経路は、製品の物理化学的特徴により、疾患についての特別な考慮により、用量若しくは投薬間隔により、又は有効性を最適化するため若しくは副作用を最小にするための要件により決定され得る。
抗TGF−β処置は医療専門家による投与に制限される必要はないということが構想される。従って、特に無針デバイスを使用する皮下注射が適切であるかもしれない。
正確な用量は、患者の状態及び病歴、抗体の正確な性質(例えば、全抗体、フラグメント又は二特異性抗体)、並びにいずれかの検出可能な標識又は抗体に結合された他の分子
の性質を含む多数の因子に依存する。典型的な抗体の用量は、全身適用について100μg〜1gmの範囲、そして局所適用について1μg〜1mgの範囲である。典型的には、抗体は全抗体であり、好ましくはIgG4アイソタイプである。これは成体患者の一回の処置のための用量であり、これは小児及び乳児については比例的に調整され得、そして分子量及び活性に比例して他の抗体形式についても調整され得る。処置は、毎日、週に2回、毎週、毎月又は他の間隔で、医師の裁量で繰り返され得る。
の性質を含む多数の因子に依存する。典型的な抗体の用量は、全身適用について100μg〜1gmの範囲、そして局所適用について1μg〜1mgの範囲である。典型的には、抗体は全抗体であり、好ましくはIgG4アイソタイプである。これは成体患者の一回の処置のための用量であり、これは小児及び乳児については比例的に調整され得、そして分子量及び活性に比例して他の抗体形式についても調整され得る。処置は、毎日、週に2回、毎週、毎月又は他の間隔で、医師の裁量で繰り返され得る。
抗体は通常、医薬組成物の形態で投与され得、これは抗体に加えて少なくとも1つの成分を含み得る。AMIの処置方法における使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容しうる添加剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含み得る。このような物質は非毒性であるべきであり、そして活性成分の有効性を妨げるべきではない。このような物質としては、生理学的に適合性の、例えば任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられ得る。薬学的に許容しうる担体のいくつかの例は、水、食塩水、リン酸緩衝化食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、さらにはそれらの組み合わせである。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容しうる物質のさらなる例は、湿潤剤又は少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存料又は緩衝剤であり、これらは抗体の貯蔵寿命又は有効性を増強する。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路に依存し、これは経口、局所、吸入によるもの又は注射によるもの、例えば静脈内であり得る。好ましい実施態様において、抗体は静脈内注入又は注射により投与される。別の好ましい実施態様において、抗体は筋内注射又は皮下注射により投与される。
経口投与のための医薬組成物は、例えば不活性希釈剤又は同化可能な食用担体を用いた、錠剤、カプセル剤、散剤又は液状形態であり得る。錠剤は固形担体、例えばゼラチン又はアジュバントを含み得る。液状医薬組成物は、液状担体、例えば水、石油、動物油又は植物油、鉱油又は合成油を一般的に含む。生理食塩水、デキストロース又は他のサッカリド溶液又はグリコール類、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールが含まれ得る。抗体(及び必要に応じて他の成分)はまた、硬質又は軟質シェルゼラチンカプセル中に封入されるか、錠剤へと圧縮されるか、又は被験体の食事に直接組み込まれ得る。経口治療的投与のために、活性成分は、添加剤とともに組み込まれ得、そして摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤(wafers)などの形態で使用され得る。非経口投与以外で化合物を投与するために、その不活化を防止するための物質で化合物をコーティングするか、又はそのような物質と化合物を同時投与することが必要かもしれない。
静脈内注射、又は患部での注射のために、活性成分は、発熱物質を除去され、かつ適切なpK、等張性及び安定性を有する非経口的に許容しうる水溶液の形態である。関連分野の当業者は、例えば等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射、リンゲル液、及び/又は乳酸リンゲル液を使用して、適切な液剤を製造することが十分可能である。保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び/又は他の添加剤が必要に応じて含まれ得る。
組成物は、単独で投与されても、他の処置と組み合わせて、処置しようとする状態に依存して同時又は連続的のいずれかで投与されてもよい。
抗体は、液状液剤(例えば、注射液及び注入可能液)、分散剤又は懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム及び坐剤のような、液状、半固形、又は固形の形態で製剤化され得る。好ましい形態は、意図される投与様式、治療的適用、分子の物理化学的特性及び送達経路に依存する。製剤は、添加剤、添加剤の組み合わせを含み得る、例えば:糖類、アミノ酸及び界面活性剤。液状製剤は、広範な抗体濃度及びpHを含み得る。固形製剤は、例え
ば凍結乾燥、噴霧乾燥、又は超臨界流体技術による乾燥により製造され得る。
ば凍結乾燥、噴霧乾燥、又は超臨界流体技術による乾燥により製造され得る。
治療用組成物は、典型的には滅菌でかつ製造及び貯蔵の条件下で安定でなくてはならない。組成物は溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化され得る。滅菌注射液は、抗体を必要量で適切な溶媒中に、必要に応じて上で列挙した成分の1つ又は組み合わせとともに取り入れて、続いて滅菌ろ過することにより製造され得る。一般に、分散液は、基本の分散媒及び上で列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を取り入れることにより製造される。滅菌注射液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分及び前もって滅菌ろ過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥である。液剤の適切な流動性は、例えばコーティング(例えばレシチン)の使用により、分散液の場合は必要な粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持され得る。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を送らせる薬剤、例えばモノステアリン酸及びゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
特定の実施態様において、抗体組成物の活性化合物は、急速な放出に対して抗体を保護する担体を用いて調製され得る(例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤)。生分解性の、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。このような製剤の製造のための多くの方法は、特許されているか、又は当業者に一般的に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J.R.Robinson、ed.、Marcel Dekker、Inc.、New York、1978)を参照のこと。
様々な実施態様において、他の治療計画が抗TGF−β抗体の投与と組み合わせられ得る。組み合わせ投与は、別々の製剤又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及びいずれかの順序での連続的投与を含み、ここで好ましくは両方(又は全て)の活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。
心筋梗塞の結果の予防又は処置のための、TGF−βアンタゴニストの適切な投薬量は、患者の状態、梗塞の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体への反応、並びに主治医の裁量に依存する。アンタゴニストは、虚血事象の0日後(例えば、約8、12又は24時間以内)、1日後、2日後、3日後、4日後、又は5日後、好ましくは0日後、3日後、又は5日後の間に開始して、1回で、又は一連の処置にわたって投与され得る。すなわち、いくつかの実施態様において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、急性心筋虚血の発生の約120時間以内、約96時間以内、約72時間以内、約48時間以内、約24時間以内、約12時間以内に、又は約8時間若しくはそれより短い時間内にも開始され得る。状態の種類及び重症度に依存して、約5mg/kgの抗体は、1つ又はそれ以上の別々の投与によるか、又はMI後の連続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初期候補投薬量である。典型的な1日投薬量は、上述の因子に依存して、5mg/kgに等しいか又はそれ以下である。数日にわたる又はそれより長期の繰り返し投与については、状態に依存して、疾患症状の所望の抑制が起こるまで処置が持続される。抗体の好ましい投薬量は、静脈内投与される5mg/kg又はそれ以下である。従って、約5mg/kg又はそれ以下(又はそのいずれかの組み合わせ)の1又はそれ以上の用量が患者に投与され得る。しかし、他の投与計画が有用であるかもしれない。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
抗TGF−β抗体は、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系のアンタゴニスト
と組み合わされた場合にAMIを処置するために有用であり、このアンタゴニストとしては、限定されないが:レニン阻害剤、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、Ang II受容体アンタゴニスト(「Ang II受容体遮断薬」としても知られる)、及びアルドステロンアンタゴニストが挙げられる。抗TGF−β抗体はまた、ベータ−アドレナリン作用系のアンタゴニストと組み合わされた場合にAMIの処置のために有用であり、このアンタゴニストとしては、限定されないが、アルプレノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、及びネビボロールからなる群が挙げられる。さらに、抗TGF−β抗体は、脂質管理薬(lipid management agents)と組み合わされた場合にAMIを処置するために有用であり、この脂質管理薬としては、限定されないが、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、レスバスタチン(resuvastatin)からなるスタチンの群、クレスチラミン(chlestyramine)、セレスチポル(celestipol)、コレセバラム(colesevalam)からなる胆汁酸捕捉剤の群、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブレートからなるフィブリン酸の群、ニコチン酸及びナイアスパン(niaspan)を含む群、コレステロール低下剤エゼチミベ(ezetimibe)及びエゼチミベとシンバスタチンとの組み合わせを含む群が挙げられる。別の局面において、抗TGF−β抗体は、抗血小板薬/抗凝固薬と組み合わされた場合にAMIを処置するために有用であり、抗血小板薬/抗凝固薬としては、限定されないが、アスピリン;クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル(ticagrelor)、チクロピジンからなるADP阻害剤の群、及び抗凝固薬ワルファリンが挙げられる。
と組み合わされた場合にAMIを処置するために有用であり、このアンタゴニストとしては、限定されないが:レニン阻害剤、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、Ang II受容体アンタゴニスト(「Ang II受容体遮断薬」としても知られる)、及びアルドステロンアンタゴニストが挙げられる。抗TGF−β抗体はまた、ベータ−アドレナリン作用系のアンタゴニストと組み合わされた場合にAMIの処置のために有用であり、このアンタゴニストとしては、限定されないが、アルプレノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、及びネビボロールからなる群が挙げられる。さらに、抗TGF−β抗体は、脂質管理薬(lipid management agents)と組み合わされた場合にAMIを処置するために有用であり、この脂質管理薬としては、限定されないが、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、レスバスタチン(resuvastatin)からなるスタチンの群、クレスチラミン(chlestyramine)、セレスチポル(celestipol)、コレセバラム(colesevalam)からなる胆汁酸捕捉剤の群、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート、クロフィブレートからなるフィブリン酸の群、ニコチン酸及びナイアスパン(niaspan)を含む群、コレステロール低下剤エゼチミベ(ezetimibe)及びエゼチミベとシンバスタチンとの組み合わせを含む群が挙げられる。別の局面において、抗TGF−β抗体は、抗血小板薬/抗凝固薬と組み合わされた場合にAMIを処置するために有用であり、抗血小板薬/抗凝固薬としては、限定されないが、アスピリン;クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル(ticagrelor)、チクロピジンからなるADP阻害剤の群、及び抗凝固薬ワルファリンが挙げられる。
処置において使用される抗体の治療用製剤は、静脈内処置に利用可能な容器で提供され得る。製剤は、所望の純度を有する抗体と、任意の薬学的に許容しうる担体、添加剤、安定化剤(限定されないが、Remington's Pharmaceutical S
ciences 16th edition、Osol、A.Ed.(1980)に記載されるものを含む)とを混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、貯蔵のために製造され得る。許容しうる担体、添加剤、又は安定化剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン;単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体;及び/又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。
ciences 16th edition、Osol、A.Ed.(1980)に記載されるものを含む)とを混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、貯蔵のために製造され得る。許容しうる担体、添加剤、又は安定化剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン;単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体;及び/又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。
製剤はまた、処置される特定の適応症のために、必要に応じて1つより多くの活性化合物を含有し得る。好ましくは、相補的な活性を有する化合物は互いに有害な影響を与えない。あるいは、又はさらに、組成物はさらに、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン薬、TGF−β標的薬、抗血管新生薬、及び/又は心臓保護薬(cardioprotectant)を含み得る。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
「サイトカイン」は、細胞間メディエータとして別の細胞に対して作用する1つの細胞集団により放出されるタンパク質についての総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;レラキシン;プロレラキシン(prorelaxin);糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、及び黄体形成ホルモン(LH);肝臓増殖因子;線維芽細胞増殖因子;プロラクチン;胎盤性ラクトゲン;腫瘍壊死因子−α及び−β;ミュラー阻害物質;マウスゴナドトロピン結合ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);神経発育因子、例えばNGF−.β.;血小板増殖因子;インスリン様成長因子−I及び−II;エリトロポイエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン、例えばインターフェロン−α、β、及び−γ;コロニー刺激因子(CSF)、例えばマクロファージ−CSF(M−CSF);顆粒球−マクロファージ−CSF(GM−CSF);及び顆粒球−CSF(G−CSF);インターロイキン(IL)、例えばIL−1、IL−1α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12;腫瘍壊死因子、例えばTNF−α又はTNF−β;並びにLIF及びkitリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される用語サイトカインには、天然供給源由来のタンパク質又は組み換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「心臓保護薬」は、患者への抗TGF−β抗体のような薬物の投与に関連する心筋機能不全(すなわち、心筋症及び/又はうっ血性心不全)を予防するか又は減少させる化合物又は組成物である。心臓保護薬は、例えばフリーラジカル媒介心臓毒性効果を遮断し得るか若しくは減少させ得、かつ/又は酸化的ストレス傷害を予防し得るか若しくは減少させ得る。
活性成分はまた、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションでの、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に封入され得る。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed
ition、Osol、A.Ed.(1980)に開示される。
ition、Osol、A.Ed.(1980)に開示される。
徐放性製剤が製造され得る。徐放性製剤の適切な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ得、これらのマトリックスは、成形された物品の形態、例えばフィルム又はマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、限定されないが、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド、L−グルタミン酸及びγエチル−L−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、並びにポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。インビボ投与のために使用しようとする製剤は滅菌でなければならない。これは滅菌ろ過膜を通す濾過により容易に達成される。
上記のようなMIの処置のために有用な物質を含有する製品が提供され得、これは一般的に、容器、及びその容器上又は容器に取り付けられたラベル又は添付文書を含む。「添付文書」は、治療用製品の市販用パッケージに習慣的に含まれる指示を含み、この指示は、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌、及び/又はこのような治療用製品の使用に関する
警告に関する情報を含む。
警告に関する情報を含む。
適切な容器としては、限定されないが、瓶、バイアル、静脈注射液バッグ、容器(vessels)、シリンジなどが挙げられる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成され得る。容器は、TGF−βシグナル伝達の阻害に有効な組成物を保持し、そして滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射液バッグ又はバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性成分は抗TGF−β抗体であり得る。ラベル又は添付文書は、その組成物が心筋梗塞、急性心筋梗塞の処置、又は心筋梗塞の結果の減少のために使用されるということを示し得る。一実施態様において、ラベル又は添付文書は、抗体を含むその組成物が心筋梗塞の急性期の間に投与され得るということを示す。
さらに、製品は、抗TGF−β抗体の組成物、及び抗体以外の治療剤を含む容器を含み得る。製品はさらに、第一及び第二の組成物が心筋梗塞を処置するために組み合わせて使用され得るということを示す添付文書を含み得る。この治療剤は、前の項において記載される補助的治療のいずれかであり得る(例えば、抗血管新生剤、抗ホルモン化合物、心臓保護薬、及び/又はサイトカインを含む哺乳動物における免疫機能の調節因子)。あるいは、又はさらに、製品は薬学的に許容しうる緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化食塩水、リンゲル液及びデキストロース液を含む第二(又は第三)の容器をさらに含み得る。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的かつ使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
便宜上、抗TGF−β抗体はキットで提供され得、すなわち、所定の量の試薬と指示書の梱包された組み合わせで提供され得る。さらに、他の添加物、例えば安定剤、緩衝液(例えばブロックバッファー又は溶解バッファー)が含まれ得る。特に、抗体は、溶解の際に適切な濃度を有する溶液を生じる添加剤を含む、通常は統括乾燥された乾燥粉末として提供され得る。
要旨及び上記の詳細な説明において記載される方法に加えて、以下の実施態様もそれらの中に考慮される。心筋梗塞、急性心筋梗塞に罹患した患者を処置する方法又は患者における急性心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法は、心筋梗塞の急性期の間にTGF−βのアンタゴニストを患者に投与することを含み得る。TGF−βアンタゴニストは、TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに対して特異的な抗体又は抗体フラグメントを含むタンパク質;TGF−β受容体;1つ又はそれ以上のTGF−β受容体に対して特異的な抗体又は抗体フラグメントを含むタンパク質;潜伏期関連ペプチド;大潜伏型(large latent)TGF−β、TGF−β阻害プロテオグリカン;ソマトスタチン;マンノース−6−リン酸;マンノース−1−リン酸;プロラクチン;インスリン様成長因子II;IP−10;arg−gly−asp含有ペプチド;植物、真菌、又は細菌の抽出物;アンチセンス又は干渉RNAオリゴヌクレオチド;及びTGF−βシグナル伝達に関与するタンパク質からなる群より選択され得る。
好ましい実施態様において、TGF−βのアンタゴニストはヒト化抗TGF−β抗体又は抗TGF−β抗体のフラグメント若しくは抗原結合部位である。TGF−βアンタゴニストは、TGF−βの1つより多くのアイソフォームに結合しかつそれらを中和することができる抗体又は抗体フラグメントであり得る。抗体は、TGF−β結合部分及び残りの部分を含むキメラモノクローナル抗体であり得、該TGF−β結合部分は、モノクローナル抗体1D11.16の抗原結合部分を含み、そして残りの部分は1つ又はそれ以上のヒト抗体から誘導されたものである。TGF−βの1つより多くのアイソフォームに対して特異的な抗体は、モノクローナル抗体1D11.16のヒト又はヒト化形態であり得、TGF−βのアンタゴニストは、ヒトTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3を中和
する抗体又は抗体フラグメントであり得る。
する抗体又は抗体フラグメントであり得る。
TGF−βのアンタゴニストの投与は、急性心筋虚血の発生の約120時間以内、約80時間以内、約72時間以内、約48時間以内、又は約24時間以内に開始され得る。いくつかの例において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、急性心筋虚血の発生の約12時間以内に開始される。TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織のマクロファージ及び単核の実質的な浸潤の前に開始され得る。他の例では、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の好中球浸潤を特徴とする期間中に開始される。さらに、いくつかの例において、TGF−βのアンタゴニストの投与は、心筋梗塞により影響を受ける組織の壊死を特徴とする期間中に開始される。
本方法はまた、TGF−βの所望の機能を選択的に回復させることができる化合物を、急性心筋梗塞と診断された患者に、心筋梗塞の急性期の間に投与することを含み得る(例えば、抗炎症薬及び/又はTNF−αのアンタゴニスト)。本方法は、患者がヒト又は非ヒト哺乳動物であり得るようにヒト及び獣医学の薬剤において使用され得る。
TGF−βのアンタゴニストに関して、いくつかの実施態様では、アンタゴニストはヒトTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3を中和する抗体であり、かつ抗体の抗原結合ドメインを含み、ここでこの抗原結合ドメインは、CDRのセットHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、そしてこの抗原結合ドメインはヒトVH1ファミリー遺伝子を利用し、そしてこのHCDR3は、配列番号5、配列番号15及び配列番号25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。ヒトVH1ファミリー遺伝子はヒトVH1−2遺伝子であり得、これはいくつかの例ではDP−10又はDP−88遺伝子であり得る。抗原結合ドメインは、CDRのセットLCDR1、LCDR2及びLCDR3をさらに含み得、そしてここでこの抗原結合ドメインはヒトVκ3ファミリー遺伝子を利用し、そしてこのLCDR3は、配列番号10、配列番号20及び配列番号30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。HCDR3及びLCDR3は;(a)それぞれ配列番号5及び配列番号10;(b)それぞれ配列番号15及び配列番号20;並びに(c)それぞれ配列番号25及び配列番号30からなる群より選択され得る。
いくつかの実施態様において、ヒトVκ3ファミリー遺伝子はヒトVK DPK22遺伝子であり得る。VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列重鎖フレームワーク内に含まれ得るか、又はVHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列アミノ酸配列からの12個までの変異を含むフレームワーク内にある。VκドメインのLCDR1、LCDR2及びLCDR3は生殖系列重鎖フレームワーク内に含まれ得る。いくつかの例において、VκドメインのLCDR1、LCDR2及びLCDR3は、生殖系列Vκアミノ酸配列からの5個までの変異を含むフレームワーク内にあり得る。
TGF−βのアンタゴニストは、ヒトTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3を中和し、かつ抗体の抗原結合ドメインを含む抗体であり得、ここでこの抗原結合ドメインはヒトVH DP−10遺伝子又はヒトVH DP−88遺伝子を利用し、かつ配列番号31におけるアミノ酸配列を含むFR4アミノ酸配列を含む。抗原結合ドメインはヒトVH DP−10遺伝子又はヒトVH DP−88遺伝子を利用し得、かつCDRのセットHCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、ここでこのHCDR3は、配列番号5、配列番号15及び配列番号25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号31におけるアミノ酸配列を含むFR4アミノ酸配列をさらに含む。抗原結合ドメインは、ヒトVκ3ファミリー遺伝子及びヒトJκ5遺伝子をさらに利用し得る。ヒトVκ3ファミリー遺伝子及びヒトJκ5遺伝子を利用する抗原結合ドメインは、CDRのセッ
トLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み得、ここでこのLCDR3は、配列番号10、配列番号20及び配列番号30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
トLCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み得、ここでこのLCDR3は、配列番号10、配列番号20及び配列番号30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施態様において、TGF−βのアンタゴニストは、ヒトTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3を中和し、かつ抗体の抗原結合ドメインを含み、ここでこの抗原結合ドメインは:(a)配列番号3のアミノ酸配列のHCDR1、配列番号4のアミノ酸配列のHCDR2、配列番号5のアミノ酸配列のHCDR3;(b)配列番号13のアミノ酸配列のHCDR1、配列番号14のアミノ酸配列のHCDR2、配列番号15のアミノ酸配列のHCDR3;又は(c)配列番号23のアミノ酸配列のHCDR1、配列番号24のアミノ酸配列のHCDR2、配列番号25のアミノ酸配列のHCDR3を含む。抗原結合ドメインは抗体VLドメインをさらに含み得る。抗原結合ドメインは:(a)配列番号8のアミノ酸配列のLCDR1、配列番号9のアミノ酸配列のLCDR2、配列番号10のアミノ酸配列のLCDR3;(b)配列番号18のアミノ酸配列のLCDR1、配列番号19のアミノ酸配列のLCDR2、配列番号20のアミノ酸配列のLCDR3;及び(c)配列番号28のアミノ酸配列のLCDR1、配列番号29のアミノ酸配列のLCDR2、配列番号30のアミノ酸配列のLCDR3からなる群より選択されるLCDRを含み得る。いくつかの例において、VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列重鎖フレームワーク内、例えばヒトVH1ファミリーフレームワーク内に含まれ得る。VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3は、生殖系列ヒト重鎖フレームワークVH1 DP−10又はDP−88内にあり得る。VLドメインのLCDR1、LCDR2及びLCDR3は、生殖系列軽鎖フレームワーク内にあり得る。生殖系列軽鎖フレームワークは、ヒトVκ3ファミリーフレームワークであり得る。抗原結合ドメインはヒトJκ5遺伝子をさらに含み得る。ヒトVκ3ファミリー遺伝子はVκ
DPK22遺伝子であり得る。
DPK22遺伝子であり得る。
いくつかの変形において、TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1073G12 VHドメイン(配列番号2)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1074B9
VHドメイン(配列番号12)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1287A10 VHドメイン(配列番号22)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1073G12 VLドメイン(配列番号7)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1074B9 VLドメイン(配列番号17)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1287A10 VLドメイン(配列番号27)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、PET 1073G12 VHドメイン(配列番号2)及びPET 1073G12 VLドメイン(配列番号7)を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、PET 1074B9 VHドメイン(配列番号12)及びPET 1074B9 VLドメイン(配列番号17)を含む抗体であり得る。あるいは、TGF−βのアンタゴニストは、PET 1287A10 VHドメイン(配列番号22)及びPET 1287A10 VLドメイン(配列番号27)を含む抗体であり得る。本明細書に記載されるさらなる変形もまた考慮される。
VHドメイン(配列番号12)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1287A10 VHドメイン(配列番号22)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1073G12 VLドメイン(配列番号7)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1074B9 VLドメイン(配列番号17)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、5個までの変異を有するPET1287A10 VLドメイン(配列番号27)、又はその抗原結合部分を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、PET 1073G12 VHドメイン(配列番号2)及びPET 1073G12 VLドメイン(配列番号7)を含む抗体であり得る。TGF−βのアンタゴニストは、PET 1074B9 VHドメイン(配列番号12)及びPET 1074B9 VLドメイン(配列番号17)を含む抗体であり得る。あるいは、TGF−βのアンタゴニストは、PET 1287A10 VHドメイン(配列番号22)及びPET 1287A10 VLドメイン(配列番号27)を含む抗体であり得る。本明細書に記載されるさらなる変形もまた考慮される。
配列番号は、本開示の一部を形成する添付の配列表中に見られる配列を指す。本方法をその特定の実施態様を参照して詳細に記載してきたが、以下の本開示の範囲又は特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な変更が為され得、そして等価物が使用され得るということが当業者には明らかだろう。さらに、以下の実施例は、本方法の局面の説明として示されるものであり、限定として解釈されるべきではない。
実施例1−抗体精製
モノクローナル抗体1D11及びGC 1008を、培養上清又は腹水のいずれかからプロテインA−セファロースクロマトグラフィーにより精製した(Goding、J Immunol Meth(1976)42;17)(Pharmacia Fien Chemicals、Uppsala、Sweden)。ガンマ(γ)1サブクラス及びガンマ(γ)4サブクラスのモノクローナル抗体、1D11及びGC 1008の、プロテインAへの結合を、市販の調製結合緩衝液を加えることにより増強した(BioRad、Richmond、Calif.)。抗体をプロテインA−セファロースから0.05Mグリシン−HCl及び0.15M NaCl緩衝液(pH2.3)を用いて溶出し、PBS及びNaCl緩衝液(pH2.3)に対して終夜透析し、PBSに対して終夜透析し、そして−20℃で保存した。上清から精製されたガンマ(γ)1及びガンマ(γ)4サブクラス抗体を濃縮し、そしてプロテインA−クロマトグラフィーの前に硫酸アンモニウム塩析(50%飽和)により部分的に精製した。
モノクローナル抗体1D11及びGC 1008を、培養上清又は腹水のいずれかからプロテインA−セファロースクロマトグラフィーにより精製した(Goding、J Immunol Meth(1976)42;17)(Pharmacia Fien Chemicals、Uppsala、Sweden)。ガンマ(γ)1サブクラス及びガンマ(γ)4サブクラスのモノクローナル抗体、1D11及びGC 1008の、プロテインAへの結合を、市販の調製結合緩衝液を加えることにより増強した(BioRad、Richmond、Calif.)。抗体をプロテインA−セファロースから0.05Mグリシン−HCl及び0.15M NaCl緩衝液(pH2.3)を用いて溶出し、PBS及びNaCl緩衝液(pH2.3)に対して終夜透析し、PBSに対して終夜透析し、そして−20℃で保存した。上清から精製されたガンマ(γ)1及びガンマ(γ)4サブクラス抗体を濃縮し、そしてプロテインA−クロマトグラフィーの前に硫酸アンモニウム塩析(50%飽和)により部分的に精製した。
実施例2−心虚血再灌流のラットモデルにおけるTGF−β阻害剤の効果
12〜14週齢の雌性Lewisラットを5つの処置グループに割り当てた。0日目(D0)に、全ての動物は心虚血とその後の再灌流の手順(I/R)を受けた。心虚血は、左心室上の左前下行冠動脈を一時的に60分間結紮することにより引き起こされた。次いで、心臓の虚血部分の再灌流を可能にするために結紮を外した。I/Rの3又は5日後に開始して、5mg/kgの1D11又はコントロール品(ネガティブコントロール抗体13C4又はビヒクル)を静脈内(IV)注射により投与し、次いで28日目まで3日ごとに再投与した。
12〜14週齢の雌性Lewisラットを5つの処置グループに割り当てた。0日目(D0)に、全ての動物は心虚血とその後の再灌流の手順(I/R)を受けた。心虚血は、左心室上の左前下行冠動脈を一時的に60分間結紮することにより引き起こされた。次いで、心臓の虚血部分の再灌流を可能にするために結紮を外した。I/Rの3又は5日後に開始して、5mg/kgの1D11又はコントロール品(ネガティブコントロール抗体13C4又はビヒクル)を静脈内(IV)注射により投与し、次いで28日目まで3日ごとに再投与した。
リスク領域(AAR)を分析するために、黄色蛍光色素で標識した直径15μmのミクロスフェアを、左下行冠動脈の一時的結紮を外す直前に左心室中に注射した(D0)。ミクロスフェアは血液中に一様に分布し、そして心臓並びに他の器官及び組織の毛細血管に留まった。心臓におけるAARを、結紮期間中にミクロスフェア(すなわち血液)を受け入れなかった心筋組織の領域と定義した。28日目に、動物をイソフルランで軽く麻酔し、そして心拍数を350±50bpmに維持した。次いで局所的及び全体的な心機能を評価するために心エコーを長軸像で行った。心エコー試験の後、ペントバルビタールナトリウムの過量投与で安楽死させた。次いで心臓を組織学的分析のために切除した。
AARを評価し、続いて定性的なスコアを割り当てた。小さいAAR(LVの<約20%)を有するか又はAARを有していない動物を研究分析から外した。LVにおける心臓線維症を組織学的に評価し、そして心臓質量を使用して、線維症の質量/総LV質量のパーセンテージとして表した。次いで局所的心機能を、前壁肥厚(AWT)を見積もることにより、リスク領域における後壁肥厚(PWT)と比較して評価した。壁肥厚は、収縮期における壁厚さと拡張期における壁厚さとの差異である。全体的な機能も駆出率(EF)及び短縮率(FS)の見積もりにより評価した。
毎日の臨床的目視観測は研究期間を通して目立たないものであった。図1において、1D11投与は、ビヒクル及びネガティブコントロール抗体13C4と比較して、LVにおける線維症のパーセンテージを顕著に減少させた。1D11処置をI/Rの3日後(D3)[1D11−D3]に開始してもI/Rの5日後(D5)[1D11−D5]に開始してもこの線維症の減少が起こった。1D11の処置をD5に開始したグループは、コントロール13C4処置グループと比較して統計的有意性に達した(P<0.05)。
表1に見られるように、心機能パラメーターをI/Rの4週後に心エコーにより評価した。駆出率及び短縮率は全体的な心機能を表す。AWT、PWT及びAWT/PWT(局
所的壁運動スコア)は局所的心機能を表す。正常齧歯動物において、AWTはPWTとほぼ等しく、PWTより高くなり得る。その後、正常動物におけるAWT/PWTの比(我々が局所的壁運動スコアと称するもの)は1以上となるだろう。表1において、正常動物グループはPWTより高いAWTを示し、そして1.7±0.2の局所的壁運動スコア(AWT/PWT)であった。
所的壁運動スコア)は局所的心機能を表す。正常齧歯動物において、AWTはPWTとほぼ等しく、PWTより高くなり得る。その後、正常動物におけるAWT/PWTの比(我々が局所的壁運動スコアと称するもの)は1以上となるだろう。表1において、正常動物グループはPWTより高いAWTを示し、そして1.7±0.2の局所的壁運動スコア(AWT/PWT)であった。
I/Rの4週後に、I/Rを受けた全てのグループにおける心機能は、正常動物グループにおいて観察されたものより低かった。AWT及びPWTは1D11−D3及び1D11−D5グループにおいて同様であり(表1及び図2)、そして局所的壁運動スコアは1D11−D3及び1D11−D5グループにおいてそれぞれ0.91±0.2及び1.01±0.15であった(表1及び図3)。局所的壁運動スコアが正常動物の1以上という値と比較して最小の局所的機能障害に対応するということがさらに示された。対照的に、ネガティブコントロール13C4グループ及びビヒクルグループにおいてAWTはPWTより顕著に低く(表1及び図2)、そして局所的壁運動スコアは、13C4グループ及びビヒクルグループにおいてそれぞれ0.7±0.1及び0.51±0.2であり、1D11処置グループ及び正常動物と比較して有意な障害に対応するものであった。とりわけ、1D11処置グループにおいて相対的に局所的心機能の障害がないことは、ビヒクルグループ及びネガティブコントロール抗体13C4グループと比較してこれらのグループにおいて観察された線維症の減少と一致していた。
1D11処置グループにおける局所的機能はビヒクルグループ及び13C4グループと比較して改善されたが、駆出率及び短縮率はこれらのグループ間で同様であった。このことは、13C4グループ及びビヒクルグループにおいて梗塞を起こしていないLVの機能における代償に起因するようである。これらのグループにおいて観察されたPWTの増加(肥大に対応する)はこの解釈と一致する。この実施例は、I/Rの3日後と5日後のどちらでTGF−β拮抗を開始すれば梗塞における減少した線維症及び改善された心機能を生じるかという評価を可能にした。ビヒクルグループ及び13C4処置グループと比較して、両方の1D11処置グループにおいて線維症のパーセンテージの顕著な減少があった。1D11−D3グループ及び1D11−D5グループにおける線維症のレベルは同様であったが、1D11−D5グループはネガティブコントロール13C4グループと比較して統計的有意性に達した(p<0.05)。MIモデルにおいて、MI後線維症の発生がTGF−β、smad経路を経るTGF−βシグナル伝達及びTGF−β調節遺伝子の上方調節と関連していることが示された。齧歯動物心臓I/Rモデルにおける1D11の投与は、線維症に関連するコラーゲン3及びフィブロネクチンを含めて、I/R後のTGF−β及びTGF−β関連遺伝子の上方調節を鈍らせた。1D11の投与に伴って観察された線維症の減少は、このモデルにおけるTGF−β媒介線維症の1D11による鈍化と一致する。
1D11処置グループにおける線維症の減少は、局所的心機能の最小の障害に対応し、一方でネガティブコントロール、13C4、及びビヒクルグループは、局所的機能において顕著な障害を示した。AWT、PWT、及び局所的壁運動スコアは1D11−D3グループ及び1D11−5グループの両方で同様であった。このことは、1D11処置動物における線維症の減少が、MI後の局所的心機能の保存(sparing)に寄与する心筋の保存又は救助(salvaging)をもたらしたということを示唆する。1D11処置グループは13C4グループ及びビヒクルグループと比較して改善された局所的機能を有するが、駆出率及び短縮率はグループ間で同様であった。このことは、13C4グループ及びビヒクルグループにおける局所的機能の障害を機能的に代償する心臓の能力と一致する。この研究の終点はI/Rの28日後であった。13C4グループ及びビヒクルグループにおける代償がこのモデルでは長期にわたって維持されず、そして1D11、13C4及びビヒクル処置動物間の全体的な機能の差異が長期にわたって明らかになるということは可能である。
I/Rの3日後又は5日後のいずれかに始まる1D11媒介TGF−β拮抗は、1D11−D5グループにおいて有意性に達する心臓線維症の減少をもたらした。線維症の減少は、ネガティブコントロール抗体13C4又はビヒクルを投与された動物と比較して改善された局所的心機能と一致し、そして1D11処置動物における心筋の保存又は救助を示唆した。
実施例3 心虚血再灌流のラットモデルにおけるTGF−β阻害剤の投与のタイミングの効果
TGF−β阻害剤抗体1D11の投与の異なるタイミングの、心虚血とその後の再灌流(I/R)のラットモデルにおける心筋線維症に対する効果を観察した。1D11投与を心臓I/Rの0、1又は5日後のいずれかに開始した。心筋線維症の減少の効果は、心エコー図により測定して改善された心機能をもたらした。
TGF−β阻害剤抗体1D11の投与の異なるタイミングの、心虚血とその後の再灌流(I/R)のラットモデルにおける心筋線維症に対する効果を観察した。1D11投与を心臓I/Rの0、1又は5日後のいずれかに開始した。心筋線維症の減少の効果は、心エコー図により測定して改善された心機能をもたらした。
12〜14週齢の雌性Lewisラットを7つの異なる処置グループに割り当てた。全ての動物は心虚血とその後の再灌流の手順(I/R)を受けた。心虚血は、左心室上の左前下行冠動脈を一時的に60分間結紮することにより引き起こされた。次いで、心臓の虚血部分の再灌流を可能にするために結紮を外した。I/Rの0日後(再灌流の2時間後)、1日後又は5日後に開始して、5mg/kgの1D11又はコントロール品(ネガティブコントロール抗体13C4又はビヒクル)を静脈内(IV)注射により投与し、次いで3日ごとに28日後まで再投与した。
リスク領域を分析するために、黄色蛍光色素で標識した直径15μmのミクロスフェアを左心室中に注射した。これは左下行冠動脈の一時的結紮を外す直前に行われた。ミクロスフェアは血液中に一様に分布し、そして心臓並びに他の器官及び組織の毛細血管に留まった。心臓におけるAARを、結紮期間中にミクロスフェア(すなわち血液)を受け入れなかった心筋組織の領域と定義した。
28日目に、動物をイソフルランで軽く麻酔し、そして心拍数を350±50bpmに維持した。次いで局所的及び全体的な心機能を評価するために心エコー検査を長軸像で行った。心エコー試験の後、動物をペントバルビタールナトリウムの過量投与で安楽死させた。次いで心臓を切除し、計量し、組織学的分析のために処理した。AARを定性的なスコアに割り当てた。小さいAAR(LVの<約20%)を有するか又はAARを有していない動物を研究分析から外した。
LVにおける心臓線維症を組織学的に評価し、そして心臓質量を使用して、線維症の質量/総LV質量のパーセンテージとして表した。局所的心機能を、前壁肥厚(AWT)を
見積もることにより、リスク領域における後壁肥厚(PWT)と比較して評価した。壁肥厚は、収縮期における壁厚さと拡張期における壁厚さとの差異である。全体的な機能を駆出率(EF)及び短縮率(FS)の見積もりにより評価した。
見積もることにより、リスク領域における後壁肥厚(PWT)と比較して評価した。壁肥厚は、収縮期における壁厚さと拡張期における壁厚さとの差異である。全体的な機能を駆出率(EF)及び短縮率(FS)の見積もりにより評価した。
0日目又は5日目いずれかに開始した1D11投与は、ビヒクル処置グループ及びネガティブコントロール抗体13C4処置グループと比較して、LVにおける線維症のパーセンテージを有意に減少させた(図4)。D1に開始した1D11投与は、対応する13C4又はビヒクルコントロールと比較して(as as)線維症の減少の傾向を示した。
表2はI/Rの4週後に心エコー検査により評価した心機能パラメーターを示す。駆出率及び短縮率は全体的な心機能を表す。AWT、PWT及びAWT/PWT(局所的壁運動スコア)は局所的心機能を表す。正常齧歯動物において、AWTはPWTとほぼ等しく、PWTより高くなり得る。その後、正常動物におけるAWT/PWTの比(我々が局所的壁運動スコアと称するもの)は1以上となるだろう。表2において、正常動物グループはPWTより高いAWTを示し、そして1.7±0.2の局所的壁運動スコア(AWT/PWT)であった。
I/Rの4週後に、I/Rを受けた全てのグループにおける心機能は正常動物グループにおいて観察された心機能より低かった。AWT及びPWTは1D11−D0、1D11−D3及び1D11−D5グループにおいて同様であった(表2及び図5)。局所的壁運動スコアは1D11−D0、1D11−D1及び1D11−D5グループにおいてそれぞれ1.38±0.2、0.79±0.1及び0.92±0.18であった(表2及び図3)。局所的壁運動スコアは、1以上という正常動物の値と比較して局所的機能における最小の障害と一致していた。対照的に、AWTはネガティブコントロール13C4及びビヒクルグループにおいてPWTより顕著に低かった(表2及び図5)。局所的壁運動スコアは13C4−D0、13C4−D1、13C4−D5及びビヒクルグループにおいてそれぞれ0.52±0.08、0.58±0.19、0.54±0.12及び0.6±0.13であり(表2及び図6)、1D11処置グループ及び正常動物と比較して有意な障害に対応していた。1D11処置グループにおいて局所的心機能の障害が相対的に欠けているということは、ビヒクルグループ及び対応するネガティブコントロール抗体13C4グループと比較して、これらのグループにおいて観察される線維症の減少と一致していた。
1D11−D5グループはまた、ビヒクルコントロールと比較して駆出率及び短縮率の全体的な心機能パラメーターにおいて有意な改善を示し(表2)、これは線維症及び局所的心機能の評価と一致している。しかし、他の1D11処置グループは、ビヒクルグルー
プ及び対応する13C4グループと比較して全体的な機能において変化を示さなかった。全体的な心機能の有意な改善は伴わず、1D11処置動物における局所的機能障害の相対的欠如を伴う線維症の減少は、以前の研究においても観察されており、そしてこれは対応する13C4グループ及びビヒクルグループにおいて梗塞を起こしていないLVの機能における代償に起因するようであり、この時点でのグループ間の変化を検出することを困難にしている。これらのグループで観察されるPWTの増加(肥大に対応する)はこの解釈と一致する。
プ及び対応する13C4グループと比較して全体的な機能において変化を示さなかった。全体的な心機能の有意な改善は伴わず、1D11処置動物における局所的機能障害の相対的欠如を伴う線維症の減少は、以前の研究においても観察されており、そしてこれは対応する13C4グループ及びビヒクルグループにおいて梗塞を起こしていないLVの機能における代償に起因するようであり、この時点でのグループ間の変化を検出することを困難にしている。これらのグループで観察されるPWTの増加(肥大に対応する)はこの解釈と一致する。
この実施例は、動物が心虚血とその後の再灌流を受けた場合の心筋梗塞のラットモデルにおいて、心筋梗塞後の異なる時点において開始した、抗TGF−β抗体1D11の生物学的活性を比較した。TGF−βがD0、D1及びD5の時点で修復反応において異なる役割を果たすこと、そしてこれらの異なる時点で開始されるTGF−β拮抗が異なる反応を生じるということが可能である。1D11−D1グループは、線維症の減少及び心機能の改善の傾向を示した。
I/Rの0日後、1日後、又は5日後のいずれかに開始される1D11媒介TGF−β拮抗は心臓線維症の減少を生じ、これはビヒクルグループ及び対応する13C4コントロール抗体グループと比較して、1D11−D0及び1D11−D5グループにおいて有意性に達した。1D11−D0及び1D11−D5グループにおいて、線維症の減少は、ネガティブコントロール抗体13C4又はビヒクルを投与された動物と比較して有意に改善された局所的心機能、さらには1D11−D5グループにおいてビヒクルコントロールと比較して有意に改善された全体的な心機能に対応していた。これらの結果は、1D11処置動物における心筋の保存又は救助を示唆した。
実施例4−心筋虚血後の心筋リモデリングの齧歯動物モデルにおけるTGF−B阻害剤1D11の効果
TGF−β阻害剤1D11の投与は線維症の発生を減少させ、その後、用量依存性の様式で心機能を改善した。0日目に、左上行冠動脈を60分間結紮し(冠動脈閉塞又はCAO)、次いで再灌流を可能にするために解放した(冠動脈再灌流又はCAR)。5日目に、ビヒクル、1D11及び13C4(コントロール)を静脈内投与し、そして28日目(4週)に屠殺するまで3日ごとに続けた。左心室機能を決定するために、心エコー検査をCARの2週後及び4週後に行った。CARの4週後に、圧力−体積(PV)血行力学を使用してLV機能を直接測定するために終末外科手技を行った。ドブタミン負荷試験も行った。上記の手順を全て完了した後、ラットを安楽死させ、そして虚血領域及び非虚血領域から心筋組織を病理分析のために集めた。9匹のラットのサブグループを梗塞サイズの評価のために使用し、そして(was and)CAO/CARの7日後に安楽死させた。次いで心臓を灌流して染色した。リスク領域及び梗塞サイズを測定し、そしてビヒクルグループと1D11(25mg/kg)グループとの間で比較した。
TGF−β阻害剤1D11の投与は線維症の発生を減少させ、その後、用量依存性の様式で心機能を改善した。0日目に、左上行冠動脈を60分間結紮し(冠動脈閉塞又はCAO)、次いで再灌流を可能にするために解放した(冠動脈再灌流又はCAR)。5日目に、ビヒクル、1D11及び13C4(コントロール)を静脈内投与し、そして28日目(4週)に屠殺するまで3日ごとに続けた。左心室機能を決定するために、心エコー検査をCARの2週後及び4週後に行った。CARの4週後に、圧力−体積(PV)血行力学を使用してLV機能を直接測定するために終末外科手技を行った。ドブタミン負荷試験も行った。上記の手順を全て完了した後、ラットを安楽死させ、そして虚血領域及び非虚血領域から心筋組織を病理分析のために集めた。9匹のラットのサブグループを梗塞サイズの評価のために使用し、そして(was and)CAO/CARの7日後に安楽死させた。次いで心臓を灌流して染色した。リスク領域及び梗塞サイズを測定し、そしてビヒクルグループと1D11(25mg/kg)グループとの間で比較した。
この実施例の結果は、1D11がビヒクルと比較して5mg/kgの用量で左心室瘢痕体積を有意に減少させたということを示す。興味深いことに、25mg/kgの用量では、LV瘢痕体積はコントロールと比較して増加した(図6)。組織学的解析は、5mg/kgの用量の1D11を用いて瘢痕に隣接する領域におけるアポトーシスが有意に減少したことを示した。25mg/kgの1D11を投与されたグループではアポトーシスが増加した(図7)。全てのグループ間で、瘢痕に隣接する領域における心外膜下間質性線維症の差異はなかった(データは示していない)。
全体的な非収縮期機能の尺度である左心室駆出率(LVEF)を2週目及び4週目に報告した(図8)。4週目のLVEFは、ビヒクル処置動物と比較して、5mg/kgの用量の1D11を用いて有意に改善された。しかし、25mg/kgで1D11を用いた処
置はEFの有意な減少をもたらした。これは図6において報告された瘢痕体積データと一致する。2週から4週目まで、1D11 5mg/kgグループにおいてLVEFの変化パーセントに有意な改善があった(図9)。
置はEFの有意な減少をもたらした。これは図6において報告された瘢痕体積データと一致する。2週から4週目まで、1D11 5mg/kgグループにおいてLVEFの変化パーセントに有意な改善があった(図9)。
拡張期機能の尺度であるLV等溶性弛緩時間(IVRT)もまた、コントロールグループ及び高用量の1D11と比較して1D11 5mg/kgグループにおいて有意に改善された。シャム動物と比較して拡張期機能の明らかな正常化があった(図10)。前壁における肥厚パーセンテージとして示される局所的壁運動は、ビヒクルグループと比較して1D11 5mg/kgグループにおける有意な改善を示した(図11)。
PV血行力学により評価される拡張期機能の尺度である左室拡張末期圧体積関係は、1D11 5mg/kgグループにおいて有意な改善を示し、ここでそのデータはシャム動物に匹敵する(図12)。ドブタミン負荷試験は、1D11 5mg/kgグループにおいて改善傾向が存在することを示した(データは示していない)。
より低い用量(5mg/kg)の1D11は明白で有意な健康的な効果を示した。第一に、4週目のLV瘢痕体積は最も低く、梗塞からの残留損傷が少ないことを示した。第二に、他のグループと比較して、瘢痕に隣接する領域においてアポトーシスが有意に少なかった。第三に、LV駆出率により評価されるLV機能は、他のグループ(grouips)よりもこのグループにおいて有意に高く、LV機能の最良の救助を示した。最後に、このグループは、LV駆出率において2週と4週の間に改善を示すという点において独特であった。4週目におけるLV拡張末期圧力−体積関係の勾配はこのグループにおいて最も低く、減少したLV硬直及び改善されたLV拡張期機能を示した。これは拡張期機能の心エコー検査による尺度であるIVRTの結果を裏付け、このグループが4週目に拡張期機能の保存を示す唯一のものであるということを示した。ドブタミン負荷試験は心機能の改善傾向を示したが、麻酔及びカテーテル挿入に伴う固有の問題がエコーデータとは対照的にこのデータに関する変動性及びより低い信頼性に寄与した。コントロール抗体実験はビヒクル処置ラットと大きな差異を示さなかった。
他方で、高用量の1D11は有害な作用を示した。4週目における瘢痕は、ビヒクル処置グループを含む他の群よりも大きかった。隣接する領域ではより多くのアポトーシスがあった。LV機能をLV駆出率により評価した場合、これは4週目において他の全てのグループよりも低かった。従って、5mg/kg用量で1D11を利用するTGF−β拮抗は、ラットにおける心筋梗塞後のリモデリングの有害な効果の予防において有効であった。LV瘢痕体積及びアポトーシスの有意な減少は、このモデルにける心臓の収縮期及び拡張期機能の改善と一致した。しかし、高用量の薬物は組織学的及び機能的終点に対して反対の有害な効果を引き起こした。
実施例5−心筋虚血後再灌流の齧歯動物モデルにおける心筋保存に対するTGF−B阻害剤1D11の効果
TGF−β阻害剤1D11の投与は、線維症を減少させ、心筋を保存し、そして2つの異なる用量で心機能を改善した。0日目に、左上行冠動脈を60分間結紮し、次いで再灌流を可能にするために解放した(I/R)。5日目に、2つの異なる用量(1又は5mg/kg)の1D11の2つの異なる製剤(第一及び第二の製剤)のうちいずれか1つ、ビヒクル、及び13C4(ネガティブコントロール抗体)をIV投与し、そして3日ごとに28日目まで続けた。
TGF−β阻害剤1D11の投与は、線維症を減少させ、心筋を保存し、そして2つの異なる用量で心機能を改善した。0日目に、左上行冠動脈を60分間結紮し、次いで再灌流を可能にするために解放した(I/R)。5日目に、2つの異なる用量(1又は5mg/kg)の1D11の2つの異なる製剤(第一及び第二の製剤)のうちいずれか1つ、ビヒクル、及び13C4(ネガティブコントロール抗体)をIV投与し、そして3日ごとに28日目まで続けた。
リスク領域を分析するために、黄色蛍光色素で標識された直径15ミクロンのミクロスフェアを心臓のLV中に注射した。これを左下行冠動脈の一時的結紮を解放した直後に行った。ミクロスフェアは血液中に一様に分布し、そして心臓並びに他の器官及び組織の毛
細血管に留まった。心臓におけるAARを、結紮期間中にミクロスフェア(すなわち血液)を受け入れなかった心筋組織の領域と定義した。
細血管に留まった。心臓におけるAARを、結紮期間中にミクロスフェア(すなわち血液)を受け入れなかった心筋組織の領域と定義した。
28日目に、動物をイソフルランで軽く麻酔し、そして心拍数を350±50bpmに維持した。次いで局所的心機能を評価するために心エコー検査を長軸像で行った。心エコー試験の後、動物をペントバルビタールナトリウムの過量投与で安楽死させた。次いで心臓を切除し、計量し、次いで組織学的分析のために処理した。AARを心臓切片に対して形態計測学的に、そして心臓質量を使用して評価し、AAR質量/LV総質量のパーセンテージとして表した。小さいAAR(<20%)を有するか又はAARを有していない動物を研究分析から外した。
LVにおける心臓線維症を組織学的に、そして心臓質量を使用して評価し、線維症の質量/LV総質量のパーセンテージとして表した。局所的心機能を、前壁肥厚(AWT)を見積もることにより、リスク領域における後壁肥厚(PWT)と比較して評価した。壁肥厚は、収縮期における壁厚さと拡張期における壁厚さとの差異である。
この実施例における結果は、I/Rの4週後に、2つの異なる製剤からの1及び5mg/kg用量の1D11が、13C4及びビヒクルコントロールと比較してLVにおける線維症のパーセンテージを有意に減少させたということを示す(図14)。さらに、両方の製剤からの両方の1D11用量が、13C4及びビヒクルコントロールと比較してAARにおける線維症パーセントを有意に減少させた(図15)。重要なことには、両方の製剤からの両方の1D11用量がコントロールと比較してAARにおける心筋のパーセンテージを有意に増加させた。この結果は、I/R後の1D11処置が、線維症を減少させるだけでなくAARにおける心筋を保存するということを示す。
I/Rの4週後に、局所的壁運動スコア(AWT/PWT)として表される心機能は、13C4及びビヒクルコントロールと比較して、全ての1D11処置グループにおいて(両方の製剤からの1及び5mg/kg用量)より少ない障害を示した(図17)。
この実施例は、TGF−βアンタゴニスト抗体1D11の2つの異なる製剤からの2つの用量(1及び5mg/kg)での生物活性を、心筋虚血とその後の再灌流の5日後に開始して評価した。両方の製剤からの1及び5mg/kg 1D11の両方の用量が線維症を有意に減少させ、そしてより重要なことには、ネガティブコントロールと比較してAARにおいて心筋を保存した。これらの改善と一致して、局所的心機能もまたネガティブコントロールと比較して改善された。
実施例6−心筋虚血後再灌流の齧歯動物モデルにおけるTGF−・及び関連遺伝子の心臓発現に対するTGF−B阻害剤1D11の効果
TGF−β阻害剤1D11の投与はTGF−β及び関連遺伝子の心臓発現を減少させ、そしてこのことは、前の実施例において観察された心筋リモデリング、心筋保存及び心筋機能に対するその効果と一致する。0日目に、左上行冠動脈を60分間結紮し、次いで再灌流を可能にするために解放した(I/R)。3日目に、2つの異なる用量(5又は50mg/kg)の1D11を静脈内投与し、そして5mg/kg 1D11を投与された動物については7日目若しくは12日目のいずれかまで、又は50mg/kg 1D11を投与された動物については12日目まで3日ごとに続けた。I/Rを受けた動物の別のグループは、いずれの処置も受けなかった。
TGF−β阻害剤1D11の投与はTGF−β及び関連遺伝子の心臓発現を減少させ、そしてこのことは、前の実施例において観察された心筋リモデリング、心筋保存及び心筋機能に対するその効果と一致する。0日目に、左上行冠動脈を60分間結紮し、次いで再灌流を可能にするために解放した(I/R)。3日目に、2つの異なる用量(5又は50mg/kg)の1D11を静脈内投与し、そして5mg/kg 1D11を投与された動物については7日目若しくは12日目のいずれかまで、又は50mg/kg 1D11を投与された動物については12日目まで3日ごとに続けた。I/Rを受けた動物の別のグループは、いずれの処置も受けなかった。
研究グループに依存して、7日目又は12日目のいずれかに、ペントバルビタールナトリウムの過量投与により動物を安楽死させた。血液を血清分離チューブ中に集め、そして1D11又はオステオポンチンELISAをそれぞれ使用して、血清を1D11及びオス
テオポンチン(線維症減少に対する1D11の効果の潜在的血清バイオマーカー)のレベルの分析のために集めた。次いで心臓を切除し、心房及び右心室(ventricled)を切り取り、そして左心室をリスク領域(左上行冠動脈の結紮の間に血液を受け取らなかった心臓の領域)の中心を通って長手方向に切開した。心室の半分を、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によるTGF−β及び関連遺伝子発現の分析のために瞬間冷凍した。RT−PCR分析のために、心室のこの部分を、リスク領域を含む先端部、及び虚血にさらされていない基底部にさらに分割した。心室の他方の半分を後の分析のためにホルマリンで固定した。正常ラットのグループを、ペントバルビタールナトリウムの過量投与により安楽死させ、そして上記のような血清及び心臓の収集を行った。
テオポンチン(線維症減少に対する1D11の効果の潜在的血清バイオマーカー)のレベルの分析のために集めた。次いで心臓を切除し、心房及び右心室(ventricled)を切り取り、そして左心室をリスク領域(左上行冠動脈の結紮の間に血液を受け取らなかった心臓の領域)の中心を通って長手方向に切開した。心室の半分を、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によるTGF−β及び関連遺伝子発現の分析のために瞬間冷凍した。RT−PCR分析のために、心室のこの部分を、リスク領域を含む先端部、及び虚血にさらされていない基底部にさらに分割した。心室の他方の半分を後の分析のためにホルマリンで固定した。正常ラットのグループを、ペントバルビタールナトリウムの過量投与により安楽死させ、そして上記のような血清及び心臓の収集を行った。
1D11を投与された動物はそれらの血清中に1D11を示したが、1D11を投与されていないI/Rグループはそれらの血清中に検出可能な1D11を有していなかった(図18)。5mg/kg 1D11を投与された動物において、7日目に安楽死させられた動物は、12日目に安楽死させられた動物において観察されたレベルより高い1D11血清レベルを有していた。7日目に安楽死させられた動物がそれらの1D11の最後の投薬の1日後にそれらの血清を集められたのに対して、12日目に安楽死させられた動物は、それらの1D11の最後の投薬の3日後にそれらの血清を集められたので、このことは予測されていた。50mg/kgの1D11の用量を投与され、そして12日目に安楽死させられた動物における血清1D11レベルは、5mg/kgの1D11を投与され、そして同日に安楽死させられた動物のレベルの約1.5倍であった。用量に対して比較して1D11の血清レベルが比例していないことは、高用量(50mg/kg)の1D11を投与された動物における1D11のより速いクリアランスに起因するかもしれない。これらのデータは、1D11のIV送達が、循環及びおそらく、心臓への1D11曝露の用量依存性のレベルを生じるということを示した。
オステオポンチンは、心臓I/Rにおける線維症の1D11媒介モジュレーションの潜在的な血清マーカーである。血清オステオポンチンレベルは、正常動物、いずれの処置も受けず12日目に安楽死させられたI/R動物、及び1D11の2回の5mg/kgの用量を投与され7日目に安楽死させられたI/R動物において同様であった(図19)。3回の5mg/kgの1D11用量を投与されて12日目に安楽死させられたI/R動物、又は3回の50mg/kgの1D11用量を投与されて12日目に安楽死させられたI/R動物のいずれかにおけるオステオポンチンレベルは減少する傾向にあった。
TGF−β及び関連遺伝子の発現を、リスク領域を含む左心室の先端部分及び虚血を受けていないLVの基底部分においてRT−PCRにより分析した。LVの基底部分において、評価された全ての遺伝子の発現レベルは正常動物において観察されたレベルと同様であった。心臓遺伝子発現の説明の残りは、心室の先端部分において観察された変化に集中させる。
全てのTGF−βアイソフォーム、TGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3の心臓発現は、いずれの処置も受けず12日目に安楽死させられたI/R動物において上昇した。正常動物と比較して、TGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3の発現はそれぞれ約2.3倍、5倍、及び6倍増加した(図20〜22)。5mg/kgでの1D11の投与はTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3の発現を減少させた(図20〜22)。3回の5mg/kg用量の1D11を投与されて12日目に安楽死させられた動物は、2回投薬されて7日目に安楽死させられた動物と比較して、TGF−β1及びTGF−β2の発現がより大きく減少した(図20、21)。2回又は3回の5mg/kg用量の1D11を投与された動物におけるTGF−β3の発現の同様の減少もあった(図22)。3回の50mg/kgの1D11用量を投与されて12日目に安楽死させられた動物もまた、全ての3つのTGF−βアイソフォームの発現の減少を示した。しかし、TGF−
β1及びTGF−β2発現の減少は、2回の5mg/kgの1D11用量を投与されて7日目に安楽死させられた動物において観察された減少よりもいくらか弱いものであった(図19〜21)。これらの結果は、1D11による全てのTGF−βアイソフォームの発現の用量依存性抑制を示す。興味深いことに、より高い1D11用量(50mg/kg)は5mg/kg用量と比較してTGF−βのより弱い抑制を生じるように思われる。
β1及びTGF−β2発現の減少は、2回の5mg/kgの1D11用量を投与されて7日目に安楽死させられた動物において観察された減少よりもいくらか弱いものであった(図19〜21)。これらの結果は、1D11による全てのTGF−βアイソフォームの発現の用量依存性抑制を示す。興味深いことに、より高い1D11用量(50mg/kg)は5mg/kg用量と比較してTGF−βのより弱い抑制を生じるように思われる。
コラーゲンは線維症の突出した成分であり、その発現はTGF−βにより調節されることが知られている。コラーゲン3の心臓発現は正常動物と比較して、いずれの処置も受けていないI/R動物において約14倍上昇した。5mg/kg 1D11の投与はコラーゲン3の発現を減少させ、ここで3回の1D11の投薬を受けた動物は、2回の1D11の投薬を受けた動物と比較してコラーゲン3発現がより大きく減少した(図23)。50mg/kg 1D11を投与された動物もまた、2回の5mg/kgの1D11用量を投与された動物において観察された減少に匹敵するコラーゲン3発現の減少を示した。I/R後の心臓線維症の1D11媒介減少と一致して、心臓コラーゲン3発現の1D11媒介用量依存性減少があった。TGF−β発現の1D11媒介抑制と同様に、より高い1D11用量(50mg/kg)は5mg/kg用量と比較してコラーゲン3のより少ない抑制を生じるように思われた。
エンドセリン−1(ET−1)は、その発現がTGF−βにより調節される強力な血管収縮薬である。ET−1の心臓発現は、正常動物と比較して、いずれの処置も受けなかったI/R動物において約5.5倍増加した。5mg/kg 1D11の投与はET−1の発現を減少させ、ここで3回の1D11投薬を受けた動物は、2回の1D11投薬を受けた動物と比較してET−1発現がより大きく減少した(図24)。3回の5mg/kgの1D11用量はET−1発現をほぼ正常化した。50mg/kg 1D11を投与された動物はまた、2回の5mg/kgの1D11用量を投与された動物において観察された減少に匹敵するET−1発現の減少を示した。I/R後のET−1発現の1D11媒介阻害は、損傷した心筋における改善された再灌流に寄与するかもしれず、そしてI/R後の心筋保存及び減少したリモデリングに寄与するかもしれない。興味深いことに、50mg/kgの1D11は5mg/kg用量と比較して、ET−1発現のより小さい抑制を生じたように思われた。
プラスミノゲン活性化因子阻害剤−1(PAI−1)は組織型プラスミノゲン活性化因子の主要な阻害剤であり、TGF−βにより調節される。上昇したレベルのPAI−1は、増加したアテローム血栓性事象及び血管性疾患と関連していた。PAI−1の心臓発現は、正常動物と比較して、いずれの処置も受けていないI/R動物において約6倍増加した。5mg/kg 1D11の投与はPAI−1発現を減少させ、ここで3回の1D11投薬を受けた動物は、2回の1D11投薬を受けた動物と比較してPAI−1発現が大きく減少した(図25)。50mg/kgの1D11を投与された動物は、PAI−1発現の辺縁での減少を示した。I/R後のPAI−1発現の1D11媒介減少は、リモデリング及び心筋保存における改善に寄与した可能性がある。50mg/kgの1D11用量は、5mg/kg用量と比較してPAI−1発現の減少に対してかなり弱い効果を有するように思われた。
近年、内皮−間葉転換(endothelial−mesenchymal transition)が心臓線維症に寄与し得るということが分かってきた。転写因子Snail1及びSnail2(Slug)は内皮間葉転換に関与し、そしてこれらの転写因子はTGF−βにより誘導される。Snail1及びSnail2の心臓発現は、正常動物と比較して、いずれの処置も受けていないI/R動物においてそれぞれ約4倍及び3倍増加した。5mg/kgの1D11の投与はSnail1及びSnail2の両方の発現を減少させ、ここで3回1D11の投薬を受けた動物は、2回の1D11の投薬を受けた動物
と比較して、Snail1及びSnail2発現のより大きな減少を有していた(図26及び27)。3回の5mg/kg用量の1D11はSnail2発現を正常化したようであった。50mg/kgの1D11を投与された動物もまた、2回の5mg/kgの1D11用量を投与された動物において観察された減少に匹敵するSnail1及びSnail2発現の減少を示した。I/R後のSnail1及びSnail2の増加した発現は、内皮−間葉転換がI/Rに対する修復応答における心臓線維症に寄与しているということを強く示唆する。I/R後のSnail1及びSnail2発現の1D11媒介減少は、心臓線維症の観察された減少及びリモデリングの改善に寄与する機構である可能性がある。興味深いことに、50mg/kgの1D11用量は、5mg/kg用量と比較して、Snail1及びSnail2発現の減少に対してより弱い効果を有するようである。
と比較して、Snail1及びSnail2発現のより大きな減少を有していた(図26及び27)。3回の5mg/kg用量の1D11はSnail2発現を正常化したようであった。50mg/kgの1D11を投与された動物もまた、2回の5mg/kgの1D11用量を投与された動物において観察された減少に匹敵するSnail1及びSnail2発現の減少を示した。I/R後のSnail1及びSnail2の増加した発現は、内皮−間葉転換がI/Rに対する修復応答における心臓線維症に寄与しているということを強く示唆する。I/R後のSnail1及びSnail2発現の1D11媒介減少は、心臓線維症の観察された減少及びリモデリングの改善に寄与する機構である可能性がある。興味深いことに、50mg/kgの1D11用量は、5mg/kg用量と比較して、Snail1及びSnail2発現の減少に対してより弱い効果を有するようである。
内皮−間葉転換において観察される間葉細胞のマーカー、a−平滑筋アクチン(α−SMA)。α−SMAの心臓発現は、正常動物と比較して、いずれの処置も受けていないI/R動物において約4倍上昇した。5mg/kg 1D11の投与はα−SMAの発現を減少させ、ここで3回の1D11の投薬を受けた動物は、2回の1D11の投薬を受けた動物と比較して、α−SMA発現のより大きな減少を有していた(図28)。50mg/kgの1D11を投与された動物はまた、2回の5mg/kg 1D11用量を投与された動物において観察された減少に匹敵するα−SMA発現の減少を示した。I/R後のSnail1及びSnail2の1D11媒介減少と一致して、1D11はα−SMAの発現を減少させた。50mg/kgの1D11用量は、5mg/kgの用量と比較して、α−SMA発現の減少に対してより弱い効果を有するようであった。
フィブロネクチンは上皮−間葉転換のマーカーであると考えられており、そしておそらく内皮−間葉転換のマーカーである。フィブロネクチンの心臓発現は、正常動物と比較して、いずれの処置も受けていないI/R動物において約16倍増加した。5mg/kg 1D11の投与はフィブロネクチンの発現を減少させ、ここで3回の1D11投薬を受けた動物は、2回の1D11投薬を受けた動物と比較して、フィブロネクチン発現のより大きな減少を有していた(図29)。50mg/kg 1D11を投与された動物はまた、2回の5mg/kg 1D11用量を投与された動物において観察された減少に匹敵するフィブロネクチン発現の減少を示した。フィブロネクチンの1D11媒介減少は、内皮−間葉転換マーカーであるSnail1、Snail2及びα−SMAにおける1D11媒介減少とに対応するものであった。50mg/kg 1D11用量は、5mg/kg用量と比較して、フィブロネクチン発現の減少に対してより弱い効果を有するようであった。
アポトーシスは心臓リモデリングの間の心筋細胞の減少に寄与する。Baxは十分認められているアポトーシス促進遺伝子であり、心臓発現Baxは、正常動物と比較して、いずれの処置も受けていないI/R動物において約1.8倍増加した。5mg/kg 1D11の投与はBaxの発現を減少させ、ここで3回1D11の投薬を受けた動物は、2回1D11の投薬を受けた動物と比較してBax発現のより大きな減少を有していた(図30)。サンプル限界に起因して、50mg/kg 1D11を投与された動物からの心臓はBax発現について分析しなかった。Bax発現の1D11媒介減少は以前の実施例における知見と一致しており、ここで5mg/kg 1D11を投与されたI/R動物からの心臓においてアポトーシスの減少があり、そして1及び5mg/kgの1D11を投与されたI/R動物において増加した心筋保存があった。
この実施例に記載される結果は、TGF−βアンタゴニスト(例えば、抗TGF−β抗体)のIV投与が1D11の用量依存性循環レベル、そしておそらく心臓への曝露をもたらすということを示す。オステオポンチンの血清レベルは心臓線維症の1D11媒介減少のマーカーであり得る。TGF−β及び関連遺伝子はI/Rにおいて誘導され、そしてI/R後に生じる心臓線維症及びリモデリングの推進力である。I/R後のTGF−βアン
タゴニスト抗体1D11の投与は、これらの遺伝子の発現の減少を媒介し、これが心臓線維症の減少、心筋保存、リモデリングにおける改善及び1D11処置で観察された心臓機能における改善のための機構を提供する。これらの結果はまた、内皮−間葉転換に関与する遺伝子がI/R後に誘導されること、及び内皮−間葉転換がI/R後の心臓線維症に寄与し得ること示した。我々の知る限り、これは新規の発見である。I/R後の1D11処置はこれらの遺伝子を下方調節し(down regulated)、そしてI/R後の心臓線維症への内皮−間葉転換のいずれかの寄与を下方制御した(down modulated)。興味深いことに、5mg/kgの1D11用量は見かけ上、50mg/kgの1D11用量と比較した場合に、IR後のTGF−β及び関連遺伝子の発現のより強い減少を生じた。
タゴニスト抗体1D11の投与は、これらの遺伝子の発現の減少を媒介し、これが心臓線維症の減少、心筋保存、リモデリングにおける改善及び1D11処置で観察された心臓機能における改善のための機構を提供する。これらの結果はまた、内皮−間葉転換に関与する遺伝子がI/R後に誘導されること、及び内皮−間葉転換がI/R後の心臓線維症に寄与し得ること示した。我々の知る限り、これは新規の発見である。I/R後の1D11処置はこれらの遺伝子を下方調節し(down regulated)、そしてI/R後の心臓線維症への内皮−間葉転換のいずれかの寄与を下方制御した(down modulated)。興味深いことに、5mg/kgの1D11用量は見かけ上、50mg/kgの1D11用量と比較した場合に、IR後のTGF−β及び関連遺伝子の発現のより強い減少を生じた。
Claims (41)
- 心筋梗塞の急性期の間に患者にTGF−βのアンタゴニストを投与するステップを含む、患者における心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法。
- 心筋梗塞が急性心筋梗塞である、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋虚血の発生の120時間以内に開始される、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋虚血の発生の約72時間以内に開始される、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋虚血の発生の約48時間以内に開始される、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋虚血の発生の約24時間以内に開始される、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋虚血の発生の約12時間以内に開始される、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋梗塞により影響を受ける組織のマクロファージ及び単核の実質的な浸潤の前に開始される、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋梗塞により影響を受ける組織の好中球の浸潤によって特徴付けられる期間中に開始される、請求項1に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストの投与が、心筋梗塞により影響を受ける組織の壊死によって特徴付けられる期間中に開始される、請求項1に記載の方法。
- 患者がヒト又は非ヒト哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
- 患者における心筋梗塞の有害な結果を減少させる方法が、心筋を保存する方法である、請求項1に記載の方法。
- TGF−βアンタゴニストが:
i) TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;
ii) TGF−β受容体又はその可溶性フラグメント;
iii) 1つ又はそれ以上のTGF−β受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント;及び
iv) アンチセンス又は干渉RNAオリゴヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。 - TGF−βの望ましい機能を選択的に回復させることができる化合物を患者に投与するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- TGF−βの望ましい機能を選択的に回復させることができる化合物が抗炎症薬である、請求項14に記載の方法。
- TGF−βの望ましい機能を選択的に回復させることができる化合物がTNF−αのアンタゴニストである、請求項14に記載の方法。
- ACE阻害剤を患者に投与するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ACE阻害剤が、ベナゼプリル、カプトプリル、ホシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、トランスドラプリル、リシノプリル、エナラプリル及びランパリルからなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
- アンギオテンシンII受容体アンタゴニストを患者に投与するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- アンギオテンシンII受容体アンタゴニストが、エプロサルタン、テルミサルタン、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、及びバルサルタンからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- ベータ−アドレナリン受容体アンタゴニストを患者に投与するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ベータ−アドレナリン受容体アンタゴニストが、アルプレノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、及びネビボロールからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記TGF−βアンタゴニストが、TGF−βの1つ又はそれ以上のアイソフォームに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである、請求項13に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、ヒトTGF−β1、TGF−β2及びTGF−β3を中和する、請求項23に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、5個までの変異を有するPET1073G12 VHドメイン(配列番号2)、又はその抗原結合部分を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、5個までの変異を有するPET1074B9 VHドメイン(配列番号12)、又はその抗原結合部分を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、5個までの変異を有するPET1287A10 VHドメイン(配列番号22)、又はその抗原結合部分を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、5個までの変異を有するPET1073G12 VLドメイン(配列番号7)、又はその抗原結合部分を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、5個までの変異を有するPET1074B9 VLドメイン(配列番号17)、又はその抗原結合部分を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、5個までの変異を有するPET1287A10 VLドメイン(配列番号27)、又はその抗原結合部分を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、PET 1073G12 VHドメイン(配列番号2)及びPET 1073G12 VLドメイン(配列番号7)を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、PET 1074B9 VHドメイン(配列番号12)及びPET 1074B9 VLドメイン(配列番号17)を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、PET 1287A10 VHドメイン(配列番号22)及びPET 1287A10 VLドメイン(配列番号27)を含む、請求項24に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、CDR HCDR1、HCDR2及びHCDR3のセットを含み、ここで該HCDR3は配列番号5、配列番号15及び配列番号25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項24に記載の方法。
- VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3が生殖系列重鎖フレームワーク内にある、請求項34に記載の方法。
- VHドメインのHCDR1、HCDR2及びHCDR3が、生殖系列アミノ酸配列からの12個までの変異を含むフレームワーク内にある、請求項35に記載の方法。
- 抗体又は抗体フラグメントが、CDR LCDR1、LCDR2及びLCDR3のセットを含み、ここで該LCDR3は、配列番号10、配列番号20及び配列番号30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項24に記載の方法。
- LCDR1、LCDR2及びLCDR3が生殖系列重鎖フレームワーク内にある、請求項37に記載の方法。
- LCDR1、LCDR2及びLCDR3が、生殖系列アミノ酸配列からの5個までの変異を含むフレームワーク内にある、請求項38に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストを心筋梗塞の急性期の間に患者に投与するステップが、患者の体重1キログラムあたり約1mgの用量を投与するステップを含む、請求項24に記載の方法。
- TGF−βのアンタゴニストを心筋梗塞の急性期の間に患者に投与するステップが、患者の体重1キログラムあたり約5mgの用量を投与するステップを含む、請求項24に記載の方法。
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