TWI664979B - 經生物工程之抗-TGF-β抗體及抗原結合片段 - Google Patents
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Abstract
抗體或其抗原結合片段經生物工程以結合轉型生長因子-β(TGFβ)。相較於人類TGFβ2以及人類TGFβ3,TGFβ同型異構體選擇性抗體或其抗原結合片段可選擇性地結合人類TGFβ1,或相較於人類TGFβ1以及人類TGFβ2,該人類TGFβ同型異構體選擇性抗體或其抗原結合片段選擇性地結合人類TGFβ3。結合至TGFβ2之GC1008的重組Fab片段的共結晶結構以及結合至TGFβ1之GC1008的scFv變體的另一共結晶結構有助於設計該等抗體或其抗原結合片段。
Description
本申請案包含以ASCII格式之電子方式呈遞並以其整體併入做為參考資料的序列表。於2014年3月7日產生的該ASCII副本命名為209262-0001-00-WO-(509735)_SL.txt而大小為10,335位元。
本發明是有關於經生物工程而結合轉形生長因子-β(TGFβ)的抗體或其抗原結合片段。本發明提供包含該等抗體或其片段的組合物以及使用其供治療涉及TGFβ活性之疾病的方法。
數種嚴重的疾病與TGFβ引起之訊號傳遞路徑功能異常有關。咸信TGFβ的組織含量增加是例如原發性肺纖維化以及心肌纖維化發展的一個因素。此外,局部TGFβ高含量可容許數種類型的癌細胞維持與進展。因此,下調TGFβ訊號傳遞可以降低此等腫瘤細胞的存活。
TGFβ同型異構體是具有類似結構骨架的~25kDa同質二聚體分子,其中兩個單體經由雙硫橋而共價連結。哺乳動物同型異構體共有70-82%的序列同一性,但在血管發育以及調節免疫細胞功能方面具有不相
同的活性。人類體內存在有三種TGFβ同型異構體:TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ(Swiss Prot存取編號分別為P01137、P08112,以及P10600)。TGFβ1與TGFβ3在結合至兩個穿膜受體(已知為第I型與第II型TGFβ受體)的細胞外域之後引起細胞訊號傳遞級聯。TGFβ2結合也被認為是涉及第I型與第II型TGFβ受體,還有第III型TGFβ受體。
已生產出可結合人類TGFβ1、TGFβ2與TGFβ3的抗體分子(例如Genzyme的美國專利第7,723,486號)。舉例而言,Grütter et al.(2008)Proc.Nat’l Acad. Sci.USA 105(51):20251-56揭示GC1008,其是一種在臨床發展中用以治療惡性疾病以及纖維化疾病的人類IgG4單株抗體(Mab)。因為GC1008能中和所有三種人類TGFβ同型異構體,故其為一種"泛-特異性(pan-specific)"TGFβ中和抗體。GC1008以近似的親和力結合至人類TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3。GC1008所辨識的TGFβ表位與第I型和第II型TGFβ受體的TGFβ結合位點相重疊,咸信是GC1008中和能力的基礎。Grütter等人揭示GC1008 Fab片段在3.1Å的解析度下與TGFβ3複合的三維結構。由TGFβ3同質二聚體組成的複合體兩側為兩個GC1008 Fab片段。亦參見在網際網路proteopedia.org/wiki/index.php/3eo0的Proteopedia entry 3eo0,“Structure of the Transforming Growth Factor-Beta Neutralizing Antibody GC-1008,”(2012年10月20日最後修改);以及在網際網路proteopedia.org/wiki/index.php/3eo1的Proteopedia entry 3eo1,“Structure of the Fab Fragment of GC-1008 in Complex with Transforming Growth Factor-Beta 3,”(2012年10月20日最後修改)。
本發明揭示TGFβ-結合抗體或其抗原結合片段。TGFβ-結合抗體或其抗原結合片段對所有TGFβ同型異構體(TGFβ1、TGFβ2與TGFβ3)來說具有泛-特異性。此等抗體或其抗原結合片段可中和所有TGFβ同型異構
體。或者或另外,相比於人類TGFβ2和TGFβ3,TGFβ-結合抗體或其抗原結合片段可選擇性地結合人類TGFβ,或相比於人類TGFβ1和TGFβ2其選擇性地結合人類TGFβ3。TGFβ同型異構體-特異性拮抗劑可表現更低的潛在副作用。結合至TGFβ2之GC1008單株抗體的重組Fab片段(在本文為GC1008(Fab))的共結晶結構,以及結合至TGFβ1之GC1008的scFv變體(在本文中已知為GC1009或GC1009(scFv))的另一個共結晶結構有助於設計該等抗體或其抗原結合片段。
一種經單離抗體或其抗原結合片段可包含具有TGFβ互補位與非互補位殘基之PET1073G12可變重鏈(VH)域(SEQ ID NO:1),以及具有TGFβ1互補位與非互補位殘基之PET1073G12可變輕鏈(VL)域(SEQ ID NO:2)的變體,其中該VH域包含至多20個互補位殘基置換以及至多20個非互補位殘基置換;其中該VL域包含至多20個互補位殘基置換以及至多20個非互補位殘基置換;以及其中該抗體或其抗原結合片段能夠結合人類TGFβ(TGFβ1、TGFβ2與TGFβ3)。
該抗體或其抗原結合片段能夠結合人類TGFβ的所有三種同型異構體,包括人類TGFβ1、人類TGFβ2以及人類TGFβ3。該抗體或其抗原結合片段以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)高兩倍、2.4倍、三倍、五倍、十倍或更高的親和力結合人類TGFβ的所有三種同型異構體。該抗體或其抗原結合片段可包含Y27、S30、S31、N32、I52、I54、V55、D56、N59、E74及/或G101殘基的置換。Y27可經Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp置換。S30可經Ala、
Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Tyr或Trp置換。S31可經Ala、Glu、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp置換。N32可經Ala、Asp、Glu、Gly、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr置換。I52可經Val置換。I54可經Ala、Phe、His、Leu、Met、Pro、Thr、Val或Trp置換。V55可經Phe或Gly置換。D56可經Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Tyr或Val置換。N59可經Arg或Tyr置換。E74可經Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr置換。G101可經Tyr置換。VH域及/或VL域可包含至多19個互補位殘基置換。較佳地,VH域及/或VL域可包含至多互補位殘基置換。互補位置換可選自表5中所示置換。VH域及/或VL域可包含至多18個非互補位殘基置換。較佳地,VH域及/或VL域可包含至多12個非互補位殘基置換。
或者,相比於人類TGFβ2和人類TGFβ3,該抗體或其抗原結合片段能夠選擇性地結合人類TGFβ1。該抗體或其抗原結合片段可選擇性地以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)高兩倍、2.4倍、三倍、五倍、十倍或更高的親和力結合TGFβ1。VH域及/或VL域可包含至多20個互補位殘基置換,較佳至多19個互補位殘基置換,以及更佳至多12個互補位殘基置換。互補位置換可選自表5中所示置換。VH域及/或VL域可包含至多20個非互補位殘基置換,較佳至多18個非互補位殘基置換,以及更佳至多12個非互補位殘基置換。
或者,相比於人類TGFβ1和人類TGFβ2,該抗體或其抗原結合片段能夠選擇性地結合人類TGFβ3。該抗體或其抗原結合片段可選擇性地以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)高兩倍、2.4倍、三倍、五倍、十倍或更高的親和力結合TGFβ3。VH域及/或VL域可包含至多20個互補位殘基置換,較佳至多19個互補位殘基置換,以及更佳至多12個互補位殘基置換。
互補位置換可選自表5中所示置換。VH域及/或VL域可包含至多20個非互補位殘基置換,較佳至多18個非互補位殘基置換,以及更佳至多12個非互補位殘基置換。
在上述任一情況中,該抗體可以是IgG1、IgG2,或IgG4抗體,例如GC1008單株抗體的變體。其抗原結合片段可以是scFv,例如GC1009(scFv)的變體,或例如雙-scFv。或者,該VH域可進一步包含人類重鏈恆定域(例如IgG1、IgG2,或IgG4恆定域),而該VL域可進一步包含人類輕鏈恆定域(例如κ輕鏈恆定域)。重鏈恆定域可具有SEQ ID NO:3中所示序列,而輕鏈恆定域可具有SEQ ID NO:4中所示序列。此具體例中的抗原結合片段可以是Fab、Fab',或F(ab')2,例如GC1008(Fab)的變體。
經單離核酸可包含編碼抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。該經單離核酸可以是cDNA。宿主細胞包含該經單離核酸。製造該抗體或其抗原結合片段的方法可包含在適於生產該抗體或其抗原結合片段的條件下培養該宿主細胞。由此方法所生產的抗體或其抗原結合片段可以經純化。
組合物可包含上述抗體或其抗原結合片段之一者。該組合物可以是醫藥組合物。該醫藥組合物可包含治療有效量之抗體或其抗原結合片段。該組合物可進一步包含一或多種生物活性化合物。
一種在人類體內治療因為TGFβ活性直接或間接所致疾病或病況的方法,其可包含投與包含治療有效量之抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。該疾病或病況可選自由纖維化疾病、癌症或免疫媒介疾病所組成之群。抗體或其抗原結合片段可用於製造用以治療選自由纖維化疾病、癌症或免疫媒介疾病所組成之群的疾病或病症的醫藥。治療該疾病或病症可包含中和TGFβ1、TGFβ2及/或TGFβ3。治療該疾病或病症可包含抑制TGFβ1、TGFβ2及/或TGFβ3訊號傳遞。治療該疾病或病症可包含抑制
TGFβ1、TGFβ2及/或TGFβ3媒介的纖維連接蛋白生成、血管內皮生長因子(VEGF)生成、上皮細胞增生、內皮細胞增生、平滑肌細胞增生或免疫壓抑。治療該疾病或病症可包含增加天然殺手細胞活性。
圖1描述GC1008(Fab)與人類TGFβ2(SEQ ID NO:6)的共結晶結構。
圖2描述GC1009(scFv)與人類TGFβ1(SEQ ID NO:5)的共結晶結構。
圖3描述GC1009(scFv)VH域(SEQ ID NO:1)與人類TGFβ1(SEQ ID NO:5)的一部分共結晶結構。
圖4描述GC1008(Fab)VH域(SEQ ID NO:1)與人類TGFβ3(SEQ ID NO:7)的一部分共結晶結構。
圖5說明GC1008(Fab)與人類TGFβ的一部分共結晶結構。顯示出表7關於重鏈(SEQ ID NO:1)的殘基Y27、S30、S31、N32、I52、P53、I54、V55、D56、N59、E74、G101、V103與L104以及輕鏈(SEQ ID NO:2)的殘基A93的熱圖分析。
本發明TGFβ-結合抗體或其抗原結合片段為包含GC1008抗體之經修飾VH域的變體,其中該等變體包含VH及/或VL域(分別為SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2)的胺基酸置換。例如,TGFβ抗體或其抗原結合片段可包含具有胺基酸置換的VH域,該胺基酸置換可賦予對人類TGFβ(TGFβ1、TGFβ2與TGFβ3)的結合和GC1008抗體所觀察到者相當或有所增進。TGFβ-同型異構體選擇性抗體或其抗原結合片段相比於人類TGFβ2和
TGFβ2可選擇性地結合TGFβ1,或它們相比於人類TGFβ1和人類TGFβ2可選擇性地結合人類TGFβ3。選擇性結合可以藉由將包含VH域之抗體或其抗原結合片段(SEQ ID NO:1)的一或多個胺基酸予以置換而達致。
”選擇性結合”表示抗體或其抗原結合片段(i)可以比包含GC1008抗體之未經修飾VH域之抗體或其抗原結合片段更高的親和力結合人類TGFβ的特定同型異構體,及/或(ii)可以比包含GC1008抗體之未經修飾VH域之抗體或其抗原結合片段更低的親和力結合其他TGFβ同型異構體。例如,選擇性結合TGFβ1同型異構體之抗體或其抗原結合片段可以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)更高的親和力(例如兩倍、三倍、五倍、十倍高或更高)結合TGFβ1。或者或另外,該抗體或其抗原結合片段可以比GC1008(Fab)或GC1009(scFv)更低的親和力(例如兩倍、三倍、五倍、十倍低或更低)結合TGFβ2與TGFβ3。
如本文所用,第一要素”及/或”第二要素表示第一或第二要素個別的特定揭露,或第一要素與第二要素組合。除非上下文另有明確指明,否則單數形式”一”、”一種”與”該”包括複數指涉對象。
包含GC1008抗體之經修飾VH域的抗體或其抗原結合片段包括,但不限於完整抗體(例如IgG,諸如IgG1、IgG2,或IgG4),或其抗原結合片段(例如F(ab')2、scFv、Fab,或dAb多肽)。單價抗原結合片段可包括Fab、Fv、scFv,以及雙-scFv,其為藉由一個肽連接子而被接合的兩個scFv分子。抗原結合片段可以是多價,例如針對TGFβ與另一種抗原。多價片段包括F(ab')2以及雙-scFv,其中兩個scFv組分是由針對個別抗原的不同可變域所組成。本發明抗體或其抗原結合片段例如可以是經修飾的GC1008(完整人類IgG4抗體)、GC1008(Fab)(GC1008的Fab片段),或GC1009(scFv)(GC1008的scFv變體)。GC1009(scFv)是一種以重組方式生產的抗原結合片
段,包含藉由一個肽連接子而接合的人類重鏈PET1073G12 VH域(SEQ ID NO:1)以及人類輕鏈PET1073G12 VL域(SEQ ID NO:2),該肽連接子容許兩個域締合至抗原結合位點中。GC1008以及GC1009進一步詳細揭示於美國專利第7,723,486號與Grütter(2008)中。GC1009(scFv)的胺基酸序列顯示於下,其中(Gly4/Ser)n模組(SEQ ID NO:10)的肽連接子為粗體並且為斜體而訊號肽為背景反灰:
(SEQ ID NO:9)。
”經修飾”或”變體”可變域相較於參考序列包含胺基酸置換。”GC1008抗體的變體VH域”例如相較於帶有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的PET1073G12 VH域可包含胺基酸置換。
該VH域及/或VL域可包含至多20個互補位殘基置換,較佳至多19個互補位殘基置換,以及更佳至多12個互補位殘基置換。例如,兩個域中之一者可含有一個互補位殘基置換,而另一個域則未經修飾,或兩個域可含有互補位殘基置換。互補位置換可以選自表5中所示置換。互補位置換可使得經修飾抗體或抗原結合片段選擇性地結合TGFβ同型異構體,或修飾可保留抗體或抗原結合片段對TGFβ同型異構體的泛-特異性結合。也可進行兩種類型互補位置換。例如,互補位置換可使得抗體或抗原結合片段選擇性地結合TGFβ同型異構體,同時可進行保留泛-特異性結合的另一個互補位置換以使得該抗體或抗原結合片段去免疫化。可依據例如arding et al.
(2010)mAbs 2:256-265的方法來進行去免疫化。
VH域及/或VL域或者或另外可含有至多20個非互補位殘基置換,較佳至多18個非互補位置換,以及更佳至多12個非互補位置換。非互補位殘基可依據不同理由來置換,例如增加抗原結台片段的熱穩定性、移除對氧化或去醯胺化敏感的胺基酸殘基、添加可易於接合至藥物或PEG分子的胺基酸,例如或移除可能的羧基化位點。
修飾也可以包括胺基酸刪除。例如,一或兩個非互補位胺基酸可以從變體VH及/或VL域被刪除。被刪除的胺基酸可以是VH及/或VL域的羧基端或胺基端。
本發明抗體或其抗原結合片段的可變域包含三個互補決定區(CDR),其每一者的兩側為骨架區(FW)。例如,VH域可包含一組三個重鏈CDR(HCDR1、HCDR2以及HCDR3)。VL域可包含一組三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2以及LCDR3)。本文揭示之一組HCDR可以與VL域組合使用的方式提供於VH域中。VH域可提供如本文所揭示之一組HCDR,且若此一VH域與VL域配成對,則VL域可提供如本文所揭示之一組LCDR。免疫球蛋白可變域CDR及FW區的結構與位置在本文中可以參照Kabat et al.(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th ed.,U.S.Department of Health and Human Services來決定。
本發明抗體或其抗原結合片段含有”互補位”與”非互補位”胺基酸殘基。本發明抗體或其抗原結合片段的”互補位”胺基酸具有在人類TGFβ同型異構體之原子核4Å內的原子核。因為各個人類TGFβ同型異構體與本發明抗體或其抗原結合片段形成結構各異的複合體,各個同型異構體的互補位殘基可能不同。”TGFβ1互補位殘基”例如具有在人類TGFβ1之原子核4Å內的原子核。表3顯示本發明抗體或其抗原結合片段對於人類TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3同型異構體各者的互補位殘基。”TGFβ互補位”殘基具有
在所有三種人類TGFβ同型異構體之原子核4Å內的原子核。
如Kabat命名所定義,一個殘基被命名為互補位殘基與在CDR或FW區內的位置無關。許多互補位殘基位在CDR區內,例如表4中所示。但是,一些互補位殘基位在FW區內。”非互補位”胺基酸是抗體或其抗原結合片段之非”互補位”胺基酸的任一胺基酸,與該殘基位在CDR或FW區內與否無關。
抗體或其抗原結合片段可包含選自不同人類生殖系的重鏈與輕鏈胺基酸置換。例如,一組HCDR可以使用重組DNA技術被引入缺少CDR的可變域譜本中。生殖系骨架包括VH-1家族之人類DP-10(VH 1-69)生殖系或人類DP-88(VH 1-e)的重鏈序列。輕鏈序列可以是來自人類Vκ3家族,例如人類DPK-22(A27)。人類生殖系可變域胺基酸序列是例如由VBASE2在網際網路於vbase2.org/vbstat.php上揭示。舉例而言,一組HCDR以及一組LCDR可以一起配對成PET1073G12、PET1074B9,或PET1287A10抗體。因此,該抗體可以是例如包含經修飾PET1073G12 VH域及/或PET1073G12 VL域的IgG4抗體分子。包括HCDR及LCDR組之PET1073G12、PET1074B9,或PET1287A10域的胺基酸序列揭示於美國專利第7,723,486號中。
抗原結合片段可進一步包含抗體恆定區或其部分。例如,VL域可以在其C端處附接至包括人類Cκ或Cλ鏈的抗體輕鏈恆定域。同樣地,包含VH域的抗體或其抗原結合片段可進一步包含附接在其C端處之衍生自任一種抗體同型(例如IgG、IgA、IgE,以及IgM)或同型亞類任一者(尤其是IgG1、IgG2,或IgG4)的整個或部分免疫球蛋白重鏈(例如CH1域)。就一些應用來說偏好為IgG4,因為其不會結合補體且不會產生效應子功能。若需要效應子功能,則偏好IgG1。在所有情況下,抗體恆定區或其部分可以是人類序列。
可以對抗體恆定區進行修飾以增進抗體或其抗原結合片段
的各種特性。例如,重組胺基酸修飾可用以降低所表現多肽的結構同質性。代表性實例為Peters et al.(2012)J.Biol.Chem.287(29):24525-33,其揭示IgG4樞紐區中Cys至Ser置換會降低雙硫鍵異質性並增加Fab域熱穩定性。同樣地,Zhang et al.(2010)Anal.Chem.82:1090-99揭示將IgG2樞紐區進行生物工程以在治療應用方面限制雙硫鍵攪亂並形成結構異構體。CH3域的胺基酸修飾也可以用來刪除羧基端Lys殘基以降低電荷變體數目。胺基酸修飾也可以用來增進重組抗體或其抗原結合片段的藥理學功能。若抗體或抗原結合片段包含Fc區,則例如胺基酸修飾可用來增進補體活化、藉由增加FcγRIIIA結合或降低FcγRIIIB結合來增強抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC),及/或藉由增加FcRn結合來增加血清半衰期。例如於Beck et al.(2010)Nature 10:345-52中回顧此等胺基酸修飾。
下表1顯示存在於GC1008(Fab)中之未經修飾PET1073G12 VH域(SEQ ID NO:1);CH1域(SEQ ID NO:3);PET1073G12 VL域(SEQ ID NO:2);以及Cκ域(SEQ ID NO:4)的胺基酸序列。標示出不同CDR以及骨架(FW);也強調CDR殘基。
抗體或其抗原結合片段可以對人類TGFβ具有單專一性,或著它們可以是雙專一性。雙專一性抗體或其抗原結合片段可以如例如Holliger et al.(1993)Current Opinion Biotechnol.4,446-449中所揭示之各種方法來製造。雙特異性抗體的實例包括雙重可變域IgG(DvD-IgG)技術或BiTETM技術的雙特異性抗體,其中可使用兩個具有不同特異性的抗體的結合域並經由短彈性肽直接連結。
本發明抗體或其抗原結合片段的重鏈及/或輕鏈可變域可以經重組修飾來改變生殖系序列的胺基酸序列。例如,重鏈CDR組中的一或多個CDR可以經修飾,輕鏈CDR組中的一或多個CDR可以經修飾,及/或VH域及/或VL域中的骨架區之一可以經修飾。可以對互補位胺基酸進行置換,例如增強或弱化對TGFβ同型異構體的結合親和力,或著它們可以使結合親和力不受改變。可以對非互補位胺基酸殘基進行其他置換以賦予抗體或其抗原結合片段各種不同的特徵,例如增進穩定性或引入可經共價修飾之域表面的反應性基團。因此,在本文中可預期本發明抗體或其抗原結合片段之VH及/或VL域的下列四種類別胺基酸置換:(1)賦予對人類TGFβ同型異構體選擇性結合的置換;(2)維持對所有三種人類TGFβ同型異構體之泛-特異性結合的置換;(3)對非互補位胺基酸的置換;以及(4)多重胺基酸置換。這
些類別的胺基酸置換不相排斥。
TGFβ同型異構體選擇性抗體或其抗原結合片段可包含在VH域(SEQ ID NO:1)內的胺基酸置換。例如,相比於人類TGFβ2和人類TGFβ3,該等抗體或其抗原結合片段可選擇性地結合人類TGFβ1,或相比於
人類TGFβ1和人類TGFβ2可選擇性地結合人類TGFβ3。選擇性結合可以藉由置換一或多個互補位胺基酸而達致。
預測胺基酸置換將會如何影響抗體或其抗原結合片段與TGFβ同型異構體交互作用的能力可因為TGFβ同型異構體每一者的共結晶結構而變得容易。GC1008(Fab)與TGFβ3的共結晶結構揭示於Grütter(2008)中。GC1008(Fab)與TGFβ2的共結晶結構顯示於圖1中。GC1009(scFv)與TGFβ1的共結晶結構顯示於圖2中。
表2顯示人類TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3同型異構體的胺基酸序列。共結晶結構的比較顯示出三個同型異構體之間的互補位差異。各個同型異構體中與GC1008交互作用的TGFβ殘基在表2中為粗體。
下表3列出VH域(SEQ ID NO:1)以及VL域(SEQ ID NO:2)的互補位殘基,如藉由與各個人類TGFβ同型異構體的共結晶結構所測定。顯示粗體的GC1008互補位殘基在所有三種TGFβ同型異構體均共有。TGFβ表位的三個區域被命名為”頂部”、”疏水性片”以及”螺旋三”。具有原子核在
TGFβ之”疏水性片”之原子核的4Å內的VH以及VL域殘基在所有三個同型異構體是守恆的,其具有序列L28GWKW32(SEQ ID NO:8)。然而,與”頂部”和”螺旋三”區交互作用的GC1008殘基顯示更高的變異性。藉由比較所有三種共結晶結構,GC1008清楚轉換位向並調整CDR環位置與側鏈構型以相近親和力容納所有三種TGFβ同型異構體。參見圖1與圖2。例如,Grütter(2008)揭示GC1008在鼬鼠肺上皮細胞(MLEC)增生分析中對三種同型異構體展現相近的親和力:對TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3的IC50值分別為1±2nM、14±5nM,以及7±2nM。而三個TGFβ同型異構體的殘基67與68因為其與VH互補位殘基Y27交互作用而有所不同。VH殘基Y27與TGFβ1殘基Q67以及H68產生氫鍵結交互作用。相對地,VH殘基Y27與TGFβ2和TGFβ3的T67和Y50形成疏水性交互作用。相比於TGFβ2和TGFβ3複合體,這使得TGFβ1複合體中的HCDR1環重新排列。
表3中的資訊在表4中被重新編排以指明在共結晶中,TGFβ3的原子核的4Å內的VH及VL域的殘基。大多數但非全部互補位殘基位在HCDR中。
共結晶結構的比對可導引VH及/或VL域殘基的置換,以改變GC1008對TGFβ同型異構體的親和力。具體而言,胺基酸置換可以是基於各個VH及/或VL殘基在三個結晶結構中的位置,考慮到殘基是否會與抗原交互作用或者是涉入與其他CDR或穩定CDR環的結構要素的交互作用。例如,LCDR3上的I97不會在三個結構中任一者與TGFβ直接交互作用;但是,I97面向抗體內部並且在亦由HCDR3之V103及V104組成之疏水性口袋中。因為V103以及V104對於TGFβ結合來說是重要的互補位,使用具有中等或低疏水性或微弱極性的殘基來置換I97在不會明顯改變對TGFβ之親和力的情況下(例如超過十倍)可能是可接受的。
螺旋三區在表位序列中顯示最高變異性。在TGFβ1與TGFβ2的位置60處的離胺酸以及精胺酸使得結合至TGFβ1和TGFβ2的GC1008相較於結合至TGFβ3有旋轉。在殘基67與68處,TGFβ1分別具有麩醯胺酸以及組胺酸來取代在TGFβ2和TGFβ3中的蘇胺酸以及異白胺酸/白胺酸(圖3)。當S30
突變成諸如A、W的疏水性殘基時,與守恆性TGFβ L64的其他疏水性交互作用是有利的,且因此增加對所有三種TGFβ的親和力。這個親和力對於TGFβ2和3來說更為明顯,因為如在TGFβ2和3中在殘基67和68處的前述蘇胺酸及異白胺酸/白胺酸有利於疏水性殘基甚過TGFβ1的Q及H。在TGFβ1及TGFβ2中,於位置60處帶正電荷的側鏈與重鏈的E74產生離子性交互作用。以帶正電荷的殘基取代E74對於GC1008結合至TGFβ1來說較不有利,但對TGFβ3來說更為有利(其在位置60處具有蘇胺酸)(圖4)。因為TGFβ3的T60側鏈的尺寸小,在重鏈E74處的大多數突變是可接受的。因為T60的部分疏水性特質,在E74處的疏水性置換也可能大幅增加對TGFβ3的結合親和力,通常在kd var:kd wt比例上增進超過至少兩倍。
為了快速地篩選對特定TGFβ同型異構體具有較高親和力或對某種同型異構體的選擇性甚過其他者的TGFβ抗體或其抗原結合片段,將表3中所列位置隨機化成其他19種胺基酸。這個可以藉由使用技藝中已知技術(Bradbury et al.(2011)Nature Biotechnol.29(3):245-254)活體外展示GC1009(scFv)、GC1008 Fab片段或GC1008庫而達致。在沒有分別複合GC1009及GC1008 Fab之TGFβ1與TGFβ2的結晶結構的情況下,僅對TGFβ3具有更高親和力的抗體或抗原結合片段可以使用在Grütter(2008)中揭示之這個活體外展示技術基於衍生自TGFβ複合體結構之與TGFβ接觸的胺基酸而被識別。使用複合至GC1009及GC1008 Fab的新穎TGFβ1及TGFβ2,吾人已確定對TGFβ1及TGFβ2具有更高親和力的抗體或其抗原結合片段也可藉由展示技術被快速地識別。此外,使用關於所有三種結構的資訊容許吾人製造更為明確的庫來鑑別同型異構體選擇性變體。例如,TGFβ1的明確庫將僅需要隨機化VH域(SEQ ID NO:1)的位置27及30。322(1024)個可能變體可被庫大小僅~105種類的噬菌體庫所涵括。(20種胺基酸可以由32個具有序列NNG/C的密碼子所表示,其中在前兩個位置是四種核酸任一者而在第三
個位置為G或C)。在沒有複合至GC1009/GC1008之TGFβ1及TGFβ2的結晶結構的情況下,吾人必須將Grütter(2008)中揭示之接觸TGFβ的所有14個衍生自TGFβ3複合體結構之胺基酸隨機化。具有多樣性為3214(1021)的噬菌體庫即便在任一已知庫的最佳者(其呈現不超過約~1011種類)中也無法完全被表現。因此,本文提供的結構數據將容許快速篩選並鑑別TGFβ選擇性拮抗劑。
可進行不會明顯改變對TGFβ同型異構體之結合親和力的置換。不會"明顯改變"對TGFβ同型異構體之結合親和力的置換不會增加變體的解離速率(kd var)相對野生型的解離速率(kd wt)的比率超過2.4(例如kd var/kd wt少於或等於2.4)。展現"泛-特異性結合"的抗體或其抗原結合片段就此目的來說可具有對TGFβ(TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)為至少10nM、30nM或100nM的表觀結合常數。對TGFβ同型異構體的親和力可以使用技藝中任何適當技術來測量,例如Grütter(2008)中所揭示的MLEC增生分析或Biacore® 3000(GE Healthcare)結合分析。展現"泛-特異性結合"的抗體或其抗原結合片段就此目的來說可具有對TGFβ(TGFβ1、TGFβ2與TGFβ3)相對野生型少於或等於2.4倍,少於或等於3倍,少於或等於5倍,或少於或等於10倍的表觀結合親和力(kd var:kd wt),較佳相對野生型少於或等於2.4倍(kd var:kd wt)。這些置換可由GC1008/GC1009與三個TGFβ同型異構體之間的三種共結晶結構所指引。參見Oberlin et al.(2012)J.Chem.Inf.Model.52:2204-2214。
對TGFβ維持泛-特異性結合的置換預期不會對TGFβ胺基酸殘基產生空間阻礙或對抗體或其抗原結合片段的穩定性具有明顯不利影響。對穩定性具有不利影響的置換可能會透過致使局部未折疊或折疊錯誤而促使抗體或其抗原結合片段聚集並且不活化。去穩定、聚集的抗體或其抗原結合片段可能引起免疫原性,因為患者的免疫系統可能會將這些聚集物辨識成外來分子。
維持泛-特異性結合的置換的一個實例為LCDR1上的R24。R24被指向遠離TGFβ結合位點且暴露於VL域表面上。這個位置可容納置換Pro與Cys以外最具有極性的殘基,它們一般來說是要避免的。另一方面,HCDR2上的I52與TGFβ上的"疏水性片"(L28GWKW32(SEQ ID NO:8))產生密切的疏水性交互作用,所以I52置換限制為中等尺寸的疏水性殘基(具有Val置換的可行性),而使用較大的疏水性殘基置換可能會在結合複合物中產生空間阻礙。
表5提供SEQ ID NO:2之VL域(表5A)以及SEQ ID NO:1之VH域(表5B)的胺基酸置換的非限制性實例。在一些情況下,可以在互補位內對骨架殘基進行胺基酸置換,例如FW2區中的VL殘基Y50。帶有一或多個以下置換的抗體或抗原結合片段預期對TGFβ具有類似的泛-特異性以及親和力增進(如GC1008/GC1009),亦即結合所有TGFβ同型異構體,其中同型異構體具有相對於野生型少於或等於2.4倍,少於或等於3倍,少於或等於5倍,或少於或等於10倍的結合親和力(kd var:kd wt)。
非互補位胺基酸可以重組方式進行置換以製造出具有類似
特性或相較於生殖系可變域特性有所改變的可變輕鏈或重鏈域。"經修飾"可變域也包括胺基酸刪除,以及置換。例如,N端或C端胺基酸殘基可以在經修飾可變域中被刪除。
可以進行非互補位胺基酸置換例如來增加穩定性及/或降低聚集傾向。穩定性不良可能影響抗原結合片段例如當以重組方式表現時正確折疊的能力,使得部分的表現片段不具功能性。低穩定性抗體或其抗原結合片段也可能傾向於形成潛在免疫原性聚集物或可能具有結合性或儲存壽命削弱。scFv多肽尤其可以證明在細菌與哺乳動物表現系統中有穩定性、溶解性、表現、聚集、分解產物以及整體可製造性的問題。預期在scFv多肽中會增加VH及/或VL域穩定性及/或降低聚集傾向的骨架胺基酸置換揭示於例如WO 2007/109254中。在本發明VH與VL域的對應殘基中的置換預期同樣會增加穩定性及/或降低聚集傾向。
可接受的置換預期包括彼等能以出現在另一人類VH或VL域生殖系序列中之對應胺基酸來取代SEQ ID NO:1或2之非互補位胺基酸者。目前,技藝中已知有約40種可變重生殖系序列,如約40個可變κ生殖系序列以及約30個可變λ生殖系序列。非互補位胺基酸置換為存在於此等生殖系序列任一者中的胺基酸預期是可接受的。例如,SEQ ID NIO:1的VH域的一個殘基可以置換為出現在任一VH生殖系序列(例如DP-10(VH 1-69)或DP-88(VH 1-e)的生殖系序列)中的對應位置處的胺基酸。對應位置在這個情況下是使用技藝中已知的比對技術(例如ClustalW)藉由各種生殖序列間的序列比對來決定。
預期可接受的其他置換為彼等對暴露於溶劑的側鏈之大部分胺基酸進行者,如藉由分析三種共結晶結構所決定。殘基的溶劑可接觸表面積可以使用技藝中已知的技術來估算。此外,若胺基酸的側鏈不會對鄰接殘基產生空間阻礙,則預期埋在可變域的胺基酸置換將會是更可以接
受的。為此,包埋的胺基酸通常置換為具有相似或較小尺寸之側鏈的胺基酸。例如,包埋的Ile殘基置換為Leu、Val、Ala,或Gly預期是可接受的。因為置換而產生的可能空間阻礙能夠藉由分析三個共結晶結構來加以預測。更多預期可接受的置換為彼等在可變域內維持現有靜電交互作用者,例如偶極-偶極交互作用、誘導性偶極交互作用、氫鍵或離子鍵。
可變域的其他胺基酸置換包括彼等預期賦予抗體或其抗原結合片段新穎的可用特性者。例如,在VH及/或VL域中的推定N醣基化位點可能被移除以防止或降低N糖型式形成。胺基端殘基可以被Gln殘基置換以產生聚麩胺作用,其會降低電荷變體的數量。胺基酸置換可用來降低等電點,等電點降低可例如降低IgG多肽抗體的排除速率。
可變域的表面殘基可使用Cys或Lys殘基來置換,例如,Cys或Lys殘基可以經共價修飾並偶合至賦予抗體或其抗原結合片段可用特性的分子(例如可偵測標記、毒素、標靶部分或蛋白質)。舉例而言,Cys殘基可以偶合至細胞毒性藥物以形成藥物接合物。Cys殘基也可以偶合至增加血清半衰期的分子,例如聚乙二醇(PEG)或血清白蛋白。例如於Beck et al.(2010)Nature 10:345-52中回顧此等胺基酸修飾。
可偵測標記包括放射性標記,諸如131I或99Tc,可使用技藝中已知方法附接至抗體或其抗原結合片段。標記也包括酵素標記,諸如辣根過氧化酶。標記進一步包括化學部分,諸如生物素,其可以經由結合至特定同源可偵測部分(例如經標記的抗生物素蛋白)而被偵測到。可附接有助於純化的其他部分。例如,抗體或其抗原結合片段可以使用重組修飾與表現的已知方法經His標記。
可以對抗體或其抗原結合片段進行多胺基酸置換。作為一般
性法則,抗體或其抗原結合片段在至少數個隨機選定胺基酸置換之後預期會維持穩定性及功能性。參見例如Wells,Biochemistry 29:8509-17(1990)。但是,因為數個置換被隨機地引入可變域中,例如,該域的整體穩定性將會降低,可能增加其聚集的趨勢,可能會使其對TGFβ的親和力降低,且會增加其可能免疫原性。因此,當進行多胺基酸置換時,由上述彼等選定較佳的置換,其預期能維持穩定性及功能性。經修飾可變域的功能性可以使用技藝中已知的慣常方法來進行測試,包括但不限於Grütter(2008)中揭示的MLEC增生分析。
本發明的又一個態樣提供編碼本文所述抗體或其抗原結合片段的核酸。經單離核酸可以是例如合成DNA、非天然mRNA或cDNA。核酸可以被插入質體、載體或轉錄或表現匣中。重組宿主細胞可包含一或多個上述構築體。"經單離"核酸(或抗體或其抗原結合片段)由其天然環境中被移出,且此外基本上是純的,例如至少90%純,或呈均質形式。
製備抗體或其抗原結合片段的方法包含在生產該抗體或其抗原結合片段的條件下於宿主細胞中表現該編碼核酸,以及回收該抗體或其抗原結合片段。回收抗體或其抗原結合片段的方法可包含單離及/或純化抗體或其抗原結合片段。生產方法可包含將抗體或其抗原結合片段調配成包括至少一種額外組分(諸如醫藥可接受賦形劑)的組合物。
包含編碼抗體或其抗原結合片段之核酸的適當載體可以經選擇或構築為含有適當調控序列,調控序列包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因以及若適當的話其他序列。載體可以是例如質體、噬菌體、噬粒、腺病毒、AAV、慢病毒。在製備核酸構築體、突變、定序、將DNA引入細胞以及基因表現時操作核酸的技術與程
序為技藝中已知。
將此等核酸引入宿主細胞可以使用技藝中已知的技術來完成。就真核細胞而言,適當技術可包括例如磷酸鈣轉染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質體媒介的轉染,及使用逆轉錄病毒或其他病毒的轉導。就原核細胞而言,適當技術可包括氯化鈣轉形、電穿孔,及使用噬菌體的轉染。引入之後可使得或容許核酸表現,例如藉由在用於表現基因的條件下培養宿主細胞。在一個具體例中,本發明的核酸被併入宿主細胞的基因體(例如染色體)中。合併可以依據標準技術藉由併入促使與基因體重組的序列而引起。
在各種不同宿主細胞中,用於選殖以及表現多肽的系統為已知的。適當的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真菌、酵母菌以及轉殖植物與動物。在技藝中可用於表現異源性多肽的哺乳動物細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞、小鼠黑色素瘤細胞、大鼠骨髓瘤細胞、人類胚腎細胞、人類胚視網膜細胞,以及許多其他細胞。在原核細胞(諸如大腸桿菌)中表現抗體及抗體片段在技藝中已充分建立。關於回顧參見例如Plückthun Bio/Technology 9:545-551(1991)。在培養的真核細胞中表現亦為彼等習於技藝者可得,如在Andersen et al.(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13:117-23中所回顧。
抗體或其抗原結合片段可以被醣基化,不論是天然或者是表現宿主的選擇,表現宿主為例如CHO或NSO(ECACC 85110503)細胞,或著它們可以是未醣基化,例如若是藉由在原核細胞中表現所生產。醣基化也可以是有目的地被改變,例如藉由抑制岩藻糖基化以增加所生成抗體的ADCC活性。
本發明抗體或其抗原結合片段可用於治療或診斷人類或動
物身體的方法中,諸如在人類患者體內治療(其可包括預防性治療)疾病或病症的方法,該方法包含向該患者投與有效量。可治療病況包括其中TGFβ扮演角色者,例如纖維化疾病、癌症、免疫媒介疾病以及傷口癒合。
本發明抗體或其抗原結合片段可用於治療直接或間接因為TGFβ活性所致的疾病與病況。本發明抗體或其抗原結合片段可選擇性地在活體外或活體內抑制人類TGFβ同型異構體的活性。TGFβ同型異構體的活性包括,但不限於TGFβ媒介的訊號傳遞、細胞外基質(ECM)沉積、抑制上皮與內皮細胞增生、促進平滑肌增生、誘導第III型膠原蛋白表現、誘導TGFβ、纖維連接蛋白、VEGF以及IL-11表現、結合隱性相關肽、腫瘤誘導免疫壓抑、促進血管新生、活化肌纖維母細胞、促進轉移,以及抑制NK細胞活性。例如,本發明抗體或其抗原結合片段可用於治療局部腎絲球硬化症(FSGS)、肝纖維化(HF)、急性心肌梗塞(AMI)、原發性肺纖維化(IPF)、硬皮症(SSc)以及馬方氏症候群。
該等抗體或其抗原結合片段可用於治療疾病及病況,包括但不限於纖維化疾病(諸如腎絲球性腎炎、神經瘢痕、皮膚瘢痕、肺部纖維化(pulmonary fibrosis)、肺纖維化(lung fibrosis)、輻射引起的纖維化、肝纖維化、骨髓纖維變性)、燒傷、免疫媒介的疾病、發炎性疾病(包括類風溼性關節炎)、移植排斥、癌症、杜普宜特朗氏攣縮,以及胃潰瘍。它們可用於治療、預防並降低發生腎功能不全的風險,腎功能不全包括,但不限於:(第I型與第II型)糖尿病腎病變、輻射引起的腎病、阻塞性腎病、瀰漫性全身性硬化、肺部纖維化、異體移植排斥、遺傳性腎病(例如多囊性腎病、髓質海綿腎、馬蹄形腎)、腎絲球性腎炎、腎硬化、腎鈣質沈著症、全身紅斑性狼瘡、休格連氏症候群、伯格氏病、全身性或腎絲球性高血壓、腎小管間質性腎病、腎小管酸血症、腎結核以及腎梗塞。具體而言,當與腎素-血管收縮素-醛固酮系統組合時它們是可供使用的,腎素-血管收縮素-醛固酮系統
包括,但不限於:腎素抑制劑、血管收縮素-轉換酶(ACE)抑制劑、Ang II受體拮抗劑(亦已知為”Ang II受體阻斷劑”),以及醛固酮拮抗劑。與此等拮抗劑組合來使用抗體或其抗原結合片段的方法如例如WO 2004/098637中所示。
該等抗體或其抗原結合片段也可以用於治療與ECM沉積有關的疾病與病況,包括全身性硬化症、手術後黏附、瘢瘤性與肥厚性瘢痕、增生性視網膜病變、青光眼引流手術、角膜受傷、白內障、佩羅尼氏病、成人呼吸窘迫症候群、肝臟硬化、心肌梗塞後瘢痕、血管成形術後再狹窄、蜘蛛膜下出血後瘢痕、多發性硬化症、椎板切除術後纖維化、肌腱及其他修復後纖維化、因為移除紋身的瘢痕、膽道硬化(包括硬化性膽管炎)、心包炎、胸膜炎、氣管造口術、穿刺性中樞神經系統損傷、嗜酸性球增多性肌痛症候群、血管再狹窄、靜脈阻塞性疾病、胰臟炎與牛皮癬性關節病。
該等抗體或其抗原結合片段進一步可用於促進疾病以及病況的再上皮化,該等疾病以及病況包括靜脈潰瘍、缺血性潰瘍(壓瘡)、糖尿病性潰瘍、移植區、移植供區、擦傷與燒傷、支氣管上皮疾病(諸如氣喘)、ARDS、小腸上皮疾病(諸如與細胞毒性治療有關的黏膜炎)、食道潰瘍(逆流性疾病)、胃潰瘍、小腸與大腸創傷(發炎性腸病)。
該等抗體或其抗原結合片段亦可用來促進內皮細胞增生,例如穩定動脈粥樣硬化斑、促進血管網癒合,或抑制平滑肌細胞增生,諸如在動脈疾病、再狹窄以及氣喘中。
該等抗體或其抗原結合片段可用於提高對巨噬細胞媒介之感染的免疫反應。它們亦可用於降低例如因為腫瘤、AIDS或肉芽腫疾病所引起的免疫抑制。該等抗體或其抗原結合片段可用於治療過度增生性疾病,諸如癌症(包括,但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胃炎、腎癌、胰臟癌、結腸直腸癌、皮膚癌、肺癌、子宮頸癌與膀胱癌)、神經膠質瘤、間
皮瘤,以及各種白血病與肉瘤(諸如卡波西氏肉瘤),且可用於治療或預防此等腫瘤的復發或轉移。抗體或其抗原結合片段亦可用於抑制環孢素媒介的轉移。
在癌症療法中,"治療"包括任一種醫學干涉,造成腫瘤生長減緩或腫瘤轉移降低,還有癌症的部分緩解以延長患者的餘命。
治療方法包含投與該抗體或其抗原結合片段或含有該抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。該抗體或其抗原結合片段可用於製造投與用醫藥。例如,製造醫藥或醫藥組合物的方法包含將抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受賦形劑一起調配。組合物可以單獨投與或與其他治療組合(同時或依序,取決於待治療病況而定)。
投與較佳是呈足以對患者顯示益處的"治療有效量"。該益處為至少減緩特定疾病或病況的至少一症狀。確切投與量以及投與速率和時間表將取決於待治療疾病或病況的本質與嚴重性。開立治療(例如決定劑量等)可依據臨床前和臨床研究來決定,而臨床前和臨床研究的設計落在習於技藝者的能力範疇內。
精確劑量將取決於數個因素,包括該抗體或其抗原結合片段是用於診斷還是用於治療、帶治療區域的大小和位置、抗體或其抗原結合片段的精確本質(例如完整抗體、Fab或scFv片段),以及任何可偵測標記或其他附接於抗體或其抗原結合片段之分子的本質。例如,完整抗體的典型劑量可以在100μg至1gm的範圍內供全身性施用,而1μg至1mg供局部施用。用於成年患者單次治療的劑量可以經適當調整以供用於兒童與嬰孩,且亦可針對其他抗體形式依照分子量和活性按比例來調整。可以按照臨床醫師的判斷每天、每週兩次、每週、每月或其他間隔來重複治療。治療可以是週期性,且投藥之間的期間可以是約兩週或更長,較佳約三週或更長,
更佳約四週或更長,或約每月一次。
每kg患者體重約0.1、0.3、1、3、10或10mg的劑量位準預期是有用且安全的。例如,0.5-5mg/kg在大鼠以及小鼠中於急性情況來說為有效劑量。因此,就長期投藥來說,基於預期半衰期為21天,可向人類投與0.3-10mg/kg。劑量對於效力來說應為充分的,同時低到足夠有助於最佳投藥。例如,少於50mg的劑量有助於皮下投藥。靜脈內投藥可用作為重病用遞送路徑,其中可能需要高劑量以及長給藥期間。皮下注射可增加對產品的潛在免疫反應。針對局部性疾病的局部投藥可能降低投與產品的數量並增加在作用部位的濃度,其可增進安全性。
抗體或其抗原結合片段可藉由注射而被投與,例如皮下、靜脈內、腔內(例如在腫瘤切除後)、病灶內、腹膜內或肌肉內。抗體或其抗原結合片段也可以藉由吸入或局部(例如眼內、鼻內、直腸、至傷口內、皮膚上)或經口而被遞送。
抗體或其抗原結合片段通常將以醫藥組合物的形式投與,其除了抗體或其抗原結合片段以外可包含至少一種組分。因此,醫藥組合物可包含醫藥上可接受賦形劑、載劑、緩衝劑、安定劑或其他對習於技藝者來說已知的材料。此等材料應為無毒且不應會干擾活性成分的效力。此等材料應包括,例如任一種及所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑與抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑。醫藥上可接受載劑的一些實例為水、食鹽水、磷酸鹽緩衝食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇與類似物,及其組合。在許多情況下,在組合物中較佳包括等張劑,例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。醫藥上可接受物質的其他實例為濕潤劑或輔助物質,諸如乳化劑、防腐劑或緩衝劑,其等增進儲存壽命或有效性。
載劑或其他材料的確切種類將取決於投與路徑。關於靜脈內注射或在罹病位點處的注射,活性成分將呈非經腸可接受水溶液形式,其
為無熱原且具有適當pK、等張性與溶解性。彼等相關技藝者能夠使用例如等張媒劑(諸如氯化鈉注射劑、林格氏注射劑以及乳糖化林格氏注射劑)來製備適當溶液。可納入防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。
抗體或其抗原結合片段可以調配呈液體、半固體或固體形式,諸如液體溶液(例如可注射與可輸注溶液)、分散劑或懸浮劑、粉劑、脂質體以及栓劑。較佳形式將取決於所要投與模式、治療用途、分子的物理化學特性,及遞送路徑。調配物可包括賦形劑或賦形劑的組合,例如:糖、胺基酸與界面活性劑。液體調配物可包括廣泛範圍的抗體濃度及pH。固體調配物可以藉由凍乾、噴霧乾燥或藉由例如超臨界流體技術來乾燥而製造。
治療性組合物可以調配為溶液、微乳液、分散劑、脂質體,或適於高藥物濃度的其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將抗體或抗原結合片段併入具有上列成分之一者或組合的適當溶劑中,接著無菌過濾來製備。大體上,分散劑是藉由將活性化合物併入含有基本分散介質與上列彼等之其他成分的無菌媒劑中來製備。在用以製備無菌可注射溶液之無菌粉劑的情況下,較佳製備方法為真空乾燥與冷凍乾燥,其由先前經無菌過濾的溶液中產生活性成分與其他所要成分的粉劑。例如,藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持分散劑的顆粒尺寸,或藉由使用界面活性劑可維持溶液的適當流動性。可注射組合物的延長吸收可以藉由將延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽與明膠)納入組合物而產生。
在某些具體例中,活性化合物可以與保護抗體或其抗原結合片段對抗快速釋放的載劑諸如做為控制釋放調配物(例如植入物、穿皮貼片與微囊封投遞系統)一起製備。可使用生物可分解、生物可相容聚合物,諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯,以及聚乳酸。用以製備此等調配物的許多方法已申請專利或為習於技藝者所熟知。
使用抗體或其抗原結合片段的方法可包含使其或容許結合至TGFβ。此結合可在活體內發生(例如在對患者投與抗體或其抗原結合片段之後),或其可在活體外發生(例如在ELISA、西方墨點、免疫細胞化學、免疫沉澱、親和力層析或以細胞為主的分析中),或在以離體為基礎的治療方法中(例如細胞或抗體流體離體與抗體或其抗原結合片段接觸並接著被投與給患者的方法)。
提供包含抗體或其抗原結合片段的套組。該抗體或其抗原結合片段可以經標記以容許其在樣品中的反應性得以測定。可在例如診斷分析中採用套組。套組可含使用該等組分的說明。有助於或能夠實行此一方法的附屬材料被納入在該套組內。
抗體或其抗原結合片段在樣品中的反應性可以透過任何適當方法(例如放射性免疫分析(RIA))來測定。經放射性標定的抗原可以與未經標記的抗原(測試樣品)混合並容許結合至抗體或其抗原結合片段。以物理方式將已結合的抗原與未結合抗原分離並且測定結合至抗體或其抗原結合片段之放射性抗原數量。亦可使用競爭性結合分析,其採用非放射性抗原,使用連結至報導子分子的抗原或類似物。報導子分子可以是螢光染料、磷或染料。適當的螢光染料包括螢光素、羅丹明、藻紅素與德州紅。適當的發色染料包括二胺基聯苯胺。
其他報導子包括巨分子膠態顆粒或顆粒物質,諸如乳膠珠粒,其為有色、磁性或偏磁性,且為可直接或間接產生能夠在視覺上被觀察到、電子偵測到或以其他方式記錄之可偵測訊號的生物或化學活性劑。這些分子可以是例如催化顯色或變色或電子特性改變之反應的酵素。它們可以是分子可激發的,以使得能態間的電子轉移產生獨特能譜吸收或發射。它們可包括用於以生物感測器接合的化學實體。可採用生物素/抗生物
素蛋白或生物素/卵白素以及鹼性磷酸酶偵測系統。由抗體-報導子接合物產生的訊號可用來在樣品中衍生相關抗體結合的可量化絕對或相對數據。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段用以在競爭分析中測量抗原含量的用途。在結合時將報導子分子連結至抗體或其抗原結合片段而產生物理或光學變化是一個可行辦法。報導子分子可直接或間接產生可偵測,且較佳可測量訊號。報導子分子的連結可以是直接或間接、共價地(例如經由肽鍵)或非共價。抗體或其抗原結合分子與蛋白質報導子可以藉由肽鍵連結或以重組方式表現如融合蛋白。
對於習於技藝者而言,本發明的更多態樣與具體例將因為包括下列實驗範例的本揭示內容而變得清楚。
抗TGFβ單鏈Fv(scFv)可依據下列揭示於美國專利第7,723,486號的實例1中的非限制性實例來製備。可以使用突變及/或組合性技術來增進TGFβ1、TGFβ2及/或TGFβ3的中和效力。對TGFβ1、TGFβ2及/或TGFβ3的效力有所增進的scFv可如美國專利第7,723,486號的實例1中所述選擇並篩選噬菌體抗體庫而生成。在MLEC增生分析中,將在實例中所產生的scFv與美國專利第7,723,486號中揭示的1D11.16來進行比對。
在美國專利第7,723,486號的實例1中,於高效力TGFβ-中和scFv中,特定生殖系被發現是具有高度代表性的。此等為重鏈的DP-10/1-69以及DP-88/1-e(均為VH1生殖系家族的成員),以及輕鏈的DPK22/A27(Vκ3家族)。此等生殖系似乎會提供對高效力TGFβ泛-中和抗體尤其合適的結構骨架。PET1073G12、PET1074B9,以及PET1287A10 scFv在MLEC增生分析中對所有三種TGFβ同型異構體顯示接近或超過1D11.16的效力。
將PET1073G12、PET1074B9以及PET1287A10 VH與VL基因
段的衍生胺基酸序列與VBASE資料庫(Tomlinson,V-BASE sequence directory,MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK,at hypertext transfer protocol vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk(1997))中的已知人類生殖系序列排列,並且藉由序列相似性來鑑別最為接近的人類生殖系。就PET1073G12與PET1074B9的VH基因段來說,最接近的人類生殖系基因鑑別為DP-10/1-69(VH1生殖系家族),而對PET1287A10的VH基因段來說,最接近的人類生殖系序列鑑別為DP-88/1-e(VH1生殖系家族)。對PET1073G12、PET1074B9以及PET1287A10的VL基因段來說,最接近的人類生殖系基因鑑別為DPK22/A27(Vκ3生殖系家族)。定位突變被用來置換與生殖系對生殖系殘基有所不同的骨架殘基,前提是此等改變在MLEC增生分析中不會使所得抗體對任一TGFβ同型異構體的效力減損超過三倍。若觀察到此一效力減損,則在最終抗體內保留非生殖系骨架胺基酸。
在生殖系PET1073G12與生殖系PET1074B9中,除了VH中的兩個殘基以及VL中的一個殘基以外,所有骨架殘基為生殖系。就VH而言,生殖系PET1073G12的胺基酸序列描述於SEQ ID NO:2中,就美國專利第7,723,486號的VL而言描述於SEQ ID NO:7中。生殖系PET1074B9的胺基酸序列就VH而言描述於SEQ ID NO:12中,而就美國專利第7,723,486號的VL而言描述於SEQ ID NO:17中。在生殖系PET1287A10中,所有VH及VL骨架殘基為生殖系。生殖系PET1287A10的胺基酸序列就VH而言描述於SEQ ID NO:22中,而就美國專利第7,723,486號的VL而言描述於SEQ ID NO:27中。
抗TGFβ抗體或其抗原結合片段的中和效力可以使用美國專利第7,723,486號的實例4中揭示的TGFβ依賴性MLCE增生分析來進行分
析。MLEC增生分析是以Danielpour et al.,J.Cell.Physiol.,138:79-86(1989)所述分析為基礎。這個分析是依照添加至鼬鼠肺上皮細胞的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3會抑制血清誘發之細胞增生的原理來運作。測試抗體對TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的中和以恢復細胞增生。增生是藉由攝取[3H]-胸苷來進行測量。抗體效力定義為中和單一濃度的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3達50%程度(IC50)的抗體濃度(以nM計)。
MLEC增生分析程序:由美國典型培養物保存中心獲得MLCE株(Cat.# CCL-64)。細胞生長在含有10%胎牛血清(FBS)(Gibco)、1%盤尼西林/鏈黴素(Gibco)與1% MEM非必需胺基酸溶液(Gibco)的最低必須培養基(MEM,Gibco)中。使T-175燒瓶的匯聚細胞由燒瓶脫離、旋轉降下、洗滌,以及再懸浮於MLEC分析培養基中,MLEC分析培養基是含有1% FBS、1%盤尼西林/鏈黴素與1% MEM非必需胺基酸溶液的MEM。接著將等分試樣的細胞標記錐蟲藍、在血球計數器上計數,並且使用分析培養基將細胞原液稀釋至1.75×105細胞/ml。100μl的這個懸浮液被添加至組織培養平底96孔盤的各孔中且培育歷時3至5小時。
製備TGFβ/抗體溶液:在MLEC分析培養基中製備6ng/ml的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3工作溶液(最終分析濃度的六倍)以及呈最終最高分析濃度的三倍的抗體(包括諸如1D11.16的對照)工作溶液。在這個分析中,TGFβ的最終濃度(1ng/ml或40pM)對應於相比無TGFβ的對照引起細胞增生的約80%抑制的濃度(亦即EC80值)。
稀釋盤設定:以3倍稀釋步驟在MLEC分析培養基中對測試與對照抗體樣品進行滴定測試並在TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3存在或不存在的情況下進行培育。在每一個實驗中納入所有相關對照:測試1D11.16及/或參考抗體(若適當的話)並進行TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3滴定測試。完成的盤被留在濕化組織培養箱中歷時1小時±15分。
添加TGFβ/抗體溶液至貼盤細胞:在適當培育時間之後,稀釋盤各孔的100μL被轉移至貼盤MLEC並且將盤放回培養箱歷時44±2小時。將25μL稀釋於磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中的10μCi/ml[3H]-胸苷添加至每一個孔(0.25μCi/孔)。接著將盤放回培養箱中歷時4小時±2分。
細胞收取:將100μL胰蛋白酶-EDTA(0.25%,Gibco)添加至各孔,在培養箱中培育盤歷時10分,且使用Tomtec或Packard96孔細胞收取器來收取細胞。
數據累積以及分析:使用貝他-盤讀取儀(TopCount,Packard)讀取來自收取細胞的數據。分析數據以獲得IC50與標準偏差值。使用Prism 2.0(GraphPad)軟體獲得IC50值。
結果:與1D11.16一起在MLEC增生分析中測試經純化PET1073G12、PET1074B9以及PET1287A10生殖系IgG4。如美國專利第7,723,486號的實例3中所述製造IgG4。PET1073G12以及PET1287A10 IgG4的平均IC50數據顯示這些抗體具有類似或接近於1D11.16對TGFβ1、TGFβ2與TGFβ3的效力。
平均IC50數據暗示,PET1074B9 IgG4對TGFβ1更有效,儘管在MLEC分析中並沒有獲得完整劑量反應曲線。透過比對,1D11.16顯示在91pM的濃度下對TGFβ1有12%中和,而PET1074B9在92pM的類似濃度下有78%中和。
另外,使用Biacore® 3000(GE Healthcare)儀器測量GC1008抗體的TGFβ同型異構體結合親和力。內部製造的TGFβ1以及TGFβ2在10mM乙酸,pH 4.5中稀釋成~1μg/mL,而TGFβ3(R&D Systems)在10mM乙酸,pH 4.0中稀釋成~2μg/mL。使用GE Healthcare的標準胺耦合套組,將CM5
感測晶片的流動槽(Flowcell)2、3以及4分別以50至100RU的TGFβ1、TGFβ2與TGFβ3共價固定。流動槽1用作為對照表面。關於動力學結合分析,GC1008在HBS-EP緩衝液中被連續地以1:3由33.3nM稀釋成1.2nM並且以三重複的方式被注射至所有四個流動槽中歷時5分鐘,接著以30μL/min的流速在緩衝液中解離5min。以75μL/min利用兩次30sec注射40mM HCl使表面再生。使用1:1結合模型以BIA Evaluation Software Kit(GE Healthcare)在扣除緩衝液與對照流動槽折射率變化之後來擬合感應譜。顯示於表6中的KD為超過25個獨立分析的平均。
抗體或其抗原結合片段用以治療慢性腎病以及其他臨床適應症的生物效力是使用美國專利第7,723,486號的實例7中所示大鼠單側輸尿管阻塞(UUO)模型來進行測定。將重量為250-280公克(約6週大)的成年Sparague Dawley大鼠(Taconic Farms,Germantown,N.Y.)豢養於空氣、溫度與光線受控的環境中。經歷UUO的大鼠接受下腹正中小切開術以露出左腎與上輸尿管。在腎臟下極位置處將輸尿管用絲線紮捆並在第一處下約0.2cm處紮捆第二次。假手術大鼠接受相同的程序但沒有輸尿管紮捆。
如美國專利第7,723,486號中所述,以PBS、鼠泛-中和單株抗體(1D11)、同型配對對照抗體(13C4)或人類泛-中和TGFβ單株抗體處理經阻塞的大鼠。在輸尿管紮捆當天起對大鼠腹膜內投與抗體歷時3週時程。13C4與1D11是以5mg/kg(3次/週)投與,而人類泛-中和抗體是以5mg/kg(每
5天)投與。在3週結束時犧牲大鼠,以PBS灌注腎臟歷時3分,並且收取經灌注腎臟用於mRNA分析、膠原蛋白含量測量以及組織學檢驗。
為了評估組織纖維化的程度,依據Kivirikko et al藉由生化分析水解物萃取物中的羥基脯胺酸來測定總組織膠原蛋白含量。亦針對總膠原蛋白含量來進行Sircol膠原蛋白分析。Sircol膠原蛋白分析是依據Sirius紅色染料與組織膠原蛋白側鏈的特異性結合來測量總酸/胃蛋白酶可溶性膠原蛋白的數量。
當相較於經PBS處理的組別(3.5±0.3μg/mg乾燥組織,p<0.05)時,以人類泛-中和單株抗體處理的UUO大鼠顯示羥基脯胺酸含量降低43.4%(1.98±0.26μg/mg乾燥組織)。腎臟纖維化減輕是進一步受到在罹病腎臟中的總溶解膠原蛋白降低所支持,如同藉由以Sirius紅色染料為基礎的分析所測量(假:18.5±2.6,PBS:69.3±3.8,以及人類泛-中和單株抗體:35.6±5.2μg/100mg組織,p<0.05vs.PBS)。
亦藉由免疫組織化學評估人類泛-中和抗TGF-β單株抗體降低組織纖維化的能力。在對照動物中,歷時三週的輸尿管阻塞使得腎小管結構廣泛地中斷,有明顯膨脹、細胞萎縮與壞死/細胞凋亡、組織發炎與有明顯纖維化的腎小管間質膨脹。有少許腎小球損傷的證據。另一方面,經1D11或人類泛-中和單株抗體治療的大鼠顯示維持腎臟結構,如同由減少腎小管擴張與失序、降低發炎滲漏(細胞性)以及減少腎小管間質膨脹與纖維化來判斷。
亦測量使用人類泛-中和抗TGF-β單株抗體治療對於經TGF-β調控的基因表現的影響。相較於經PBS治療或經13C4對照抗體治療的動物,TGF-β1 mRNA在經人類泛-中和單株抗體治療的UUO動物中降低。相較於經PBS或13C4治療者,也在經人類與鼠抗-TGF-β抗體治療的阻塞腎臟中看到第III型膠原蛋白的mRNA含量明顯降低,指出膠原蛋白合成降低。
進一步藉由測量總腎臟TGF-β1蛋白質來確認人類泛-中和抗TGF-β單株抗體降低自體引起之TGF-β合成的效力。相較於進行假手術的動物,阻塞腎臟在總組織TGF-β1方面表現出明顯增加。但是,給與人類泛-中和單株抗體的阻塞大鼠顯示組織TGF-β1含量下降75%,低於對照組所記錄到的程度。依據比較,鼠1D11抗體相較對照組降低組織TGF-β1含量達45%。上述結果證實,使用人類泛-中和抗TGF-β單株抗體的TGF-β中和會中斷TGF-β自分泌調節環,伴隨著防止TGF-β1生產以及膠原蛋白III mRNA表現。
進一步決定人類泛-中和抗TGF-β單株抗體對平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表現的影響作為TGF-β抑制的間接指標。平滑肌肌動蛋白表現是活化肌纖維母細胞的一個指標,其與組織纖維化相關並製造纖維結締組織。TGF-β是基質纖維母細胞以及定殖上皮細胞對肌纖維母細胞的活化與表現型轉形的誘導子。藉由標準西方墨點分析偵測α-SMA蛋白。
當與假手術的動物相比時,帶有阻塞腎臟的大鼠顯示在α-SMA蛋白方面戲劇性地上調,如藉由組織均質物的西方墨點所測量。給與人類泛-中和抗TGF-β單株抗體的阻塞大鼠顯示在可測得α-SMA表現方面有明顯降低(相較於PBS對照為75%)。
這些結果證實,人類泛-中和抗TGF-β單株抗體在纖維化腎臟中降低膠原蛋白沉積的效力,明確指出該抗體在這個嚴重腎損傷以及腎小管間質纖維化的模型中是腎臟膠原蛋白製造與沉積的強力抑制劑。因為組織纖維化在器官(諸如肺臟、肝臟或腎臟)中的過程具有相同的機制或路徑,習於技藝者將理解該抗體可用於治療慢性腎病,以及特徵為病理性纖維化的其他臨床適應症。
如下測定GC1008(Fab)-TGFβ2複合體的結構。帶有C-端His6標誌(SEQ ID NO:11)的重組GC1008(Fab)在HEK293FS細胞中暫時表現並且經鎳-NTA親和力樹脂純化,接著為尺寸篩除層析。經純化的GC1008(Fab)與TGFβ2同型二聚體混合且使用尺寸篩除層析單離複合體。GC1008(Fab)-TGFβ2複合體在35% PEG400、100mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pH 6.0)中於20℃下結晶並進一步藉由種晶以及pH最佳化予以最佳化。最終數據組收集為2.83Å呈空間群P21212,並且使用分子取代以Grütter(2008)中揭示的GC1008(Fab)-TGFβ3結構來解析結構。GC1008(Fab)-TGFβ2複合體的結構描述於圖1中。
如下測定GC1009(scFv)-TGFβ1複合體的結構。帶有C-端His6標誌(SEQ ID NO:11)的重組GC1009(scFv)在大腸桿菌中過度表現並且經鎳-NTA親和力樹脂純化,接著為尺寸篩除層析。經純化的GC1009(scFv)與TGFβ1同型二聚體混合且使用尺寸篩除層析單離複合體。GC1009(scFv)-TGFβ1複合體在16% PEG 4K、0.1M檸檬酸(pH 5.0)、4% 2-丙醇中於21℃下結晶。結構測定為3Å呈空間群C2,並且使用分子取代以實例4中測定之GC1008(Fab)-TGFβ2結構來解析結構。GC1009(scFv)-TGFβ1複合體的結構描述於圖2中。
編碼GC1008重鏈或輕鏈的質體在PCR為主的突變反應中用作為模板。對編碼DNA進行突變以產生編碼重鏈胺基酸序列的155個單一胺基酸置換以及編碼輕鏈胺基酸序列的一個單一胺基酸置換。依據製造商說明書使用QuikChange® Lightning Site-Directed Mutagenesis套組,利用一組前
向與反向引子來產生DNA突變,該前向與反向引子是針對特定胺基酸或針對所有20種胺基酸以簡併密碼子(NNK)來設計。在定序確認之後,經鑑別的突變DNA與野生型輕鏈或重鏈DNA配對以供轉染至Expi293FTM宿主細胞懸浮液(Life Techonologies Corp.,Grand Island,NY)中。在轉染後4天時,收取條件培養基(1mL)並使用1mL Protein A PhyTip®管柱(PhyNexus,Inc.,San Jose,CA)以及PureSpeedTM 12-通道抽吸管(Rainin Instrument LLC,Oakland,CA)純化。使用經100RU含量的TGFβ1、2和3固定的表面,以二重複的方式在Biacore® 3000(GE Healthcare)上以50nM濃度分析經純化的變體抗體樣品。變體的解離速率(kd)除以野生型對照的kd以獲得kd的變化倍數。若(kd var/kd wt)小於1,則表示親和力增加,若該數值大於1,則表示親和力降低。產生熱圖來看結果。對TGFβ3完全喪失親和力的變體顯示為黑色而沒有數字。結果顯示於表7A、7B及7C中。
選定17個變體並按規模放大以生產足夠數量的經純化蛋白質供藉由Biacore的KD分析之用(平衡常數=kd/ka)。在經150RU含量的TGFβ1、2及3固定的表面上,以二重複的方式使用多個濃度(90、30、10以及3.33nM)。使用整體曲線擬合分析針對1對1藍幕爾結合模型(Langmuir binding model)計算KD。除了I54N與I54R變體只使用最上面2個濃度以外,所有四個濃度的實驗數據被用來計算。KD變化倍數與表7B中的kd(解離速率)變化倍數相比較,並生成一個熱圖以供視察。從兩個數據組觀察到相似的倍數變化,確認使用kd作為篩選如表7B中所示155個單一變體的參數的有效性。
表7的熱圖分析可在圖5中看到,圖5顯示GC1008結合至TGFβ的3D結構。依據顯示在圖7A底部用於熱圖分析的顏色圖解,灰鏈代表GC1008,而黑鏈代表TGFβ2。殘基I52、I54及V55標示為黑色字母;殘基Y27、S31、N32及D56標示為灰色;而殘基S30及E74標記為白色。以類似字型標記的其他六個殘基P53、N59、G101、V103、L104,及A93(輕鏈)依據熱圖分析有相似的著色。基於突變分析,最為敏感的位置(呈黑色字母的I52、I54、V55)是與完全守恆TGFβ疏水性徑區的核心交互作用的互補位殘基,而最可接受的位置(呈白色字母的S30、E74)更為遠離且與TGFβ螺旋三區交互作用。
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<120> 經生物工程之抗-TGF-β抗體及抗原結合片段ENGINEERED ANTI-TGF-BETA ANTIBODIES AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS
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<223> 人工序列的說明:合成6xHis標誌
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Claims (11)
- 一種抗體或其抗原結合片段於製造醫藥品之用途,該醫藥品用於在所需病患治療乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、胰臟癌、結腸直腸癌、皮膚癌、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠質瘤、間皮瘤、白血病或肉瘤,其中該抗體包含一可變重鏈(VH)域,其包含具有選自下列所組成群組之置換的SEQ ID NO:1:S30A、S30H、S30W、E74A、E74C、E74D、E74F、E74G、E74H、E74L、E74P、E74Q、E74R、E74S、E74T、E74W及E74Y;及一可變輕鏈(VL)域,其包含SEQ ID NO:2。
- 如請求項1之用途,其中該抗體進一步包含人類IgG恆定域。
- 如請求項2之用途,其中該IgG恆定域是人類IgG4恆定域。
- 如請求項3之用途,其中該抗體進一步包含人類κ恆定域。
- 如請求項4之用途,其中該人類IgG4恆定域包含SEQ ID NO:3,且該人類κ恆定域包含SEQ ID NO:4。
- 如請求項1-5中任一項之用途,其中該病患具有卵巢癌。
- 如請求項1-5中任一項之用途,其中該病患具有結腸直腸癌。
- 如請求項1-5中任一項之用途,其中該病患具有肺癌。
- 如請求項1-5中任一項之用途,其中該病患具有子宮頸癌。
- 如請求項1-5中任一項之用途,其中該病患具有膀胱癌。
- 如請求項1-5中任一項之用途,其中該病患具有乳癌。
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