KR20060133604A - 인간화 항-ｔｇｆ-베타 항체 - Google Patents

Abstract

본원에는 인간화 항-TGF-베타 항체 뿐만 아니라 이의 제조 방법, 및 TGF-베타 질환, 예를 들어 암의 치료 방법을 포함한 사용 방법이 제공된다. 또한, 본원의 인간화 항체를 함유하는, 각종 용도로 고안된 제조품이 제공된다.

Description

인간화 항-ＴＧＦ-베타 항체 {Humanized anti-TGF-beta antibodies}

본 발명은 인간화 항-TGF-베타 항체, 및 이의 제조 방법 및 TGF-베타 관련 질환의 치료 방법으로 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 항체는, 예를 들어 면역친화 정제, 면역분석, 생체내 조영, 방사성수용체 분석, 및 TGF-베타 활성, 특히 TGF-베타1 활성을 길항시키는 것이 요망되는 치료에 유용하다.

전환 성장 인자-베타 (TGF-베타)는 처음에 정상 섬유아세포를 부착-비의존성으로 성장할 수 있는 세포로 형질전환시킬 수 있는 능력 때문에 그렇게 명명된 다기능 사이토킨이다. 주로 조혈 세포와 종양 세포에 의해 생성된 TGF-베타는 각종의 정상 및 종양 조직 기원 세포의 성장과 분화를 조절, 즉 자극하거나 억제할 수 있고 (Sporn et al., Science, 233: 532 (1986)) 각종 간질 요소의 형성과 합성을 자극할 수 있다. TGF-베타 및 그의 작용에 관한 일반적인 고찰은 다음 문헌을 참고한다 (porn et al., J. Cell Biol., 105: 1039-1045 (1987) 및 Sporn and Roberts, Nature, 332: 217-219 (1988)).

이들은 많은 증식성 및 비증식성 세포 과정, 예를 들어 세포 증식과 분화, 배아 발생, 세포외 매트릭스 형성, 뼈 발생, 상처 치유, 조혈, 및 면역 및 염증 반응에 관여하는 것으로 공지되어 있다 (Pircher et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 136: 30-37 (1986); Wakefield et al., Growth Factors, 1: 203-218 (1989); Roberts and Sporn, pp 419-472 in Handbook of Experimental Pharmacology eds M.B. Sporn & A. B. Roberts (Springer, Heidelberg, 1990); Massague et al., Annual Rev. Cell Biol., 6: 597-646 (1990); Singer and Clark, New Eng. J. Med., 341: 738-745 (1999)). 또한, TGF-베타는 장 점막의 질환을 치료 및 예방하는데 사용된다 (WO 2001/24813).

면역학적 관점에서 특히 관심을 끄는 것은 TGF-베타의 강력한 면역억제 활성이며, 림포카인-활성화 킬러 (LAK) 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 억제 (Ranges et al., J. Exp. Med., 166: 991 (1987), Espevik et al., J. Immunol., 140: 2312 (1988), Grimm et al., Cancer Immunol. Immunother., 27: 53 (1988), Kasid et al., J. Immunol., 141: 690 (1988), Mule et al., Cancer Immunol. Immunother., 26: 95 (1988)), 저하된 B 세포 림프구형성과 카파 경쇄 발현 (Lee et al., J. Exp. Med., 166: 1290 (1987)), 조혈의 역조절 (Hino et al., Br. J. Haematol., 70: 143 (1988), Sing et al., Blood, 72: 1504 (1988)), 종양 세포 상에서 HLA-DR 발현의 하향 조절 (Czarniecki et al., J. Immunol., 140: 4217 (1988), Zuber et al., Eur. J. Immunol., 18: 1623 (1988)), 및 B 세포 성장 인자에 반응하여 항원-활성화 B 림프구의 증식 억제 (Petit-Koskas et al., Eur. J. Immunol., 18: 111 (1988))를 포함한다. 많은 인간 종양 (deMartin et al., EMBO J., 6: 3673 (1987), Kuppner et al., Int. J. Cancer. 42: 562 (1988)) 및 많은 종양 세포주 (Derynck et al., Cancer Res., 47: 707 (1987), Roberts et al., Br. J. Cancer, 57: 594 (1988))가 TGF-베타를 생산한다는 관찰 결과는, 이들 종양이 정상적인 면역 감시를 교묘하게 피할 수 있게 해주는 기전을 제안하고 있다. 이러한 역 면역조정은, 특정의 형질전환된 세포주가 자가분비 방식으로 TGF-베타와 반응할 수 있는 능력을 상실하였다는 관찰 결과 (Wakefield et al., J. Cell Biol., 105: 965 (1987), McMahon et al., Cancer Res., 46: 4665 (1986)), 및 TGF-베타가 간질 형성을 자극하고 종양의 면역 감시를 저하시킨다는 관찰 결과와 연계해서, 신생물 (종양) 탈제어와 증식에 관한 흥미로운 모델을 제시하고 있다 (Roberts et al., Br. J. Cancer, 상기 참고).

또한, 미국 특허 제5,824,297호 및 제5,262,319호는 정상 세포에 TGF-베타, 예를 들어 TGF-베타3을 투여함으로써 정상 세포의 세포독성 중독을 억제하는 방법을 개시한다.

현재 5가지 이상의 TGF-베타형이 확인되었다: TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4 및 TGF-베타5. 이러한 계열의 TGF-베타를 각종 종, 예를 들어 인간, 마우스, 그린 원숭이, 피그, 소, 병아리 및 개구리와, 각종 신체 공급원, 예를 들어 뼈, 혈소판 또는 태반으로부터 정제하는데 적합한 방법, 이를 재조합 세포 배양 하에 생성시키는데 적합한 방법, 및 이의 활성을 측정하는데 적합한 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, Derynck et al., Nature, 316: 701-705 (1985); European Pat. Pub. Nos. 200,341 published December 10, 1986; 169,016 published January 22, 1986; 268,561 published May 25,1988; and 267,463 published May 18, 1988; U. S. Pat. No. 4,774,322; Cheifetz et al, Cell, 48: 409-415 (1987); Jakowlew et al., Molecular Endocrin., 2: 747-755 (1988); Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 4715-4719 (1988); Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986); Sharples et al., DNA, 6: 239-244 (1987); Derynck et al., Nucl. Acids. Res., 15: 3188-3189 (1987); Derynck et al., Nucl. Acids. Res., 15: 3187 (1987); Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988); Seyedin et al., J. Biol. Chem., 261: 5693-5695 (1986); Madisen et al., DNA, 7: 1-8 (1988); 및 Hanks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 79-82 (1988); 이들 공개문헌의 전문이 본원에 참고로 도입된다).

TGF-베타1의 활성화 형태는 390개 아미노산 전구체의 카복시 말단 112개 아미노산을 이량체화함으로써 형성된 동종-이량체이다 (Derynck et al., Nature, 상기 참고). TGF-베타2는 414개 아미노산의 전구체 형태이고, 이를 또한 처리하여, 활성 형태의 TGF-베타1과의 상동률이 대략 70%인 카복시 말단 112개 아미노산으로부터 동종-이량체로 만든다 (Marquardt et al., J. Biol. Chem., 262: 12127 (1987)). TGF-베타2는 돼지 혈소판 (Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: 1946-1949 (1987)) 및 인간 교모세포종 세포 (Wrann et al., EMBO J., 6: 1633 (1987))로부터 정제하였고, 재조합 인간 TGF-베타2를 클로닝하였다 (deMartin et al., 상기 참고). 재조합 TGF-베타1을 클로닝하였고 (Derynck et al., Nature, 상기 참고), 이를 중국산 햄스터 난소 세포에서 발현시켰다 (Gentry et al., Mol. Cell. Biol., 7: 3418-3427 (1987)). 현재 TGF-베타1 및 TGF-베타2로서 각각 인식된 CIF-A 및 CIF-B에 관해서는 미국 특허 제4,774,322호; 제4,843,063호; 및 제4,848,063호를 참고할 수 있다 (Ellingsworth et al., J. Biol. Chem., 261: 12362-12367 (1986)). 상기 2 가지 형태 (TGF-베타1 및 TGF-베타2)의 처음 36개 아미노산 잔기에 있어 14개 아미노산이 상이하긴 하지만, 그들의 생물학적 활성은 유사하다 (Cheifetz et al., Cell, 48: 409-415 (1987); Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: 상기 참고).

가장 최근에 발견된 TGF-베타 형태인 TGF-베타3, TGF-베타4 및 TGF-베타5는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인하였다. 이들 3 가지 추정 단백질 중의 어느 것도 천연 공급원으로부터 분리하지는 못하였지만, 노던 블롯은 상응하는 mRNA의 발현을 나타내었다. 인간 및 돼지의 TGF-베타3을 클로닝하였으며, 이는 동종-이량체로서 보고되었고 중국산 햄스터 난소 세포에서 발현되었다 (Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988), ten Dijke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4715 (1988); U.S. Pat. No. 4,886,747). TGF-베타3 단백질 및 이에 대한 항체에 관해서는 WO 1992/00318을 참고할 수 있다. TGF-베타1은 27개의 주요 보존적 변화에 있어 TGF-베타2와 상이하고, 22개 주요 보존적 변화에 있어 TGF-베타3과 상이하다. 이러한 상이성은 3-D 구조와 관계가 있다 (Schlunegger and Grutter, Nature, 358: 430-434 (1992)).

TGF-베타4와 TGF-베타5는 각각 치킨 연골세포 cDNA 라이브러리 (Jakowlew et al., Molec. Endocrinol., 2: 1186-1195 (1988)) 및 개구리 난모세포 cDNA 라이브러리로부터 클로닝하였다. 이러한 개구리 난모세포 cDNA 라이브러리는 또 다른 유형의 TGF-베타의 하나 이상의 서열로부터 유래된 프로브를 사용하여 스크리닝할 수 있다. TGF-베타4 mRNA는 병아리 배아 연골세포에서 탐지 가능하지만, 발생기 배아 또는 병아리 배아 섬유아세포에서는 TGF-베타3 mRNA 보다 훨씬 덜 풍부하다. TGF-베타5 mRNA는 신경배 상태 이외의 개구리 배아 및 크세노푸스 (Xenopus) 올챙이 (XTC) 세포에서 발현된다.

TGF-베타1, TGF-베타2 및 TGF-베타3의 재조합 생성은 미국 특허 제5,061,786호; 제5,268,455호 및 제5,801,231호에 기재되어 있다. 호르몬적으로 반응성인 암종을 치료하고 항체를 생성하기 위해 사용된 TGF-베타2에 관해서는 미국 특허 제5,120,535호를 또한 참고할 수 있다. TGF-베타1.2로 불리우는, TGF-베타1과 TGF-베타2의 이종-이량체를 확인하였고, 미국 특허 제4,931,548호 및 제5,304,541호에 기재된 바와 같이 그의 용도가 입증되었는데, 후자 특허에는 그에 대한 항체가 또한 기재되었다. 문헌 (1989년 7월 20일자로 공개된 WO 1990/00900)에는 동종-이량체성 TGF-베타1 및 TGF-베타2와, 이종-이량체 TGF-베타1.2를 사용하여 염증 질환을 치료하는 방법이 기재되어 었다. 미국 특허 제5,462,925호에는 TGF-베타2와 TGF-베타3의 이종-이량체가 기재되어 있다. 미국 특허 제5,780,436호에는 TGF-베타의 소펩티드 모의체가 기재되어 있다.

증가 수준의 TGF-베타 활성은 다음을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 수 많은 병리적 질환에 관여한다: (i) 섬유증, 반흔 형성, 및 상처 치유 동안의 부착; (ii) 폐, 간 및 신장의 섬유성 질환; (iii) 아테롬성 경화증 및 동맥경화증; (iv) 특정 유형의 암, 예를 들어 전립선암, 소화계의 신경내분비 종양, 자궁경부암, 교모세포종, 및 위암; (v) 혈관병증, 혈관병증, 신병증; (vi) 전신성 경화증; (vii) 바이러스성 감염, 예를 들어 C형 간염 및 HIV; 및 (viii) 면역학적 및 염증 질환 및 결핍증, 예를 들어 류마티스성 관절염. TGF-베타에 의한 면역 및 염증 반응의 조정에는 (i) 모든 T-세포 서브세트 (subset)의 증식 억제; (ii) B 림프구의 증식 및 기능에 대한 억제 효과; (iii) 천연 킬러 세포 활성 및 T 세포 반응의 하향 조절; (iv) 면역 세포에 의한 사이토킨 생성의 조절; (v) 대식세포 기능 조절; 및 (vi) 백혈구 동원 및 활성화가 포함된다.

암에 관해서는 구체적으로, TGF-베타 계열 구성원들이 종양형성 (혈관형성 포함) 및 전이와 관계된 수 많은 생물학적 활성을 지니고 있는 것으로 공지되어 있다. TGF-베타는 모세혈관 내피 세포 및 평활근 세포를 포함한 수 많은 세포 유형의 증식을 억제한다. TGF-베타는 인테그린 발현을 하향 조절한다 (알파1베타1, 알파2베타1, 및 알파v베타3이 내피 세포 이동에 관여한다). 인테그린은 전이성 세포를 포함한 모든 세포의 이동에 관여한다. TGF-베타는 혈관형성과 전이 둘 다에 필요한 매트릭스 메탈로프로테이나제 발현을 하향 조절한다. TGF-베타는 혈관형성과 전이에 필요한 프로테이나제 케스케이드를 억제하는 플라스미노겐 활성화제 억제제를 유도시킨다. TGF-베타는 정상 세포가 형질전환된 세포를 억제하도록 유도시킨다. 예를 들어, 문헌 (Yingling et al., Nature Reviews, 3 (12): 1011-1022 (2004))에는 TGF-베타를 탈제어하는 것이 각종 질환 (암 및 섬유증 포함)의 발병 기전에 밀접한 영향을 미쳤다고 기재되어 있고, TGF-베타 신호 전달 억제제를 암 치료제, 바이오마커/진단제로서 평가하기 위한 이론적 근거, 개발중인 소분자 억제제의 구조, 및 이들 개발에 적용되는 표적화 약물 발견 모델이 제시되었다. 암을 조기에 검진하는 것이 매우 중요하고 (Ruth et al., Nature Reviews Cancer, 3: 243-252 (2003)), 암 전이의 발병 기전이 연구되고 있다 (Fidler, Nature Reviews Cancer, 3: 453-458 (2003)).

TGF-베타는 내피 세포 증식, 이동, 세포외 매트릭스 (ECM) 대사, 및 부착 분자의 발현을 조절함으로써 혈관형성의 주요 조정인자인 것으로 밝혀졌다. 이는 정상 유방 상피 세포와 수 많은 유방암 세포주의 강력한 성장 억제제이다. TGF-베타는 유방암의 종양형성에 있어 문맥상 방식으로 다형질성 효과를 발휘하는 것으로 여겨지는데, 즉 이는 혈관형성과 종양 세포 성장을 직접적으로 억제함으로써 초기 단계에서 종양형성을 억제한다. 그러나, 진행 종양에 의해 TGF-베타가 과도하게 생성되면, 이는 간접적인 혈관형성 자극과 면역 억제를 통하여 질병 진행을 촉진시킬 수도 있다. 세포막 항원 CD105 (엔도글린: endoglin)가 TGF-베타1 및 TGF-베타3과 결합하고, 이는 혈관형성성 혈관 내피 세포에서 우선적으로 발현된다. HUVEC에서의 CD105 수준 저하로 인해, TGF-베타1의 존재 하에 중증 세포가 사망하고 시험관내 혈관형성이 억제된다. CD105 기능없는 (null) 마우스는 혈관계 손상으로 인해 태내 사망하는데, 이는 CD105가 혈관 발생에 있어 중추적 역할을 한다는 것을 지시한다 (Li et al., Microsc. Res. Tech., 52: 437-449 (2001)). 비정상적인 혈관형성을 나타내긴 하지만, 본래의 조혈 능력이 TGF-베타 유형 I 수용체-결핍성 마우스에서 관찰되었다 (Larsson et al., EMBO J., 20 (7): 1663-1673 (2001)). 추가로, TGF-베타 수용체 유형 II 결핍으로 인해, 난황낭 조혈과 혈관생성에 결함이 생겼다 (Oshima et al., Developmental Biology. 179 (1): 297-302 (1996)). 또한, 심장 및 간 결함과, 전환 성장 인자 베타2 민감도 저하가 TGF-베타 유형 III 수용체-결핍성 배아에서 관찰되었다 (Stenvers et al., Mol. Cell. Biol., 23 (12): 4371-4385 (2003)). 추가로, 마우스 TGF-베타1 유전자를 표적화 붕괴시키면, 다병소성 염증 질환이 발생하였다 (Shull et al., Nature. 359 (6397): 693-699 (1992)). TGF-베타1-기능없는 마우스에서의 초기 발병 다병소성 염증은 림프구 매개된 것으로 밝혀졌다 (Diebold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92 (26): 12215-12219 (1995)).

TGF-베타의 가장 중요한 비증식성 기능은 세포외 매트릭스의 형성을 증강시키는데 있다. 이것이 주로 콜라겐과 피브로넥틴 둘 다의 전사 증가를 통하여 달성되긴 하지만, 프로테아제가 매트릭스를 분해하지 못하게 억제하는 것 또한 그의 안정성에 기여한다. 세포외 매트릭스의 분해는 프로테아제 자체의 분비가 감소되고, 이와 동시에 프로테아제 억제제 수준이 증가함으로써 억제된다.

WO 1984/001106에는 TGF-베타1, 및 세포 증식과 조직 복구, 상처 치유 및 외상 치료를 증진시키기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 미국 특허 제4,806,523호에는 TGF-베타1과 TGF-베타2 둘 다가 소염 활성을 보유하고 있고, 이들이 분열촉진물질-자극된 T 세포 증식 및 B 세포 활성화의 억제제라고 기재되어 있다. 이에는 또한, TGF-베타가 조혈과 림프구형성의 중심에 국재되므로, TGF-베타가 조혈 또는 림프구형성의 기능장애 또는 기능이상과 연관된 적응증을 치료하는데 유용할 수 있다고 보고되었다.

TGF-베타2는 인간 눈 (eye)의 감각신경 망막, 망막 색소 상피-맥락막 및 유리체에서 TGF-베타의 주요 이소형인 것으로 밝혀졌고 (Pfeffer et al.. Exp. Eye Res., 59: 323-333 (1994)), 안내 수정체 이식을 수반하는 백내장 적출이 진행되고 있는 눈 표본 내의 인체 안구방수 (aqueous humour)에서 발견되었다 (Jampel et al., Current Eye Research, 9: 963-969 (1990)). 형질전환되지 않은 인체 망막 색소 상피 세포는 주로 TGF-베타2를 분비한다 (Kvanta, Ophthalmic Res., 26: 361-367 (1994)).

TGF-베타에 대항한 항체를 이용한 치료가 그 잠재력을 발휘하는 기타 질병에는 성인 호흡기 장애 증후군, 간경화증, 후-심근 경색, 혈관확장술 후 재발협착증, 켈로이드성 흉터 (keloid scar), 및 피부 경화증이 포함된다. 골다공증에서 TGF-베타2 발현 수준이 증가되었다는 것은 (Erlenbacher et al. J. Cell Biol., 132: 195-210 (1996)), 이것이 TGF-베타2에 대항하여 지시된 항체에 의해 잠재적으로 치료 가능한 질병이라는 것을 의미한다.

TGF-베타는 다수의 중증 병리학적 질환과 관련이 있기 때문에, TGF-베타의 억제제를 개발하는데 상당한 관심이 있다. TGF-베타 억제제에 대한 제안 중의 상당 수가 항체와 관련이 있었다.

동일한 종의 TGF-베타에 대해 특이적인 항체 단편을 분리하는 것은 어려운 작업이다. 동물은 정상적으로는 자기 항원에 대한 항체를 생산하지 않는데, 이러한 현상은 관용성 (tolerance)으로 불리운다 (Nossal, Science, 245: 147-153 (1989)). 일반적으로, 자기 항원으로 예방접종하면 순환성 항체가 생성되지 않는다. 따라서, 인간 자기 항원에 대한 인간 항체를 생성시키는 것은 어렵다. 또한, 인간을 예방접종하는데 있어 도덕상의 문제점이 있다. TGF-베타에 대해 특이적인 비-인간 항체를 생성시키는 것과 관련하여 수 많은 문제점이 있다. TGF-베타는 면역억제성 분자이고, 이에는 추가로, 인간 TGF-베타 분자와 마우스 TGF-베타 분자 간의 서열이 상당히 보존되어 있다. 마우스 TGF-베타1과 인간 TGF-베타1은 1개의 아미노산 잔기 만이 상이한데, 즉 숨겨진 잔기에서의 알라닌 (인간)-대-세린 (마우스) 변화 만이 존재한다 (Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986)). 마우스와 인간 TGF-베타2는 3개의 잔기에서만 상이하다: 잔기 59 (T 마우스, S 인간); 잔기 60 (K 마우스, R 인간), 및 잔기 94 (N 마우스; K 인간). 이로써, 마우스에서 인간 TGF-베타에 대항한 항체를 생성시키는 것은 어렵다. 추가로, 생성된 어떠한 항체도 제한된 에피토프 세트에 대항해서만 지시될 수 있다.

치킨을 면역시키고 B 세포를 불멸화시킴으로써 TGF-베타에 대항한 모노클로날 항체를 생성시키고, 이를 미국 특허 제6,143,559호에 기재된 바와 같이, 예를 들어 질병의 진단 및 수동 치료를 위해 사용하였다.

중화 에피토프와 비-중화 에피토프 둘 다에 대항한 인간 TGF-베타1 및 인간 TGF-베타2와 결합하는 폴리클로날 항체를 토끼 (Danielpour et al., Growth Factors, 2: 61-71 (1989); Roberts et al. Growth Factors, 3: 277-286 (1990)), 치킨 [공급처: R&D Systems, Minneapolis] 및 칠면조 (Danielpour et al., J. Cell Physiol., 138: 79-86 (1989); Danielpour and Sporn, J. Cell Biochem., 13B: 84 (1989))에서 생성시켰다.

부분 또는 완전한 TGF-베타 서열을 나타내는 펩티드를 또한, 토끼에서 중화 폴리클로날 항혈청을 생성시키기 위한 면역원으로서 사용하였다 (Ellingsworth et al., J. Biol. Chem., 261: 12362 (1986); Ellingsworth et al., Cell. Immunol., 114: 41 (1988); Border et al. Nature, 346: 371-374 (1990); Flanders, Biochemistry 27: 739-746 (1988); Flanders et al., Growth Factors, 3: 45-52 (1990); Flanders et al., Development, 113: 183-191 (1991)). 또한, TGF-베타에 대항한 마우스 모노클로날 항체의 분리에 관한 보고서는 제한되었다. 소의 TGF-베타2 (인간 TGF-베타2와 동일함)로 면역시킨 후, TGF-베타2에 대해 특이적인 3개의 비-중화 모노클로날 항체와, TGF-베타1 및 TGF-베타2에 대해 특이적인 1개의 중화 항체를 분리하였다 (Dasch et al., J. Immunol., 142: 1536-1541 (1989)). 또 다른 보고서에는, 인간 TGF-베타1로 면역시킨 후, TGF-베타1에 대해 특이적이거나, 또는 TGF-베타1, TGF-베타2 및 TGF-베타3과 교차 반응되는 중화 항체를 분리하였다 (Lucas et al., J. Immunol., 145: 1415-1422 (1990)). 인간 및 돼지의 TGF-베타에 대한 폴리클로날 항혈청 (Keski-Oja et al., Cancer Res., 47: 6451-6458 (1987))과, 돼지의 TGF-베타2에 대한 폴리클로날 항혈청 (Rosa et al., Science 239: 783-785 (1988))이 TGF-베타1 및 TGF-베타2의 생물학적 활성을 각각 중화시키는 것으로 밝혀졌다. 토끼 항-TGF-베타 혈청이 다음 문헌에 기재되었다 (Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4167-4171 (1986)). 또한, 토끼 항혈청을 이용하여 TGF-베타1에 대항한 RIA를 확립하여, 혈소판 응집 동안 방출된 단백질을 정량화하였다 (Assoian and Sporn, J. Cell Biol., 102: 12178-1223 (1986)).

TGF-베타2와 TGF-베타3 이소형 둘 다와 결합하는 중화 마우스 모노클로날 항체가 공급처 [Genzyme Diagnostics]로부터 시판되고 있다. 인간 TGF-베타1에 대항하여 지시된 마우스 모노클로날 항체는 공급처 [R&D Systems]로부터 입수 가능하다. 이러한 항체는 중화 분석에서 TGF-베타1을 약하게만 중화시킨다. 아미노산 위치 48 내지 60 (TGF-베타1, TGF-베타2 및 TGF-베타3과 반응성인 항체) 및 아미노산 위치 86 내지 101 (TGF-베타1에 대해 특이적인 항체)을 포함하는 인간 TGF-베타1 펩티드로 면역시킨 마우스로부터 중화 마우스 모노클로날 항체를 또한 생성시켰다 (Hoefer and Anderer, Cancer Immunol. Immunother., 41: 302-308 (1995)).

파지 항체 기술 [참고: WO 1992/01047; WO 1993/19172; WO 1992/20791; WO 1993/06213; and WO 1993/11236]은 인간 TGF-베타에 대항한 인간 항체를 직접 분리할 수 있는 능력을 부여해 준다. 파지 상에 표시된 항체 절편 레퍼토리로부터 항-자기 항체를 분리하는 것이 보고되었다 (Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Nissim et al. EMBO J., 13: 692-698 (1994); Griffiths et al. 13: 3245-3260 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10003-10007 (1993); and WO 1993/11236). 또한, 문헌 (Tempest et al., Immunotechnology, 2: 306 (1996))에는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 인간 TGF-베타에 대해 특이적인 인간 항체가 기재되어 있다.

WO 1997/13844에는 인간 TGF-베타1에 대해 특이적인 인간 항체와, 인간 TGF-베타2에 대해 특이적인 인간 항체의 분리 방법이 기재되어 있다. 이에는 31G9 VH 도메인 및 이 도메인의 변이체를 수반하는 항체, 보다 구체적으로는 31G9 VH 도메인을 CS37 VL 및 이 도메인의 변이체와 함께 포함하는 항체 CS37가 기재되어 있는데, 이에는 (i) ELISA에서 TGF-베타1과의 결합을 놓고 CS37과 경쟁하는 항체, (ii) TGF-베타3에 비해 TGF-베타1과 우선적으로 결합하는 항체, 및 (iii) TGF-베타1을 중화시키는 항체가 포함된다.

미국 특허 제6,492,497호는 CS37과 관계가 있긴 하지만, TGF-베타1의 결합 및 중화와 관련하여 예상치 못한 유리한 특성을 지니고 있는 항체의 확인 (동정)에 기초한 것이다. 이들 항체는 TGF-베타2 또는 TGF-베타3과 결합하지 않고 이를 중화시키지도 않는다. 이들 항체에 대한 에피토프는 TGF-베타1의 C-말단 영역 (잔기 83 내지 112)에 있으며, 이에는 TGF-베타에 대한 수용체와 상호 작용하는 것으로 확인된 영역인, TGF-베타1의 잔기 92 내지 98로 이루어진 루프 (핑거 2로서 공지되기도 함)가 포함된다.

고도로 특이적이고 종양 진단 및 친화 크로마토그래피를 위해 사용될 수 있는, 인간 TGF-베타1에 대항한 모노클로날 항체가 JP 95068278 B2 (1995년 7월 26일자로 공개됨)에 기재되어 있다.

혈압을 조정하고 고혈압 및 저혈압을 각각 치료하기 위한, TGF-베타 및 그의 길항제의 용도가 WO 1991/19513에 기재되어 있다.

WO 1991/15223에는 TGF-베타1과 특이적으로 결합하는 칠면조 항-TGF-베타 항체와 함께 항온 배양할 수 있는 정제된 호흡 급증 억제 인자가 기재되어 있다. 이러한 항체는 활성화 대식세포 상에서의 TGF-베타1의 활성은 완전히 중화시켰지만, 대식세포 상에서의 호흡 급증 억제 인자의 활성에 대해서는 전혀 효과를 나타내지 않았다.

ECM-생성 활성 억제인자, 예를 들어 항-TGF-베타 항체와의 접촉에 의해 섬유성 질환, 예를 들어 사구체신염을 진단 및 치료하는데 있어서 TGF-베타 활성 및 세포외 매트릭스 축적을 억제하는 것이 WO 1991/04748 및 WO 1993/10808에 기재되었다. TGF-베타로부터의 선형 펩티드에 대항한 항체, 및 이러한 항체를 생산하는 세포가 또한 기재되었다.

미국 특허 제5,888,705호에는 인간 성체 췌장 세포의 일차 배양물을 간세포 성장 인자 단독과 접촉시키거나 또는 간 세포 성장 인자와 항-TGF-베타 항체의 조합물과 접촉시킴으로써, 이러한 인간 성체 췌장 세포의 증식 또는 그의 분화를 유도하는 방법이 기재되어 있다.

WO 2001/66140에는 신 기능 손실을 치료 또는 예방하기 위한 TGF-베타 길항제 (예: 항체)의 용도가 기재되어 있다.

WO 2000/40227에는 TGF-베타를 억제시키는 작용제 (예: 항체)를 사용하여, 과도한 세포외 매트릭스의 축적과 연관된 질환을 치료하는 방법이 기재되어 있다.

TGF-베타에 대한 항체는 일측성 요관 폐색증에서 관상 세포소멸을 완화시키는 것으로 다음 문헌에 기재되었다 (Miyajima et al., Kidney International, 58: 2301-2313 (2000)).

db/db 당뇨병 마우스에서 모노클로날 항-TGF-베타 항체로 처치함으로써 신 부전증, 과도한 매트릭스 유전자 발현 및 사구체 혈관사이 매트릭스 팽창을 장기간 예방하는 방법이 다음 문헌에 기재되었다 (Ziyadeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (14): 8015-8020 (2000)).

실험적 당뇨병성 신장 질환에 있어 중화 항-TGF-베타 항체를 이용한 바람직한 치료 결과가 다음 문헌에 보고되었다 (Han and Ziyadeh, Peritoneal dialysis international, 19 Suppl 2: S234-237 (1999)). TGF-베타는 고혈당증 및 당뇨병성 신장 질환에 있어 중요한 매개인자인 것으로 밝혀졌다 (Sharma and Ziyadeh, Diabetes, 44 (10) p1139-46 (1995)). 당뇨병성 신병증에 있어서의 TGF-베타의 용도가 다음 문헌에 기재되어 있다 (Border et al., Diabetes Metab. Rev., 12/4: 309-339 (1996)).

미국 특허 제5,662,904호에는 반흔 조직 형성을 억제하기 위해 상처를 치료하는데 사용하기 위한 조성물이 기재되어 있다. 이러한 조성물의 예로는 성장 인자 중화 항체, 예를 들어 TGF-베타1, TGF-베타2 및 PDGF에 대한 항체가 있다.

미국 특허 제5,972,335호에는 섬유성 질환의 상처 치유를 증진시키는데 사용하기 위한 2 가지 이상의 항체를 포함하는 조성물이 기재되어 있는데, 제1 항체는 TGF-베타1 상의 단일 에피토프에 대해 특이적이고, 제2 항체는 TGF-베타2 상의 단일 에피토프에 대해 특이적이다.

미국 특허 제5,958,411호에는 중화 항-TGF-베타 항체를 투여함으로써 CNS 병리학을 치료하는 방법이 기재되어 있다.

미국 특허 제5,616,561호에는 TGF-베타 길항제 (예: 항체)를 사용하여, 방사선에 의해 유발된 조직 손상을 치료하는 방법이 기재되어 있다.

미국 특허 제6,500,920호에는 TGF-베타2의 아미노산 49 내지 58을 포함하는 10 내지 25개 아미노산의 펩티드가 기재되어 있는데, 이러한 펩티드는 TGF-베타가 특정 세포 상의 TGF-베타 수용체와 특이적으로 결합하는 것을 억제할 수 있다.

미국 특허원 제2002/0176858호 및 미국 특허 제5,693,607호; 제6,419,928호; 제6,090,383호; 제5,783,185호; 제5,772,998호; 및 제5,571,714호 뿐만 아니라 EP 489,062; 557,418; 및 669,833, 및 WO 1992/08480; 1994/09815; 및 1994/18991에는 TGF-베타에 대한 모노클로날 항체, 예를 들어 TGF-베타1 및 TGF-베타2의 활성을 중화시키는 항체, 및 TGF-베타가 과생성되는 적응증 (예를 들어, 급성 간 손상, 간질성 폐 섬유증, 간경화증, 만성 간성 섬유증, 및 섬유성 피부 질환, 예를 들어 피부 경화증)을 치료하고, 악성 종양 (예: 육종 및 흑색종) 및 전이성 암을 진단 또는 치료하기 위한 치료적 적용에 있어서의 이들 항체의 용도가 기재되어 있다.

TGF-베타3과 연관된 질환, 예를 들어 골다공증, AIDS, 암 등을 치료하기 위한 새로운 항체가 WO 1992/00330 및 미국 특허 제5,262,319호에 기재되었다. 이러한 항체는 인간 TGF-베타3과 결합하고, TGF-베타1 및 TGF-베타2와는 교차 반응성을 나타내지 않는다.

미국 특허 제6,509,318호에는 상처 치유 동안 반흔 조직 억제 등에 사용하기 위해 TGF-베타 활성에 대해 억제성인 것으로 밝혀진 특정 계열의 소 펩티드가 기재되었다.

뇌 질환, 예를 들어 뇌 허혈증을 치료하기 위해 예비-손상된 신경세포 상에서 TGF-베타의 생물학적 활성을 억제시킬 수 있는 특정 화합물 (예: 항체)의 용도가 WO 2000/13705에 기재되었다.

뇌 질환을 치료하는데 유용한, 예비-손상된 신경세포 상에서 TGF-베타의 생물학적 활성을 억제시킬 수 있는 TGF-베타의 3 가지 이소형 모두를 인식하는 모노클로날 항체가 WO 2000/54804에 기재되었다. 이러한 항체를 사용하여, 섬모체 신경절 (CG) 및 후근절 (DRG) 뿐만 아니라 병아리 배아에서의 척수 운동신경세포의 개체발생적 세포 사멸의 주요 기간 동안 내인성 TGF-베타를 중화시켰다.

혈관형성 인자 또는 수용체에 대해 특이적인 항체, 예를 들어 TGF-베타3에 대해 특이적인 항체를 사용하여, 타목시펜 (tamoxifen)-민감성 또는 타목시펜-내성 유방암 발생 가능성을 진단 및 예측하는 방법이 WO 2000/34788에 기재되었다.

EP 945464 B1에는 인간 TGF-베타에 대한 특이적 결합 구성원, 즉 TGF-베타3과 비교해서 이소형 TGF-베타2 또는 TGF-베타1, 또는 이들 둘 다와 우선적이고도 특이적으로 결합하는 인간 TGF-베타에 대해 특이적인 인간 항체-항원 결합 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성원이 기재되었다. 특이적 결합 구성원을 분리하여, 이를 질병, 특히 섬유성 질병 및 면역/염증 질병을 치료하는데 활용할 수 있다.

TGF-베타에 대항한 항체는 사구체신염 [참고: Border et al., Diabetes Metab. Rev., 상기 참고]; 신경 반흔 형성 [참고: Logan et al., Eur. J. Neurosci., 6: 355-363 (1994); WO 1993/19783]; 피부 반흔 형성 [참고: Shah et al., Lancet, 339: 213-214 (1992); Shah et al., J. Cell Science, 107: 1137-1157 (1994); Shah et al., J. Cell Science, 985-1002 (1995); W01992/17206]; 폐 섬유증 [참고: Giri et al., Thorax, 48: 959-966 (1993)]; 동맥 손상 [참고: Wolf et al., J. Clin. Invest., 93: 1172-1178 (1994)]; 및 류마티스성 관절염 [참고: Wahl et al., J. Exp. Medicine, 177: 225-230 (1993)]을 치료하는데 유효한 것으로 밝혀졌다. TGF-베타3이 피부 반흔 형성에 있어 TGF-베타1 및 TGF-베타2에 대해 길항적으로 작용하는 것으로 제안되었다 [Shah et al., 1995 상기 참고].

문헌 [참고: Arteaga et al., J. Clin. Invest., 92: 2569-2576 (1993)]에는 항-TGF-베타 항체가 유방암 세포 종양원성을 억제시키고 마우스 비장 천연 킬러 세포 활성을 증가시킨다고 기재되었다.

섬유성 질환을 치료하고 상처 치유를 위한 항섬유성 작용제 (항-TGF-베타 포함)가 WO 1993/19769에 기재되었다.

항-TGF-베타2의 구체적 서열이 EP 853,661 B1에 기재되어 있다.

TGF-베타에 대항한 항체가 유망한 치료 효능을 나타낸 것으로 밝혀진 기타 적용 분야에는 안구 섬유증과 관련이 있는 안과 질환, 예를 들어 증식성 망막병증 [참고: Pena et al., Invest. Ophthalmology. Vis. Sci., 35: 2804-2808 (1994)]을 치료하고, 백내장 [참고: WO 1995/13827], 망막 박리 및 녹내장 배액 수술 후 증상 [참고: Khaw et al., Eye, 8: 188-195 (1994)]을 예방하기 위해 TGF-베타에 대항한 항체를 사용하는 것이 포함된다. 문헌 [참고: Connor et al., J. Clin. Invest., 83: 1661-1666 (1989)]에는 안구 섬유증을 수반하지 않으면서 복잡하지 않은 망막 박리를 나타내는 환자와 비교해서, 증식성 망막병증과 연관된 안내 섬유증 환자로부터의 유리체 흡인물에는 훨씬 더 고수준의 TGF-베타2가 존재하였고, 이러한 TGF-베타2의 생물학적 활성은 TGF-베타2에 대항하여 지시된 항체를 이용하여 중화시킬 수 있었다고 보고되었다.

질병을 치료하기 위해 TGF-베타에 대항한 항체를 사용하는 것은 섬유성 질환 [참고: WO 1991/04748]; 대식세포-결핍성 질환 [참고: WO 1993/14782]; 대식세포 병원체 감염증 [참고: WO 1993/17708; 미국 특허 제5,730,976호]; 및 혈관성 질환 [참고: WO 1993/21945]에 관한 특허 출원의 주제였다.

시험관내 또는 생체 외에서 14일 동안 생존할 수 있고, 신속하게 생체내 조혈계에서 재증식할 수 있는 TGF-베타 항체-처리된 줄기 세포 조성물이 WO 2000/43499에 기재되었다.

문헌 [참고: Scrip 2580 p14, October 04, 2000]에는 캠브릿지 항체 기술 [Cambridge Antibody Technology (CAT)]과 젠자임 (Genzyme)이 함께 작업하여 TGF-베타에 대항한 인간 모노클로날 항체를 개발하였다고 보고되었다. CAT는 2 가지 본래 인간 TGF-베타 항체인 CAT-152 및 CAT-192를 갖고 있고, 젠자임은 TGF-베타1, TGF-베타2 및 TGF-베타3을 중화시키고 미만성 피부 경화증에 대한 잠재적 치료제로서 평가되고 있는 뮤린 범-특이적 모노클로날 항체인 1D11을 갖고 있다. CAT는 그의 파지 디스플레이 기술을 이용하여 1D11의 인간 유사체를 개발하고자 하였다. 항-TGF-베타 치료에 대한 기타 몇 가지 임상 적응증, 예를 들어 안과 적응증, 수술 후 반흔 형성, 주요 기관 (예: 폐, 신장 및 간)의 섬유증, 및 특정 암이 또한 고려될 뿐만 아니라 TGF-베타2의 성장을 억제함으로써 악성 뇌 종양을 치료하는 것이 고려될 것이다. CAT-152 (항-TGF-베타2)는 녹내장 수술이 진행되고 있는 환자에게서 수술 후 반흔 형성을 예방하기 위한 제II 상 시험 중에 있고, CAT-192 (항-TGF-베타1)은 제I 상 시험을 완료하였다 [참고: "Trends in Antibody Research: The Monoclonal Elite" by Tim Searle, Bioventure-View 1510 p14, October 1, 2000].

항-TGF-베타 항체를 사용하여 TGF-베타를 정량화하는 방법이 WO 1995/19987에 기재되었다. TGF-베타-반응성 발현 벡터를 함유하는 진핵성 세포를 사용하여 특정 샘플 중에서 활성 TGF-베타를 측정하기 위한 새로운 분석이 WO 2000/00641에 기재되었다. 이러한 분석에는 한랭박편을 항-TGF-베타 이소형 중화 항체와 함께 예비-항온 배양하는, 특정 샘플 중에서 TGF-베타 이소형 수준을 측정하기 위한 분석이 포함된다. TGF-베타 항체를 이용하는 TGF-베타 면역분석이, 예를 들어 JP 2126157 및 JP 92041307 B (1992년 7월 7일자로 공개됨)에 기재되었다.

문헌 [참고: Darland and D'Amore, J. Clin. Invest., 103: 157-158 (1999)]에는 혈관 발생이 성장 인자 의존성 기로부터 진행되는데, 생존 인자 손실로 인해 세포소멸이 유발된다고 기재되었다. 혈관 안정화는 벽 세포를 수반한 매몰, TGF-베타의 국소 활성화, 및 기저막 생성을 특징적으로 나타낸다. 이는 VEGF 및 TGF-베타를 포함한 성장 인자의 성체 혈관에서의 역할이 무엇인지에 관한 몇 가지 의문을 제기한다. 문헌 [참고: Benjamin et al., J. Clin. Invest., 103: 159-165 (1999)]에는 VEGF 철수에 따라 확립된 인간 종양에서 미성숙 혈관이 선택적으로 제거된다고 기재되었다.

키메라 및 인간화 항체를 제조하는 방법이 보고되었고, 이러한 분야에서의 기타 참고 문헌에는, 예를 들어 다음이 포함된다: 인간 표피 성장 인자 수용체에 대항한 본래의 인간 모노클로날 항체에 관한 미국 특허 제6,235,883호; 마우스-인간 키메라 항체에 관한 EP 184187; 파지 기술을 사용하여 항체를 재조합적으로 제조하는 방법에 관한 EP 844,306; 비-인간 공여자 및 인간 수용자 골격을 갖는 CDR-그래프트화 항체, 바람직하게는 인간화 항체의 제조에 관한 미국 특허 제5,859,205호; 인간화 기술에 관한 EP 120,694, EP 125,023, EP 171,496, EP 173,494, EP 239,400, WO 1989/07452, WO 1990/07861 및 WO 1986/01533; 초인간화 항체에 관한 미국 특허원 제2003/0039649호; 인간 TNF-알파에 대한 특이성을 지닌 인간화 항체에 관한 미국 특허원 제2003/0039645호; 재조합 항체 및 그의 생성에 관한 EP 239,400; 인간화 항체에 관한 WO 1991/09967; 항체 생성에 관한 WO 1992/01047; 인간화 항체의 제조 방법에 관한 WO 1992/22653; 다가 항원 결합 단백질에 관한 WO 1993/11161; 다가 항원 결합 단백질에 관한 WO 1994/13804; TGF-베타에 대한 특이적 결합 구성원에 관한 WO 2000/66631; 및 문헌 [참고: Henry "Special Delivery: Alternative methods for delivering drugs improve performance, convenience, and patient compliance." C & EN, p. 49-65 (2000)]. 또한, 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: U.S. Pat. Nos. 6,140,471 and 5,969,108 and 5,872,215 and 5,871,907 and 5,858,657 and 5,837,242 and 5,733,743; EP 1,024,191; EP 774,511; WO 1997/13844; EP 656,941 and 605,522 and WO 1994/13804; EP 589,877; EP 585,287; WO 1993/19172; EP 540,586; WO 1993/06213; WO 1992/20791; WO 1992/01787; and WO 1992/01047]. 추가로, WO 2004/065417에는 수율을 개선시키기 위한 항체 및 항원 결합 단편에 대한 각종 변경물이 기재되었다 [또한, US 20050049403 참고].

상기 제시된 바와 같은 질환에 있어 불리한 효과를 예방하기 위해 TGF-베타 분자를 제어할 필요가 있다. 또한, TGF-베타 길항제로서 작용하도록 하기 위해 TGF-베타와 특이적으로 결합하고 TGF-베타 활성을 중화시키는 고 친화성의 모노클로날 항체를 제공할 필요가 있다. 면역 기능 억제 및 TGF-베타 유도된 간질 형성과 연계해서 종양 세포에 의한 명백한 TGF-베타 조절 손실로 인해, TGF-베타 길항제를 이용한 잠재적 개입이 암 요법에 대한 흥미로운 선택 사항이 되었다. 또한, TGF-베타 항체는 진단 분석 및 면역친화 분석에 있어 유용하다.

발명의 요약

일면에서, 본 발명은 인간 가변 중쇄 (V_H) 도메인 내로 혼입된 비-인간 초가변 영역 잔기를 포함하는 V_H 도메인을 포함하는 TGF-베타와 결합하는 인간화 항체를 제공하는데, 이러한 가변 도메인은 48, 49, 67, 69, 71, 73, 및 78로 이루어진 군 중에서 선택된 위치 [문헌 (참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에 제시된 넘버링 시스템을 활용함]에서의 서열 6 내의 골격 영역 (FR) 치환을 포함한다. 상기 항체에는 본래 IgGl 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 Fab가 포함된다.

바람직하게는, 인간화 항체가 위치 49, 67 및 71에서의 FR 치환을 포함하는데, 보다 바람직하게는 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 67에서 페닐알라닌이 알라닌으로 변화되며, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화된다.

또 다른 바람직한 태양에서는, 인간화 항체가 위치 48, 49 및 71에서의 FR 치환을 포함하는데, 보다 바람직하게는 위치 48에서 발린이 이소루이신으로 변화되고, 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되며, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화된다.

또한 바람직하게는, 인간화 항체가 위치 49, 69 및 71에서의 FR 치환을 포함하는데, 보다 바람직하게는 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 69에서 이소루이신이 루이신으로 변화되며, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화된다. 또 다른 국면에서는, 부가의 FR 치환이 위치 73에서 이루어지는데, 보다 바람직하게는 위치 73에서 아스파라긴이 리신으로 변화된다.

또 다른 바람직한 태양에서는, 인간화 항체가 위치 49, 71 및 73에서의 FR 치환을 포함하는데, 보다 바람직하게는 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화되며, 위치 73에서 아스파라긴이 리신으로 변화된다.

또 다른 바람직한 태양에서는, 인간화 항체가 위치 49, 71 및 78에서의 FR 치환을 포함하는데, 보다 바람직하게는 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화되며, 위치 78에서 루이신이 알라닌으로 변화된다.

또 다른 바람직한 태양에서는, 상기 항체 모두가 가변 경쇄 (V_L) 도메인 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 RASQSVLYSSNQKNYLA (서열 36); WASTRES (서열 38); 및 HQYLSSDT (서열 40)을 포함하거나; 또는 제1 CDR (CDR Ll)이 인간 생식세포계 카파 유전자 자리 L8/L9의 서열: RASQGISSYLA (서열 37)로 복귀되고/되거나 제2 CDR (CDR L2)이 인간 생식세포계 카파 유전자 자리 L8/L9/L14/L15으 서열: YASSLQS (서열 39)로 복귀되는 V_L 도메인 CDR 잔기를 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서는, 상기 항체 모두가 V_H 도메인 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 GYAFTNYLIE (서열 41), VNNPGSGGSNYNEKFKG (서열 42), 또는 VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및 SGGFYFDY (서열 44)을 포함한다.

또한, 본 발명은 세포독성제와 접합되거나 또는 접합되지 않은 상기 항체들을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 항체와 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

추가적인 태양에서, 본 발명은 인간화 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

부가적으로, 본 발명은 상기 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하여, 이러한 핵산이 발현되고 항체가 생성되도록 하는데, 이러한 항체가 바람직하게는 숙주 세포 배양물, 보다 바람직하게는 숙주 세포 배양 배지로부터 회수되도록 하는 것을 포함하여, 인간화 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 또한, 숙주 세포를 가변 중쇄 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와, 가변 경쇄 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 공동-형질감염시킬 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 유효량의 인간화 항체를 포유류에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 포유류, 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게는 인간에게서 TGF-베타 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이는 인간화 항체 이외의 치료제, 예를 들어 화학요법제, 항혈관형성제, 세포독성제 또는 사이토킨의 유효량을 포유류에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 인간화 항체를 특정 신체 샘플과 접촉시키고, TGF-베타에 대한 항체 결합이 이루어졌는지를 측정하는 것을 포함하여, 상기 신체 샘플 중에서 TGF-베타를 탐지하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 인간화 항체를 함유하는 용기와, 사용자가 이러한 항체를 이용하여 포유류, 바람직하게는 인간에게서 TGF-베타 질환을 치료하도록 지시하는 지시 사항을 포함하는 제조품을 제공한다. 이러한 제조품은 인간화 항체 이외의 치료제를 함유하는 용기를 포함할 수도 있는데, 지시 사항은 사용자가 상기 질환을 치료하기 위해 본 발명의 항체를 상기 치료제와 병용해서 사용하는 것을 지시하고 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 TGF-베타 항체 및 혈관 내피 성장 인자와 결합하는 항체의 유효량을 포유류에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 포유류에게서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 포유류가 인간이다. 또 다른 태양에서는, TGF-베타 항체가 다음 중의 어느 하나 이상과 결합한다: TGF-베타1, TGF-베타2 및 TGF-베타3. 추가 태양에서는, 상기 항체가 TGF-베타1과 결합하거나, 또는 TGF-베타1 및 TGF-베타2 둘 다와 결합한다.

도 lA 및 1B는 뮤린 모노클로날 항체 2G7의 가변 경쇄 (V_L) (도 1A) 및 가변 중쇄 (V_H) (도 1B) 도메인의 아미노산 서열 (각각 서열 1 및 2); 인간화 huxTGFB 버젼의 V_L 및 V_H 도메인 (V5H.V5L)의 아미노산 서열 (각각 서열 3 및 4); 및 인간 V_L 및 V_H 컨센서스 골격 (hum κl, 경쇄 카파 아군 I; humIII, 중쇄 아군 III)의 아미노산 서열 (각각 서열 5 및 6) 정렬을 도시한 것이다. 별표는 인간화 huxTGFB와 뮤린 모노클로날 항체 2G7 간의 차이, 또는 인간화 huxTGFB와 인간 컨센서스 골격 영역 간의 차이를 확인한 것이다. 상보성 결정 영역 (CDR)이 밑줄쳐져 있고, 실제 인간 생식세포계 서열의 CDR이 비교를 위해 컨센서스 골격 영역 아래에 있다 서열 7 내지 11).

도 2는 각종 CDR 영역 (서열 18 내지 23)을 코딩하는 DNA 서열 (서열 12 내지 17)을 도시한 것이다.

도 3은 709.landH.IgGl의 아미노산 서열 (서열 24); H2NI.V5L의 아미노산 서열 (서열 25), V11H.V11L의 아미노산 서열 (서열 26), V5H.V5L의 아미노산 서열 (서열 27), chimL.chimH의 아미노산 서열 (서열 28), 및 V5H.g1L2의 아미노산 서열 (서열 29)을 도시한 것이다.

도 4는 도 3의 서열을 코딩하는 신호 서열을 수반하지 않고 및 수반한 핵산 서열을 도시한 것이다 (서열 30 내지 35).

도 5는 TGF-베타에 대한 2G7 IgG 변이체 인간화 항체의 결합 곡선을 도시한 것이다.

도 6은 실시예 2에 기재된 바와 같은 면역글로불린 경쇄를 발현하기 위한 플라스미드 pDRl의 서열 (서열 45; 5391 bp)을 도시한 것이다. pDRl은 무관한 항체, 즉 인간화 항-CD3 항체 [참고: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]의 경쇄를 코딩하는 서열을 함유하는데, 그의 출발 및 중지 코돈이 진하게 밑줄쳐져 있다.

도 7은 실시예 2에 기재된 바와 같은 면역글로불린 중쇄를 발현하기 위한 플라스미드 pDR2의 서열 (서열 46; 6135 bp)을 도시한 것이다. pDR2는 무관한 항체, 즉 인간화 항-CD3 항체 [Shalaby et al., 상기 참고]의 중쇄를 코딩하는 서열을 함유하는데, 그의 출발 및 중지 코돈이 진하게 밑줄쳐져 있다.

도 8은 TGF-베타에 대한 2G7 생식세포계 복귀 돌연변이체 인간화 항체의 결합 곡선을 도시한 것이다.

도 9는 TGF-베타1 항체 2G7 및 몇 가지 TGF-베타 변이체 항체의 마우스 혈관사이 세포 증식 분석의 차단 결과를 도시한 것이다.

도 10A-10C는 TGF-베타에 대항한 3 가지 인간화 항체 (H2NI.V5L, H2NI.glL2, 및 V5H.gIL2) 및 2G7 뮤린 항체에 의한 3T3 섬유아세포 증식 분석에서, 3 가지 상이한 농도 각각에서의 TGF-베타3의 중화를 도시한 것이다.

도 11A-11C는 도 10에 제시된 4개 항체에 의한 3T3 섬유아세포 증식 분석에서, 3 가지 상이한 농도 각각에서의 TGF-베타2의 중화를 도시한 것이다.

도 12A-12C는 도 10에 제시된 4개 항체에 의한 3T3 섬유아세포 증식 분석에서, 3 가지 상이한 농도 각각에서의 TGF-베타1의 중화를 도시한 것이다.

도 13A-13C는 도 10에 제시된 4개 항체에 의한 3T3 섬유아세포 증식 분석에서, 2 ng/ml TGF-베타l, 베타2, 및 베타3의 중화를 도시한 것이다.

도 14A-14D는 인간화 항체 H2NI.V5L (도 14A), 인간화 항체 H2NI.glL2 (도 14B), 2G7 뮤린 항체 (도 14C), 및 인간화 항체 V5H.glL2 (도 14D)에 의한 3T3 섬유아세포 증식 분석에서, 3 가지 TGF-베타 이소형의 중화를 도시한 것이다.

도 15A 및 15B는 정상 및 종양 상피 세포에 의한 TGF-베타의 생성 및 억제의 ELISA 결과를 도시한 것이다. 도 15A는 정상 상피 세포 (EpC) (C57) 및 종양 EpC (4Tl 모델)에 의한 TGF-베타1의 시험관내 생성을 도시한 것이다. 도 15B는 정상 및 종양 EpC에서 IgG 대조군 항체 (이소형-매치된 IgG; 항-두드러기쑥 (ragweed) 항체)와 비교한, 종양 EpC에서의 혈청 TGF-베타1 수준에 대한 생체내 항-TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다. 이러한 동일한 IgG 대조군은 나머지 도면에서도 사용되었고, 도 28에서는 이와 동일하거나 동일하지 않을 수 있는 IgG 대조군이 사용되었다.

도 16A 및 16B는 IgG 대조군과 비교한, 이차 폐 종양에 대한 항-TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다. 도 16A는 IgG 대조군 항체와 항-TGF-베타 항체 2G7 둘 다에 대한, 악성도 및 병에 걸린 엽의 수를 나타낸 조직학 스코어를 도시한 것이고, 도 16B는 동일한 대조군과 항-TGF-베타 항체 2G7에 대한 조직 중량을 그램 및 체중 비율로 도시한 것이다.

도 17은 IgG 대조군과 비교한, μCT에 의한 폐 종양의 정량화 (종양 용적 및 종양 수로 나타냄)에 대한 항-TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다.

도 18A 및 18B는 IgG 대조군과 비교한, 4T1 유방암 모델에서 항-TGF-베타 항체 2G7과 화학요법의 효과를 도시한 것이다. 도 18A는 식염수를 수반한 IgG 대조군, IgG 및 도세탁셀 [docetaxel: TAXOTERE^®] 대조군, 및 항-TGF-베타 항체 2G7 및 도세탁셀 (TAXOTERE^®)에 대한, 세포 주사한 후의 시간의 함수로서의 종양 용적을 도시한 것이다. 도 18B는 2 가지 대조군 [TAXOTERE^® 도세탁셀을 수반한 IgG 및 수반하지 않은 IgG] 및 도세탁셀 (TAXOTERE^®)을 수반한 항-TGF-베타 항체에 대한 뇌, 폐, 비장 및 종양의 조직 중량을 도시한 것이다.

도 19는 대조군 IgG (대조군) 또는 항-TGF-베타 (2G7)로 처리시킨 4T1 유방 종양이 있는 마우스에서, 또는 종양이 없는 마우스 (정상)에서의 혈장 VEGF 수준 (pg/ml)을 도시한 것이다.

도 20A 및 20B는 상이한 유방암 모델 PymT에서 TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다. 도 20A는 TGF-베타 항체 및 IgG 대조군에 대한 종양 성장의 일수 함수로서의 종양 용적을 도시한 것이고, 도 20B는 TGF-베타 항체 및 IgG 대조군에 대한 종양 중량을 도시한 것이다.

도 21A 및 21B는 마우스 흑색종 모델 B16, 및 IgG 대조군과 비교한 TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다. 도 21A는 대조군 및 TGF-베타 항체에 대한 병리학 및 표면에 대한 폐 종양 마우스 비율을 도시한 것이고, 도 21B는 대조군 및 TGF-베타 항체에 대한 표면, 클리어된 및 CT에 대한 폐 종양 수를 도시한 것이다

도 22는 대조군 IgG와 비교한, 접종 후 14일에 걸쳐 B16 종양 성장 (용적)에 대한 TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다.

도 23은 대조군 IgG와 비교한, B16 (E6) 가시적 폐 전이 계수치에 대한 TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다.

도 24는 대조군 IgG와 비교한, 접종 후 17일에 걸쳐 B16 종양 성장 (용적)에 대한 TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다.

도 25는 대조군 IgG와 비교한, B16 원발차 종양 중량에 대한 TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다.

도 26은 대조군 IgG와 비교한, B16 (E7) 가시적 폐 전이 계수치에 대한 TGF-베타 항체 2G7의 효과를 도시한 것이다.

도 27은 42일 까지의 기간에 걸쳐 대조군 IgG와 비교한, 인간 폐 세포 Calu-6 마우스 이종이식편에서의 종양 용적에 대한 TGF-베타 항체 2G7, 뮤린 모노클로날 항-VEGF 항체 A461, 및 이들 두 항체의 조합물의 효과를 도시한 것이다. 각종 작용제를 이용한 처치는 2일째에 시작하였다.

도 28은 3 가지 유형의 항체 처치 및 IgG 대조군에 대한 도 27에서의 Calu-6 실험에 대한 최종 종양 중량을 도시한 것이다.

I. 정의

용어 "TGF-베타" 및 "전환 성장 인자-베타"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 인간으로부터의 모든 TGF-베타 [이에는 전구체 및 성숙한 TGF-베타의 잠복 형태 및 연합되거나 연합되지 않은 복합체 ("잠복 TGF-베타")가 포함된다]의 완전한 길이 본래의 아미노산 서열을 갖는, 전술된 계열의 분자를 지칭한다. 이러한 본원에서의 TGF-베타에 대한 기준은 현재 확인된 형태, 예를 들어 TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4 및 TGF-베타5, 및 이들의 잠복 버젼 뿐만 아니라 앞으로 확인될 인간 TGF-베타 종, 예를 들어 공지된 모든 TGF-베타의 서열로부터 유래되고 이러한 서열과 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 95% 이상 상동성인 폴리펩티드 중의 어느 하나에 대한 기준인 것으로 인지해야 할 것이다. 특정 용어 "TGF-베타1", "TGF-베타2" 및 "TGF-베타3" 뿐만 아니라 "TGF-베타4" 및 "TGF-베타5"는 다음 문헌에서 규정된 TGF-베타를 지칭한다 [Derynck et al., Nature, 상기 참고, Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262, 상기 참고, 및 deMartin et al., 상기 참고]. 용어 "TGF-베타"는 인간 TGF-베타를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 바람직한 TGF-베타는 본래 서열 인간 TGF-베타이다.

TGF-베타 계열 구성원은 해당 분자의 성숙 부위에 9개 시스테인 잔기를 갖고, 성숙 영역에서 기타 공지된 TGF-베타 서열과의 상동률이 65% 이상이며, 동일한 수용체를 놓고 경쟁할 수 있는 것으로서 정의된다. 또한, 이들 구성원 모두는 N-말단 근처에 높은 상동성 영역을 공유하고 있고, 프로세싱에 의해 나중에 제거될 전구체의 일정 부분에 3개의 시스테인 잔기 보존을 나타내는 보다 큰 전구체로서 코딩되는 것으로 여겨진다. 더욱이, TGF-베타는 4개 또는 5개 아미노산을 수반한 프로세싱 부위를 갖는 것으로 여겨진다.

"본래 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 폴리펩티드 (예: TGF-베타1)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 본래 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 분리할 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 따라서, 본래 서열 폴리펩티드는 천연 발생적 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 기타 모든 포유류 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

용어 "아미노산 서열 변이체"는 본래 서열 폴리펩티드와는 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 이러한 변이체와 비교되는 본래 서열 폴리펩티드 또는 그의 일부와의 상동률이 약 70% 이상일 것이며, 바람직하게는 이들 변이체가 상기 본래 서열 폴리펩티드 또는 그의 일부와의 상동률이 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 본래 아미노산 서열 내의 특정 위치에서의 치환, 결실 및/또는 삽입을 보유한다.

"상동률"은 서열들을 정렬하고, 최대 상동률을 달성하기 위해 필요에 따라 갭을 도입한 후에 동일한 아미노산 서열 변이체 내의 잔기 비율로서 규정된다. 정렬 방법 및 정렬시키기 위한 컴퓨터 프로그램은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램 중의 하나가 "얼라인 (Align) 2"인데, 이는 제넨테크, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)가 1991년 12월 10일자로 미국 저작권국 (the United States Copyright Office, Washington, DC 20559)에 사용자 문서로 출원하였다.

본원에서의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 본래의 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2개 이상의 본래 항체로부터 형성된 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하는데, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체는, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 지시된다. 더욱이, 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 지시된다. 모노클로날 항체는 그의 특이성 이외에도, 기타 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 지시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제4,816,567호 참고]에 의해 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol.Biol., 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 그의 단편이 포함된다 [참고: U.S. Patent No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]. 본원에서 관심있는 키메라 항체에는 비-인간 영장류 (예: 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체가 포함되다.

"항체 단편"은 본래 항체의 일부, 바람직하게는 그의 항원 결합성 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아보디 (diabody); 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편(들)으로부터 형성된 다중-특이적 항체가 포함된다.

"본래" 항체는 항원 결합 가변 영역 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (C_L) 및 중쇄 불변 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 본래 서열 불변 도메인 (예: 인간 본래 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 본래 항체가 한 가지 이상의 효과기 기능을 지닌다.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (본래 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예에는 Clq 결합성; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다.

본래 항체의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 이러한 항체는 상이한 "부류"로 지정될 수 있다. 본래 항체에는 5 가지 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있는데, 이들 중의 몇 개는 "아부류" (이소형)으로 추가 분할될 수 있다: 예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위체 구조와 3차원적 입체 배치는 널리 공지되어 있다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식한 다음, 연속해서 이러한 표적 세포의 용해를 유발시키는 세포-매개성 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는데 있어 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [참고: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석, 예를 들면, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [참고: Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 652-656 (1998)]에 기재된 바와 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다.

"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR를 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 상기 세포가 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 및 호중구가 포함되는데, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이러한 효과기 세포는 그의 본래 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMC로부터 분리할 수 있다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 본래 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 것이고 (감마 수용체), 이에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 아부류의 수용체가 포함되는데, 이에는 이들 수용체의 대립 유전자성 변이체 및 대체 스플라이싱된 형태 또한 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")가 포함되는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [참고: Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)]. FcR는 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995)]. 기타 FcR는 앞으로 확인될 것을 포함하여, 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어에는 또한, 모계 IgG를 태아에게 전이시키는데 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn이 포함된다 [참고: Guyer et al., J. Immunol., 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol., 24: 249 (1994)].

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포를 용해시킬 수 있는 특정 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을, 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예: 항체)와 결합시킴으로써 개시시킨다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [참고: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.

"본래 항체"는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 디설파이드 연쇄 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한, 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (V_H)에 이어 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (V_L)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하고, 이러한 부분은 특정한 각 항체가 그의 특정한 항원에 대한 특이성과 결합을 위해 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역으로 불리우는 3 가지 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분이 골격 영역 (FR)으로 지칭된다. 본래 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하는데, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 상기 FR에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 [Kabat et al., 상기 참고]. 불변 영역은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 각종의 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체 참여를 나타낸다.

본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들면, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (Ll), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (Hl), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); Kabat et al, 상기 참고] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들면, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (Ll), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 참고: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.. 196: 901-917 (1987)]를 포함한다. "골격 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

항체를 파파인 분해시키면, "Fab" 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원 결합 단편 (각각은 단일 항원 결합 부위를 갖는다)과 잔류성 "Fc" 단편 (이의 명칭은 용이하게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영한다)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생상된다.

"Fv"는 본래 항체 인식 및 항체 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 이러한 입체 배치에서는, 각 가변 도메인의 3개 초가변 영역이 V_H-V_L 이량체 표면 상에 항원 결합 부위를 명백히 규정하도록 상호 작용한다. 집합적으로, 6개 초가변 영역이 항체에 항원 결합 특이성을 부여해 준다. 그러나, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 초가변 영역 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.

Fab 단편은 또한, 경쇄의 불변 도메인과, 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 수 개의 잔기를 부가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 1개 이상의 자유 티올기를 보유하고 있는, Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래에는, 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링물이 또한 공지되어 있다.

모든 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2 가지 명백한 별개 유형 [카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭됨] 중의 하나로 지정될 수 있다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 바람직하게, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, V_H 및 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 고찰에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]. 항-TGF-베타 항체 scFv 단편이 문헌 [참고: WO 1993/16185; 미국 특허 제5,571,894호 및 미국 특허 제5,587,458호]에 기재되었다.

용어 "디아보디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 가변 경쇄 도메인 (V_L)과 연결된 가변 중쇄 도메인 (V_H)을 포함한다 (V_H - V_L). 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 짝짓기시킴으로써, 2개의 항원-결합 부위를 창출시킨다. 디아보디는, 예를 들어 다음 문헌에 보다 상세히 기재되었다 [참고: EP 404,097; WO 1993/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)].

"인간화" 형태의 비-인간 (예: 설치류) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류로부터의 초가변 영역 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)].

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 특정 구성분으로부터 격리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 태양에서는, 항체를 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 측정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조할 것이다.

관심있는 항원, 예를 들어 TGF-베타 항원과 "결합하는" 항체는 이러한 항체가 상기 항원을 발현하는 세포를 표적화하는데 있어 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 항원과 결합할 수 있는 것이다. 항체가 TGF-베타와 결합하는 경우에는, 통상적으로 TGF-베타 초분자군의 기타 구성원들과는 반대로 TGF-베타와 우선적으로 결합할 것이며, 이러한 계열의 기타 단백질, 예를 들어 BMP, 악티빈 등과는 상당히 교차 반응하지 않는 것일 수 있다. 이러한 태양에서는, 항체가 이들 비-TGF-베타 단백질과 결합하는 정도가 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 10% 미만일 것이다.

지명된 항체, 예를 들어 2G7로 지명된 모노클로날 항체의 "생물학적 특징"을 지닌 항체는, 이를 동일한 항원 (예: TGF-베타)와 결합하는 기타 항체들과 구별시켜 주는 항체의 한 가지 이상 생물학적 특징을 보유하고 있는 것이다. 예를 들어, 2G7의 생물학적 특징을 지닌 항체는 TGF-베타의 활성화를 차단시킬 수 있고/있거나 2G7에 의해 결합된 바와 동일한, TGF-베타의 세포외 도메인 내의 에피토프와 결합할 수 있다.

달리 지시되지 않는 한, "모노클로날 항체 2G7"이란 표현은 다음 실시예의 뮤린 2G7 항체의 항원 결합성 잔기 또는 뮤린 2G7 항체로부터 유래된 항원 결합성 잔기를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 모노클로날 항체 2G7은 뮤린 모노클로날 항체 2G7, 또는 뮤린 모노클로날 항체 2G7의 항원 결합성 아미노산 잔기를 보유하고 있는 그의 변이체, 예를 들어 인간화 항체 2G7일 수 있다. 인간화 2G7 항체의 예가 다음 실시예 2에 제공된다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 경우의 표현 "rhuMAb 2G7"은 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 임의로 발현된 인간 경쇄 및 중쇄 IgG1 (비-A 동종이형) 불변 영역 서열과 융합된, 서열 1 및 2의 가변 경쇄 (V_L) 및 가변 중쇄 (V_H) 서열을 각각 포함하는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 경우의 "성장 억제제"는 특정 세포, 특히 TGF-베타-발현성 암 세포의 성장을 시험관내 또는 생체 내에서 억제시켜 주는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상에서의 TGF-베타-발현성 세포의 비율을 상당히 감소시켜 주는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S 상 이외의 위치에서) 세포-주기 진행을 차단시켜 주는 작용제, 예를 들어 G1 정지 및 M-상 정지를 유도시켜 주는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-상 차단제에는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시켜 주는 작용제는 또한, S-상 정지를 유발시키는데, 이에는 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C가 포함된다. 추가의 정보는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p.13].

"성장 억제성" 항체의 예는 TGF-베타와 결합하고, TGF-베타를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시켜 주는 것이다. 바람직한 성장 억제성 항-TGF-베타 항체는 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서, 세포 배양 중인 SK-BR-3 유방 종양 세포의 성장을 20% 초과, 바람직하게는 50% 초과 (예를 들어, 약 50% 내지 약 100%) 억제시켜 주는데, 이러한 성장 억제는 SK-BR-3 세포를 항체에 노출시킨지 6일 후에 측정한다 [1997년 10월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,677,171호 참고]. SK-BR-3 세포 성장-억제 분석이 상기 특허에 보다 상세히 기재되어 있다.

"세포 사멸을 유도하는" 항체는 생육 가능한 세포를 생육 불가능한 세포가 되도록 하는 것이다. 이 세포는 일반적으로, TGF-베타 수용체를 발현하는 것인데, 특히 상기 세포는 TGF-베타 수용체를 과발현한다. 바람직하게는, 상기 세포가 암 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 시험관 내에서는 상기 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 시험관 내에서의 세포 사멸은, 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸과 구별하기 위해 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에서 측정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸을 알아보기 위한 분석은 열-불활성화 혈청을 사용하고 (즉, 보체의 부재 하에) 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도시킬 수 있는지를 측정하기 위해, 처치되지 않은 세포와 비교해서 프로피듐 요오드 (PI), 트리판 블루 [참고: Moore et al., Cytotechnology, 17: 1-11 (1995)] 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가된 바와 같은 막 완전성의 상실을 평가할 수 있다. 바람직한 세포-사멸-유도성 항체는 BT474 세포에서의 PI 흡수 분석에서 PI 흡수를 유도시켜 주는 것이다 (하기 참고).

"세포소멸을 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 내형질 세망의 확장, 세포 단편화 및/또는 막 소포 (세포소멸체로 불리움)의 형성에 의해 측정된 바와 같은 프로그램된 세포 사멸을 유도시키는 것이다. 세포는 통상적으로, TGF-베타 수용체를 과발현하는 것이다. 바람직하게는, 세포가 종양 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 시험관 내에서는 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 세포소멸과 연관된 세포성 사건을 평가하기 위한 각종 방법이 현재 이용 가능하다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 DNA 래더링 (laddering)을 통하여 평가할 수 있으며; DNA 단편화를 수반하는 핵/염색질 응축은 저이배체 (hypodiploid) 세포 상의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 세포소멸을 유도시키는 항체는 BT474 세포를 이용한 아넥신 결합 분석 (하기 참조)에서, 처치되지 않은 세포에 비해 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 정도로 아넥신 결합을 유도시켜 주는 것이다. 때때로, 프로-세포소멸성 항체는 TGF-베타 결합을 추가로 차단시켜 주는 것인데 (예를 들어, 2G7 항체), 즉 이러한 항체는 TGF-베타에 대한 항체와 생물학적 특징을 공유하고 있다. 기타 상황에서는, 항체가 TGF-베타를 상당히 차단시키지 않는 것이다. 추가로, 항체는 세포소멸은 유도시키지만, S 상 세포 비율의 상당한 감소는 유도시키지 않는 것일 수 있다 (예를 들면, 이들 세포 비율을 대조군에 비해 약 0 내지 10% 정도만 감소시켜 주는 것이다).

"에피토프 2G7"은 항체 2G7 (ATCC HB 10240)과 결합하는 TGF-베타의 세포외 도메인 내의 영역이다. 2G7 에피토프와 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위해, 통상적인 교차-차단 분석, 예를 들어 문헌 [참고: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 분석을 수행할 수 있다.

"TGF-베타 항체"는 TGF-베타의 모든 이소형, 바람직하게는 TGF-베타1, TGF-베타2 또는 TGF-베타3, 또는 이의 모든 조합물, 보다 바람직하게는 적어도 TGF-베타1, 또는 적어도 TGF-베타2, 가장 바람직하게는 TGF-베타1, 또는 TGF-베타1을 TGF-베타2와 함께 결합하는 항체를 지칭한다. 임의로, 이러한 항체는 적어도 TGF-베타3과 결합할 수 있다.

"치료 (처치)"는 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료가 필요한 대상체에는 이미 질병에 걸린 대상체 뿐만 아니라 해당 질병을 예방하기 위한 대상체가 포함된다. 따라서, 본원에서 치료하고자 하는 포유류는 질병에 걸린 것으로 진단되었거나 또는 질병에 걸릴 것으로 예측되거나 걸리기 쉽다.

치료 목적상 "포유류"는 포유류로서 분류된 모든 동물을 지칭하는데, 이에는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들면, 개, 말, 고양이, 소 등이 포함된다. 바람직하게는, 포유류가 영장류, 예를 들어 원숭이, 유인원 또는 인간이고, 가장 바람직하게는 인간이다.

"TGF-베타 질환" 또는 "TGF-베타 관련 질환"은 항-TGF-베타 항체를 이용한 치료로부터 이득을 얻는 모든 장애, 질병 또는 질환을 지칭한다. 이에는 포유류가 문제의 질환에 걸리기 쉬운 병리 상태를 포함한 만성 및 급성 질환 또는 질병이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 질환에는 세포외 매트릭스의 축적을 특징으로 하는 질병, 순환성 TGF-베타 또는 국소 부위에서 활성화된 TGF-베타에 의해 유발된 질병, 내인성 TGF-베타 생성으로 인한 면역계 억제에 의해 유발된 질환, 중증 상해, 화상 및 중병, 예를 들어 바이러스성 또는 세균성 감염증으로부터 비롯된 급성 면역 결핍증, TGF-베타 생성 또는 과생성으로 인한 다기관 전신병, 및 TGF-베타 생성 종양이 포함된다. 이의 비제한적인 구체적 예에는 신경세포, 신경절, 성상세포, 시상하부 및 기타 선상, 대식세포, 상피, 간질 및 포배강 질환, 섬유증, 반흔 형성, 방사선에 의해 유발된 것과 같은 조직 손상, 및 상처 치유 동안의 부착, 섬유성 피부 질환, 예를 들어 피부 경화증, CNS 병리학 반흔 조직, 피부 반흔 형성, 켈로이드 반흔 형성 및 신경 반흔 형성, 복막강, 폐, 간 및 신장의 섬유성 질환, 예를 들어 만성 간성 섬유증, 급성 간 손상, 간질성 폐 및 신 섬유증, 및 간경화증, 낭포성 섬유증, 혈관성 질환, 예를 들어 심장 섬유증, 동맥 손상, 예를 들어 아테롬성 경화증 및 동맥경화증, 양성 및 악성 종양, TGF-베타에 의해 억제되지 않는 특정 백혈병, 및 악성 종양 (예: 육종, 암종 및 흑색종), 예를 들어 전립선, 섬유성, 난소, 악성 흑색종, 유방, 폐, 결장, 직장, 결장직장 또는 자궁경부 암 및 전이성 암 뿐만 아니라 소화계의 신경내분비 종양 및 교모세포종, 혈관병증, 혈관병증, 신병증, 전신성 경화증, 감염증, 예를 들어 대식세포 병원체 감염증 및 바이러스성 감염증, 예를 들면, C형 간염 및 HIV, 면역학적, 혈관형성성 및 염증성 질환 및 결핍증, 예를 들어 류마티스성 관절염, 안구 질환, 특히 안구 섬유증과 관련된 질환, 예를 들어 증식성 망막증, 망막 박리 및 후-녹내장 배농 수술, 예를 들어 인간 눈의 감각신경 망막, 망막 색소 상피-맥락막 및 유리체, 및 백내장, 골다공증, 급성 호흡기 질환 증후군, 후-심근 경색, 혈관확장술 후 재발 협착증, 사구체신염, 당뇨병 관련 질환, 예를 들어 고혈당증, 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경병증 또는 망막증, 및 대식세포-결핍성 질환이 포함된다.

바람직하게는, 상기 질환이 섬유증, 동맥 손상, 감염증, 류마티스성 관절염, 당뇨병 또는 당뇨병성 질환, 또는 악성 종양, 예를 들어 TGF-베타를 발현하는 암, 보다 바람직하게는 TGF-베타의 과도한 활성화를 특징으로 하는 암이다. 이러한 암은 TGF-베타를 과발현할 수 있거나, 또는 TGF-베타의 과발현을 특징으로 하지 않을 수 있다.

용어 "유효량"은 포유류에서 특정 질병이나 질환을 치료하는데 유효한 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료상 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법에 대한 효능은, 예를 들어 질병 진행 시간 (TTP)을 평가하고/하거나 반응 속도 (PR)를 측정함으로써 측정할 수 있다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에게서의 생리적 질환을 지칭하거나 기재한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암 (예: 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 페의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.

"TGF-베타 발현성 암"은 그의 세포 표면에 충분한 수준의 TGF-베타를 생성시킴으로써, 항-TGF-베타 항체가 이와 결합하여 암에 대한 치료 효과를 나타내도록 하는 것이다.

TGF-베타 수용체의 "과도한 활성화를 특징으로 하는" 암은 암 세포에서의 TGF-베타 수용체 활성화 정도가 동일한 조직 유형의 비-암성 세포에서의 상기 수용체의 활성화 수준을 상당히 초과하는 것이다. 이러한 과도한 활성화는 암 세포에서 TGF-베타 수용체를 활성화시키기 위해 이용 가능한 TGF-베타 리간드의 정상 수준 보다 많은 양으로 TGF-베타 수용체가 과발현됨으로써 비롯될 수 있다. 이러한 과도한 활성화는 암 세포의 악성 상태를 유발시킬 수 있고/있거나 이러한 악성 상태에 의해 유발될 수 있다. 몇몇 태양에서는, 암을 대상으로 진단 또는 예후 분석을 수행하여, TGF-베타 수용체의 증폭 및/또는 과발현이 발생하여 이러한 TGF-베타 수용체의 과도한 활성화를 유발시키는지를 측정할 것이다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 암을 대상으로 진단 또는 예후 분석을 수행하여, TGF-베타 리간드의 증폭 및/또는 과발현이 이러한 암에게서 발생하여 수용체의 과도한 활성화를 유발시키는지를 측정할 수 있다. 이러한 암의 일부에서는, 상기 수용체의 과도한 활성화가 자가분비 자극 경로로부터 비롯될 수 있다.

"자가분비" 자극 경로에서는, TGF-베타 리간드와 그의 동족 TGF-베타 수용체 둘 다를 생산하는 암 세포를 통하여 자기-자극이 일어난다. 예를 들어, 암은 TGF-베타 수용체를 발현 또는 과발현할 수 있고, 또한 TGF-베타 리간드 (예: TGF-베타1)를 발현 또는 과발현할 수 있다.

TGF-베타 수용체를 "과발현"하는 암은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교해서, 그의 세포 표면에 상당히 고 수준의 TGF-베타 수용체를 갖는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 유발되거나 또는 전사 또는 해독 증가에 의해 유발될 수 있다. TGF-베타 수용체 과발현은 특정 세포 표면 상에 존재하는 TGF-베타 단백질의 증가 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 분석 (예: 면역조직화학 분석; IHC)에서 측정할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 예를 들어 형광성 계내 혼성화 [FISH; 참고: WO 1998/45479 (1998년 10월에 공개됨)], 서던 블롯팅 (southern blotting), 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들어 실시간 정량 PCR (RT-PCR)을 통하여 세포 내의 TGF-베타-코딩 핵산 수준을 측정할 수 있다. 또한, 생물학적 유체, 예를 들어 혈청에서 쉐드 (shed) 항원 (예: TGF-베타 세포외 도메인)을 측정함으로써 TGF-베타 수용체 과발현을 연구할 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,933,294호 (1990년 6월 12일자로 허여됨); WO 1991/05264 (1991년 4월 18일자로 공개됨); 미국 특허 제5,401,638호 (1995년 3월 28일자로 허여됨); 및 Sias et al. J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)]. 상기 분석 이외에도, 각종 생체내 분석이 당업자에게 이용 가능하다. 예를 들어, 환자 체내 세포를, 탐지 가능한 표지, 예를 들어 방사성 동윈원소로 임의로 표지시킨 항체에 노출시킬 수 있고, 이러한 환자 내의 세포에 대한 항체 결합을, 예를 들어 방사능에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 미리 노출시킨 환자로부터 취한 생검을 분석함으로써 평가할 수 있다.

역으로 말하면, "TGF-베타 수용체의 과발현을 특징으로 하지 않는" 암은 진단 분석에서 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교해서 TGF-베타 수용체를 정상 수준 보다 높은 수준으로 발현하지 않는 것이다.

TGF-베타 리간드를 "과발현하는" 암은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교해서, 상기 리간드를 상당히 높은 수준으로 생성시키는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 유발되거나 또는 전사 또는 해독 증가에 의해 유발될 수 있다. TGF-베타 리간드의 과발현은 환자, 예를 들어 종양 생검 내의 리간드 (또는 이를 코딩하는 핵산) 수준을 평가하거나, 또는 각종 진단 분석, 예를 들어 IHC, FISH, 서던 블롯팅, PCR, 또는 상기 언급된 생체내 분석에 의해 진단적으로 측정할 수 있다.

"호르몬-비의존성" 암은 그의 증식이 암 세포에 의해 발현된 수용체와 결합하는 호르몬의 존재에 의존적이지 않는 것이다. 이러한 암은 종양 내 또는 종양 근처의 호르몬 농도를 감소시키는 약리학적 또는 외과적 전략 투여시 임상적 퇴행을 진행하지 않는다. 호르몬-비의존성 암의 예에는 안드로겐-비의존성 전립선암, 에스트로겐-비의존성 유방암, 자궁내막암, 및 난소암이 포함된다. 이러한 암은 호르몬-의존성 종양으로서 양성일 수 있고, 항호르몬 요법 후 호르몬-민감성 단계에서부터 호르몬-난치성 종양으로 진행할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사성 동위원소), 및 독소, 예를 들면, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)가 포함된다.

"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들면, 티오테파 및 시클로포스파미드 (CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예를 들면, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들면, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들면, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 질소 머스타드, 예를 들면, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들면, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들면, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들면, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들면, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들면, 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들면, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들면, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들면, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들면, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜킨; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨, 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK^® 크레스틴; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산 (또는 탁소이드), 예를 들면, 파클리탁셀 (TAXOL^®; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀 (TAXOTERE^®; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 약물의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들면, 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERMs)가 포함되는데, 이의 예에는 타목시펜 (NOLVADEX^® 타목시펜), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON·토레미펜; 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE^® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN^® 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR^® 보로졸, FEMARA^® 레트로졸 및 ARIMIDEX^® 아나스트로졸; 및 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상한 세포 증식에 밀접한 영향을 미치는 신호 전달 경로에 있어 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras의 발현을 억제시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN^® 백신, LEUVECTIN^® 백신 및 VAXID^® 백신; PROLEUKIN^® rIL-2; LURTOTECAN^® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX^® rmRH; 및 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "EGFR-표적화 약물"은 EGFR와 결합하고, 임의로 EGFR 활성화를 억제하는 치료제를 지칭한다. 이러한 치료제의 예에는 EGFR와 결합하는 항체 및 소분자가 포함된다. EGFR와 결합하는 항체의 예에는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) [참고: 미국 특허 제4,943,533호 (Mendelsohn et al.)] 및 그의 변이체, 예를 들어 키메라화 225 (C225) 및 다시 만든 (reshaped) 인간 225 (H225) [참고: WO 1996/40210, Imclone Systems Inc.]; 유형 II 돌연변이체 EGFR과 결합하는 항체 [참고: 미국 특허 제5,212,290호]; 미국 특허 제5,891,996호에 기재된 바와 같이 EGFR과 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR과 결합하는 인간 항체 [참고: WO 1998/50433, Abgenix]가 포함된다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합함으로써, 면역접합체를 생성시킬 수 있다 [참고: EP 659,439, Merck Patent GmbH]. EGFR과 결합하는 소분자의 예에는 ZD1839 (공급처: Astra Zeneca), CP-358774 (공급처: OSI/Pfizer), 및 AG1478이 포함된다.

"인간화 항체 이외의 치료제"는 본원의 항체 이외의, TGF-베타 질환을 치료하는데 유효한 모든 작용제를 지칭하고, 이에는 다음에 열거된 유형들이 포함된다.

"항혈관형성제"는 혈관의 발생을 어느 정도 차단시키거나 방해하는 화합물을 지칭한다. 항혈관형성 인자는, 예를 들어, 혈관형성을 증진시키는데 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체와 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 이의 예에는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 길항제, 예를 들어 VEGF와 특이적으로 결합하는 항체 [예: AVASTIN^®]이 포함된다. "VEGF와 결합하는 항체"에는 키메라, 인간 및 인간화 항체 뿐만 아니라 단편이 포함되고, 또한 VEGF를 차단 또는 중화시키거나, 또는 하나 이상의 VEGF 수용체, 바람직하게는 수용체 둘 다에 대한 VEGF 결합을 차단시키는 항체가 포함된다.

"포유류에서의 면역 기능 조절인자"란 표현은 포유류의 면역 기능을 조절하는 사이토킨 및 성장 인자를 지칭하는데, 이에는 인터루킨, 종양 괴사 인자, 림포톡신, 표피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, TGF-α, 대식세포-이동 억제 인자, 대식세포 활성화 인자, 섬유아세포 성장 인자, 대식세포 활성화 인자, 인터페론, 및 집락 자극 인자가 포함된다. 이들 조절인자는 천연 공급원으로부터 유래되거나, 백혈구에 의해 형성되거나, 경우에 따라 화학적 방법에 의해 합성되거나, 또는 재조합적으로 제조될 수 있다. 바람직한 것은 IL-1, IL-2,I L-6, 및 IFN-β이다.

용어 "사이토킨"은 또 다른 세포 상에서 세포간 매개인자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 유전적 용어이다. 이러한 사이토킨의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 사이토킨에 포함되는 것은 특히, 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 물레리안-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 기타 폴리펩티드 인자 [이에는 LIF 및 kit 리간드 (KL)가 포함된다]이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 사이토킨에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 본래 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물이 포함된다.

본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "프로드럭 (prodrug)"은 모 약물과 비교해서 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 효소적으로 활성화되거나 보다 더 활성인 모 형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다 [참고: 예를 들어 Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]. 본 발명의 프로드럭에는 보다 활성인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, D-아미노산 변형된 프로드럭, 당화 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신, 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화할 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

"리포솜"은 약물 (예를 들어, 본원에 기재된 항-TGF-베타 항체, 및 임의의 화학요법제)을 포유류에게 전달하는데 유용한, 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포솜의 구성분은 생체 막의 지질 배열과 유사한, 이층 형성으로 통상 배열된다.

용어 "패키지 삽입물"은 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 치료 제품의 사용과 관련한 경고에 관한 정보를 함유하고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.

"심장보호제"는 특정 약물, 예를 들어 안트라사이클린 항생제 및/또는 항-TGF-베타 항체를 환자에게 투여하는 것과 연관된 심근 기능이상 (즉, 심근병증 및/또는 울혈성 심부전증)을 예방하거나 저하시키는 화합물 또는 조성물이다. 심장보호제는, 예를 들어 자유 라디칼-매개된 심장독성 효과를 차단 또는 저하시킬 수 있고/있거나 산화적-스트레스 손상을 예방 또는 저하시킬 수 있다. 본 발명의 정의에 포괄되는 심장보호제의 예에는 철-킬레이트제 덱스라족산 [dexrazoxane (ICRF-187)] [참고: Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28: 1063-1072 (1994)]; 지질 저하제 및/또는 항산화제, 예를 들어 프로부콜 [참고: Singal et al. , J. Mol. Cell Cardiol., 27: 1055-1063 (1995)]; 아미포스틴 (amifostine) {아미노티올 2-[(3-아미노프로필)아미노]에탄티올-디히드로겐 포스페이트 에스테르 (WR-2721로 지칭됨), 및 그의 탈인산화 세포성 흡수 형태 (WR-1065로 지칭됨)} 및 S-3-(3-메틸아미노프로필아미노)프로필포스포로티오산 (WR-151327) [참고: Green et al., Cancer Research, 54: 738-741 (1994)]; 디곡신 (digoxin) [참고: Bristow, M. R. In: Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease (New York: Elsevier 191-215 (1980)]; 베타 차단제, 예를 들어 메토프롤롤 (metoprolol) [참고: Hjalmarson et al., Drugs. 47: Suppl 4:31-9 (1994); and Shaddy et al., Am. Heart J., 129: 197-199 (1995)]; 비타민 E; 아스코르브산 (비타민 C); 자유 라디칼 소거제, 예를 들어 올레아놀산, 우르솔산, 및 N-아세틸시스테인 (NAC); 스핀-트랩핑 화합물, 예를 들어 알파-페닐-3급-부틸 니트론 (PBN) [참고: Paracchini et al., Anticancer Res., 13: 1607-1612 (1993)]; 유기셀렌 화합물, 예를 들어 P251 (Elbesen) 등이 포함된다.

"단리된" 핵산 분자는 항체 코딩 핵산의 천연 공급원 내에서 통상 연합되는 하나 이상의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 격리시킨 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 바와 같은 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자에는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체 위치 내에 존재하는 경우에 항체를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.

"제어 서열"이란 표현은 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열을 발현시키는데 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열에는, 예를 들어 프로모터, 임의의 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵성 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증강인자를 활용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동적으로 연결된"다. 예를 들어, 프리-서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터 또는 증강인자는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동적으로 연결되어 있거나; 또는 리보솜-결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키도록 위치 설정된 경우에 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된 것이고, 분비성 리더인 경우에는 연속된 판독 기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 증강인자는 연속적이지 않다. 편리한 제한 부위에서 연결시킴으로써 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고, 이러한 명칭 모두는 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"에는 1차 대상 세포와, 전이 횟수에 상관없이 이로부터 유래된 배양물이 포함된다. 의도하였거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량에 있어 정확하게 동일할 수는 없다는 것을 인지해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 바와 동일한 기능적 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭을 고려하는 경우에도, 이는 본문 내용으로부터 명백할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 "신체 샘플"은 탐지하고자 하는 TGF-베타를 함유하거나 함유할 수 있는 모든 액상물 또는 생물학적 샘플을 지칭한다. 이러한 샘플에는 유체, 예를 들어 인체 또는 동물 체액, 예를 들면, 혈액, 혈청, 뇨, 양수, 조직 추출물, 뇌척수액 등이 포함된다. 샘플은 그 안에 함유된 성분들의 안정성, 응집 또는 저장 용기에 의한 흡수 등에 대한 경향에 따라서, 분석하기 전에 추출과 같은 특수 처리를 요구할 수 있다.

II. 인간화 항-TGF-베타 항체의 생성

비-인간 항체를 인간화시키는 방법이 당해 분야에 보고되었다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입 (import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988))]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 덜한 본래의 인간 가변 도메인을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체시킨 키메라 항체 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]이다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 초가변 영역 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다.

인간화 항체를 제조하는 또 다른 방법이 미국 특허 공보 제2003/0017534호 (2003년 1월 23일로 공개)에 기재되어 있는데, 여기서는 인간화 항체와 항체 제제를 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 생성시켰다. 비-인간 동물은 다양해진 인간화 면역글로불린을 생성하기 위해 트랜스제닉 비-인간 동물에서 유전자 재배열과 유전자 전환을 진행할 수 있는 하나 이상의 인간화 면역글로불린 유전자 자리를 함유하도록 유전 공학적으로 처리시킨다.

인간화 항체를 제조하는데 사용될, 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선택이 항원성을 저하시키는데 있어 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 골격 영역 (FR)으로서 허용하였다 [참고: Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특별한 골격 영역을 이용한다. 동일한 골격을 여러 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 [참고: Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151 :2623 (1993)].

항원에 대한 높은 결합 친화성과 기타 바람직한 생물학적 특성을 유지하고 있는 항체로 인간화시키는 것이 추가로 중요하다. 이를 달성하기 위한 바람직한 방법에 따르면, 모 서열과 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열과 각종 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 면역글로불린 모델은 시판되고 있으며, 당업자에게 널리 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 추정상의 3차원 입체 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 입수 가능하다. 이들 디스플레이를 검사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어 잔기의 예상 역할을 분석할 수 있는데, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원과 결합할 수 있는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선별하고, 이를 수용자로부터 유입 서열과 합하여, 목적하는 항체 특징, 예를 들면, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성을 달성하도록 한다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합성을 좌우하는데 있어 직접적이면서도 가장 실재적으로 관여한다.

다음 실시예 2에는 TGF-베타와 결합하는 예시 인간화 항-TGF-베타 항체의 생성 방법이 기재되어 있다. 이러한 인간화 항체는 인간 가변 중쇄 도메인 내로 혼입된 비-인간 초가변 영역 잔기를 포함하고, 48, 49, 67, 69, 71, 73, 및 78로 이루어진 군 중에서 선택된 위치 [카바트 (Kabat) 등의 문헌 (상기 참고)에 기재된 가변 도메인 넘버링 시스템을 활용함]에서의 골격 영역 (FR) 치환을 추가로 포함한다. 한 가지 태양에서는, 인간화 항체가 위치 48, 49, 67, 69, 71, 73, 및 78 중의 2군데 이상에서의 FR 치환을 포함하고; 기타 태양에서는, 상기 위치의 3군데 또는 4군데 이상에서의 FR 치환을 포함한다. 바람직한 태양에서는, 상기 항체가 위치 49, 67 및 71, 위치 48, 49 및 71, 또는 위치 49, 69 및 71, 또는 위치 49, 69, 71 및 73, 또는 위치 49, 71 및 73, 또는 위치 49, 71 및 78에서의 FR 치환을 포함한다. 면역원성을 최소화하기 위해서는 많은 골격 치환 보다는 오히려 더 적은 수의 치환이 바람직하지만, 효능도 매우 중요하게 고려해야 한다. 실제적으로 치환된 아미노산은 면역원성 또는 효능을 변화시키지 않도록 바람직하게 보존된 것이다. 위치 48에서의 변화는 바람직하게는, 발린에서 부터 이소루이신으로의 변화이고, 위치 49에서의 변화는 바람직하게는, 알라닌에서 부터 글리신으로의 변화이며, 위치 67에서의 변화는 바람직하게는, 페닐알라닌에서 부터 알라닌으로의 변화이고, 위치 69에서의 변화는 바람직하게는, 페닐알라닌에서 부터 알라닌으로의 변화이며, 위치 71에서의 변화는 바람직하게는, 아르기닌에서 부터 알라닌으로의 변화이고, 위치 73에서의 변화는 바람직하게는, 아스파라긴에서 부터 리신으로의 변화이며 위치 78에서의 변화는 바람직하게는, 루이신에서 부터 알라닌으로의 변화이다.

본원에서 관심있는 예시 인간화 항체는 가변 중쇄 도메인 상보성-결정 잔기 GYAFTNYLIE (서열 41); VNNPGSGGSNYNEKFKG (서열 42) 또는 VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및/또는 SGGFYFDY (서열 44)을 포함하는데, 이는 예를 들어, 항체의 친화성을 본질적으로 유지시키거나 개선시키는 경우에는, CDR 잔기의 아미노산 변형을 임의로 포함한다. 예를 들어, 관심있는 항체 변이체는 상기 가변 중쇄 도메인 CDR 서열 내에 약 1 내지 약 7개 또는 약 5개 아미노산 치환물을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어, 다음에 기재되는 바와 같은 친화성 성숙에 의해 제조할 수 있다. 바람직하게는, 잔기가 GYAFTNYLIE (서열 41); VNNPGSGGSNYNEKFKG (서열 42) 또는 VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43) 중의 2개 이상, 가장 바람직하게는 3개 모두; 및/또는 SGGFYFDY (서열 44)이다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 4 내의 가변 중쇄 도메인 아미노산 서열, 또는 GYAFTNYLIE (서열 41); VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및 SGGFYFDY (서열 44)을 수반한 것이다.

인간화 항체는, 예를 들어 앞서 단락에서의 가변 중쇄 도메인 CDR 잔기 이외에도, 가변 경쇄 도메인 상보성-결정 잔기 RASQSVLYSSNQKNYLA (서열 36) 또는 RASQGISSYLA (서열 37); WASTRES (서열 38) 또는 YASSLQS (서열 39); 및/또는 HQYLSSDT (서열 40)을 포함할 수 있다. 이러한 인간화 항체는, 예를 들어 항체의 친화성을 본질적으로 유지시키거나 개선시키는 경우에는, 상기 CDR 잔기의 아미노산 변형을 임의로 포함한다. 예를 들어, 관심있는 항체 변이체는 상기 가변 경쇄 CDR 서열 내에 약 1 내지 약 7개 또는 약 5개 아미노산 치환물을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어, 다음에 기재되는 바와 같은 친화성 성숙에 의해 제조할 수 있다. 바람직하게는, 잔기가 RASQSVLYSSNQKNYLA (서열 36); WASTRES (서열 38); 및/또는 HQYLSSDT (서열 40) 중의 2개 이상, 가장 바람직하게는 3개 모두이다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 3 내의 가변 경쇄 도메인 아미노산 서열을 포함한다.

본원은 또한, TGF-베타와 결합하는 친화성 성숙된 항체를 고려한다. 모 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체, 예를 들어 각각 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및/또는 중쇄 서열을 포함하는 것일 수 있다 (즉, 버젼 5). 친화성 성숙된 항체는 바람직하게는, 뮤린 2G7 또는 변이체 5에 비해 탁월한 친화성으로 TGF-베타와 결합한다 [예를 들어, TGF-베타-세포외 도메인 (ECD) ELISA를 이용하여 평가된 바와 같이, 친화성이 약 2배 또는 약 4배 내지 약 100배 또는 약 1000배 개선되었다].

각종 형태의 인간화 항체 또는 친화성 성숙된 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 친화성 성숙된 항체는 면역접합체를 생성시키기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)와 임의로 접합되는 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 또 다른 한편, 인간화 항체 또는 친화성 성숙된 항체는 본래의 항체, 예를 들어 본래의 IgG1 항체일 수 있다.

인간화 항체의 항체 단편을 생성시키기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 본래의 항체를 단백질 분해적 절단시킴으로써 유도되었다 [참고: 예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]. 그러나, 이들 단편은 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 또 다른 한편, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고, 이를 화학적으로 커플링시켜 F(ab')₂ 단편을 형성시킬 수 있다 [참고: Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]. 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 분리시킬 수 있다. 항체 단편을 생성시키기 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 태양에서는 선택되는 항체가 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다 [참조: WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호]. 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있다.

이중-특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 항체이다. 예시되는 이중-특이적 항체는 TGF-베타 단백질의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 이러한 기타 항체는 TGF-베타 결합 부위를 HER-2, EGFR, ErbB, ErbB3 및/또는 ErbB4에 대한 결합 부위와 결합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 항-TGF-베타 암을, TGF-베타-발현성 세포에 대한 세포성 방어 기전에 집중하도록, 백혈구 상의 촉발성 분자, 예를 들면, T-세포 수용체 분자 (예: CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)과 결합하는 암과 합할 수 있다. 이중-특이적 항체를 사용하여 세포독성제를, TGF-베타를 발현하는 세포에 국재시킬 수도 있다. 이들 항체는 TGF-베타-결합 암과, 세포독성제 (예: 사포린, 항인터페론-α, 빈카 알카로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)과 결합하는 암을 보유하고 있다. 이중-특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예: F(ab')₂ 이중-특이적 항체)로서 제조할 수 있다.

WO 96/16673에는 이중-특이적 항-TGF-베타/항-FcγRIII 항체가 기재되어 있고, 미국 특허 제5,837,234호에는 이중-특이적 항-TGF-베타/항-FcγRI 항체가 기재되어 있다. 이중-특이적 항-TGF-베타/Fcα 항체가 WO 98/02463에 제시된다. 미국 특허 제5,821,337호는 이중-특이적 항-TGF-베타/항-CD3 항체를 교시하고 있다.

이중-특이적 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 전통적인 완전한 길이 이중-특이적 항체의 생성 방법은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것에 기초하는데, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [참고: Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 [쿠아드로마(quadroma)]는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중에서 1개 만이 정확한 이중-특이적 구조를 갖는다. 친화 크로마토그래피 단계에 의해 통상 수행되는, 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생성물 수율도 낮다. 유사한 과정이 문헌 [참고: WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

상이한 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 융합물 중의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물과, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 세포 내로 공동 형질감염시킨다. 이는 구축에 사용된 3 가지 폴리펩티드 쇄의 부적당한 비율이 최적 수율을 제공해주는 경우의 태양에서, 3 가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 융통성을 제공해준다. 그러나, 2 가지 이상의 폴리펩티드 쇄를 동등한 비율로 발현시키는 것이 고 수율을 가져다 주거나, 또는 이들 비율이 특별한 의미가 없는 경우에는, 2 가지 또는 3 가지 모두의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.

상기 접근법의 바람직한 태양에서는, 이중-특이적 항체가 하나의 암 중에 제1의 결합 특이성을 지닌 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 다른 암 중에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2의 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조가 목적하는 이중-특이적 화합물을 바람직하지 못한 면역글로불린 쇄 조합물로부터 격리시키는 것을 촉진시켜 주는데, 이는 이중-특이적 분자의 단지 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 격리 방식을 제공해주기 때문인 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중-특이적 항체를 생성시키기 위한 추가의 상세 내역에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]을 참고할 수 있다.

미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 간의 계면을 공학적으로 처리하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종-이량체의 비율 (%)을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체시킨다. 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 대상성 "강(cavity)"은, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것 (예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체시킴으로써 제2 항체 분자의 계면 상에서 창출시킨다. 이는 기타 바람직하지 못한 최종 생성물, 예를 들면, 동종-이량체에 비해 이종-이량체의 수율을 증가시켜 주는 기전을 제공한다.

이중-특이적 항체에는 가교결합되거나 "이종-접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종-접합체 내의 항체들 중의 하나를 아비딘에 커플링시킬 수 있고, 다른 것은 바이오틴에 커플링시킬 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 바람직하지 못한 세포에 표적화하고 [참고: 미국 특허 제4,676,980호], HIV 감염증을 치료하는 것으로 제안되었다 [참조: WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089]. 이종-접합체 항체는 편리한 모든 가교결합 방법을 사용하여 만들 수 있다. 적합한 가교결합제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 수 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

항체 단편으로부터 이중-특이적 항체를 생성시키는 기술 또한 당해 분야에 보고되었다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 화학적 연쇄를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [참고: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에는 본래의 항체를 단백질 분해적으로 절단시켜 F(ab')₂ 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편을 디티올 착화제 나트륨 아비산염의 존재 하에 환원시켜 근접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지시킨다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써, Fab'-TNB 유도체들 중의 하나를 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중-특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중-특이적 항체를, 효소를 선택적으로 고정화시키기 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

최근 기술상의 진보로 인해, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접적으로 회수하는 것이 촉진되었는데, 이들 단편을 화학적으로 커플링시켜 이중-특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [참고: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]에는 본래 인간화 이중-특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성 방법이 기재되어 있다. 각 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 별개로 분비시키고, 이를 대상으로 하여 시험관 내에서 직접적인 화학적 커플링을 수행하여 이중-특이적 항체를 형성시켰다. 이로써 형성된 이중-특이적 항체는 인간 유방 종양 표적에 대항한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 촉발시킬 뿐만 아니라 TGF-베타 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포와 결합할 수 있었다.

재조합 세포 배양물로부터 이중-특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 분리하기 위한 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중-특이적 항체를 생성시켰다 [참고: Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 이종-이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종-이량체를 생성시키기 위해 활용할 수도 있다. 문헌 [참고: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디" 기술은 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기전을 제공하였다. 이러한 단편은 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 V_H 및 V_L 도메인을 또 다른 단편의 상보적 V_H 및 V_L 도메인와 짝짓기시킴으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다 [참고: Gruber et al., J. Immunol, 152: 5368 (1994)].

2 원자가 이상을 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다 [참고: Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)].

예를 들어, TGF-베타 활성을 중화, 길항 또는 억제시킬 수 있는 능력, 예를 들어 당해 분야의 문헌에 규정된 바와 같이, 성숙한 TGF-베타의 부착-비의존성 성장 증진 활성, 바람직하지 못한 성장 억제 활성, 면역억제 활성 또는 간질 형성 (간질성 요소에는 염증 세포, 내피 세포 및 섬유아세포가 포함된다) 활성 중의 한 가지 이상 활성을 실질적으로 예방할 수 있는 능력을 평가함으로써 항체의 성장 억제 효과를 평가할 수 있다. 따라서, 항체는 종양 및 억제인자 림프계 세포 (T 세포)에 의해 생성된 모든 내인성 TGF-베타의 활성을 차단시킬 수 있다. 이러한 중화를 측정하기 위한 한 가지 방식은 밍크 (mink) 폐 섬유아세포 세포주, 예를 들어 Mv-3D9의 ³H-티미딘 흡수 억제에 의한 것인데, 여기서는 항체의 농도가 증가함에 따라, TGF-베타의 활성이 지속적으로 선형적 또는 비선형적으로 저하된다. 밍크 폐 세포주는 TGF-베타의 성장 억제 효과에 대해 극히 민감하며, 수행하기가 비교적 용이한 분석이다. 일반적으로, 이러한 분석은 2 mM 글루타민과 5% 태아 소 혈청을 함유하는 최소 필수 배지에서 세포를 TGF-베타와 항체의 혼합물과 함께 5% CO₂ 중에서 37℃ 하에 18 내지 24시간 동안 항온 배양한 다음, 20 ㎕ 중의 1 μCi의 ³H-티미딘으로 펄싱하고 37℃에서 4시간 후에 수거함으로써 수행한다. 바람직하게는, 상기 항체가 모노클로날 항체 2G7 보다 더 큰 정도로 TGF-베타에 의한 세포 증식을 억제할 수 있을 것이다. 항체의 성장 억제 효과를 평가하기 위한 또 다른 방식은 다음 실시예에 제시된 바와 같은 마우스 혈관사이 세포 증식 분석에서 상기 항체가 TGF-베타를 억제하는지를 시험하는 것이다. 본원의 항체는 또한, 방사성 표지된 TGF-베타 (예를 들어, 방사성 요오드화 rhTGF-베타1)와 항체의 혼합물을, TGF-베타 수용체를 함유하는 세포 (예를 들어, 밍크 폐 섬유아세포, 예를 들면, Mv1Lu 세포주; 이는 ATCC로부터 ATCC No. CCL-64로서 입수 가능하다)와 함께 항온 배양하고, 이러한 항체가 상기 수용체에 대한 표지된 TGF-베타의 결합을 차단하는지를 측정하는 바와 같이, 통상적인 방식으로 수용체 결합 또는 방사수용체 분석에 유용하다.

세포 사멸을 유도하는 항체를 선별하기 위해, 예를 들어 PI, 트립판 블루 (trypan blue) 또는 7AAD 흡수에 의해 지시된 바와 같은 막 완전성 상실을 대조군과 비교해서 평가할 수 있다. 바람직한 분석은 BT474 세포를 사응하는 PI 흡수 분석이다. 이러한 분석에 따르면, BT474 세포 [이는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 수득할 수 있다]를, 10% 열 불활성화 FBS (공급처: Hyclone) 및 2 mM L-글루타민을 보충시킨 둘벡코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: D-MEM):햄스 (Ham's) F-12 (50:50)에서 배양한다 (따라서, 이 분석은 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행한다). BT474 세포를 100 x 20-mm 디쉬에서 디쉬당 3 x 10⁶개의 밀도로 시딩하고, 밤새 부착시켜 두었다. 이어서, 배지를 꺼내고, 이를 신선한 배지 단독으로 대체시키거나 또는 10 ㎍/ml의 적당한 모노클로날 항체를 함유하는 배지로 대체시킨다. 세포를 3일 동안 항온 배양한다. 각 처리 후, 단층을 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 트립신 처리함으로써 박리시킨다. 그 다음, 세포를 4℃에서 5분 동안 1200 rpm으로 원심분리시키고, 펠릿을 3 ml 빙냉 Ca ²⁺ 결합용 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCI₂)에 재현탁시키고, 35-mm 여과기-캡핑된 12 x 75 튜브 (튜브당 1ml; 처리군 당 3개 튜브) 내로 등분하여 세포 집단 (덩어리)을 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)을 공급한다. FACSCAN™ 세포 유동계수기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (공급처: Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정된 바와 같이 통계상 유의적 수준의 세포 사멸을 유도시키는 항체를 세포 사멸 유도성 항체로서 선별할 수 있다.

세포소멸을 유도시키는 항체를 선별하기 위해, BT474 세포를 이용하는 아넥신-결합 분석을 이용할 수 있다. BT474 세포를 앞서 단락에서 논의된 바와 같이 디쉬에서 배양 및 시딩한다. 이어서, 배지를 꺼내고, 이를 신선한 배지 단독으로 대체시키거나 또는 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체를 함유하는 배지로 대체시킨다. 3일 동안 항온 배양한 후, 단층을 PBS로 세척하고, 트립신 처리함으로써 박리시킨다. 그 다음, 상기 세포-사멸 분석에 대해 논의된 바와 같이, 세포를 원심분리시키고, Ca ²⁺ 결합용 완충액에 재현탁시키고, 튜브 내로 등분한다. 이어서, 튜브에 표지시킨 아넥신 (예: 아넥신 V-FITC) (1 ㎍/ml)을 공급한다. FACSCAN™ 세포 유동계수기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (공급처: Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. 대조군에 비해 통계상 유의적 수준의 아넥신 결합을 유도시키는 항체를 세포소멸 유도성 항체로서 선별한다.

아넥신-결합 분석 이외에도, BT474 세포를 이용하는 DNA-염색 분석을 이용할 수 있다. 이러한 분석을 수행하기 위해, 앞서 두 단락에서 기재된 바와 같이 관심있는 항체로 처리시킨 BT474 세포를 37℃에서 2시간 동안 9 ㎍/ml HOECHST 33342™ 형광 프로브와 함께 항온 배양한 다음, MODFIT LT™ 소프트웨어 (공급처: Verity Software House)를 사용하여 EPICS ELITE™ 유동 세포계수기 (공급처: Coulter Corporation) 상에서 분석한다. 처리시키지 않은 세포 (100% 이하 세포소멸성 세포) 보다 2배 이상 더 큰 비율로 세포소멸성 세포 비율 상의 변화를 유도시키는 항체가, 이러한 분석을 이용한 전-세포소멸성 항체로서 선별될 수 있다.

관심있는 항체에 의해 결합된 TGF-베타 상의 에피토프와 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 통상적인 교차-차단 분석, 예를 들어 문헌 [참고: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 분석을 수행할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 에피토프 지도화를 수행할 수 있다.

본 발명은 또한, 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 [예: 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)], 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성 접합체)와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

이러한 면역접합체를 생성시키는데 유용한 화학요법제가 상기 언급되었다. 특정 항체와, 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신 (calicheamicin), 마이탄신 (maytansine) [참고: 미국 특허 제5,208,020호], 트리코텐 (trichothene) 및 CC1065 항암제와의 접합체가 또한 본원에 고려된다.

본 발명의 한 가지 바람직한 태양에서는, 항체를 하나 이상의 마이탄신 분자와 접합시킨다 (예를 들어, 항체 분자당 약 1 내지 약 10개의 마이탄신 분자). 마이탄신은 예를 들어, May-SS-Me로 전환시킬 수 있고, 이를 환원시켜 May-SH3를 수득하고 이를 변형된 항체 [참고: Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992)]와 반응시켜 마이탄신-항체 면역접합체를 생성시킬 수 있다.

관심있는 또 다른 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자와 접합된 항-TGF-베타 항체를 포함한다. 칼리케아미신 계열의 항생제는 이본쇄 DNA 절단물을 피코몰 이하 농도로 생성시킬 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: Hinman et al., Cancer Research, 53: 3336-3342 (1993) and Lode et al., Cancer Research, 58: 2925-2928 (1998); U.S. Patent Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; and 5,773,001; 본원에 참고로 도입된다].

사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합성 활성 단편, 외독소 A 쇄 [슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨], 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다 [참고: 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232].

본 발명은 특정 항체와, 핵산분해 활성을 지닌 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 간에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.

각종 방사성 동위원소가 방사성접합된 항-TGF-베타 항체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다.

각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예: 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [참고: Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다 [참고: WO 94/11026]. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시켜 주는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드 함유 링커 [참고: Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992)]를 사용할 수 있다.

또 다른 한편, 항-TGF-베타 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 만들 수 있다.

또 다른 태양에서는, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 제거제 (clearing agent)를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환시 제거하고, 이어서 세포독성제 (예: 방사뉴클레오티드)와 접합되는 "리간드" (예: 아비딘)을 투여한다.

프로드럭을 활성 항암 약물로 전환시켜 주는 프로드럭-활성화 효소 (예: 펩티딜 화학요법제; 참고: W0 1981/01145)에 항체를 접합시킴으로써, 본 발명의 항체를 ADEPT에 사용할 수도 있다 [참고: 예를 들어, WO 88/07378 및 U.S. Pat. No. 4,975,278].

ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분에는, 프로드럭이 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환되도록 하는 방식으로 프로드럭 상에서 작용할 수 있는 모든 효소가 포함된다.

본 발명의 방법에 유용한 효소에는 포스페이트-함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 아릴설파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어, 세라티아 프로테아제, 더모리신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신 (예: 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단성 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화시킨 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 그들의 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 각각 유도체화시킨 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 한편, 당해 분야에서 "아브자임 (abzyme)"으로서 공지되기도 한, 효소적 활성을 지닌 항체를 사용하여 본 발명의 프로드럭을 자유 활성 약물로 전환시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Massey, Nature, 328: 457-458 (1987)]. 아브자임을 종양 세포 집단에 전달하기 위하여, 항체-아브자임 접합체를 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

당해 분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 상기 논의된 이종-이관능성 가교결합 시약을 사용함으로써, 본 발명에 유용한 효소를 항-TGF-베타 항체에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 적합한 효소의 적어도 기능적 활성 부분과 연결된, 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합성 영역을 포함하는 융합 단백질을, 당해 분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 구축할 수 있다 [참고: Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)].

항체의 기타 변형이 본원에 고려된다. 예를 들어, 항체를 각종 비-단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중의 하나와 연결시킬 수 있다. 항체를 또한, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐 [예를 들면, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐]; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

본원에 기재된 항-TGF-베타 항체를 면역리포솜으로서 제형화시킬 수도 있다. 이러한 항체를 함유하는 리포솜은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [참고: Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and WO 1997/38731 (1997년 10월 23일자로 공개됨)]에 기재된 방법에 의해 제조한다. 순환 시간이 증강된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 기재되었다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 규정된 공극 크기의 필터를 통하여 리포솜을 압출시켜 목적하는 직경의 리포솜을 산출시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디설파이드-쇄간 반응을 통하여 문헌 [참고: Martin et al. J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합시킬 수 있다. 화학요법제가 리포솜에 임의로 함유된다 [참고: Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)].

III. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 발명은 또한, 인간화 항-TGF-베타 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체를 생성하기 위한 재조합 기술을 제공한다.

항체를 재조합 생성하기 위해, 이를 코딩하는 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 및 서열 분석한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

(i) 신호 서열 성분

본 발명의 항-TGF-베타 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 선별된 이종 신호 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 본래의 항-TGF-베타 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더로 이루어진 군 중에서 선택된 원핵성 신호 서열로 대체시킨다. 효모 분비의 경우에는, 본래의 신호 서열을, 예를 들어 효모 전화효소 리더, α-인자 리더 [삭카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함], 산-포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 문헌 [참고: WO 1990/13646]에 기재된 신호로 대체시킬 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호를 이용할 수 있다.

이러한 전구체 영역에 대한 DNA가 동일 판독 프레임 내에서, 항-TGF-베타 항체를 코딩하는 DNA에 연결된다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 벡터와 클로닝 벡터 둘 다는 이러한 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 벡터가 숙주 염색체성 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있게 해주는 것이고, 이에는 복제 기점 또는 자기 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 2 μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 각종 바이러스성 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터에 필요치 않다 (SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 이는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다).

(iii) 선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선별성 마커로 명명되기도 하는 선별 유전자를 함유한다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주는 단백질; (b) 영양요구성 결핍증을 보충해주는 단백질; 또는 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양분, 예를 들어 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 공급해 주는 단백질을 코딩한다.

선별 도식의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 중지시키기 위한 약물을 활용한다. 이종 유전자를 이용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 단백질을 생산하므로, 선별 처방에서 살아 남는다. 이러한 우성 선별의 예들은 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.

포유류 세포에 적합한 선별성 마커의 또 다른 예는 항-TGF-베타 항체 코딩 핵산을 흡수하기에 적격한 세포를 확인 (동정)시켜 줄 수 있는 것인데, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이 있다.

예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, 형질전환체 모두를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적당한 숙주 세포는, DHFR 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

또 다른 한편, 항-TGF-베타 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시켰거나 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드성 항생제 (예: 카나마이신, 네오마이신 또는 G418)에 대한 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장시킴으로써 선별할 수 있다 [참고: 미국 특허 제4,965,199호].

효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [참고: Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)]. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 [참고: Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. 이때, 효모 숙주 세포 게놈 내에 trp1 병변이 존재한다는 것은 트립토판 부재 하의 성장에 의한 형질전환을 탐지하는데 유효한 환경을 제공해준다. 유사하게, Leu2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)가 Leu2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로써 고려된다.

또한, 1.6-㎛ 환상 플라스미드 pKDl로부터 유래된 벡터를 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 재조합 송아지 카이모신 (chymosin)을 대규모로 생성하기 위한 발현 시스템이 케이. 락티스 (K. lactis)에 대해 보고되었다 [참고: Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의해 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민을 분비시키는데 적합한 다중-복사 발현 벡터가 또한 보고되었다 [참고: Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)].

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항-TGF-베타 항체 코딩 핵산에 작동적으로 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵성 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 기타 공지된 세균성 프로모터도 적합하다. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항-TGF-베타 항체를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵성 유전자가, 전사가 개시되는 부위로부터의 대략 25 내지 30개 염기 상단에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80개 염기 상단에서 발견된 또 다른 서열은 CNCAAT (서열 47) 영역인데, 여기서 N은 어떠한 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵성 유전자의 3' 말단에는 AATAAA (서열 48) 서열이 존재하는데, 이는 폴리 A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 부가하기 위한 신호일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵성 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트, 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 제어된 부가의 전사 이점을 지니고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모토는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 책임이 있는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 있어 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터가 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 증강인자 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 항-TGF-베타 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 (fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40) 등의 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 및 열-쇽 프로모터에 의해 제어되는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 화합성이어야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 함유하기도 하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉발형 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978에 기재되어 있다. 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Reyes et al., Nature, 297:598- 601 (1982)]. 또 다른 한편, 라우스 (rous) 육종 바이러스 장-말단 반복 서열을 프로모터로서 사용할 수 있다.

(v) 증강인자 요소 성분

고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항-TGF-베타 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 증강인자 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 증강인자 서열이 현재 포유류 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로는, 진핵성 세포 바이러스로부터의 증강인자가 사용될 것이다. 이의 예에는 복제 기점의 후기 측면 (bp 100-270) 상의 SV40 증강인자, 시토메갈로바이러스 초기-프로모터 증강인자, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 증강인자, 및 아데노바이러스 증강인자가 포함된다. 진핵성 프로모터 활성화를 위한 증강 요소에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]. 증강인자는 항-TGF-베타 항체 코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터의 5' 부위에 위치한다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵성 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 핵형성 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한, 전사를 종결시키고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵성 또는 바이러스성 DNA 또는 cDNA의 비해독 영역의 5' 말단, 종종 3' 말단으로부터 통상 이용 가능하다. 이들 영역은 항-TGF-베타 항체를 코딩하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 가지 유용한 전사 종결 요소는 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 [참고: WO 1994/11026; 및 이에 기재된 발현 벡터].

(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환

본원 내의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 상기 언급된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물에는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리챠 (Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다.

원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예를 들면, 필라멘트상 진균 또는 효모가 항-TGF-베타 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모가 저급 진핵성 숙주 미생물 중에 가장 흔히 사용되는 것이다. 그러나, 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에 유용한데, 예를 들면 시조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라질리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 있다.

당화 항-TGF-베타 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바쿨로바이러스성 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충: caterpillar), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기: mosquito), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) (초파리: fruitfly), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 상응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 균주, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다.

면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.

그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양 하에 성장하도록 아클로닝된 인간 배아 신장주 293 세포 [참고: Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)]; 유아 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO (참고: Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4216 (1980)); DG44 (참고: Urlaub et al., Som. Cell and Mol. Gen., 12:555-566 (1986)) 및 DP12 세포주 포함]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 [TM4; 참고: Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [참고: Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)이다.

숙주 세포를 항-TGF-베타 항체 생성을 위해 상기 언급된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.

(viii) 숙주 세포 배양

본 발명의 항-TGF-베타 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma], RPMI-1640 (공급처: Sigma), 및 둘벡코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma]가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 [참고: Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102: 255 (1980); U.S. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; or U.S. Pat. Re. 30,985]. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

(ix) 항-TGF-베타 항체의 정제

재조합 기술을 사용하는 경우, 항체를 주변세포질 공간에서 세포내적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비할 수 있다. 항체가 세포내적으로 생성되는 경우에는, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미세 부스러기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [참고: Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간 내로 분비되는 항체를 분리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 해동시킨다. 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 먼저 일반적으로, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (AMICON™) 또는 밀리포어 펠리콘 (MILLIPORE PELLICON™) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 전술된 단계들 중의 어느 단계에 포함시켜 단백질 분해를 억제시킬 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지시킬 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A가 친화성 리간드로서 적합한지의 여부는 항체에 존재하는 모든 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 의거하여 항체를 정제할 수 있다 [참고: Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 γ3에 권장된다 [참고: Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스지만, 기타 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 이용하여 달성된 것 보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용해 준다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (BAKERBOND) ABX™ 수지 (공급처: J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토분획 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을, 회수하고자 하는 항체에 따라서 이용하기도 한다.

예비 정제 단계(들) 후, 관심있는 항체와 오염물을 포함하는 혼합물을 대상으로 하여 pH 약 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 저염 농도 (예: 약 0 내지 0.25 M 염)에서 용출 완충제를 사용하여 저 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피할 수 있다.

IV. 제약 제형 (제제)

본 발명에 따라서 사용된 항체의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 항체를 임의의 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 완충제, 예를 들면 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들면 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 바람직한 동결건조된 항-TGF-베타 항체 제형은 WO 1997/04801 (본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.

본원의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, HER-2, EGFR, TGF-베타 (예를 들어, TGF-베타 상의 상이한 에피토프와 결합하는 항체), ErbB3, ErbB4, 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 항원과 결합하는 항체를 하나의 제형 내에 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 조성물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항-호르몬제, TGF-베타-표적화 약물, 항혈관형성제, 및/또는 심장보호제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.

활성 성분을, 예를 들어 액적형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면, 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테애트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.

V. 항-TGF-베타 항체를 이용한 치료

본 발명에 따라서, 항-TGF-베타 항체를 사용하여 각종 질병 또는 질환을 치료할 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 질환 또는 장애의 예에는 양성 또는 악성 종양; 백혈병 및 림프계 악성 종양; 및 기타 질환, 예를 들어 신경세포, 신경절, 성상세포, 시상하부, 선상, 대식세포, 상피, 간질, 포배강, 염증, 혈관형성 및 면역학적 질환이 포함된다.

일반적으로, 치료하고자 하는 질환에는 TGF-베타 질환, 가장 바람직하게는 암이다. 본원에서 치료하고자 하는 암의 예에는 암종, 모세포종 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프계 악성 종양이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암 (예: 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 페의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.

한 태양에서는, 암이 TGF-베타 수용체를 발현 (및 과발현)하는 것이다. TGF-베타 수용체(들)를 발현/과발현할 수 있는 암의 예에는 편평 세포 암 (예: 상피 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 페의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐만 아니라 두경부암이 포함된다. 그러나, 본 발명의 항체에 의해 치료하고자 하는 암은 단순히 TGF-베타 수용체를 발현 또는 과발현하는 것이 아닌, 모든 암일 수 있다.

본원에서 치료하고자 하는 암이 TGF-베타 수용체의 과도한 활성화를 특징으로 하는 것일 수 있다면, 이러한 과도한 활성화는 TGF-베타 수용체의 과발현 또는 생성 증가에 기인될 수 있다. 본 발명의 한 태양에서는, 환자의 암이 TGF-베타 수용체의 과도한 활성화를 특징으로 하는지를 측정하기 위한 진단 또는 예후 분석을 수행할 것이다. 예를 들어, 암에서 TGF-베타 유전자 증폭 및/또는 TGF-베타 수용체의 과발현을 측정할 수 있다. 이러한 증폭/과발현을 측정하기 위한 각종 분석이 당해 분야에서 이용 가능한데, 예를 들면, 면역조직화학 (IHC); FISH, 서던 블롯팅, 또는 PCR 기술이 있다.

더욱이, TGF-베타 수용체 과발현 또는 증폭은 생체내 진단 분석을 사용하여, 예를 들어 탐지하고자 하는 분자와 결합하고 탐지 가능한 표지 (예: 방사성 동위원소)로 태그화시킨 분자 (예: 항체)를 투여하고, 이러한 표지의 국재화를 알아보기 위해 환자를 외부적으로 스캐닝함으로써 평가할 수 있다.

본원의 인간화 항체가 생체내 시험과 시험관내 시험 둘 다에서 TGF-α의 종양-감소 활성을 증강시키는 것으로 밝혀졌는지를 측정하는데 유용한 분석이 다음에 기재되어 있다:

A. 세포독성 분석 과정

L-929 분석 시스템은 임의로 적당한 면역 기능 조절제와 연계해서 본원의 항체 활성을 신속하게 측정할 수 있게 해주는 편리한 시험관내 분석이다. 이와 생체내 종양 괴사 분석 [참고: Carswell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3666 (1975)] 간의 상관 정도는 현재 공지되어 있지 않지만, 이러한 분석이 뮤린 종양 세포를 특이적으로 활용하기 때문에, 상관 정도는 높을 것으로 예상된다. 단백질 종양 괴사 인자 (TNF-α) 및 림포톡신 (TGF-베타)는 상기 분석에서 활성을 제공한다. 이 분석은 개념상, 뮤린 L-M 세포와 메틸렌 블루 염색을 사용하는 미국 특허 제4,457,916에 기재된 것과 유사하다. 그러나, L-929 분석은 (HL-60 세포로부터 유래된 TNF-α의 경우) 인간 종양 세포주 세포독성과 상관이 있는 것으로 밝혀졌다.

본원에서의 L-929 분석 시스템에서는, L-929 세포를 미세역가 판에서 단층으로서 밤새 제조한다. 가장 우수한 샘플을 상기 판을 가로질로 2배 희석시키고, UV 조사한 다음, 상기와 같이 제조된 세포 단층 상에 부가한다. 이어서, 웰 중의 배양 배지를 1 ㎍/ml 악티노마이신 D가 되도록 한다. 판을 37℃에서 18시간 동안 항온 배양하고, 판을 현미경 하에 가시적으로 스코어링한다. 웰 중에서의 세포 사멸 정도를 예시하는 25, 50, 75, 또는 100% 마크 (mark)를 각 웰에 공급한다. TGF 활성 1 단위는 50% 사멸이 일어나는 희석률의 역수로서 정의된다.

B. 생체내 분석

종양을 사멸시키거나 종양 성장을 억제시킬 수 있는 항-TGF-베타 항체의 능력 및 종양을 보유하고 있는 동물이 사망하지 못하게 하는 항-TGF-베타 항체의 능력을 이용하여, 활성을 알아보기 위해 제제를 시험할 수도 있다. Balb/c 마우스에게 각종 유형의 종양 세포를 피하 주사하여 국한성 종양을 창출시킨다. 종양 세포주에는 복수액으로부터 세포 현탁물로서 수득한 MethA 마우스 섬유육종, 및 세포 1-㎣ 덩어리로서 투여되는 인간 유방 암종인 MCF-7이 포함된다.

분석을 위해, 암컷 Balb/c 마우스 (19-22 g)에게 0.1 ml 배지 중의 5 x 10⁵개 섬유육종 세포를 함유하는 현탁물 또는 MCF-7 덩어리를 26-게이지 바늘로 피하 주사한다 (이러한 섬유육종 현탁물은 혈청-무함유 배지로 세포 계수 및 희석함으로써 8일생 복수액으로부터 제조한다). 9 내지 10일 후, 종양을 촉진할 수 있게 (손으로 만질 수 있게) 되면, 마우스당 1 ㎍의 TNF-α를 정맥내 주사하고, 경우에 따라 TNF-α의 투여를 그 다음 수일 동안 반복한다. 종양 용적과 생존률을 측정함으로써 결과를 평가한다. 마우스당 1 ㎍의 TNF-α 및 마우스 kg당 10 mg의 항체 4A11을 별개로 순차적으로 주사함으로써 상기 시험을 반복한다. 활성을 알아보기 위해 상기 시험용 항체를 이들 작용제에 대항하여 비교한다.

치료하고자 하는 암이 호르몬-비의존성 암인 경우에는, 예를 들어 상기 언급된 바와 같이 이용 가능한 각종 분석 중의 어느 것을 사용해서도, 종양에서의 호르몬 (예: 안드로겐) 및/또는 그의 동족 수용체의 발현을 평가할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 환자가 항-안드로겐 요법에 더 이상 반응하지 않는다면, 환자에게 호르몬-비의존성 암이 있는 것으로 진단할 수 있다.

특정 태양에서는, 세포독성제와 접합된 항-TGF-베타 항체를 포함하는 면역접합체를 환자에게 투여한다. 바람직하게는, 이와 결합되는 면역접합체 및/또는 TGF-베타 단백질이 세포에 의해 내재화되면. 이와 결합되는 암 세포를 사멸시키는데 있어서의 면역접합체의 치료 효능이 증가된다. 바람직한 태양에서는, 세포독성제가 암 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다. 이러한 세포독성제의 예에는 마이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제, 및 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.

본 발명의 항-TGF-베타 항체 또는 면역접합체는 널리 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들면 거환으로서 또는 일정 기간에 걸친 연속식 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여한다. 항체를 정맥내, 복강내 또는 피하 투여하는 것이 바람직하고, 피하 또는 복강내 경로가 특히 바람직하다. 바람직한 투여 스케쥴은 치료하고자 하는 특정한 포유류, 항체의 유형, 및 전문의에게 널리 공지된 기타 요인들에 따라서 매주 약 2 내지 3회 투여하는 것이다. 그러나, 기타 투여 스케쥴도 본원에서 작동 가능하다.

기타 치료적 처방을 항-TGF-베타 항체 투여와 병용할 수 있다. 이러한 병용 투여에는 별개의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하여 동시 투여하고, 어떠한 순서로든 순차적으로 투여하는 것이 포함되는데, 바람직하게는 두 가지 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있다.

한 가지 바람직한 태양에서는, 환자를 2 가지 상이한 항-TGF-베타 항체로 치료한다.

항-TGF-베타 항체(들)를 또 다른 종양 관련 항원에 대항하여 지시된 항체와 병용 투여하는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 경우 기타 항체는, 예를 들어 항원, 예를 들면, HER-2, EGFR, ErbB3, ErbB4, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 또는 B-세포 표면 마커 또는 항원 (이와 결합되는 길항제를 이용하여 표적화시킬 수 있는 B 세포 표면 상에 발현된 항원), 예를 들면, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커와 결합할 수 있다 [이에 대한 설명은 문헌 [The Leukocyte Antigen Facts Book, 2^nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York)을 참고할 수 있다]. 기타 B-세포 표면 마커에는 RP105, FcRH2, B-세포 CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRHl, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTAl, FcRH6, BCMA, 및 239287이 포함된다. 특히 관심있는 B-세포 표면 마커는 포유류의 기타 비-B-세포 조직과 비교해서 B 세포 상에 우선적으로 발현되고, 전구체 B 세포와 성숙한 B 세포 둘 다 상에서 발현될 수 있다. 본원에서 바람직한 B-세포 표면 마커는 CD20 및 CD22이다. 또 다른 국면에서는, TGF-베타 항체를, 혈관형성을 억제시키는 작용을 하는 항혈관형성제와 병용할 수 있다. 특정 예가 VEGF에 대한 길항제, 예를 들어 AVASTIN™ 등의 항체이다.

한 태양에서는, 본 발명의 치료법이 항-TGF-베타 항체(들)와 한 가지 이상의 포유류 면역 기능 조절제, 예를 들어 사이토킨 뿐만 아니라 화학요법제 또는 성장 억제제를 병용 투여하는 것을 포함하는데, 이에는 상이한 화학요법제의 칵테일을 동시 투여하는 것이 포함된다. 바람직한 화학요법제에는 탁산 (예: 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제가 포함된다. 이러한 화학요법제에 대한 제제 및 투약 스케쥴은 제조업자의 지시에 따라서 또는 전문의에 의해 실험적으로 측정된 바와 같이 사용할 수 있다. 상기 화학요법에 대한 제제 및 투약 스케쥴은 또한 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)].

본 발명의 항체를 항-호르몬 화합물, 예를 들어 항-에스트로겐 화합물, 예를 들면, 타목시펜 또는 아로마타제 억제제, 예를 들면, 아나스트로졸; 항-프로게스테론, 예를 들면, 오나프리스톤 (onapristone) [참고: EP 616 812]; 또는 항-안드로겐, 예를 들면, 플루타미드와 이러한 분자에 대해 공지된 투여량으로 병용할 수 있다. 치료하고자 하는 암이 호르몬-비의존성 암인 경우에는, 환자에게 이미 항-호르몬 요법을 적용했었을 수 있고, 암이 호르몬 비의존성이 된 후에, 항-TGF-베타 항체 (및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 기타 작용제)를 환자에게 투여할 수 있다.

종종, 심장 보호제 (상기 요법과 연관된 심근 기능이상을 예방하거나 저하시키기 위함) 또는 하나 이상의 사이토킨을 환자에게 동시 투여하는 것이 유익할 수 있다. 세포독성제를 동시 투여할 수도 있다. 상기 치료적 처방 이외에도, 환자에게 암 세포의 외과적 제거 및/또는 방사선 요법을 적용할 수 있다.

본원에서의 항-TGF-베타 항체를 상기 정의 섹션에서 논의된 바와 같은 EGFR-표적화 약물과 병용하여, 상보적, 및 잠재적으로 상승적 치료 효과를 가져다 줄 수 있다.

상기 동시 투여되는 작용제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이며, 이는 상기 작용제와 항-TGF-베타 항체의 병용 작용 (상승 작용)으로 인해 낮아질 수 있다.

질병을 예방 또는 치료하는데 적당한 항체 투여량은 상기 규정된 바와 같은 치료하고자 하는 질병 유형, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되든지 간에 질병의 중중도 및 과정, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 의해 좌우될 것이다. 항체는 환자에게 1회 투여하거나 치료 전 기간에 걸쳐 투여하는 것이 적합하다. 질병의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여에 의해서든 아니면 연속식 주입에 의해서든지 간에, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예: 0.1 내지 20 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보이다. 전형적인 1일 투여량 범위는 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 상태에 따라서 수일에 걸쳐 반복 투여하는 경우의 치료는 질병 증상이 목적하는 수준으로 억제될 때까지 지속한다.

바람직한 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 lO mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 lO mg/kg (또는 이들의 조합량)의 1회 이상 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로 투여할 수 있는데, 예를 들어 매주 또는 3주 마다 투여할 수 있다 (예를 들어, 항-TGF-베타 항체를 약 2 내지 약 20회, 예를 들어 약 6회 용량으로 환자에게 투여한다). 초기에는 보다 고 용량을 투여한 다음, 1회 이상 낮은 용량을 투여할 수 있다. 예시되는 투약 처방은 항-TGF-베타 항체 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량을 투여한 다음, 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 기타 투여량 처방도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링한다.

또 다른 한편, 항체를 문헌 [참고: UMCC (Ed.), Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982)]에 지칭된 바와 같은, 방사선 치료--방사성 물질의 도입 또는 조사--와 병용하거나 일련으로 투여하는 것이 적합하다.

항체 단백질을 환자에게 투여하는 것 이외에도, 본 출원은 항체를 유전자 요법에 의해 투여하는 것을 고려한다. 이와 같이 항체를 코딩하는 핵산을 투여하는 것은 "치료상 유효량의 항체 투여"란 표현으로써 포괄된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성시키기 위한 유전자 요법의 사용에 관한 WO 1996/07321 (1996년 3월 14일자로 공개됨)을 참고할 수 있다.

핵산 (임의로 벡터 내에 함유됨)를 생체내 및 생체외에서 환자의 세포 내로 유입시키기 위한 2 가지 주요 접근법이 있다. 생체내 전달하는 경우에는, 핵산을 통상적으로 항체를 요구하는 부위에서 환자에게 직접 주사한다. 생체외 처치하는 경우에는, 환자의 세포를 제거하고, 핵산을 이들 단리된 세포 내로 도입하며, 이와 같이 변형시킨 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 또는 예를 들어, 환자 내로 이식되는 다공성 막 내에 피막 형성된 채로 투여한다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호]. 핵산을 살아 있는 세포 내로 도입하는데 이용 가능한 각종 기술이 있다. 이러한 기술은 핵산이 시험관내 배양 세포 내로 전이되는지, 아니면 의도한 숙주의 세포에 생체내 전이되는지에 따라서 다양하다. 핵산을 시험관 내에서 포유류 세포 내로 전이하는데 적합한 기술에는 리포솜의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 유전자를 생체외 전달하기 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전이 기술에는 바이러스성 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 단순 포진 I 바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스)를 이용한 형질감염, 및 지질에 의거한 시스템 (유전자를 지질 매개된 전이시키는데 유용한 지질은, 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)이 포함된다. 몇몇 상황에서는, 표적 세포를 표적으로 하는 작용제, 예를 들어 세포-표면 막 단백질 또는 표적 세포에 대해 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 이용되는 경우에는, 세포내 이입과 연관된 세포-표면 막 단백질과 결합하는 단백질을 표적화를 위해 및/또는 흡수 촉진을 취해 사용할 수 있는데, 이에는 예를 들면 특정한 세포 유형에 대해 지향성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화를 진행하는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증강시키는 단백질이 있다. 수용체-매개된 세포내 이입 기술이, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987) and Wagner et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990)]. 현재 공지된 유전자 제조 및 유전자 요법 프로토콜에 대한 고찰을 위해서는, 다음 문헌을 참고할 수 있다 (Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992); WO 1993/25673 및 이에 인용된 참고 문헌).

한 가지 구체적 태양에서는, 유효량의 TGF-베타 항체 및 VEGF와 결합하는 항체를, 임의로 본원에 기재된 바와 같은 기타 적합한 작용제와 함께 포유류에게 투여함으로써, 이러한 포유류, 바람직하게는 인간에게서 암, 예를 들어 폐암, 흑색종, 유방암, 신장암, 결장직장암, 췌장암 또는 전립선암을 치료한다. 바람직하게는, TGF-베타 항체가 모노클로날 항체이고, 보다 바람직하게는 TGF-베타1, TGF-베타2 및 TGF-베타3 중의 어느 하나 이상과 결합하는 항체이고, 보다 더 바람직하게는 적어도 TGF-베타1과 결합하거나 또는 TGF-베타1과 TGF-베타2 둘 다와 결합하는 항체이며, 가장 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 인간화 항체이다. 또 다른 태양에서는, VEGF와 결합하는 항체가 모노클로날 항체이고, 보다 바람직하게는 VEGF를 차단 또는 중화시키고/시키거나 VEGF가 그의 수용체 중의 하나 또는 둘 다와 결합하는 것을 차단시키는 것이다.

VI. 제조품

본 발명의 또 다른 태양에서는, 상기 언급된 질환을 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 본 발명의 제조품은 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 한 가지 이상 활성제가 본원의 인간화 항-TGF-베타 항체이다. 상기 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 선택된 질환, 예를 들어 암을 치료하는데 사용된다는 것을 지시한다. 한 태양에서는, 라벨 또는 패키지 삽입물이 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 사용하여 TGF-베타 질환, 예를 들어 TGF-베타 수용체를 발현하는 암을 치료할 수 있다는 것을 지시한다. 또한, 라벨 또는 패키지 삽입물은 치료하고자 하는 환자가 TGF-베타 수용체의 과도한 활성화를 특징으로 하는 암을 지닌 환자라는 것을 지시할 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물을 사용하여 암을 치료할 수 있다는 것을 지시할 수 있는데, 이러한 암은 TGF-베타 수용체의 과발현을 특징으로 나타내지 않는다. 기타 태양에서는, 패키지 삽입물이 항체 또는 조성물을 사용하여 유방암 (예: 전이성 유방암); 호르몬-비의존성 암; 전립선암 (예: 안드로겐-비의존성 전립선암); 폐암 (예: 비-소세포 폐암); 결장암, 직장암 또는 결장직장암; 또는 본원에 기재된 기타 질병 또는 질환을 치료할 수 있다는 것을 지시할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 제조품은 (a) 본원의 인간화 항체를 포함하는 조성물이 함유된 제1 용기와 (b) 본원의 인간화 항체 이외의 치료제를 포함하는 조성물이 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 이러한 본 발명의 태양에서의 제조품은 TGF-베타 질환, 예를 들어 암을 치료하기 위해 제1 조성물과 제2 조성물을 병용해서 사용할 수 있다는 것을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 치료제는 앞서 섹션에서 기재된 부가 요법들 중의 어느 것일 수 있다 [예를 들어, 화학요법제, 항혈관형성제, 항호르몬 화합물, 심장 보호제 및/또는 포유류의 면역 기능 조절제 (사이토킨 포함)]. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충제, 예를 들어 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들면, 기타 완충액, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.

VII. 항-TGF-베타 항체의 비-치료적 용도

본 발명의 항체 (예를 들면, 인간화 항-TGF-베타 항체)는 추가의 비-치료적 용도를 지닌다.

예를 들어, 항체를 친화도-정제 작용제로서 사용할 수 있다. 이러한 공정에서는, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, 항체를 고체 상, 예를 들어 SEPHADEX™ 수지 또는 필터지 상에 고정화시킨다. 이와 같이 고정화시킨 항체를, 정제시키고자 하는 TGF-베타 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정화 항체와 결합되는 TGF-베타 단백질을 제외하고는 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거시키는데 적합한 용매를 이용하여 지지체를 세척한다. 최종적으로, 항체로부터 TGF-베타 단백질을 방출시키는데 적합한 또 다른 용매, 예를 들어 글리신 완충액 (pH 5.0)으로 지지체를 세척한다.

항-TGF-베타 항체는 TGF-베타 단백질에 대한 진단 분석에 유용할 수 있는데, 예를 들어 이러한 단백질이 특이적 세포, 조직 또는 혈청 내에 발현되는지를 탐지하는데 유용할 수도 있다.

진단 적용하는 경우에는, 항체를 전형적으로, 탐지 가능한 부분으로 표지시킬 것이다. 일반적으로 다음 범주로 나눌 수 있는 수 많은 표지가 이용 가능하다:

(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I. 항체를, 예를 들어 문헌 [참고: Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있고, 신틸레이션 계수를 이용하여 방사능을 측정할 수 있다.

(b) 형광성 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (에우로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민 (Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)가 이용 가능하다. 형광성 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 참고]에 기재된 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있다. 형광계를 사용하여 형광을 정량화할 수 있다.

(c) 각종 효소-기질 표지가 이용 가능하고, 미국 특허 제4,275,149호에는 이들 중의 몇 가지에 관한 고찰이 제공된다. 효소는 일반적으로, 각종 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있는데, 이는 분광광도계를 이용하여 측정할 수 있다. 또 다른 한편, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광 상의 변화를 정량화하는 기술이 상기 언급되어 있다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 예를 들어 화학발광계를 사용하여 측정할 수 있는 빛을 방출하거나 에너지를 형광 수용체에 기증할 수 있다. 효소적 표지의 예에는 루시퍼라제 (예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알킬리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예: 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예: 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)].

효소-기질 조합물의 예에는, 예를 들어 다음이 포함된다:

(i) 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제의 조합물 [여기서는, 수소 퍼옥시다제가 염료 전구체 (예: 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다];

(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트의 조합물; 및

(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예: p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제의 조합물.

당업자는 수 많은 기타 효소-기질 조합물을 입수할 수 있다. 이들에 관한 일반적인 고찰을 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참고할 수 있다.

종종, 표지를 항체와 간접적으로 접합시킨다. 당업자는 이를 달성하기 위한 각종 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체를 바이오틴과 접합시키고, 상기 언급된 3 가지 광범위한 범주의 표지 중의 어느 하나를 아비딘과 접합시킬 수 있는데, 그 반대의 경우도 가능하다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하므로, 표지를 이러한 간접 방식으로 항체와 접합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 표지를 항체와 간접적으로 접합시키기 위해, 항체를 작은 합텐 [예: 디곡신 (digoxin)]과 접합시키고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중의 하나를 항-합텐 항체 (예: 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 이로써, 표지와 항체와의 간접적 접합이 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 항-TGF-베타 항체를 표지시킬 필요가 없는데, 그의 존재는 TGF-베타 항체와 결합하는 표지된 항체를 사용하여 탐지할 수 있다.

본 발명의 항체는 공지된 모든 분석 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에 이용할 수 있다 [참고: Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)].

면역조직화학의 경우에는, 종양 샘플이 신선하거나 동결될 수 있거나, 또는 파라핀에 포매시키고 포르말린 등의 방부제로 고정시킬 수 있다.

본 발명의 항체를 생체내 진단 분석에 사용할 수도 있다. 일반적으로, 항체를 방사성 핵종 (예: ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P 또는 ³⁵S)으로 표지시켜, 예를 들어 면역섬광조영술을 이용하여 종양을 국재시킬 수 있다.

편의상, 본 발명의 항체를 키트 내에 제공할 수 있는데, 즉 진단 분석을 수행하기 위한 설명서와 함께 예정량으로 패키지된 시약 조합물로 제공될 수 있다. 항체를 효소로 표지시킨 경우에는, 키트가 이러한 효소에 의해 요구되는 기질 및 조인자 (예를 들어, 탐지 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 기타 부가제, 예를 들어 안정화제, 완충제 (예: 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등을 포함할 수 있다. 각종 시약의 상대량은 해당 분석의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 시약은 통상적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있는데, 이에는 용해시 적당한 농도를 지닌 시약 용액을 제공해주는 부형제가 포함된다.

본원의 항체는 생체내 조영에 유용한데, 여기서는 표지된 항체를 숙주, 바람직하게는 혈류에 투여하고, 숙주 내에서의 상기 표지된 항체의 존재 및 위치를 분석한다. 이러한 조영 기술은 신생물 (종양)의 병기 및 치료에 있어 적합하게 사용된다. 항체는 숙주에서 탐지 가능한 모든 부분, 예를 들어, 핵 자기 공명 또는 당해 분야에 공지된 기타 수단에 의해 탐지 가능한 비-방사성 지시기로 적합하게 표지시킨다. 그러나, 바람직하게는 표지가 방사성 표지, 예를 들어 요오드, 예를 들면, ¹²⁵I 및 ¹³¹I, 셀레늄, 이관능성 킬레이트, 구리 (예: ⁶⁷Cu), 테크네튬 (예: ^99mTc), 및 레늄 (예: ¹⁸⁶Re 및 ¹⁸⁸Re)이다. 이러한 방사성 동위원소를 모든 수단, 예를 들어 금속-킬레이트 화합물 또는 락토퍼옥시다제, 또는 요오드화를 위한 요오도젠 (iodogen) 기술에 의해 단백질에 접합시키다.

뮤린 모노클로날 항체 2G7은 1989년 9월 28일자로 수탁기관 [American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC)]에 HB 10240으로서 기탁되었고; 뮤린 모노클로날 항체 4A11은 1989년 9월 28일자로 ATCC HB10241로서 기탁되었다.

본 발명의 추가 상세 내역이 다음 비-제한적 실시예에 의해 예시된다. 본원에 인용된 모든 문헌의 기술 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

실시예 1

모노클로날 항체 2G7 및 4A11의 생성 및 특성

A. 분석 과정

I. ELISA 측정

96-웰 폴리스티렌 분석용 판을 pH 9.6 탄산염 완충액 중의 1 ㎍/ml에서 100 ㎕/웰의 정제된 TGF-베타1로 4℃ 하에 18시간 동안 피복시켰다. 이와 같이 피복시킨 판을 22℃에서 1시간 동안 PBS 중의 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) (BPBS로 칭해짐)으로 차단시키고, PBS 중의 0.05% TWEEN20™ (PBST으로 칭해짐)으로 세척한 다음, 100 ㎕의 하이브리도마 상등액과 함께 22℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 판을 PBST로 세척하고, 결합된 항체를, 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-마우스 IgG (공급처: Tago, Burlingame, CA)를 이용하여 탐지하였다. 판을 PBST로 세척하고, o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 기질을 100 ㎕/웰로 가하였다. 15분 후에 반응을 중지시키고, UVMAX™ 판 판독기 (공급처: Molecular Devices, Palo Alto, CA) 상에서 492 nm 하의 광학 밀도를 측정하였다.

II. rTGF-베타1의 요오드화

정제된 TGF-베타1를 CHLORAMINE T™ n-클로로-파라-톨루엔 설폰아미드 나트륨 염을 이용하는 변형된 과정에 의해 요오드화시켰다 [참고: Greenwood et al., Biochem. J., 89: 114 (1963)]. 간략하게 언급하면, 10 ㎍의 정제된 rTGF-베타1을, 2분 항온 배양 간격을 둔 20 ㎕의 0.1 mg/ml CHLORAMINE™ n-클로로-파라-톨루엔 설폰아미드 나트륨 염의 3 가지 순차적 부가물을 이용하여 얼음 상에서 1 mCi의 Na¹²⁵I로 표지시켰다. 20 ㎕의 50 mM N-아세틸 티로신, 1 M 요오드화칼륨에 이어, 200 ㎕의 8 M 우레아를 순차적으로 부가하여 상기 반응을 중지시켰다. C18 칼럼과 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 구배를 이용하여 HPLC함으로써, 요오드화 rTGF-베타1를 자유 Na¹²⁵I로부터 격리시키고, 주요 피크를 함유하는 분획을 풀링한 다음, -70℃ 하에 저장하였다 (특이 활성 112 μCi/㎍).

III. 항원 포획 방사성면역분석

IMMUNLON™ 2 "REMOVAWELL"™ 미세역가 스트립 (공급처: Dynatech, Chantily, VA)를 4℃에서 18시간 동안, pH 9.6 탄산염 중의 5 ㎍/ml 염소 항-마우스 IgG (공급처: Boehringer Mannheim)로 피복시켰다. 웰을 PBST로 세척하고, 0.1% 젤라틴을 함유하는 PBS (PBSG로 칭해짐)으로 차단시키며, PBST로 세척한 다음, 22℃에서 4시간 동안 하이브리도마 상등액과 함께 항온 배양하였다. 웰을 PBST로 세척하고, PBST 중의 100 ㎕의 0.1% 젤라틴 중에서 대략 75,000 CPM/웰의 ¹²⁵I-rTGF-베타1을 가하고, 22℃에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 상기 판을 PBST로 세척하고, 결합된 ¹²⁵I-rTGF-베타1을 GAMMAMASTER™ 계수기 (공급처: LKB, Sweden) 상에서 정량화하였다.

IV. ¹²⁵ I-rTGF-베타의 면역침전

항-TGF-베타 모노클로날 항체의 특이성은 또한, ¹²⁵I-rTGF-베타1 또는 돼지의 혈소판-유래된 ¹²⁵I-rTGF-베타2 (공급처: R & D Systems, Minneapolis, MN; 특이 활성 103.4 μCi/㎍)를 면역침전시킬 수 있는 그들의 능력에 의해 평가하였다. 2 ㎍의 정제된 모노클로날 항체를 22℃에서 2시간 동안, 5 x 10⁴ CPM의 ¹²⁵I-rTGF-베타1 또는 ¹²⁵I-rTGF-베타2와 함께 항온 배양하였다. 면역복합체를 토끼 항-마우스 IgG (공급처: Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)로 피복시킨 단백질 A-SEPHAROSE™ 아가로스 (공급처: Repligen, Cambridge, MA)으로 펠릿화하고, 연속해서 PBST로 3회 세척하였다. 환원성 샘플 완충액을 이용하여, 상기 복합체를 단백질 A-SEPHAROSE™ 아가로스로부터 해리시키고 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE) 내로 전기영동시킨 다음, 자가방사선 촬영하였다.

V. TGF-베타 모노클로날 항체의 친화도 측정

문헌 [참고: Mariani et al., J. Immunol. Methods. 71: 43 (1984)]에 기재된 고체 상 방사성면역 분석 과정을 사용하여 TGF-베타-특이적 모노클로날 항체의 친화도를 측정하였다. 간략하게 언급하면, 정제된 항-TGF-베타 모노클로날 항체를 4℃에서 18시간 동안 pH 9.6 탄산염 완충액 중의 IMMUNLON™ 2 "REMOVAWELL"™ 미세역가 스트립 상에서 피복시켰다. 웰을 상기 언급된 바와 같이 세척 및 차단시켰다. 50 ㎕ PBSG 중의 40,000 CPM/웰의 ¹²⁵I-rTGF-베타1 또는 돼지의 ¹²⁵I-rTGF-베타2 (공급처: R & D Systems)를, 50 ㎕ PBSG 중의 2500 내지 9.7 ng/웰 범위의 비-표지된 rTGF-베타1 또는 돼지의 TGF-베타2의 일련의 2배 희석물에 가하였다. 이로써 생성된 혼합물을 4℃에서 18시간 동안 항온 배양하였다. 웰을 상기 언급된 바와 같이 세척 및 계수하고, 문헌 [참고: Antoni and Mariani, J. Immunol. Meth., 83: 61 (1985)]의 비-선형 회귀 분석과 유사한 결과를 제공해주는 스카챠드 (Scatchard) 분석 [참고: Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980)]에 의해 친화도 상수를 측정하였다.

VI. 복수액으로부터 모노클로날 항체의 정제

상기 분석에서 양성인 항체를 분비하는 모 하이브리도마 배양물을 제한 희석에 의해 클로닝하고, PRISTANE™ 프라이머로 프라이밍시킨 Balb/c 마우스 [참고: Potter et al., JNCI, 49: 305 (1972)]의 복수액에서 성장시켰다. 단백질 A-SEPHAROSE™ 아가로스 상에서 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제하고, 확립된 과정 [참고: Goding, J. Immunol. Methods, 20: 241 (1978)]을 이용하여 0.1 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 2.4에서 용출시킨 다음, 4℃ 하에 PBS 중에서 멸균 저장하였다.

VII. 시험관내 TGF-베타 특이 활성의 모노클로날 항체 중화

시험관내 TGF-베타 분석은 밍크 폐 섬유아세포 세포주 Mv-3D9 [Mv1Lu로부터 아클로닝됨; American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 ATCC No. CCL-64로서 입수 가능함]를 이용하였다. 간략하게 언급하면, 정제된 항-TGF-베타 모노클로날 항체 및 대조군을 4℃에서 18시간 동안 1000 내지 2000 pg/ml의 최종 농도로 rTGF-베타1, 본래의 돼지 TGF-베타2 (공급처: R & D Systems), 또는 rTGF-베타3 [Derynck et al., Nature, 상기 참고]와 함께 항온 배양하였다. 이들 혼합물 50 ㎕를 96-웰 미세역가 판에 가한 다음, 2 mM 글루타민과 5% 태아 소 혈청을 함유하는 50 ㎕의 최소 필수 배지 중의 1 x 10⁴ Mv-3D9 세포에 가하고, 5% C0₂ 중에서 37℃ 하에 18 내지 24시간 동안 항온 배양하였다. 웰을 20 ㎕ 중의 1 μCi의 ³H-티미딘으로 펄싱하고, 37℃ 하에 4시간 후에 수거한 다음, 신틸레이션 계수기로 계수하였다. TGF-베타 표준의 각 희석물에 대한 ³H-티미딘 흡수 억제율 (%)을 사용하여 음성 대조군 모노클로날 항체 및 TGF-베타-특이적 모노클로날 항체-처리된 샘플의 TGF-베타 활성을 pg/ml로 산정하였다.

VIII. 모노클로날 항체의 이소형별 검사

PANDEX™ 형광 스크린 기계 기술을 이용하여, TGF-베타1-반응성 모노클로날 항체의 이소형별 검사를 수행하였다. 랫트 항-마우스 IgG 항혈청-피복된 폴리스티렌 입자를 사용하여, PANDEX™ 96-웰 분석용 판에 분배된 배양 상등액으로부터 모노클로날 항체를 결합시켰다. 이 판을 세척하고 FITC-접합된 랫트 모노클로날 항-마우스 이소형 특이적 시약 (공급처: Becton Dickinson Monoclonal Center)을 가하였다. 결합된 형광을 PANDEX™ 형광 스크린 기계 기술에 의해 정량화하였다.

IX. 에피토프 분석

정제된 항-rTGF-베타1 모노클로날 항체를 문헌 [참고: Nakane and Kawaoi, J. Histochem. Cytochem, 22: 1084 (1974)]의 방법에 의해 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 커플링시켰다. rTGF-베타1-피복된 판을 22℃에서 2시간 동안, PBS 중의 50 ㎍/ml의 정제된 항-rTGF-베타1 또는 음성 대조군과 함께 항온 배양하였다. 그 다음, 항-rTGF-베타 모노클로날 항체-HRP 접합체의 예정된 희석물을 판에 가하고, 22℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 판을 세척하고 기질을 가한 다음, 상기 언급된 바와 같이 반응성을 정량화하였다. 이종 항-rTGF-베타1 모노클로날 항체의 차단율 (%)을 자기 유래의 양성 차단성 대조군과 비교하였다.

X. 면역블롯 분석

1 ㎍/레인의 rTGF-베타1을, 비-환원성 샘플 완충액을 이용하여 12% SDS-PAGE에서 전기영동시켜, 이량체 형태의 rTGF-베타1과 각종 모노클로날 항체의 반응성을 측정하였다. 펩티드를 니트로셀룰로스 종이 상으로 트랜스블롯팅하고, HRP와 접합된 적당한 모노클로날 항체로 프로빙하였다. 불용성 기질 4-클로로-1-나프톨 (공급처: Kirkegaard and Perry, Gathersburg, MD)를 사용하여, 결합된 항체를 가시화하였다. 증류수로 소모적 세척함으로써 15분 후에 상기 반응을 중지시키고, 면역블롯을 건조시킨 다음, 사진을 찍었다.

B. 항-TGF-베타1- 및 항-TGF-베타2-특이적 모노클로날 항체의 생성

초기 면역 프로토콜에서는, 각종 면역원 제제, 용량 및 스케쥴을 사용하고 완전 프로인트 아주반트 (Freund's adjuvant)와 불완전 프로인트 아주반트를 사용하여, Balb/c 마우스를 피하 및 복강내 경로에 의해 rTGF-베타1 [문헌 (Derynck et al., Nature 상기 참고)에 기재된 바와 같이 생성 및 정제됨]으로 면역시켰다. 이러한 면역 스케쥴을 대략 11주 동안 지속하였다. 몇 마리 마우스는 측정 가능한 수준으로 반응하였지만, 낮은 항-rTGF-베타1 역가를 나타내었고, 이들 마우스 중의 2마리는 희생시켜 그들의 비장을 융합용으로 사용하였다. 1152개 모 배양물 중에서 단지 84개 만이 항-TGF-베타 양성 상등액인 것으로 탐지되었다. 이들 하이브리도마 중의 10개를 클로닝하였는데, 이로써 친화도가 낮은 모노클로날 항체가 생성되었으며, 이는 분석 개발이나 정제를 위해 사용할 수 없었다.

대체 전략으로서, 10마리 Balb/c 암컷 마우스 군 (공급처: Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA)에게 0, 3, 7, 10 및 14일째에, 100 ㎕ DETOX™ 아주반트 (공급처: RIBI ImmunoChem Res. Inc., Hamilton, MT) 중의 (1회분당) 5 ㎍의 정제된 TGF-베타1를 뒷 발바닥에 주사하였다. 17일째에 동물을 희생시키고, 그들에게서 유출되는 서혜부 (inguinal) 및 오금 (popliteal) 림프절을 제거하고, 스텐레스-강 메쉬를 사용하여 림프절 간질로부터 림프구를 해리시켰다. 10마리 마우스 모두로부터의 림프구 현탁물을 풀링하고, 확립된 과정 [참고: Oi and Herzenberg, in Selected Methods in Cellular Immunology, B. Mishel and S. Schiigi, eds., (W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, 1980), p.351]에 의해 50% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 사용하여 마우스 골수종 주 X63-Ag8.653 [참고: Kearney et al., J. Immunol. 123: 1548 (1979)]와 융합시켰다. 이와 같이 융합시킨 세포를 2 x 10⁵개 세포/웰 밀도로 총 1344개 96-웰 미세역가 판에 도말한 다음, 주입 후 1일째에 HAT 선별하였다 [참고: Littlefield, J.W., Science 145: 709 (1964)].

상기 웰 중의 1190개가 ELISA 시험에서 고정화 재조합 TGF-베타1와 반응성이었다. 팽창되었을 때 이들 배양물 중의 18개가 안정한 채로 유지되었고, 세포주를 냉동 보존하였다. 이들 모 배양물을 대상으로 하여 이소형별 검사하고, ¹²⁵I-rTGF-베타1을 포획할 수 있는 그들의 능력과 시험관내 TGF-베타1 활성을 중화시킬 수 있는 그들의 능력을 알아보기 위해 분석하였다. rTGF-베타1를 중화시키는 것을 알아보기 위해 분석하고 후속 이소형별 검사를 수행한 18개 모 배양물로부터, 2개가 IgG1 카파 이소형이었고; 나머지는 IgG2b 카파 이소형이었다. IgG1 아부류에 속하는 모노클로날 항체 만이 시험관 내에서 rTGF-베타1 억제 (중화) 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 고 친화성 항-TGF-베타 모노클로날 항체를 분비하는 3개의 안정한 하이브리도마를 선별하였다. 이들 항체의 성상 확인이 다음에 추가로 상세히 기재되어 있다.

C. 방사성 요오드화 TGF-베타의 면역침전

TGF-베타1을 인식하고 이를 용액 중에 침전시킬 수 있는 3 가지 모노클로날 항체의 능력을 측정하기 위한 면역침전 실험을 수행하였다. 자가방사선상은 항-TGF-베타 모노클로날 항체 2G7, 4A11, 및 12H5가 등량의 ¹²⁵I-rTGF-베타1를 면역침전시킨 반면, 대조군 모노클로날 항체 6G12는 음성이었다는 것을 나타내었다. 면역침전된 밴드는 겉보기 분자량이 대략 14.5 kD였다. 경쟁적 억제 분석을 사용하여 TGF-베타1과 각 모노클로날 항체 간의 상호 작용의 친화도를 측정하였다. 모노클로날 항체 2G7 및 4A11은 동등한 수준으로 보다 높은 친화도를 지녔는데, 이는 1.2 x 10⁸ l/mole이었다.

TGF-베타2를 인식하고 이를 용액 중에 침전시킬 수 있는 것으로 선별된 모노클로날 항체의 능력을 측정하기 위한 면역침전 실험을 또한 수행하였다. 자가방사선상은 rTGF-베타1과는 달리, 단지 항체 2G7 만이 ¹²⁵I-rTGF-베타2를 측정 가능한 정도로 면역침전시켰다는 것을 나타내었다. 4A11 및 12H5를 음성 대조군과 비교한 결과, 특이적 침전이 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 교차-차단 실험 결과, 4A11 및 2G7이 인간 rTGF-베타1에 대한 서로의 결합을 억제할 수 있었다는 사실이 밝혀졌다는 측면에서 보면 놀라운 것이었다 (표 1 참고).

취합해 보면, 상기 데이터는 이들 2개의 모노클로날 항체에 의해 인식된 에피토프는 별개의 것이지만, 서로 근접해 있거나 멀리서 서로의 결합에 대해 어떻게든지 영향을 미친다는 것을 지시한다. 면역침전 실험과 교차-차단 실험 둘 다로부터, 12H5는 별개의 에피토프인 것으로 여겨지지만, 몇몇 차단이 관찰되었다. 이러한 결론은 또한, 다음의 중화 데이터에 의해 뒷받침된다.

D. rTGF-베타1를 이용한 면역블롯 분석

활성 형태의 TGF-베타는 동종-이량체이기 때문에, 면역블롯을 수행하여 모노클로날 항체가 이러한 형태를 인식하였는지를 측정하였다. 항체 2G7, 4A11 및 12H5는 모두 간접 면역블롯에서 TGF-베타1 이량체 (비환원됨) 형태와 반응하였다. 2G7은 4A11 또는 12H5 보다 훨씬 더 강력한 밴드를 제공해주었다. 면역침전 실험에서와 같이, 대조군 항체 6G12는 음성이었다. 이러한 패턴의 반응성은 직접 웨스턴 블롯에서, 이들 모노클로날 항체의 HPR 접합체를 이용한 경우에도 관찰되었다.

요약하면, 유출되는 림프절의 융합과 연계된 발바닥 면역을 이용하는 프로토콜은, 완전 및 불완전 프로인트 아주반트를 이용한 Balb/c 및 C3H 마우스에서의 각종의 면역 과정과 투약 스케쥴을 사용하여 rTGF-베타1에 대한 파단 내성에 있어 성공적이지 못한 다수의 시도 후에 수행하였다. 일반적으로, 이러한 과정은 Balb/c 마우스에서 면역원으로서 프로인트 아주반트 중의 정제된 소 뼈-유래 TGF-베타2를 사용하여 TGF-베타1- 및 TGF-베타2-중화 모노클로날 항체를 생성시킨 것으로 문헌 [Dasch et al., 상기 참고]에 보고된 것과는 대조적으로, 상기 약한 면역원에 대하여 극히 높은 친화도로 신속하게 반응하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.

3 가지 모노클로날 항체 모두는 면역블롯, ELISA, 교차-차단성 및 면역침전 분석에서 rTGF-베타1과 결합하였다. 항-rTGF-베타 항체 중의 2개가 시험관 내에서 rTGF-베타1 활성을 중화시킨 반면, 이러한 2개 중의 1개 만이 밍크 폐 섬유아세포 세포 분석에서 TGF-베타2 활성과 TGF-베타3 활성 모두를 중화시켰다. TGF-베타1-중화성 항체는 또한, 방사수용체 분석에서 방사성요오드화 rTGF-베타1 결합을 차단시켰는데, 이는 rTGF-베타1 활성의 시험관내 중화가 수용체 차단에 기인될 수 있다는 것을 지시해준다.

실시예 2

인간화 2G7 항체

뮤린 모노클로날 항체 2G7의 가변 도메인을 먼저, 마우스/인간 키메라 Fab 단편의 생성을 허용해 주는 벡터 내로 클로닝하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 STRATAGENE™ RNA 추출용 키트를 사용하여, 총 RNA를 하이브리도마 세포로부터 분리하였다. 이러한 가변 도메인을 RT-PCR에 의해 증폭시키고, 겔 정제한 다음, 기존 문헌 [참고: Carter et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4285 (1992) and U.S. Pat. No. 5,821,337]에 기재된 바와 같이 인간 카파 불변 도메인과 인간 C_H1 도메인을 함유하는 pUC119-이용 플라스미드의 유도체 내로 삽입하였다. 이로써 생성된 플라스미드를, Fab 단편의 발현을 위해 이. 콜라이 균주 16C9 내로 형질전환시켰다. 배양물의 성장, 단백질 발현 유도 및 Fab 단편의 정제는 기존 문헌 [참고: Werther et al,. J. Immunol. 157: 4986-4995 (1996); Presta et al., Cancer Research. 57: 4593-4599 (1997)]에 기재된 바와 같이 하였다.

키메라 클론을 DNA 서열 분석하여, CDR 잔기를 확인할 수 있었다 [Kabat et al., 상기 참고]. 올리고뉴클레오티드 부위-지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 이들 CDR 영역 6개 모두를, 문헌 [참고: Presta et al., Cancer Research, 57: 4593-4599 (1997)]에 기재된 바와 같이 플라스미드 VX4 상에 함유된 완전 인간 골격 (V_L 카파 아군 I 및 V_H 아군 III) 내로 도입하였다. 이로써 생성된 "CDR-교환 (swap)"으로부터의 단백질을 상기 언급된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 결합 연구를 수행하여 두 버젼을 비교하였다. 간략하게 언급하면, NUNC MAXISORP™ 판을 4℃ 하에 밤새, 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 1 마이크로그램/ml의 TGF-베타 세포외 도메인 (ECD; WO 90/14357에 기재된 바와 같이 생성됨)으로 피복시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 ELISA 희석제 (0.5% BSA, 0.05% POLYSORBATE™ 20 비이온성 계면활성제, PBS)로 차단시켰다. ELISA 희석제 중의 일련의 샘플 희석물을 상기 판 상에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 세척 후, 결합된 Fab 단편을 바이오티닐화 뮤린 항-인간 카파 항체 (ICN 634771)로 탐지한 다음, 스트렙타비딘-접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제 (공급처: Sigma) 및 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (공급처: Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 사용하여 탐지하였다. 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다. CDR-교환 Fab의 결합은 키메라 Fab 단편의 결합과 비교해서 상당히 감소되었다.

인간화 Fab의 결합을 복원하기 위해, 주형으로서 CDR-교환으로부터의 DNA를 사용하여 돌연변이체를 구축하였다. 컴퓨터 생성된 모델을 이용하여, 변화가 CDR 입체 형태 또는 항체-항원 계면에 영향을 미칠 수도 있는 위치에서 그들의 뮤린 대응물에 대한 인간 골격 영역 잔기가 변화하도록 이들 돌연변이를 계획하였다. 돌연변이체가 표 2에 나타나 있다 [주: 모든 아미노산 넘버링은 문헌 (Kabat et al., 상기 참고)에서와 같이 표현되었다]. 서열에 대해서는, 도 1 내지 4를 참고할 수 있다.

버젼 3 및 4는 나중 번호를 갖는 인간화 Fab 버젼을 수득하기 위한 중간체로서 사용되었다. 변화물 AlaH49Gly, PheH67Ala, 및 ArgH71Ala를 수반하는 버젼 5는 버젼 709 및 11과 마찬가지로, 본래의 키메라 2G7 Fab 단편의 것에 대해 복원된 결합을 지니고 있는 것으로 여겨진다 (도 5). 버젼 710 및 712는 키메라 단편에 대한 유사한 결합을 나타내는 것으로 예상되지만, 버젼 712는 면역원성 증가 가능성 때문에 바람직하지 않을 수도 있는 부가의 골격 돌연변이를 수반한다. 부가의 FR 또는 CDR 잔기, 예를 들어 L3, L24, L54, 및/또는 H35를 변형시킬 수 있다 (예를 들어, 다음과 같이 치환된다: GlnL3Met, ArgL24Lys, ArgL54Leu, GluH35Ser). 안정성을 증강시키는데 바람직할 수도 있는 치환은, 메티오닌을 루이신 또는 이소루이신으로 치환시켜 산화 반응을 저하시키거나, 또는 CDRs 내의 아스파라긴을 다른 잔기로 변화시켜 탈아미드화 가능성을 감소시키는 것이다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 인간화 항체를 친화성 성숙시켜 (상기 참고) 그의 친화성 및/또는 기타 생물학적 활성을 추가로 개선 또는 정련시킬 수 있다.

키메라 2G7 Fab 뿐만 아니라 인간화 Fab 버젼 5, 709, 및 11의 VL 및 VH 도메인을, 포유류 세포 발현을 위해 앞서 기재된 pRK 벡터 [참고: Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech., 2: 3-10 (1990)] 내로 아클로닝함으로서, 본래 길이의 IgG의 발현을 위한 플라스미드를 구축하였다. 간략하게 언급하면, 각 Fab 구조물을 EcoRV 및 BlpI로 분해시켜 VL 단편을 절제한 다음, 본래 경쇄 (VL-CL 도메인)의 발현을 위해 이를 플라스미드 pDR1의 EcoRV/BlpI 부위 (도 6 참고) 내로 클로닝하였다. 부가적으로, 각 Fab 구조물을 PvuII 및 ApaI로 분해시켜 VH 단편을 절제한 다음, 본래 중쇄 (VH-CH1-CH2-CH3 도메인)의 발현을 위해 플라스미드 pDR2의 PvuII/ApaI 부위 (도 7 참고) 내로 클로닝하였다.

각 IgG 변이체에 대해, 경쇄 발현성 플라스미드와 중쇄 발현성 플라스미드를 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 내로 공동-형질감염시킴으로써 일시적 형질감염을 수행하였다 [참고: Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-74, (1977)]. 간략하게 언급하면, 293 세포를 형질감염시키기 전날 분할시키고, 혈청 함유 배지에 도말하였다. 그 다음 날, 경쇄 및 중쇄의 이본쇄 DNA로부터 인산칼슘 침전물을 pADVANTAGE™ 벡터 DNA (공급처: Promega, Madison, WI)와 함께 제조하고, 상기 판에 적가하였다. 세포를 37℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, PBS로 세척하고 혈청-무함유 배지에서 4일 동안 배양하였는데, 이때 적응용 배지 (conditioned medium)를 수거하였다. 단백질 A-SEPHAROSE CL-4B™ 아가로스를 사용하여 배양 상등액으로부터 항체를 정제한 다음, 완충제를 10 mM 나트륨 석시네이트, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 교환하고, CENTRICON-10™ 미소농축기 (공급처: Amicon)를 사용하여 농축시켰다. 280 nm에서의 흡광도를 측정하거나 정량적 아미노산 분석함으로써 단백질 농도를 측정하였다.

CDRs이 결합에 기여하였는지, CDRs이 활성 상실 없이 인간 생식세포계 카파 유전자 자리의 서열로 복귀될 수 있었는지, 또는 항체의 안정화에 대해 명확하기 위해, hu2G7 버젼 5 IgG에 대한 부가의 변형을 만들었다. 이들은 표 3에 나타낸 바와 같이 명명되었고, 버전 5와 이들 버젼들 간의 아미노산 차이가 제공된다:

인간화 2G7 CDR 돌연변이물의 명칭

돌연변이체 번호	인간 항-TGF-베타 버젼 5와 비교한 바와 같은 CDR 치환물
버젼 5 (V5H.V5L)
H2N1.V5L	Asn51이 CDR H2에서 Ile로 변하는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함
V5H.glL2	CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자 자리 L8/L9/L14/L15의 서열: YASSLQS (서열 39)로 복귀되는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함
V5H.glL1glL2	CDR L1이 인간 생식세포계 카파 유전자 자리 L8/L9의 서열: RASQGISSYLA (서열 37)로 복귀 되고, CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자 자리 L8/L9/L14/L15의 서열: YASSLQS (서열 39)로 복귀되는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함
H2NI.glL1glL2	CDR L1이 인간 생식세포계 카파 유전자 자리 L8/L9의 서열: RASQGISSYLA (서열 37)로 복귀 되고, CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자 자리 L8/L9/L14/L15의 서열: YASSLQS (서열 39)로 복귀되며, Asn51이 CDR H2에서 Ile로 변하는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함

CDR L1에 사용된 생식세포계 서열에 대한 명칭은 문헌 [참고: Cox et al., Eur. J. Immunol., 24: 827-836 (1994)]의 도 4, 및 문헌 [참고: Schable and Zachau, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001-1022 (1993)]의 도 2e에 기재된 바와 같은 L8/L9이다. CDR L2에 대해 사용된 생식세포계 서열은 L8/L9/L14/L15이다 (Cox et al, 상기 참고 및 Schable and Zachau, 상기 참고).

인간 생식세포계 (gl) 카파 유전자 자리의 서열로의 복귀는 모든 CDR's에서 이루어졌지만, 상기 제시된 생식세포계 복귀 돌연변이체 만이 결합을 나타내었다 (도 8 참고). 이 도면으로부터, CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자 자리의 서열로 복귀된 V5H.glL2는 TGF-베타 뿐만 아니라 V5H.V5L과도 여전히 결합한다는 것을 알 수 있다. 2 가지 버젼 V5H.g1L1g1L2 및 H2N1. g1L1g1L2 뿐만 아니라 H2Nl.V5L은 상기 뿐만 아니라 키메라와도 결합하지 않았다.

마우스 혈관사이 세포 증식 분석을 사용하여 대조군 항체와 몇 가지 인간화 항체 (V5H.V5L, V5H.glL2, H2N1.V5L, V5H.glL1glL2, 및 H2N1.glL1glL2)를 시험하였다. 그 프로토콜은 다음과 같다:

1일 째: 마우스 혈관사이 세포를 배지 (95%-태아 소 혈청-5%-14 mM HEPES 완충제가 보충된 햄스 F12 배지와 둘벡코 변형 이글스 배지의 1:3 혼합물)에서 96-웰 판에 도말하고 밤새 성장시켰다.

2일 째: 3 가지 상이한 농도 (100 ng, 10 ng 및 1 ng)를 지닌 TGF-베타, 및 5 가지 상이한 유형의 인간화 TGF 항체 (20 ㎍/ml)를 혈청 무함유 배지에서 희석시키고 세포에 가하였다. 마우스 TGF 항체를 대조군으로서 사용하였다 (2G7).

4일 째: 48시간 항온 배양 후, 20 ㎕의 반응 완충액 [CELLTITER 96 AQUEOUS ONE SOLUTION REAGENT ™ 완충액 (공급처: Promega Inc. Cat number G3580)]을 상기 판의 각 웰에 가하고 2시간 동안 항온 배양하였다. 490 nm에서 흡광도 (OD)를 측정하였다.

H2NI.V5L (20 ㎍/ml)은 1 ng/ml 수준의 TGF-베타에 의해 유도된 세포 억제를 완전히 차단시켰는데, 이는 키메라 마우스 대조군을 이용한 바와 동일한 결과이다 (도 9 참고). 버젼 5 (V5H.V5L) 역시 대조군과 유사하게 세포 억제를 차단시켰다.

각종 인간화 항체를 대상으로 하여, 시험관 내에서 3개의 TGF-베타 중의 하나로 자극시킨 해체된 스위스산 마우스 배야의 섬유아세포로부터의 3T3 세포주를 사용하여 각종 TGF-베타 대 2G7를 중화시키는데 있어서의 그들의 활성을 알아보기 위해 시험한 다음, 그들의 증식을 활성으로서 측정하였다. 그 결과가 도 10 내지 14에 도시되었다. 이들 도면은 인간화 항체 H2Nl.V5L이 대조군 2G7 항체에 비해 활성을 차단하는데 있어 다소 탁월하였다는 것을 지시한다. 시험된 기타 인간화 항체인 H2Nl.glL2 (CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자 자리의 서열로 복귀되었다) 및 V5H.glL2 (CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자 자리의 서열로 복귀되었다)는 필적하는 활성을 보여주었는데, V5H.glL2가 TGF-베타1 내지 TGF-베타3 모두에 대해 최소한 유효하였다.

요약하면, 인간화 항체 V5H.V5L, V5H.glL2, H2Nl.V5L, H2Nl.glL2, 및 버젼 709, 710 및 711이 가장 바람직한 인간화 버젼인데, 이는 이들이 키메라 항체 (chimH.chimL; 2G7 Fab 단편)로서 거의 동등하게 TGF-베타와 결합하고/하거나 TGF-베타를 중화시키거나 또는 시험관 내에서 TGF-베타에 의해 유도된 세포 억제를 차단시키며, 시험된 인간화 항체 모두의 가장 적은 수의 골격 변화를 나타내는데, 이것이 환자에게서 면역 반응의 위험을 최소화시킬 수 있기 때문이다. 또한, H2Nl.V5L이 특히 바람직한 항체인데, 이는 CDR H2 상의 변화로 인해 개선된 안정성을 가질 수도 있고 3 가지 모든 TGF-베타 이소형 (TGF-베타1, 2, 3)의 중화 활성이 명백하게 탁월하기 때문이다. 추가로, 마우스 모노클로날 항체 2G7과 비교해서, 시험관 내에서 3 가지 모든 TGF-베타 리간드의 활성을 차단시킬 수 있는 개선된 능력을 나타내는 본원의 인간화 항체가, TGF-베타-유도된 섬유아세포 증식에 대한 분석에 나타낸 바와 같이 (도 10 내지 14), 범-TGF-베타-유도된 효과를 억제할 수 있는 그들의 탁월한 능력을 통하여 다음의 각종 적응증에 있어 2G7 보다 더 우수하게 작용하는 것으로 예상된다.

실시예 3

재발되거나 난치성인 전립선암의 치료

본 실시예의 항체는 TGF-베타에 대항하는 본래 길이의 인간화 모노클로날 항체 (CHO 세포에서 생성됨)이다. 이는 호르몬-난치성 (안드로겐-비의존성) 전립선암 환자를 치료하기 위한 단일 작용제로서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 단일 작용제로서 사용된 경우에, 이용 가능한 가장 우수한 보호 (미톡산트론/프레드니손)와 비교한 전체 생존, 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 시간-대-질병 진행, 반응 속도, 삶의 질, 통증 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

항체는 또한, 호르몬-난치성 (안드로겐-비의존성) 전립선암 환자를 치료하기 위한 화학요법과 병용해서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 화학요법과 비교한 전체 생존, 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 시간-대-질병 진행, 반응 속도, 삶의 질, 통증 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

전립선암 (예: 안드로겐-비의존성 전립선암)을 치료하기 위해 인간화 항-TGF-베타 항체와 병용할 수 있는 약물의 예에는 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적화 약물 (예: C225 또는 ZD1839); 세포소멸을 유도시키는 HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체, 또는 항-ErbB 항체, 예를 들어 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 또는 친화성-성숙된 변이체 포함); 2C4 또는 인간화 2C4; 또 다른 항-TGF-베타 항체 (예: 모노클로날 TGF-베타 항체); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 항-안드로겐 (예: 플루타미드 또는 시프로테론 아세테이트); 류프롤리드; 수라민; 화학요법제, 예를 들어 빈블라스틴, 에스트라무스틴, 미톡산트론, 리아로졸 (레티노산 대사 차단제), 시클로포스파미드, 안트라사이클린 항생제, 예를 들어 독소루비신, 탁산 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 또는 메토트렉세이트, 또는 이들의 모든 병용물, 예를 들면, 빈블라스틴/에스트라무스틴 또는 시클로포스파미드/독소루비신/메토트렉세이트; 프레드니손; 히드로코르티존; 또는 이들의 병용물이 포함된다. 이들 각종 약물에 대한 표준 용량을 투여할 수 있는데, 예를 들어 매주 40 mg/㎡ 도세탁셀 (TAXOTERE^®); 6 (AUC) 카르보플라틴; 및 200 mg/㎡ 파클리탁셀 (TAXOL^®)을 투여할 수 있다.

TGF-베타는 또한, 전립선암에 밀접한 영향을 미치기 때문에 [참고: Shah et al., Cancer Research, 62: 7135- 7138 (2002)], 성공을 기대하면서 항체를 전립선암 모델 (예: TRAMP 트랜스제닉 마우스 뿐만 아니라 이식된 PC-3 세포)에서 시험할 수 있다.

실시예 4

유방암 치료

본 실시예의 항체는 유방암 환자, 특히 전이성 환자 (이에 제한되지 않는다)를 치료하기 위한 단일 작용제로서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 반응 속도 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 전체 생존, 시간-대-질병 진행, 삶의 질, 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 인간화 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

본 실시예의 인간화 항체는 또한, 유방암 환자를 치료하기 위한 화학요법과 병용해서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 화학요법 단독과 비교한 전체 생존, 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 시간-대-질병 진행, 반응 속도, 삶의 질, 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 인간화 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

유방암 (예: TGF-베타 과발현을 특징으로 하지 않는 전이성 유방암)을 치료하기 위해 인간화 항-TGF-베타 항체와 병용할 수 있는 약물의 예에는 화학요법제, 예를 들어 안트라사이클린 항생제 (예: 독소루비신), 시클로포스파미드, 탁산 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 나벨빈, 크셀로다, 미토마이신 C, 백금 화합물, 옥살리플라틴, 젬시타빈, 또는 이들의 2 가지 이상 병용물, 예를 들면, 독소루비신/시클로포스파미드; 세포소멸을 유도시키는 HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체, 또는 항-ErbB 항체, 예를 들어 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 또는 친화성-성숙된 변이체 포함); 2C4 또는 인간화 2C4; 또 다른 항-TGF-베타 항체 (예: 모노클로날 TGF-베타 항체); 항-에스트로겐 (예: 타목시펜); 아로마타제 억제제 (예: 아나스트로졸); 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적화 약물 (예: C225 또는 ZD1839); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 또는 이들의 병용물이 포함된다. 이러한 부가 약물에 대한 표준 투여량을 사용할 수 있다.

본 실시예의 인간화 항체는 유방암 환자, 특히 전이를 나타내는 유방암 환자를 치료하기 위한 HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체 또는 rhuMAb 2C4와 병용해서 부가적으로 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 반응 속도 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 시간-대-질병 진행, HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체 또는 rhuMAb 2C4 단독과 비교한 전체 생존, 삶의 질, 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, rhuMAb 2C4를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체 rhuMAb 2C4를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다. HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체를 4 mg/kg의 초기 부하 용량으로 정맥내 투여한 다음, 매주 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하였다. HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체는 동결건조된 분말로서 공급되었다. HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체의 각 바이알은 440 mg HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체, 9.9 mg L-히스티딘 HCl, 6.4 mg L-히스티딘, 400 mg α-α 트레할로스 이수화물, 및 1.8 mg POLYSORBATE 20™ 계면활성제를 함유하고 있다. 방부제로서 1.1% 벤질 알코올을 함유하는, 20 ml의 제균성 주사용수 (BWFI)로 재구성하면, 21 mg/mL HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체를 함유하는 21 ml의 다중-용량 용액 (pH 약 6.0)이 산출되었다.

자발적 마우스 유방암의 유방 종양 모델로부터의 4T1 상피 세포에 뮤린 항체 2G7을 사용하여, 세포 (1.5 x 10⁵개)를 마우스의 유방 지방에 접종하였다 (0일째). 이 모델에서는, 촉진할 수 있는 원발성 종양이 1주째에 나타났고; 이차 전이는 2주째에 폐에서 나타났고, 3주째에는 간에서 나타났으며, 4주와 5주 사이에는 뼈에서 나타났다. 5주째에 조직을 수거하였다. 2G7 항체와 2개의 대조군 IgG 항체를 매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 마우스에게 복강내 주사하고, 4T1 세포에 의한 혈청 TGF-베타 생성을 시판용 ELISA (공급처: R&D systems)에 의해 조직 배양 배지 (또는 생체내 연구를 위해서는 혈액)에서 측정하였다.

도 15A는 시험관내 ELISA에 의한 대조군으로서의 정상 마우스 상피 세포 C57 및 4T1 세포에 의한 TGF-베타 생성을 도시한 것이다. 도 15B는 대조군 (Con) 항체 (이소형-매치된 IgG; 항-두드러기쑥 항체)로 처리한 종양을 수반하지 않는 마우스 (-Con)와 비교하고, 대조군 항체로 처리한 종양을 수반한 마우스 (+Con)와 비교한, 종양을 수반한 마우스 (+항-TGF-베타)에서 생체내 4T1 세포에 의한 혈청 TGF-베타 생성에 대한 2G7 항체의 효과를 도시한 것이다. 이들 결과는 4T1 상피 종양 세포가 시험관 내에서 대조군 C57 상피 세포 보다 더 많은 TGF-베타를 생성하였고 (도 15A), 본 실시예에서의 2G7 항체가 대조군 항체로 처리한 종양을 수반한 마우스와 비교해서 순환되는 자유 TGF-베타의 양을 감소시켰다는 것을 나타낸다 (도 15B).

자유 TGF-베타의 혈청 수준은 항-TGF-베타 항체 2G7로 처리한 마우스에서 감소하였는데, 이는 항-TGF-베타 항체가 TGF-베타의 생체내 이용 효율을 변경시킬 수 있다는 기존의 결과와 일치한다 [참고: Wojtowicz-Praga et al., Immunother Emphasis Tumor Immunol., 19(3):160-75 (1996). Erratum in: J Immunother Emphasis Tumor Immunol, 19 (5):386 (1996), Verma UM (corrected to Verma UN)]. 또한, 본 실시예에 사용된 항체 (2G7)는, ELISA 판독치가 비히클을 이용한 경우와 비교해서, 1:10, 1:100 및 1:1000의 희석률로 2G7을 대조군 혈장에 부가하는 것에 의해 전혀 영향을 받지 않았다는 사실로써 입증된 바와 같이 ELISA 분석에서 방해되지 않았다 [참고: Ziyadeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 8015-20 (2000)].

도 16A는 조직학 스코어를 도시한 것이고, 도 16B는 도 15에 관한 설명에 따라 마우스에게 제공된 바와 같은 항-두드러기쑥 IgG 대조군 및 항-TGF-베타 2G7을 이용하여 도 15에 대해 사용된 종양 세포 모델에 의해 생성된 이차 폐 종양에 대한 조직 중량을 도시한 것인데, 이는 항-TGF-베타가 대조군과 비교해서 악성도, 병에 걸린 엽의 수, 조직 중량 (그램), 및 체중 비율로서의 폐 중량을 감소시켰다는 것을 지시한다. 이차 폐 종양은 생체외 컴퓨터 단층촬영 스캐닝에 의해 탐지하였다.

도 17은 종양 용적과 수의 지표인, μCT에 의한 상기 마우스 모델 폐 종양의 정량화를 도시한 것인데, 항-TGF-베타 2G7은 IgG 대조군 보다 낮은 종양 용적을 나타냈고, 2G7과 대조군 둘 다는 도 15에 대한 설명에 따라서 마우스에 제공되었다 (즉, 매주 3회씩 25 mg/kg을 복강내 투여함).

도 18A는 IgG 대조군을 식염수 또는 탁솔과 함께 매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 복강내 세포 주사한 후, 및 항-TGF-베타 2G7을 탁솔과 함께 매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 복강내 세포 주사한 후 시간 (일수)의 함수로서 상기 마우스 모델에서의 종양 용적을 도시한 것인데, 이는 후자가 종양 용적을 감소시키는데 있어 가장 효과적이란 사실을 지시해준다. 도 18B는 항-TGF-베타 항체 2G7을 화학요법과 병용하면, IgG/식염수 대조군과 IgG/화학요법 대조군 둘 다에 비해 조직 중량 (폐, 비장 및 종양)이 감소되었다는 것을 도시한 것이다.

추가로, 2G7 항체는 상기 마우스 모델에서 IgG 대조군에 비해 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 전신 수준을 감소시켰다. 도 19는 대조군 IgG (대조군) 또는 항-TGF-베타 2G7 (aTGF-b)으로 처리한 (대조군 및 항-TGF-베타에 대해 매주 3회씩 25 mg/kg 용량을 복강내 투여함) 4T1 유방 종양을 수반한 마우스, 및 종양을 수반하지 않는 마우스 (정상)에서의 혈장 VEGF 수준 (pg/ml)을 도시한 것이다. 각 점은 개개 마우스를 나타낸다. 막대는 해당 군에 대한 평균을 지시한다.

요약하면, 동계 마우스의 유방 지방체 내로 주사되는, Balb C 마우스에서 자발적 유방 종양 (4T1)으로부터 유래된 상피 세포의 유방암 모델에서는, 2G7 항체가 자유 TGF-베타1의 순환 수준과 전신 VEGF 수준을 감소시켰고, 작은 수준이긴 하지만 대조군에 비해 원발성 종양 성장을 저하시킬 수 있는 상당한 일시적 능력을 지니고 있는 것으로 밝혀졌다. 2G7을 이용하여 초기에 치료하는 것이 이차 폐 종양을 저하시켰다.

추가로, 2G7 항체를 이용하여 초기에 치료하는 것이, 폐에 대한 바와 동일한 스캐닝을 사용하여 알 수 있는 바와 같이, 상기 모델에서 발생하는 유방 종양-유도된 골 파괴를 훨씬 더 극복하게 해주었다 (표 4 참고), 이러한 표에서는, 잔기둥 (trabecular) 수가 잔기둥 (골수강 내로 연장되는 작은 골소극)의 수를 지칭하고, 잔기둥 두께는 이들 잔기둥의 평균 두께를 지칭한다. 이들 파라미터 둘 다는 골의 양을 지시하고, 이는 마이크로-컴퓨터 이용한 단층촬영술과 각종 골 파라미터를 정량화하는 알고리듬을 사용하여 측정하였다 (표 4).

주: 상기 비율은

1) "원발성 종양을 수반하지 않은 2G7" 샘플과 "원발성 종양을 수반한" 샘플에 대해 정상 마우스 (즉, 종양을 수반하지 않음)와 비교한 (상대적) 비율을 지칭하고;

2) "원발성 종양을 수반한 2G7" 샘플에 대해 IgG 대조군 항체로 처리한, 종양을 수반한 마우스와 비교한 (상대적) 비율을 지칭한다.

항체 2G7을 또한, 다음 문헌에 기재된 바와 같이 유방암 모델 (PymT)에서 시험하였다 [참고: Maglione et al., Transgenic Polyoma middle-T mice model premalignant mammary disease, Cancer Res., 61(22):8298-305 (2001) and Lin et al., Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases, Am J Pathol., 163(5):2113-26 (2003)]. 양 항체 [IgG 대조군 (항-두드러기쑥 항체) 및 항-TGF-베타 2G7]를 다음과 같이 투약하였다: 매주 3회씩 25 mg/kg 용량으로 복강내 투여함. 도 20A는 IgG 대조군과 비교한, PymT 모델에서 종양 성장 일수의 함수로서 종양 용적에 대한 항-TGF-베타 2G7의 효과를 도시한 것인데, 이는 2G7 항체가 IgG 대조군에 비해 시간이 지남에 따라 종양 용적을 감소시켰다는 것을 지시해준다. 도 20B는 IgG 대조군에 비해 TGF-베타 항체 2G7를 사용한 경우에 종양 중량이 또한 감소되었다는 것을 도시한 것이다. Her2 종양에 비해 PyMT 종양에서 VEGF 수준이 감소된 것으로 또한 밝혀졌다.

이들 데이터 관점에서 보면, 본 실시예의 2G7 항체의 인간화 버젼이 종양 성장과 전이 측면에서 2G7과 유사하게 작용할 것이다.

4T1 상피 세포와는 달리, Her+ 상피 세포는 시험관 내에서 고수준의 TGF-베타를 합성하지 못하였고, 시험관 내에서 TGF-베타에 의해 성장 억제되었으며 [참고: Siegel et al., Transforming growth factor beta signaling impairs Neu-induced mammary tumorigenesis while promoting pulmonary metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A, 100 (14):8430-5 (2003)], 생체 내에서 항-TGF-베타 처치에 의해 성장 억제되지는 않았다. 더욱이, 항-TGF-베타 항체 2G7을 투여한 경우에는, 상기 모델에서 IgG 대조군에 비해 VEGF 수준이 증가하였다.

기저 막 (콜라겐 IV), 내피 세포 (CD31), 또는 혈관 지지 세포 (혈관 주위세포로 불리운다) (SMA 또는 NG2)에 대한 3 가지 유방 종양 모델 (4Tl, PyMt 및 Her2)을 염색한 결과, 이들 3 가지 성분들 측면에서 이들 모델 시스템 상의 차이가 나타났다. 어느 한 가지 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이들 성분은 항-TGF-베타 처치에 대한 종양의 민감도에 관해 예보할 수 있다.

암에 있어서 TGF-베타의 이기능성 역할 특성이 제안된다면, 환자가 어떻게 반응할 것인지를 측정하기 위한 진단제를 사용하는 것은 암을 치료하기 위해 TGF-베타 억제 전략을 적용하는데 있어 유용할 수 있다. 예를 들어, 소정의 환자의 암 세포가 TGF-베타의 성장 억제 효과에 대해 여전히 민감한지 아닌지를 측정하는 것은 중요할 수 있다.

어느 한 가지 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 다음은 항-TGF-베타 처치에 가장 반응을 잘할 것으로 예상되는 환자/종양을 선별하기 위한 잠재적 진단 마커에 관한 목록인데, 이로써 제한되지는 않는다:

1) 3 가지 TGF-베타 이소형, 즉 TGF-베타1, TGF-베타2 및/또는 TGF-베타3 중에서, 특히 보다 높은 수준으로 발현하는 이소형 (특별히 TGF-베타1에 대한 관심이 집중된다) 중의 한 가지 이상의 발현.

a. 이는 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐암 및 피부암 (흑색종)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상이한 수 많은 유형의 암을 포괄할 것이다. 동일한 조직 유형의 매치된 정상 조직 샘플과 비교해서, 이들 종양 유형에서는 TGF-베타1이 상당한 수준으로 과발현되는 것으로 밝혀졌다.

b. Her2-양성 유방암과는 달리 Her2-음성 유방암은 TGF-베타1의 보다 높은 발현으로써 지시된 바와 같이 항체 처치에 보다 잘 반응할 수있다. 이와 관련하여, 동일한 조직 유형의 매치된 정상 조직 샘플과 비교해서, 이들 종양 유형에서는 TGF-베타1이 상당한 수준으로 과발현되는 것으로 밝혀졌다.

2) #1에 따른 결과로서, TGF-베타가 간질/환경 하에서 또한 만들어지는 지의 여부에 상관없는 종양 세포 생성.

3) 한 가지 이상 TGF-베타 수용체, 특히 TGF-베타l RI 또는 TGF-베타RII (유형-IIR) (이로써 제한되지 않는다) 상의 돌연변이, 및 이의 발현 저하.

4) 다음을 포함하지만 그에 제한되지 않는, TGF-베타 신호 전달 경로 분자의 수준 또는 국재화에 있어서의 돌연변이 또는 변화: SMADs/포스포SMADs, c-myc, CDC25A, pl5INK4B, p21WAFl/CiPl, 및 p27K1P1.

5) 다음을 포함하지만 그에 제한되지 않는, TGF-베타 활성에 영향을 미치는 것으로 공지된 기타 신호 전달 경로 상의 변경: FoxGl, Jagged/Notch, CDK2, 및 CDK4, 및 특히 Her2/neu, 에스트로겐 수용체 수준, Ras 활성, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K), AKT 및 MAPK 활성 뿐만 아니라 p53 상태.

치료하고자 하는 종양을 측정하기 위한 상기 열거된 진단 마커 이외에도, 다음을 포함하지만 그에 제한되지 않는, 처리 전 및 처리 후 환자에게서 항-TGF-베타 항체의 생물학적 활성을 평가하기 위한 (종양 내에서 및/또는 말초에서) 몇 가지 마거를 사용할 수 있다:

1) 종양 내에서의 TGF-베타 수준 또는 순환시 TGF-베타 수준 [이는 도 15B에 의해 도시된 바와 같을 뿐만 아니라, 종양 이종이식편 Colo205 및 Calu6 종양, HPAC 종양, 및 관상 유방 선암종의 인간 종양 샘플의 염색된 조직 박편 내에서의 TGF-베타1 단백질 발현을 나타내는 면역조직화학 (IHC) 데이터로써 제시된 바와 같다].

2) 종양 내에서의 VEGF 수준 또는 순환시 VEGF 수준 [이는 도 19에 의해 도시된 바와 같고, 2G7이 제공된 경우에는 Her2-양성 모델에서의 VEGF 수준이 대조군에 비해 증가된다는 것을 나타내는 데이터로써 제시된 바와 같다].

3) 종양 내에서 및/또는 말초 세포, 예를 들어 혈액 단핵 세포 (BMCs)에서, TGF-베타 신호 전달 경로 내의 분자 (예: SMAD/포스포SMAD) 수준.

4) 면역 세포 기능, 특히 NK, T-세포, 및 대식세포 활성의 지표.

실시예 5

폐암 치료

본 실시예의 인간화 항체는 제IIIb 병기 또는 제IV 병기 비-소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하기 위한 단일 작용제로서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 반응 속도 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 전체 생존, 시간-대-질병 진행, 삶의 질, 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 인간화 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

이러한 인간화 항체는 또한, 전이성 비-소세포 폐암 환자를 치료하기 위한 화학요법과 병용해서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 표준 요법 비교한 전체 생존, 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 시간-대-질병 진행, 반응 속도, 삶의 질, 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 인간화 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

폐암을 치료하기 위해 본 실시예의 항체와 병용할 수 있는 부가 약물의 예에는 화학요법제, 예를 들어 카르보플라틴, 탁산 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 젬시타빈, 나벨빈, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 또는 이들의 병용물, 예를 들면, 카르보플라틴/도세탁셀; 세포소멸을 유도시키는 HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체, 또는 항-ErbB 항체, 예를 들어 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 또는 친화성-성숙된 변이체 포함); 2C4 또는 인간화 2C4; 또 다른 항-TGF-베타 항체 (예: 모노클로날 TGF-베타 항체); 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적화 약물 (예: C225 또는 ZD1839); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 또는 이들의 병용물이 포함된다.

실시예 6

결장직장암 치료

본 실시예의 인간화 항체는 전이성 결장직장암을 치료하기 위한 단일 작용제로서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 반응 속도 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 전체 생존, 시간-대-질병 진행, 삶의 질, 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 인간화 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

이러한 인간화 항체는 또한, 전이성 결장직장암 환자를 치료하기 위한 화학요법과 병용해서 지시된다. 효능에 대한 일차 종점에는 표준 요법 비교한 전체 생존, 및 안전성이 포함된다. 이차 효능 종점에는 시간-대-질병 진행, 반응 속도, 삶의 질, 및/또는 반응 기간이 포함된다. 질병이 진행될 때까지, 인간화 항체를 매주 또는 3주 마다 각각 2 또는 4 mg/kg씩 정맥내 (IV) 투여하였다. 항체를 다중-용량 액상 제형 (20 mg/mL 이상의 농도로 20-mL 충진시킴)으로서 공급한다.

TGF-베타와 결합하는 인간화 항체와 병용할 수 있는, 결장직장암을 치료하는데 사용되어 온 화학요법제의 예에는 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린 (LV), CPT-11, 레바미솔, 또는 이들 2 가지 이상의 병용물, 예를 들면, 5-FU/LV/CPT-11이 포함된다. 이러한 화학요법제의 표준 투여량을 투여할 수 있다. 결장직장암을 치료하기 위해 항-TGF-베타 항체와 병용할 수 있는 기타 약물에는 파르네실 트랜스퍼라제 억제제; 항혈관형성제 (예: 항-VEGF 항체); EGFR-표적화 약물 (예: C225 또는 ZD1839); 사이토킨 (예: IL-2, IL-12, G-CSF 또는 GM-CSF); 세포소멸을 유도시키는 HERCEPTIN^® 항-HER-2 항체, 또는 항-ErbB 항체, 예를 들어 7C2 또는 7F3 (그의 인간화 또는 친화성-성숙된 변이체 포함); 2C4 또는 인간화 2C4; 또 다른 항-TGF-베타 항체 (예: 모노클로날 TGF-베타 항체); 또는 이들의 병용물이 포함된다.

결장암에 있어서 TGF-베타의 가능한 역할이 제공된다면, 상기 항체를 결장 암 모델 (예: HT29 및 HCT116)에서 시험하고 연구할 수 있을 것으로 예상된다.

실시예 7

흑색종 치료

본 실시예에서 모노클로날 항체 2G7을 사용한 결과는, 본 실시예의 인간화 항체가 악성 흑색종을 치료하는데 유용할 것이란 사실을 제안하였다. 뮤린 항-TGF-베타1 항체 2G7을 흑색종 동물 모델에서 시험하였다. 구체적으로 언급하면, 마우스 흑색종 세포 (B16F10 또는 B16B16)를 피하 주사한 동계 C57black6 마우스에게 항-TGF-베타 (2G7)을 매주 3회씩 25 mg/kg 용량으로 복강내 처치하면, 이소형 매치된 IgG 대조군 (항-두드러기쑥 항체)을 이용한 처치 (매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 복강내 투여함)와 비교해서 원발성 종양 크기가 감소되었다 (도 22, 24 및 25). 이러한 B16 모델에서는, 항-TGF-베타 2G7 처치가 또한, 각각의 종양 정량화 방법, 즉 표면 계수법 ("표면"), 조직학적 조사 ("병리학"), 조직을 투명하게 ("클리어됨") 만든 후 가시적인 모든 종양의 정량화, 또는 마이크로컴퓨터를 이용한 단층촬영술 ("CT")를 사용하는 방법에 대해 (도 23 및 26 참고) , 대조군에 비해 폐 종양을 수반한 마우스의 비율 (즉, 폐 종양 발생수)을 감소시키고 (도 21A), 폐 종양 수를 감소시켰다 (도 21B).

Calu-6 (인간 비-소세포 폐암종) 종양 세포 [공급처: American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA]가 시험관 내에서 TGF-베타를 생성시키는 것으로 밝혀졌다. Calu-6 CM 세포는 시험관내 섬유아세포에서의 VEGF 및 SMA 발현을 유도시켰는데, 그 효과는 뮤린 항-TGF-베타 2G7 항체로 처치함으로써 억제되었다. 이들 결과는, 어느 한 가지 이론에 얽매이는 것은 아니지만, TGF-베타가 종양 환경 하에서 간질 세포의 활성화에 관여할 수 있다는 것을 제안한다. 이들 세포의 이종이식체를 누드 마우스에서 만들고 [참고: Gourdeau et al., Mol Cancer Ther., 3:1375-1384 (2004)], 항-VEGF 항체 (A461) (매주 3회씩 5 mg/kg의 용량으로 복강내 투여함), 뮤린 항-TGF-베타 항체 2G7 (매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 복강내 투여함), 및 2G7과 A461의 병용물 (상기와 같은 투약)과 함께, 상기 B16 실험에 사용된 대조군 IgG2b 항체 (매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 복강내 투여함)로 처치한 후, 종양 용적을 시험하였다. 도 27 및 28에 각각 도시된 종양 용적 및 종양 중량 결과는 2G7과 항-VEGF 항체의 병용물이 가장 탁월한 치료를 나타냈고, 그 다음으로 2G7 항체가 우수한 치료를 나타냈다는 사실을 지시해준다. 이들 결과는 상기 두 항체 (항-TGF-베타 및 항-VEGF)가 서로 상승적이고/이거나 부가적이란 사실을 나타낸다.

이들 데이터에 기초하면, 본 실시예의 인간화 항체가 악성 흑색종에 관여하는 원발성 종양과 이차 종양을 저하시킬 것으로 예상된다. 구체적으로 언급하면, 인간화 항체 H2NI.V5L을 두 모델에서 시험할 수 있는데, 여기서는 뮤린 항체 2G7을 이용한 효능을 나타내었다:

1) 마우스 흑색종 세포 (B16)를 동계 마우스 내로 주입한 모델; 및

2) Calu-6 (인간 NSCLC) 종양 세포를 이종이식체로서 누드 마우스 내로 주입한 모델.

B16 모델에서는, 세포를 마우스 내로 피하 이식하였다. 양 모델에서는, 촉진 가능한 종양이 존재하게 되면, H2NI.V5L을 포함한 각종 항-TGF-베타 항체 (매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 투여함) 또는 대조군 항체 (매주 3회씩 25 mg/kg의 용량으로 투여함)를 이용한 치료를 시작하였다. 종양을 매주 2 내지 3회씩 측정하였다.

모든 항체를 시험하기에 앞서, TGF-베타-유도된 섬유아세포 (NIH3T3) 세포 성장을 억제할 수 있는 H2NI.V5L의 능력을 확인하였다.

H2NI.V5L의 마우스 Fc 부분이 마우스에서의 활성에 요구되지 않는다면, H2NI.V5L이 마우스에서 본래 마우스 모노클로날 2G7과 동일하거나 이보다 더 우수한 활성을 지닐 것으로 예상된다. 상기 항체의 마우스 Fc 부분이 마우스에서의 활성에 요구되는 경우에는, H2NI.V5L이 마우스 연구에서 본래의 마우스 모노클로날 2G7과 마찬가지로 유효할 것으로 예상되지 않는다. 그러나, H2NI.V5L (및 본원에 청구된 바와 같은 기타 인간화 항체)는 인간에게서는 여전히 유효할 것으로 예상되는데, 이는 인간 Fc가 인간에게서 활성을 나타낼 것이기 때문이다.

실시예 8

정상 및 종양 보유 마우스에서 2G7 항체의 약물동력학

본 실시예의 목적은 정상 마우스 대 종양 보유 마우스에서 뮤린 항-TGF-베타 2G7의 약동학적 (PK) 특징을 평가하기 위한 것이다.

연구 계획:

동물 모델은 4T1-세포 유도된 유방 종양을 보유하고 있는 Balb/c 마우스였다. 43 mg/kg을 4 가지 군에게 1회 투약하였다:

● 군 1: 종양을 보유하고 있지 않는 마우스 (정맥내)

● 군 2: 종양을 보유하고 있는 마우스 (정맥내)

● 군 3: 종양을 보유하고 있는 마우스 (복강내)

● 군 4: 종양을 보유하고 있는 마우스 (피하)

N = 3 마리 마우스 (한 무리당 한 시점당). 각 마우스를 3회 출혈시켰다.

5, 15, 30, 60분; 3, 6, 24시간; 3, 7, 10, 14, 21일 째에 뮤린 항-TGF-베타 ELISA에 대한 혈청을 수집하였다.

결과:

본 결과는 뮤린 항-TGF-베타의 제거 프로파일이 정상 마우스 보다는 종양 보유 마우스에서 보다 신속하게 나타났다는 것을 제시한다. 추가로, 본 발명의 항체를 복강내 및 피하 투여 경로로 투여한 후에 95% 초과의 생체내 이용 효율이 나타났다. 종양 보유 마우스에서의 반감기는 2 내지 3일이었다.

따라서, 2G7 항체에 대한 PK 프로파일은 허용 가능한 것으로 나타났다. 정상 마우스에서는, 항체의 반감기가 4일이었는데, 이는 정상 마우스에서의 기타 항체 및 융합 단백질에 대해 관찰된 범위 내이다. 종양 보유 마우스에서는, 항체 클리어런스가 약 2배 정도 더 신속하였는데, 이는 이러한 용량 수준에서는 특정 요인인 것으로 예상되지 않는다. 95% 초과의 생체내 이용 효율은 복강내 또는 피하 투여가 요법에 적당한 경로란 사실을 지시해준다. 2 내지 3일의 반감기는 매주 2 내지 3회 투약 처방을 뒷받침해준다.

관련 출원

본 출원은 2004년 3월 31일자로 출원된 미국 가출원 제60/558,290호에 대해 35 U.S.C. 119조하에서 우선권을 주장하고, 그 내용이 본원에 참고로 도입된다.

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<210> 45 <211> 6135 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 45 attcgagctc gcccgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 50 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 100 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 150 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 200 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 250 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 300 taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 350 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 400 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 450 atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 500 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 550 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg 600 tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 650 tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc 700 attggaacgc ggattccccg tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag 750 agtctatagg 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1600 caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc 1650 ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 1700 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac 1750 cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 1800 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1850 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta 1900 ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca 1950 aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 2000 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac 2050 cctgccccca tcccgggaag agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 2100 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 2150 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc 2200 cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt 2250 ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 2300 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgagtgcg 2350 acggccctag agtcgacctg cagaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 2400 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 2450 acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 2500 catcaatgta tcttatcatg tctggatcga tcgggaatta attcggcgca 2550 gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt 2600 ctgaggcgga aagaaccatc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa 2650 agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 2700 tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 2750 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 2800 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 2850 catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 2900 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct 2950 tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 3000 gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 3050 ccccccttcg ccagttggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 3100 ttcccaacag ttgcgtagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt 3150 ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac 3200 catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt 3250 acgcgcagcg 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ggaagagtat 4100 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 4150 gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 4200 gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 4250 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 4300 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgatgacgcc 4350 gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 4400 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 4450 gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 4500 ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 4550 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4600 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc agcagcaatg 4650 gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 4700 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 4750 ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 4800 gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 4850 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 4900 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 4950 cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 5000 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 5050 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 5100 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 5150 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 5200 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 5250 agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 5300 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 5350 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 5400 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 5450 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 5500 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 5550 agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 5600 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 5650 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 5700 gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 5750 ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg 5800 attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 5850 cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 5900 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 5950 ccaactggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 6000 gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 6050 tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6100 acacaggaaa cagctatgac catgattacg aatta 6135 <210> 46 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> Unsure <222> 2 <223> Unknown base <400> 46 cncaat 6 <210> 47 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 47 aataaa 6

Claims (58)

1. 인간 가변 중쇄 (V_H) 도메인 내로 혼입된 비-인간 초가변 영역 잔기를 포함하는 V_H 도메인을 포함하고, 이러한 가변 도메인이 48, 49, 67, 69, 71, 73, 및 78로 이루어진 군 중에서 선택된 위치 [문헌 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에 제시된 넘버링 시스템을 이용]에서 서열 6 내의 골격 영역 (FR) 치환을 포함하는 TGF-베타와 결합하는 인간화 항체.
2. 제1항에 있어서, 위치 49, 67 및 71에서 FR 치환을 포함하는 인간화 항체.
3. 제2항에 있어서, 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 67에서 페닐알라닌이 알라닌으로 변화되며, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화된 인간화 항체.
4. 제1항에 있어서, 위치 48, 49 및 71에서 FR 치환을 포함하는 인간화 항체.
5. 제4항에 있어서, 위치 48에서 발린이 이소루이신으로 변화되고, 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되며, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화된 인간화 항체.
6. 제1항에 있어서, 위치 49, 69 및 71에서 FR 치환을 포함하는 인간화 항체.
7. 제6항에 있어서, 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 69에서 이소루이신이 루이신으로 변화되며, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화된 인간화 항체.
8. 제6항에 있어서, 추가적인 FR 치환이 위치 73에서 일어난 인간화 항체.
9. 제8항에 있어서, 위치 73에서 아스파라긴이 리신으로 변화된 인간화 항체.
10. 제1항에 있어서, 위치 49, 71 및 73에서 FR 치환을 포함하는 인간화 항체.
11. 제10항에 있어서, 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화되며, 위치 73에서 아스파라긴이 리신으로 변화된 인간화 항체.
12. 제1항에 있어서, 위치 49, 71 및 78에서 FR 치환을 포함하는 인간화 항체.
13. 제12항에 있어서, 위치 49에서 알라닌이 글리신으로 변화되고, 위치 71에서 아르기닌이 알라닌으로 변화되며, 위치 78에서 루이신이 알라닌으로 변화된 인간화 항체.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 가변 경쇄 (V_L) 도메인 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 RASQSVLYSSNQKNYLA (서열 36) 또는 RASQGISSYLA (서열 37); WASTRES (서열 38) 또는 YASSLQS (서열 39); 및 HQYLSSDT (서열 40)을 포함하는 인간화 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 가변 경쇄 (V_L) 도메인 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 RASQSVLYSSNQKNYLA (서열 36); WASTRES (서열 38); 및 HQYLSSDT (서열 40)을 포함하는 인간화 항체.
16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 3의 V_L 도메인 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체.
17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, V_H 도메인 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 GYAFTNYLIE (서열 41); VNNPGSGGSNYNEKFKG (서열 42) 또는 VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및 SGGFYFDY (서열 44)을 포함하는 인간화 항체.
18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, V_H 도메인 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 GYAFTNYLIE (서열 41); VNNPGSGGSNYNEKFKG (서열 42); 및 SGGFYFDY (서열 44)을 포함하는 인간화 항체.
19. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, V_H 도메인 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 GYAFTNYLIE (서열 41); VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및 SGGFYFDY (서열 44)을 포함하는 인간화 항체.
20. 제1항 내지 제3항 또는 제14항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 4의 V_H 도메인 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체.
21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 본래의(intact) IgG1 항체인 인간화 항체.
22. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 단편인 인간화 항체.
23. 제22항에 있어서, Fab 단편인 인간화 항체.
24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포독성제와 접합되지 않은 인간화 항체.
25. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포독성제와 접합된 인간화 항체.
26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항의 인간화 항체와 담체를 포함하는 조성물.
27. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항의 인간화 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
28. 제27항의 핵산을 포함하는 벡터.
29. 제27항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
30. 제29항의 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키고 인간화 항체를 생성하는 것을 포함하는 인간화 항체의 생성 방법.
31. 제30항에 있어서, 숙주 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 항체가 숙주 세포 배양 배지로부터 회수되는 방법.
33. 제30항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양하기 전에, 숙주 세포를 가변 중쇄 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 가변 경쇄 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 공동-형질감염시키는 방법.
34. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항의 인간화 항체의 유효량을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 TGF-베타 질환의 치료 방법.
35. 제34항에 있어서, 포유류가 영장류인 방법.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
37. 제34항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 질환이 섬유증, 동맥 손상, 감염, 류마티스성 관절염, 또는 암인 방법.
38. 제37항에 있어서, 암이 결장암, 결장직장암, 직장암, 폐암, 유방암, 난소암 또는 악성 흑색종인 방법.
39. 제34항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체 이외의 치료제의 유효량을 포유류에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 치료제가 화학요법제, 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제, 항혈관형성제, 또는 항체인 방법.
41. 제40항에 있어서, 치료제가 항혈관형성제인 방법.
42. 제39항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제가 항체인 방법.
43. 제42항에 있어서, 항체가 혈관 내피 성장 인자에 결합하는 방법.
44. 제42항에 있어서, 항체가 Her-2 항원에 결합하는 방법.
45. 제42항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 본래의 항체인 방법.
46. 제42항 내지 제44항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
47. 제46항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편인 방법.
48. 제42항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 세포독성제와 접합되는 방법.
49. 제42항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 세포독성제와 접합되지 않는 방법.
50. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항의 인간화 항체를 신체 샘플과 접촉시키고 TGF-베타에 대한 항체 결합이 일어나는지 여부를 측정하는 것을 포함하는 신체 샘플에서 TGF-베타의 탐지 방법.
51. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항의 인간화 항체를 담은 용기와, 유효량의 항체로 포유류에서 TGF-베타 질환을 치료하도록 사용자에게 지시하는 설명서를 포함하는 제조품.
52. 제51항에 있어서, 인간화 항체 이외의 치료제를 담은 용기를 부가적으로 포함하며, 설명서는 유효량의 치료제와 병용하여 항체로 질환을 치료하도록 사용자에게 지시하는 것인 제조품.
53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 포유류가 인간인 제조품.
54. 혈관 내피 성장 인자에 결합하는 항체와 TGF-베타 항체의 유효량을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 암의 치료 방법.
55. 제54항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
56. 제54항 또는 제55항에 있어서, TGF-베타 항체가 TGF-베타1, TGF-베타2 및 TGF-베타3 중의 하나 이상에 결합하는 방법. .
57. 제54항 내지 제56항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 TGF-베타1에 결합하는 방법.
58. 제54항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체가 TGF-베타1 및 TGF-베타2에 결합하는 방법.