ES2823033T3 - Ensayo basado en células para detectar homodímeros anti-CD3 - Google Patents

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Abstract

Un metodo para detectar homodimeros anti-CD3 en una composicion que comprende un anticuerpo biespecifico dependiente de linfocitos T (TDB) en donde el anticuerpo biespecifico comprende un fragmento de union al antigeno diana y un fragmento de union a CD3, comprendiendo el metodo poner en contacto una poblacion de linfocitos T con la composicion, en donde los linfocitos T comprenden acido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un elemento de respuesta que es sensible a la activacion de linfocitos T y en donde la poblacion de linfocitos T no comprende el antigeno diana, en donde la expresion del indicador indica la presencia de homodimeros anti-CD3.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo basado en células para detectar homodímeros anti-CD3
Campo de la invención
La presente invención proporciona métodos para analizar preparaciones de anticuerpos multiespecíficos en donde al menos un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo multiespecífico se une a CD3. En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para determinar la presencia de homodímeros anti-CD3 en una composición de uno o más anticuerpos multiespecíficos en donde al menos un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo multiespecífico se une a CD3.
Antecedentes de la invención
Los anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T (TDB, por sus siglas en inglés) están diseñados para unirse a un antígeno diana expresado en una célula y para unirse a linfocitos T, con frecuencia mediante la unión de la subunidad CD3e del receptor de linfocitos T. La unión del anticuerpo biespecífico a los dominios extracelulares tanto del antígeno diana como del CD3 de los linfocitos T da como resultado el reclutamiento de los linfocitos T por las células diana, lo que da como resultado la activación de los linfocitos T y el agotamiento de las células diana. En ausencia de la célula diana, el brazo sencillo anti-CD3 no es capaz de reticular los TCR para inducir la activación de los linfocitos T y la destrucción de las células diana. El homodímero anti-CD3 es una impureza relacionada con el producto que se forma durante el proceso de fabricación de anticuerpos TDB y es capaz de reticular el TCR e inducir un nivel bajo de activación de linfocitos T en presencia o ausencia de células diana. El homodímero anti-CD3 también puede afectar la eficacia terapéutica si está presente en niveles altos, lo que puede dar como resultado una disminución de la potencia biológica de los TDB in vitro. El homodímero anti-CD3 puede tener efectos inespecíficos al inducir un nivel bajo de activación de linfocitos T y citocinas inflamatorias por parte de los linfocitos T en ausencia de células diana. Por lo tanto, es deseable controlar los niveles de variantes relacionadas con el producto activador de linfocitos T presentes en el proceso de fabricación de TDB y se necesita un método de ensayo de impurezas sensible, reproducible y cuantitativo para detectar homodímeros anti-CD3 que pueden estar presentes en el producto purificado con el fin de apoyar el desarrollo de un fármaco clínico candidato seguro y eficaz.
Los ensayos de impurezas deben poder distinguir entre la impureza relacionada con el producto/proceso y el producto deseado. Muchos enfoques tradicionales para la detección de impurezas de proteínas de Células de Ovario de Hámster Chino (CHOP, por sus siglas en inglés) utilizan un enfoque de formato de ensayo de unión, donde la presencia de proteínas CHO relacionadas con el proceso se puede detectar con sensibilidad en el producto para evaluar la pureza y seguridad del producto. Estos anticuerpos de CHOP son específicos para las proteínas CHOP, pero no reconocen el producto, por lo que, en general, no hay ningún impacto en la detección sensible de impurezas en presencia del producto final. Se podrían utilizar enfoques similares para anticuerpos biespecíficos, siempre que puedan identificarse anticuerpos que distingan entre el producto final y la impureza. La implementación de un formato de ensayo de unión de homodímeros anti-CD3 útil requeriría el desarrollo de anticuerpos altamente especializados, lo que puede no ser posible para este antígeno u otros biespecíficos en general. Métodos alternativos basados en fisicoquímica (RP-HPLC, Mass Spec) también se puede utilizar para detectar impurezas relacionadas con el producto y confiar en la capacidad de separar adecuadamente las impurezas relacionadas con el producto del producto, y así detectar la cantidad de impureza presente. La cantidad de impureza se detecta en relación con las otras especies presentes en el material, o añadiendo un patrón variante y comparando el porcentaje de material presente con el patrón añadido. Sin embargo, muchos de estos métodos pueden implicar etapas adicionales de manipulación y procesamiento de muestras para separar la variante del material del producto deseado y estas etapas pueden alterar el material o limitar la sensibilidad y precisión del método. Además, también es deseable saber que las isoformas estructurales de cualquier impureza relacionada con el producto de homodímeros anti-CD3, que puede estar presente en el artículo de prueba biespecífico (producto purificado, DS, DP, muestra de estabilidad, muestra de estrés) u otras posibles impurezas que activan los linfocitos T, son biológicamente activos con el fin de asignar un riesgo apropiado a la impureza. El nuevo enfoque de ensayo con homodímeros anti-CD3 descrito en el presente documento usa un enfoque basado en células para detectar impurezas de homodímeros anti-CD3 biológicamente activos y, por lo tanto, evita los desafíos y limitaciones para la detección de impurezas de homodímeros en preparaciones biespecíficas usando ensayos de unión o formatos basados en fisicoquímica.
Stel A. et al., J. Immunol., vol. 173, n.° 10, Noviembre de 2004, páginas 6009-6016 demuestra el papel de la coestimulación de linfocitos T mediada por linfocitos B en la eficacia del anticuerpo biespecífico de redireccionamiento de linfocitos T BIS20x3 usando la línea de linfocitos T con indicador NFAT-luciferasa Jurkat AMIT. La activación de los linfocitos T se determinó cuantitativamente midiendo la actividad luciferasa.
Sun L.L. et al., Sci. Translat. Med., vol. 7, N.° 287, 287ra70, 13 de mayo de 2015, páginas 1-10 describe la generación y las pruebas preclínicas de un anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB) antiCD20/CD3 para redirigir los linfocitos T a neoplasias malignas de linfocitos B CD20 positivos para el tratamiento de neoplasias malignas de linfocitos B. La composición de TDB obtenida está libre de homodímeros o agregados multivalentes significativos que podrían conducir a una seguridad inaceptable a través de la activación de linfocitos T inespecíficos.
Brischwein K. et al., J. Immunother., vol. 30, n.° 8, Noviembre de 2007, páginas 798-807 divulga formas monoméricas y dimerizadas de construcciones de anticuerpos monocatenarios biespecíficos. Las moléculas con 2 brazos de unión a CD3 pueden activar los linfocitos T de una manera independiente de las células diana, mientras que incluso concentraciones muy elevadas de aglutinantes de CD3 monovalentes como se usan en moléculas BiTE no tienen esa actividad.
Junttila T.T. et al., Cancer Res., vol. 74, n.° 19, Octubre de 2014, páginas 5561-5571 divulga la generación y purificación del anticuerpo biespecífico HER2-CD3 de longitud completa (HER2-TDB) y demuestra su capacidad para dirigirse a HER2 y activar linfocitos T, así como su eficacia antitumoral. La cromatografía de exclusión por tamaño mostró un bajo nivel de agregación y el análisis por espectrometría de masas mostró un pico de deconvolución de masa principal correspondiente al heterodímero con una ausencia de cantidades significativas de cualquiera de los homodímeros.
Sumario
La invención proporciona métodos para detectar homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB) en donde el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método poner en contacto una población de linfocitos T con la composición, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana, en donde la expresión del indicador indica la presencia de homodímeros anti-CD3.
En algunas realizaciones de la realización anterior, el indicador es luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, una beta lactamasa o una beta galactosidasa. En realizaciones adicionales, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de los linfocitos T es un promotor NFAT, un promotor AP-1, un promotor NPkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor IRF. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T comprende elementos sensibles a la activación de los linfocitos T de uno o más de NFAT, AP-1, NPkB, FOXO, STAT3, STAT5 y IRF.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la población de linfocitos T es población de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+. En algunas realizaciones, la población de linfocitos T es la población de linfocitos T Jurkat o linfocitos T CTLL-2.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la población de linfocitos T se pone en contacto con una composición que comprende el anticuerpo biespecífico a una concentración que varía de 0,01 ng/ml a 50 ng/ml. En algunas realizaciones, el indicador se detecta después de una o más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 o 24 horas después de poner en contacto las células con la composición.
En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para cuantificar la cantidad de anticuerpos homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB en la que el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método poner en contacto la población de linfocitos T con la composición a una o más concentraciones del TDB, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana, correlacionar la expresión del indicador en función de la concentración de anticuerpos con una curva patrón generada al poner en contacto los linfocitos T con diferentes concentraciones de homodímeros anti-CD3 purificados.
En algunas realizaciones de las anteriores, que cuantifican la cantidad de anticuerpos homodímeros anti-CD3 en una composición, el indicador es luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, beta lactamasa o una beta galactosidasa. En realizaciones adicionales, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa.
En algunas realizaciones de las anteriores, que cuantifican la cantidad de anticuerpos homodímeros anti-CD3 en una composición, el indicador es luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, una beta lactamasa o una beta galactosidasa. En realizaciones adicionales, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de los linfocitos T es un promotor NFAT, un promotor AP-1, un promotor NPkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor IRF. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T comprende elementos sensibles a la activación de los linfocitos T de uno o más de NFAT, AP-1, NFkB, FOXO, STAT3, STAT5 y IRF.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la población de linfocitos T es población de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+. En algunas realizaciones, la población de linfocitos T es la población de linfocitos T Jurkat o linfocitos T CTLL-2.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la población de linfocitos T se pone en contacto con una composición que comprende el anticuerpo biespecífico a una concentración que varía de 0,01 ng/ml a 50 ng/ml. En algunas realizaciones, el indicador se detecta después de una o más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 o 24 horas después de poner en contacto las células con la composición.
En algunos aspectos, la invención proporciona un linfocito T modificado por ingeniería para la detección de homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un anticuerpo biespecífico donde el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, en donde el linfocito T comprende un indicador unido operativamente a un elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T; en donde el elemento de respuesta es como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones del aspecto anterior, el linfocito T comprende un indicador en donde el indicador es una luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, beta lactamasa o una beta galactosidasa. En realizaciones adicionales, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa.
En algunas realizaciones de la realización anterior, el linfocito T comprende un indicador en donde el indicador es una luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, una beta lactamasa o una beta galactosidasa. En realizaciones adicionales, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de los linfocitos T es un promotor NFAT, un promotor AP-1, un promotor NPkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor |Rf . En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T comprende elementos sensibles a la activación de los linfocitos T de uno o más de NFAT, AP-1, NFkB, FOXO, STAT3, STAT5 y IRF.
En algunas realizaciones de las realizaciones anteriores, la población de linfocitos T es población de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+. En algunas realizaciones, la población de linfocitos T es la población de linfocitos T Jurkat o linfocitos T CTLL-2.
En algunos aspectos, la invención proporciona un kit para la detección de homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un anticuerpo biespecífico donde el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, en donde el kit comprende un linfocito T modificado por ingeniería de la invención.
En algunas realizaciones, el kit comprende además un patrón de ensayo de homodímeros anti-CD3 y/o un control de homodímeros anti-CD3.
En algunas realizaciones de los kits anteriores, el indicador es luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, beta lactamasa o una beta galactosidasa. En realizaciones adicionales, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa.
En algunas realizaciones de los kits anteriores, el indicador es luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, una beta lactamasa o una beta galactosidasa. En realizaciones adicionales, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de los linfocitos T es un promotor NFAT, un promotor AP-1, un promotor NPkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor IRF. En algunas realizaciones, el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T comprende elementos sensibles a la activación de los linfocitos T de uno o más de NFAT, AP-1, NFkB, FOXO, STAT3, STAT5 y IRF.
En algunas realizaciones de los kits anteriores, la población de linfocitos T es población de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+. En algunas realizaciones, la población de linfocitos T es la población de linfocitos T Jurkat o linfocitos T CTLL-2.
Breve descripción de los dibujos
Las Fig. 1A y 1B muestran que un TDB de CD20 (aCD20 (Mab2; VH SEQ ID NO: 31/VL SEQ ID NO: 32)/aCD3 (Mab1; VH SEQ ID NO: 19/VL SEQ ID NO: 20)) necesita células diana que expresan el antígeno CD20 para inducir la activación de los linfocitos T y la destrucción de las células diana. La Fig. 1A muestra la activación de células CD8+ según lo medido mediante la expresión de CD69 y CD25. Los círculos representan muestras que incluyen las células diana y los cuadrados representan muestras que contienen linfocitos T, pero no células diana. La Fig. 1B muestra la destrucción de las células diana en presencia de linfocitos T (círculos) o en muestras en las que los linfocitos T CD3+ se agotaron del grupo de PBMC (cuadrados).
La Fig. 2 muestra que los homodímeros anti-CD3 pueden activar los linfocitos T de donantes humanos. Se trataron PBMC humanas de dos donantes diferentes con cantidades crecientes de homodímeros anti-CD3 purificados (triángulos) o TDB de CD20 (círculos). La activación de los linfocitos T se midió mediante el % de células CD69+ en la población de células CD8+ humanas. La CE50 para TDB de CD20 fue de 5,5 ng/ml para las células del Donante 1 y 4,4 ng/ml para las células del Donante 2. La CE50 para el homodímero anti-CD3 fue 526 ng/ml para las células del Donante 1 y 169 ng/ml para las células del Donante 2.
La Fig. 3A muestra que un homodímero anti-CD3 puede disminuir la potencia de TDB de CD20. Se añadió TDB de CD20 con diversas cantidades de homodímero anti-CD3 y se midieron las respuestas de células diana (cuadrados) y linfocitos T (diamante). La Fig. 3B muestra que los niveles bajos de homodímero anti-CD3 añadido a TDB de CD20 no reducen significativamente la activación de los linfocitos T CD8+ (panel izquierdo) o la activación de los linfocitos T CD4+ (panel derecho). TDB de CHO representado por círculos, TDB de CHO HD al 2,5% representado por cuadrados y TDB de CHO HD al 5 %representado por triángulos.
La figura 4A muestra que el homodímero anti-CD3 puede activar débilmente los linfocitos T CD8- humanos de varios donantes humanos en ausencia de células diana. Las Fig. 4B-4E muestran que la activación del homodímero anti-CD3 de los linfocitos T humanos muestra una tendencia dependiente de la dosis para el aumento de algunas citocinas representativas. Se ha representado gráficamente la respuesta media del nivel medio de citocinas.
La Fig. 5A muestra que la activación de los linfocitos T por el homodímero anti-CD3 se puede controlar usando un ensayo de gen indicador. La línea celular de linfocitos T CD4+ se modificó por ingeniería genéticamente para expresar de manera estable el gen indicador de luciferasa de luciérnaga impulsado por varios elementos de respuesta transcripcional sensibles a receptores de linfocitos T (TCR) (AP-1, NFAT y NPkB), se seleccionaron grupos de células estables y se evaluaron grupos para determinar la respuesta al tratamiento con 10 |jg/ml de homodímero anti-CD3 purificado durante 4 horas. Se representaron gráficamente las respuestas de luminiscencia (actividad del gen indicador de luciferasa), con la respuesta más alta observada del grupo estable Jurkat/NFKBluciferasa. La Fig. 5B muestra clones estables de Jurkat/NFKBLuciferasa.
Las Fig. 6A y 6B muestran que el homodímero anti-CD3 purificado puede activar linfocitos T en presencia o ausencia de células diana. La Fig. 6A muestra una comparación de TDB de CD20 purificado y posible homodímero anti-CD3 purificado para activar linfocitos T. Los linfocitos T Jurkat que expresan un gen indicador NFKBLuciferasa se activan de forma dependiente de la dosis por TDB de CD20 en presencia de células que expresan el antígeno diana. El TDB de CD20 activa las células Jurkat/NFKB-luciferasa de luciérnaga en presencia de la línea celular que expresa el antígeno diana. El TDB de CD20 purificado es 1000 veces más activo que el homodímero anti-CD3 purificado, en presencia de células coestimuladoras que expresan el antígeno diana. La Fig. 6B muestra que en ausencia de células que expresan el antígeno diana (cuadrados), TDB de CD20 no activa las células Jurkat/NFKBLuciferasa, pero el homodímero anti-CD3 purificado induce de forma dependiente de la dosis la actividad luciferasa dependiente de NFkB (diamantes).
La Fig. 7 muestra el cálculo de homodímero anti-CD3 presente en muestras de TDB de CD20. La actividad de luciferasa observada en las células tratadas con muestra Jurkat/NFKBLuc, medida por un lector de placas de luminiscencia (ULR), se compara con la respuesta de activación de linfocitos T generada por una cantidad conocida de homodímero anti-CD3. Se usa una ecuación derivada de la curva ajustada a la respuesta patrón del homodímero para resolver la concentración de homodímero anti-CD3 presente en una muestra. El porcentaje de homodímero anti-CD3 presente en una muestra se determina después a partir de la relación del homodímero detectado en la muestra dividida por la cantidad total de TDB de CD20 presente en la muestra.
La Fig. 8 muestra que el ensayo de activación de linfocitos T anti-CD3 es preciso para muestras de prueba de TDB de CD20 del 0,25 % a 35 %. La recuperación por adición de homodímero anti-CD3 demuestra que el método analítico es lineal en todo el intervalo del método con una R2 de 0,99, pendiente de 1,05 e y-int de 0,078 y muestra un sesgo mínimo.
La Fig. 9 muestra que el ensayo de activación de linfocitos T es capaz detectar otras impurezas relacionadas con el producto. El nivel de HMWS presente en el material con TDB de CD20 afecta la activación de los linfocitos T en el ensayo de homodímeros.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona métodos para detectar homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB) donde el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método poner en contacto una población de linfocitos T con la composición, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana, en donde la expresión del indicador indica la presencia de homodímeros anti-CD3.
En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para cuantificar la cantidad de anticuerpos homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB en la que el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método poner en contacto la población de linfocitos T con la composición a una o más concentraciones del TDB, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana, correlacionar la expresión del indicador en función de la concentración de anticuerpos con una curva patrón generada al poner en contacto los linfocitos T con diferentes concentraciones de homodímeros anti-CD3 purificados.
En otros aspectos, la invención proporciona linfocitos T modificados por ingeniería para la detección de homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB donde el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, en donde el linfocito T comprende un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación del linfocito T.
En otros aspectos, la invención proporciona kits para la detección de homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB donde el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, en donde el kit comprende un linfocito T modificado por ingeniería que comprende un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación del linfocito T.
I. Definiciones
Los términos "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcaje o toxina. En la definición también se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los términos "polipéptido" y "proteína", como se usan en el presente documento, abarcan específicamente anticuerpos.
Polipéptido "purificado" (p. ej., anticuerpo o inmunoadhesina) significa que el polipéptido ha aumentado en pureza, de tal manera que existe en una forma que es más pura de lo que existe en su entorno natural y/o cuando se sintetiza y/o amplifica inicialmente en condiciones de laboratorio. Pureza es un término relativo y no necesariamente significa pureza absoluta.
El término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba o neutralice parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido natural. De manera similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica de un polipéptido natural. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos agonistas o antagonistas, variantes de fragmentos o de secuencia de aminoácidos de un polipéptido natural, etc. Los métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido.
Un polipéptido "que se une" a un antígeno de interés, p. ej., un antígeno diana polipeptídico asociado a un tumor, es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad de modo que el polipéptido sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a una célula o tejido que exprese el antígeno, y no reaccione de manera cruzada de manera significativa con otros polipéptidos. En dichas realizaciones, el grado de unión del polipéptido a un polipéptido "no diana" será menos de aproximadamente el 10 % de la unión del polipéptido a su polipéptido diana particular como se determina mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) o radioinmunoprecipitación (RIA, por sus siglas en inglés).
Con respecto a la unión de un polipéptido a una molécula diana, la expresión "unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular significa una unión que es diferente de manera medible de una interacción no específica. Se puede medir la unión específica, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar por competencia con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica la unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe competitivamente por un exceso de diana no marcada.
El término "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos incluyendo TDB) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con anticuerpo en el presente documento.
Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina de origen natural que tienen estructuras variables, todas ellas basadas en el pliegue de las inmunoglobulinas. Por ejemplo, los anticuerpos IgG tienen dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligeras" que están unidas por enlaces disulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada cadena pesada y ligera comprende en sí misma una región "constante" (C) y una región "variable" (V). Las regiones V determinan la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo, mientras que las regiones C proporcionan soporte estructural y funcionan en interacciones no específicas de antígeno con efectores inmunitarios. La especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo es la capacidad de un anticuerpo para unirse específicamente a un antígeno particular.
La especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo está determinada por las características estructurales de la región V. La variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En lugar de ello, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables denominados regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en inglés) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de gran variabilidad denominadas "regiones hipervariables" (HVR, por sus siglas en inglés) que son, cada una, de 9­ 12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden, cada uno, cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración en lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina p. La regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés).
Cada región V normalmente comprende tres HVR, p. ej., regiones determinantes de la complementariedad ("CDR", cada una de los cuales contiene un "bucle hipervariable") y cuatro regiones marco conservadas. Un sitio de unión de anticuerpos, la unidad estructural mínima necesaria para unirse con una afinidad sustancial a un antígeno deseado particular, por lo tanto, incluirá normalmente, las tres CDR y al menos tres, preferentemente cuatro, regiones marco conservadas intercaladas allí para mantener y presentar las CDR en la conformación apropiada. Los anticuerpos clásicos de cuatro cadenas tienen sitios de unión a antígeno que están definidos por dominios Vh y Vl en cooperación. Determinados anticuerpos, tal como los anticuerpos de camello y tiburón, carecen de cadenas ligeras y dependen de los sitios de unión formados únicamente por cadenas pesadas. Se pueden preparar inmunoglobulinas modificadas por ingeniería de dominio único en las que los sitios de unión están formados por cadenas pesadas o cadenas ligeras solamente, en ausencia de cooperación entre Vh y Vl.
El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan "regiones marco conservadas" (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden, cada uno, cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración en lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés).
La expresión "región hipervariable" (HVR) cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable puede comprender restos de aminoacídicos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (p. ej., de aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la Vl, y alrededor de aproximadamente 31-35B (H1), 50-65 (H2) y 95­ 102 (H3) en la Vh (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (p. ej., restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la VLy 26-32 (H1), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en la Vh (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
Los restos de "región marco conservada" o "FR" son aquellos restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable como se define en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, Los anticuerpos biespecíficos dependientes de linfocitos T o "TDB" son anticuerpos biespecíficos diseñados para unirse a un antígeno diana expresado en una célula y para unirse a linfocitos T, con frecuencia mediante la unión de la subunidad CD3e del receptor de linfocitos T.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; diacuerpos en tándem (taDb, por sus siglas en inglés), anticuerpos lineales (p.ej., Patente de EE.UU. N.° 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); anticuerpos de un brazo, anticuerpos de dominio variable único, minicuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenario; anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (p. ej., incluidos, sin limitación, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV) 4-Fc, di-scFv, bi-scFv o (di,tri)-scFv en tándem); y activadores de linfocitos T biespecíficos (BiTE).
La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y sigue siendo capaz de entrecruzar el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígenos y unión a antígenos. Esta región consiste en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración en las que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. En conjunto, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse con el antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en donde el resto o los restos de cisteína de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden además dividirse en subclases (isotipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 5, £, y y M, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl). Usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Se describen diacuerpos de manera más completa en, por ejemplo, el documento EP 404.097; documento WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
La expresión "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que tiene especificidad poliepitópica. Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (Vl), donde la unidad VhVl tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios Vl y Vh con cada unidad VhVl de unión a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos, uniéndose cada dominio variable único a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos, triacuerpos, anticuerpos trifuncionales, fragmentos de anticuerpo que se han unido de forma covalente o no covalente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la misma o diferentes diana(s). "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unirse solamente a un epítopo. De acuerdo con una realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 |jM a 0,001 pM, 3 |jM a 0,001 pM, 1 |jM a 0,001 pM, 0,5 j M a 0,001 pM o 0,1 j M a 0,001 pM.
En algunos ejemplos, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo biespecífico (p. ej., un anticuerpo biespecífico que se une a CD3 y a otro epítopo). Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo.
Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, la expresión conjunta recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983), el documento WO 93/08829 y Traunecker etal., EMb O J. 10: 3655 (1991)) y diseño de "botón-en-ojal" (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. n.° 5.731.168). También pueden producirse anticuerpos multiespecíficos diseñando efectos de direccionamiento electrostático para producir moléculas heterodiméricas de anticuerpo Fc (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, p. ej., la Patente de EE.u U. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, p. ej., Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando la tecnología de "diacuerpo" para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, p.ej., Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenario (sFv) (véase, p.ej., Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos, como se describe, p. ej., en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
La expresión "anticuerpos de dominio único" (sdAb, por sus siglas en inglés) o "anticuerpos de dominio variable único (SVD, por sus siglas en inglés)" generalmente se refiere a anticuerpos en los que un dominio variable único (VH o VL) puede conferir unión a antígeno. En otras palabras, el dominio variable único no necesita interactuar con otro dominio de variable para reconocer el antígeno diana. Ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen los derivados de camélidos (llamas y camellos) y peces cartilaginosos (p. ej., tiburones nodriza) y los derivados de métodos recombinantes a partir de anticuerpos humanos y de ratón (Ward, ES et al., Nature (1989) 341:544-546; Dooley, H. et al., Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Muyldemans S et al., Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Holt, lJ et al., Trends Biotechnol (2003):21:484-490; documento WO 2005/035572; documento WO 03/035694; Davies, J et al., Febs Lett (1994) 339:285-290; documento WO00/29004; documento WO 02/051870).
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando presentes dichas variantes generalmente en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica la naturaleza del anticuerpo a obtener de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento pueden producirse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975) o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante (véase, p.ej., la Patente de EE.UU. n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. n.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (p. ej., Mono del Viejo Mundo, tal como babuino, mono rhesus o cynomolgus) y secuencias de región constante humana (patente de EE.UU. n° 5.693.780).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable del receptor están sustituidos por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana están sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Así mismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana o todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por sustitución o sustituciones de FR como se indica anteriormente. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véanse Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Para los fines del presente documento, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros, así como una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (p. ej., dominios constantes de secuencia natural humana) o variantes de la secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.
Los "anticuerpos naturales" son habitualmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios espaciados de manera regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo (como se define en el presente documento) que no está conjugado con una molécula heteróloga, tal como un resto citotóxico o radiomarcador.
En algunas realizaciones, las "funciones efectoras" del anticuerpo se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de la secuencia natural o una región Fc variante de la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente de complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de superficie celular.
La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (p. ej. linfocitos Citolíticos Naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar en la ADCC, linfocitos NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan, FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de EE.UU. N° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Como alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, p. ej., en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998).
Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En algunas realizaciones, las células expresan al menos FcyRIII y llevan a cabo la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las PBMC y los linfocitos NK.
La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) con una molécula (p. ej. polipéptido (p.ej., un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC, p. ej. como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Las expresiones "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, el FcR preferente es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativa de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. (véase Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término "FcR" en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"Impurezas" se refiere a materiales que son diferentes del producto polipeptídico deseado. En algunas realizaciones de la invención, las impurezas incluyen variantes de carga del polipéptido. En algunas realizaciones de la invención, las impurezas incluyen variantes de carga de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otras realizaciones de la invención, las impurezas incluyen, sin limitación: materiales de la célula hospedadora, tal como CHOP; proteína A lixiviada; ácido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxina; contaminante viral; componente de medio de cultivo celular, etc. En algunos ejemplos, la impureza puede ser una proteína de la célula hospedadora (HCP, por sus siglas en inglés) de, por ejemplo, pero sin limitación, una célula bacteriana como una célula de E. coli, una célula de insecto, una célula procariota, una célula eucariota, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula de ave, una célula fúngica. En algunos ejemplos, la impureza es un homodímerop.e/, un homodímero anti-CD3).
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de un polipéptido heterólogo con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulinas. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es normalmente una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluidas IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.
Por "molécula indicadora", tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se entiende una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal identificable analíticamente que permite la detección del anticuerpo unido al antígeno. Las moléculas indicadoras utilizadas más habitualmente en este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclidos (es decir, radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes.
Como se usa en el presente documento, "esencialmente el mismo" indica que un valor o parámetro no se ha alterado por un efecto significativo. Por ejemplo, una fuerza iónica de una fase móvil cromatográfica a la salida de la columna es esencialmente la misma que la fuerza iónica inicial de la fase móvil si la fuerza iónica no ha cambiado significativamente. Por ejemplo, una fuerza iónica a la salida de la columna que está dentro del 10 %, el 5 % o el 1 % de la fuerza iónica inicial es esencialmente la misma que la fuerza iónica inicial.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que se dirigen a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, una descripción que hace referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
T al como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/una", "o", y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se entiende que aspectos y variaciones de la invención descrita en el presente documento incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente en" aspectos y variaciones.
II. Ensayos con indicadores basados en células
La presente invención proporciona ensayos basados en células para detectar homodímeros anti-CD3 presentes en una composición que comprende un TDB en donde un fragmento de unión a antígeno del TDB se une a CD3 y activa los linfocitos T.
A. Activación de linfocitos T
El mecanismo de acción de un TDB es agotar de manera específica una célula que expresa el antígeno diana. La unión simultánea del TDB a la subunidad CD3e del receptor de linfocitos T (TCR) y al antígeno diana expresado en la superficie de la célula diana da como resultado la agrupación de TCR que conduce a la activación de los linfocitos T y al agotamiento citotóxico de la célula diana. Ha habido muchos TDB en la clínica (aCD3/aCD19, aCD3/aCD20, aCD3/aHER2; de Gast GC, et al., 1995, Cancer Immunol Immunother. 40(6):390-396; Buhmann R, et al.,2009 Bone Marrow Transplant. 43(5):383-397; Chan JK, et al., 2006, Clin Cancer Res. 12(6):1859-1867) y se están evaluando nuevas versiones de biespecíficos similares a TDB para mejorar la eficacia clínica (Chames, P. y Baty, D.2009, MAbs 1(6):539-547; Fournier, P. y Schirrmacher, V., 2013, BioDrugs 27(1):35-53). Los Td B biespecíficos son capaces de activar linajes de linfocitos tanto CD4+ como CD8+, siempre que estén presentes las células que expresan la diana correcta. La activación de linfocitos T CD4+ dará como resultado la inducción de la expresión del gen de citocinas (IL-2, etc.) que conduce al reclutamiento y activación de otras células inmunitarias, incluyendo la expansión y proliferación de linfocitos T CD8+. La activación de CTL CD8+ es el resultado de la formación de una estructura similar a una sinapsis inmunitaria con las células diana a través de la formación de puentes celulares mediada por TDB que conduce a la activación de CTL, inducción de la transcripción de Perforina y Granzimas (A, B, C; dependiendo del subtipo de CTL), desgranulización, y la liberación localizada de Perforina y Granzimas a través de la interfaz similar a una 'sinapsis inmunitaria' entre la célula diana y la célula efectora, dando como resultado la destrucción de la célula diana (Pores-Fernando, Pores-Fernando AT, Zweifach A, 2009, Immunol Rev., 231(1):160-173; Pipkin, ME, et al., 2010, Immunol Rev., 235(1):55-72). La destrucción celular mediada por células efectoras es un proceso relativamente lento que requiere la estabilización de la sinapsis durante varias horas y requiere la activación dependiente de la transcripción del gen p rfl y genes de las granzimas para asegurar la destrucción celular completa. Como alternativa, también se ha demostrado que la destrucción de células diana mediada por CTL se produce por apoptosis mediada por Fas (Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol., 15(12): 1441-1450). La regulación transcripcional del prfl, grB y la maquinaria de destrucción celular mediada por Fas depende de los elementos potenciadores NFAT, NPkB y STAT ubicados dentro de los promotores de los genes necesarios para mediar el agotamiento de los linfocitos B (Pipkin, ME, et al., 2010, Immunol Rev., 235(1):55-72; Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol., 15(12): 1441-1450). La fuerza de la interacción entre las células diana y efectoras (sinapsis inmunitaria) depende de otras moléculas coestimuladoras de las cuales la señalización también es necesaria para estabilizar y mantener la interacción entre la diana y la célula efectora (Krogsgaard M, et al., 2003, Semin Immunol. 15(6):307-315; Pattu V, et al., 2013, Front Immunol., 4:411; Klieger Y, et al., 2014, Eur J Immunol. 44(1):58-68; Schwartz JC, et al., 2002, Nat Immunol. 3(5):427-434). La monitorización de la inducción transcripcional de genes diana, mediante el uso de ensayos con genes indicadores, es, por lo tanto, un sistema de ensayo alternativo reflectante MOA para observar la activación de linfocitos T por TDB.
La activación de los linfocitos T requiere la reorganización espacial y cinética de las proteínas de la superficie celular y las moléculas de señalización en el sitio de contacto de la célula presentadora de antígenos para formar la sinapsis inmunitaria. La coordinación de la activación y señalización del receptor de linfocitos T (TCR) y de los receptores (CD28, CD40, ICOS, etc.) y ligandos coestimuladores regula tanto la duración como la señalización que se requiere para la activación de los linfocitos T. La presentación de antígenos en la superficie de la Célula Presentadora de Antígenos (APC, por sus siglas en inglés) a través de MHC es reconocida por TCR en la superficie del linfocito T. La agrupación de MHC y TCR inicia el reclutamiento y activación de vías de señalización que pueden conducir a la activación de linfocitos T, dependiendo de la expresión de receptores coestimuladores e inmunomoduladores, que desempeñan un papel clave en la regulación de la activación de los linfocitos T. Los anticuerpos contra las subunidades del TCR, tal como CD3e (OKT3; Brown, WM, 2006, Curr Opin Investig Drugs 7:381-388; Ferran, C et al., 1993 Exp Nephrol 1:83-89), pueden inducir la activación de los linfocitos T reticulando el TCR y, por lo tanto, imitando la agrupación de TCR en la sinapsis inmunitaria, y se han utilizado clínicamente, así como durante muchos años como activadores sustitutos para estudiar la señalización de TCR in vitro. La agrupación de TCR por anticuerpos anti-CD3 sin coestimulación activa débilmente los linfocitos T, pero aún conduce a la activación de los linfocitos T y a la transcripción y liberación limitadas de citocinas. Se ha demostrado que la señalización mediada por anti-CD3 activa varios factores de transcripción, incluyendo NFAT, AP1 y NPkB (MF et al., 1995, J. Leukoc. Biol. 57:767-773; Shapiro VS et al., 1998, J. Immunol. 161(12)6455-6458; Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol., 15(12):1441-1450). La coestimulación regula el nivel y el tipo de liberación de citocinas a través de la modulación de la señalización que afecta a la regulación transcripcional de la expresión de citocinas que afecta a la naturaleza de la respuesta de activación de los linfocitos T (Shannon, MF et al., 1995, J. Leukoc. Biol. 57:767-773). El TDB biespecífico agrupa TCR en la superficie celular del linfocito T como resultado del puente formado entre el linfocito T y la célula que expresa el antígeno diana. Los elementos reguladores de la transcripción que dirigen la expresión de genes indicadores que pueden estar inducidos por la transcripción mediante la activación de linfocitos T se probaron en líneas de linfocitos T para determinar qué eventos son activados por el TDB en presencia y ausencia de células diana.
B. Moléculas indicadoras
Un ensayo con indicadores es un método analítico que permite la caracterización biológica de un estímulo mediante la monitorización de la inducción de la expresión de un indicador en una célula. El estímulo conduce a la inducción de vías de señalización intracelular que dan como resultado una respuesta celular que normalmente incluye la modulación de la transcripción génica. En algunos ejemplos, la estimulación de las vías de señalización celular da como resultado la modulación de la expresión génica a través de la regulación y el reclutamiento de factores de transcripción en regiones de ADN no codificantes cadena arriba que se requieren para el inicio de la transcripción del ARN que conduce a la producción de proteínas. Se requiere el control de la transcripción y traducción de genes en respuesta a un estímulo para provocar la mayoría de las respuestas biológicas, tal como la proliferación celular, diferenciación, supervivencia y respuestas inmunitarias. Estas regiones no codificantes de ADN, también llamados potenciadores, contienen secuencias específicas que son los elementos de reconocimiento de los factores de transcripción que regulan la eficacia de la transcripción génica y, por lo tanto, la cantidad y tipo de proteínas generadas por la célula en respuesta a un estímulo. En un ensayo con indicadores, un elemento potenciador y un promotor mínimo que es sensible a un estímulo se modifica por ingeniería para impulsar la expresión de un gen indicador utilizando métodos convencionales de biología molecular. Después, el ADN se transfecta a una célula, que contiene toda la maquinaria para responder específicamente al estímulo y el nivel de transcripción, traducción o actividad del gen indicador se mide como una medida sustituta de la respuesta biológica.
En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para detectar homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB poniendo en contacto una población de linfocitos T con la composición, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación de CD3 de manera que la expresión del indicador indica la presencia de homodímeros anti-CD3. Una molécula indicadora puede ser cualquier molécula para la que se pueda desarrollar un ensayo para medir la cantidad de esa molécula que es producida por la célula en respuesta al estímulo. Por ejemplo, una molécula indicadora puede ser una proteína indicadora que está codificada por un gen indicador que es sensible al estímulo; por ejemplo, activación de linfocitos T. Los ejemplos usados habitualmente de moléculas indicadoras incluyen, pero sin limitación, proteínas luminiscentes tales como luciferasa, que emiten luz como subproducto de la catálisis del sustrato que se puede medir experimentalmente. Las luciferasas son una clase de proteínas luminiscentes que derivan de muchas fuentes, incluida la luciferasa de luciérnaga (de la especie, Photinus pyralis), Luciferasa de renilla del pensamiento de mar (Renilla reniformis), luciferasa de escarabajo click (de Pyrearinus termitilluminans), luciferasa de copépodo marino Gaussia (de Princeps de Gauss), y Nano luciferasa de camarón de aguas profundas (de Oplophorus gracilirnstrís). La luciferasa de luciérnaga cataliza la oxigenación de luciferina a oxiluciferina, dando como resultado la emisión de un fotón de luz, mientras que otras luciferasas tal como Renilla emiten luz catalizando coelenteracina. La longitud de onda de la luz emitida por diferentes formas y variantes de luciferasa se puede leer utilizando diferentes sistemas de filtro, que facilitan la multiplexación. La cantidad de luminiscencia es proporcional a la cantidad de luciferasa expresada en la célula y los genes de luciferasa se han utilizado como un indicador sensible para evaluar el impacto de un estímulo para provocar una respuesta biológica. Los ensayos con genes indicadores se han utilizado durante muchos años para una amplia gama de propósitos, incluida la investigación básica, exploración HTS, y para determinar la potencia (Brogan J, et al., 2012, Radiat Res. 177(4):508-513; Miraglia LJ, et al., 2011, Comb Chem High Throughput Screen.
14(8):648-657; Nakajima Y y Omiya Y.2010, Expert Opin Drug Discovery, 5(9):835-849; Parekh BS, et al., 2012, Mabs, 4(3):310-318; Svobodova K y Cajtham L T., 2010, Appl Microbiol Biotechnol., 88(4): 839-847).
En algunas realizaciones, la invención proporciona ensayos basados en células para detectar homodímeros anti-CD3 en composiciones de TDB en donde los linfocitos T codifican una construcción indicadora que es sensible a la activación de los linfocitos T. En algunas realizaciones, la construcción indicadora comprende una luciferasa. En algunas realizaciones, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga (p. ej., de la especie Photinus pyralis), Luciferasa de Renilla del pensamiento marino (p. ej., de la especie Renilla reniformis), luciferasa de escarabajo click (p. ej., de la especie Pyrearinus termitilluminans), luciferasa de copépodo marino Gaussia (p. ej., de la especie Princeps de Gauss), y Nano luciferasa de camarón de aguas profundas (p. ej., de la especie Oplophorus gracilirostris). En algunas realizaciones, la expresión de luciferasa en el linfocito T modificada por ingeniería indica la presencia de homodímeros anti-CD3 en la composición de TDB. En otros aspectos, la construcción indicadora codifica una p-glucuronidasa (GUS); una proteína fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja (RFP), proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente amarilla (YFP) y variantes de las mismas; una cloranfenicol acetiltransferasa (CAT); una p-galactosidasa; una p-lactamasa; o una fosfatasa alcalina secretada (SEAP).
En algunos aspectos de la invención, el ácido nucleico que codifica una molécula indicadora (p. ej., una proteína indicadora) está operativamente unido a un promotor y/o potenciador sensible a la activación de los linfocitos T. En algunas realizaciones, el promotor y/o potenciador sensible a la activación de linfocitos T es una secuencia de control de la expresión. Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está operativamente unido al ácido nucleico que codifica el polipéptido (p. ej., el polipéptido indicador). Convenientemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas (p. ej., linfocitos T). Una vez que el vector se ha incorporado al hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos después de la activación de los linfocitos T.
Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Casi todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases cadena arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases cadena arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.
En algunos aspectos de la invención, la invención proporciona linfocitos T que comprenden ácido nucleico que codifica una molécula indicadora bajo el control de un promotor sensible a la activación de linfocitos T. Se conocen en la técnica promotores sensibles a la activación de linfocitos T.
En otras realizaciones, la invención proporciona linfocitos T que comprenden ácido nucleico que codifica una molécula indicadora bajo el control de un promotor mínimo unido operativamente a un elemento potenciador sensible a la activación de los linfocitos T. En algunas realizaciones, el promotor mínimo es un promotor mínimo de timidina cinasa (TK), un promotor mínimo de citomegalovirus (CMV), un promotor derivado de SV40, o un promotor mínimo del factor 1 de elongación alfa (EF1a). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la molécula indicadora está bajo el control de un promotor mínimo de TK regulado por elementos de reconocimiento de ADN sensibles a la activación de linfocitos T. En algunas realizaciones, los elementos de reconocimiento de ADN sensibles a la activación de linfocitos T son potenciadores NFAT (Factor Nuclear de Linfocitos T Activados), potenciadores AP-1 (Fos/Jun), potenciadores NFAT/AP1, potenciadores NPkB, potenciadores FOXO, potenciadores STAT3, potenciadores STAT5 y potenciadores IRF. El potenciador puede sufrir corte y empalme en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica el polipéptido, pero en algunas realizaciones, se localiza en un sitio 5' del promotor. En algunas realizaciones, la invención proporciona linfocitos T en donde un gen de luciferasa está operativamente unido a un promotor mínimo de TK que a su vez está operativamente unido a un elemento potenciador sensible a NPkB.
En algunas realizaciones de la invención, los vectores indicadores de expresión utilizados en células hospedadoras eucariotas (células de levadura, hongos, insectos, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariota o vírico. Un componente útil de terminación de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véanse el documento WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en ese documento.
En algunas realizaciones, la invención proporciona vectores para la expresión de la molécula indicadora en linfocitos T. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes, una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un sitio de clonación múltiple que contiene secuencias de reconocimiento para numerosas endonucleasas de restricción, un elemento potenciador, un promotor (p. ej., un elemento potenciador y/o promotor sensibles a la activación de linfocitos T) y una secuencia de terminación de la transcripción. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido. En otras realizaciones, el vector es un genoma vírico recombinante; p. ej., un genoma lentiviral recombinante, un genoma de retrovirus recombinante, un genoma de virus adenoasociado recombinante. Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos (p. ej., el gen indicador unido operativamente a un promotor/potenciador sensible a linfocitos T) se pueden transferir a un linfocito T hospedador mediante métodos bien conocidos. Por ejemplo, se puede usar tratamiento con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, transfección basada en biolística o en virus. (Véase en general Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a ed., 1989). Otros métodos usados para transformar células de mamífero incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación y microinyección.
C. Células
En algunos aspectos, la invención proporciona un ensayo basado en células para detectar homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB poniendo en contacto una población de linfocitos T que comprenden un complejo indicador sensible a la activación de los linfocitos T. En algunas realizaciones, los linfocitos T de la población son linfocitos T CD4+. En algunas realizaciones, los linfocitos T son linfocitos T CD8+. En otras realizaciones más, el linfocito T es un linfocito T CD4+/ CD8+. En algunas realizaciones, los linfocitos T CD4+ y/o CD8+ muestran una mayor liberación de citocinas seleccionadas del grupo que consiste en IFN-y, TNF-a e interleucinas. En algunas realizaciones, la población de linfocitos T es una población de linfocitos T inmortalizados (p. ej., una línea de linfocitos T inmortalizada). En algunas realizaciones, la población de linfocitos T es una población de células CD4+ y/o CD8+ inmortalizadas que expresan TCR/CD3e. En algunas realizaciones, el linfocito T es una célula Jurkat. En algunas realizaciones, el linfocito T es un linfocito T CTLL-2.
En algunas realizaciones, los linfocitos T de la invención comprenden un receptor de linfocitos T. Los receptores de linfocitos T existen como un complejo de varias proteínas. El propio receptor de linfocitos T está compuesto por dos cadenas peptídicas separadas codificadas por los genes alfa y beta del receptor de linfocitos T independientes (TCRa y TCRp). Otras proteínas del complejo son proteínas CD3: CD3e (también conocida como CD3e), c D3y, CD35 y CD3Z. Las proteínas CD3 se encuentran como heterodímeros CDey y CD3e5 y un homodímero CD3Z. El homodímero CD3 Z permite la agregación de complejos de señalización alrededor de estas proteínas. En algunas realizaciones, un brazo del TDB se une a un complejo de receptores de linfocitos T. En algunas realizaciones, el TDB se une a CD3. En algunas realizaciones, el TDB se une a la proteína CD3s (CD3e).
En algunas realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden linfocitos T para su uso en un ensayo basado en células para detectar y/o cuantificar homodímeros anti-CD3 en una composición de TDB. En algunas realizaciones, los linfocitos T de la composición son linfocitos T CD4.+. En algunas realizaciones, los linfocitos T de la composición son linfocitos T CD8+. En otras realizaciones más, los linfocitos T de la composición son linfocitos T CD4+/ CD8+. En algunas realizaciones, los linfocitos T de la composición son linfocitos T inmortalizados. En algunas realizaciones, los linfocitos T de la composición son células Jurkat. En algunas realizaciones, los linfocitos T de la composición son linfocitos T CTLL-2. En algunas realizaciones, los linfocitos T de la composición comprenden un complejo indicador sensible a la activación de linfocitos T. En algunas realizaciones, el complejo indicador comprende un polinucleótido que codifica una luciferasa. En algunas realizaciones, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica el indicador (p. ej., luciferasa) está operativamente unido a un elemento regulador sensible a la activación de linfocitos T (p. ej., un promotor y/o potenciador sensible a la activación de linfocitos T). En algunas realizaciones, el promotor sensible a la activación de los linfocitos T es un promotor NFAT, un promotor AP-1, un promotor NPkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor IRF.
En algunas realizaciones, los linfocitos T en los que se han introducido construcciones indicadoras sensibles a la activación de linfocitos T (linfocitos T indicadores) se exploran para determinar la activación por homodímeros anti-CD3. Por ejemplo, los clones estables pueden aislarse limitando la dilución y explorarse para determinar su respuesta a un homodímero anti-CD3 purificado. En algunas realizaciones, los linfocitos T indicadores estables se exploran con más de aproximadamente cualquiera de 1 |jg/ml, 2 |jg/ml, 3 |jg/ml, 4 |jg/ml, 5 |jg/ml, 6 |jg/ml, 7 |jg/ml, 8 |jg/ml, 9 |jg/ml, o 10 |jg/ml de homodímero anti-CD3 purificado.
En algunas realizaciones, la invención proporciona composiciones de linfocitos T modificados por ingeniería con un complejo indicador de activación de linfocitos T. En algunas realizaciones, el indicador es luciferasa, una proteína fluorescente (p. ej., un GFP, un YFP, etc.), una fosfatasa alcalina o una beta galactosidasa. En algunas realizaciones, la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa. En algunas realizaciones, el promotor sensible a la activación de los linfocitos T es un promotor NFAT, un promotor AP-1, un promotor NPkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor IRF. En algunas realizaciones, el promotor sensible a la activación de linfocitos T comprende elementos sensibles a los linfocitos T de uno cualquiera o más de NFAT, AP-1, NFkB, FOXO, STAT3, STAT5 y IRF. En algunas realizaciones, la composición de linfocitos T comprende linfocitos T CD4+ y/o linfocitos T CD8+. En algunas realizaciones, los linfocitos T son células Jurkat o células CTLL-2. En algunas realizaciones, los linfocitos T son células Jurkat que comprenden un polinucleótido que codifica una luciferasa unida operativamente a un promotor NPkB.
D. Métodos de identificación de homodímeros de CD3
En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para detectar homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB en donde el anticuerpo TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método poner en contacto una población de linfocitos T con la composición, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana, en donde la expresión del indicador indica la presencia de homodímeros anti-CD3. En algunas realizaciones, la población de linfocitos T no comprende células que expresan el antígeno diana (antígeno que no es de linfocitos T) del TDB.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos T se pone en contacto con una composición que comprende el TDB en un intervalo de concentración de una cualquiera de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,05 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 40 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 1 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 0,5 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 0,1 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 0,05 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, o de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml.
En algunas realizaciones, el indicador se detecta después de una cualquiera de más de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 20 h, o aproximadamente 24 h después de poner en contacto las células con la composición. En algunas realizaciones, el indicador se detecta entre aproximadamente uno cualquiera de aproximadamente 1 hora y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 8 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 6 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 4 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 4 horas y aproximadamente 12 horas, aproximadamente 4 horas y aproximadamente 8 horas, aproximadamente 8 horas y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, aproximadamente 16 horas y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 16 horas y aproximadamente 20 horas, o aproximadamente 20 horas y aproximadamente 24 horas después de poner en contacto las células con la composición.
En algunos aspectos, la invención proporciona métodos para cuantificar la cantidad de anticuerpos homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB en la que el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método poner en contacto la población de linfocitos T con la composición a una o más concentraciones del TDB, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana, correlacionar la expresión del indicador en función de la concentración de anticuerpos con una curva patrón generada al poner en contacto los linfocitos T con diferentes concentraciones de homodímeros anti-CD3 purificados. Se preparan diluciones de un patrón de ensayo de homodímeros anti-CD3 (un homodímero anti-CD3 purificado de concentración conocida), un control de homodímeros anti-CD3 y muestras de prueba de TDB y se añaden a los linfocitos T indicadores. Después de una incubación programada, se mide la cantidad de actividad indicadora que es inducida por el patrón de ensayo de homodímeros, el control de homodímero y las muestras de prueba de TDB. La cantidad de homodímero anti-CD3 biológicamente activo en una muestra de prueba de TDB se determina a partir de una curva patrón generada a partir del patrón de ensayo de homodímeros anti-CD3.
El porcentaje de homodímero anti-CD3 presente en una muestra de prueba se determina mediante la relación de la cantidad de homodímero anti-CD3 presente con respecto a la cantidad total de TDB presente en la muestra de prueba.
En algunas realizaciones, la población de linfocitos T se pone en contacto con una composición que comprende el TDB en un intervalo de concentración de una cualquiera de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,05 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 40 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 1 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 0,5 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 0,1 ng/ml, de aproximadamente 0,01 ng/ml a aproximadamente 0,05 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, o de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml.
En algunas realizaciones, la curva patrón del patrón de ensayo de homodímeros anti-CD3 se genera poniendo en contacto linfocitos T indicadores con homodímero anti-CD3 en una pluralidad de concentraciones que varían desde aproximadamente una cualquiera de 0,01 ng/ml a 50 ng/ml. En algunas realizaciones, la pluralidad de concentraciones de patrón de homodímero anti-CD3 incluye una cualquiera de 100/ml ng, 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 500 ng/ml, 750 ng/ml, 1 |jg/ml, 2,5 |jg/ml, 5 |jg/ml, 10 |jg/ml, 25 |jg/ml, 50 |jg/ml, 100 |jg/ml, 250 |jg/ml o 500 |jg/ml. En algunas realizaciones, la pluralidad de concentraciones de patrón de homodímero anti-CD3 es aproximadamente tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez concentraciones.
La precisión del método se evalúa añadiendo cantidades purificadas de homodímero anti-CD3 de cantidades conocidas en una preparación de TDB y midiendo el porcentaje de recuperación de homodímero anti-CD3. En algunas realizaciones, una o más mezclas de homodímero anti-CD3 y TDB se generan añadiendo más de aproximadamente 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, 1 jg , 2,5 jg , 5 jg , 10 jg , 25 jg , 50 jg , 100 jg , 250 jg o 500 jg de homodímero anti-CD3 purificado a una reserva de aproximadamente 1 mg/ml de TDB aCD20/aCD3.
En algunas realizaciones, el indicador se detecta después de una cualquiera de más de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 20 h, o aproximadamente 24 h después de poner en contacto las células con la composición. En algunas realizaciones, el indicador se detecta entre aproximadamente uno cualquiera de aproximadamente 1 hora y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 12 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 8 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 6 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 4 horas, aproximadamente 1 hora y aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 4 horas y aproximadamente 12 horas, aproximadamente 4 horas y aproximadamente 8 horas, aproximadamente 8 horas y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 8 horas y aproximadamente 12 horas, aproximadamente 16 horas y aproximadamente 24 horas, aproximadamente 16 horas y aproximadamente 20 horas, o aproximadamente 20 horas y aproximadamente 24 horas después de poner en contacto las células con la composición.
E. Desarrollo del Ensayo
El siguiente es un método a modo de ejemplo pero no limitante de desarrollar un ensayo basado en células para detectar homodímeros anti-CD3 en una preparación de TDB.
Construcciones de ADN: El lentivirus se usa para generar las líneas celulares estables que se usan para evaluar la pureza del anticuerpo biespecífico TDB. Se construyen vectores lentivirales que expresan el gen indicador luciferasa de luciérnaga, Luciferasa de Renilla, o Nanoluciferasa bajo el control de un promotor mínimo de TK regulado por elementos de reconocimiento de ADN para NFAT (factor nuclear de linfocitos T activados), AP-1 (Fos/Jun), NFAT/AP1, NFkB, FOXO, STAT3,5 e IRF. Los casetes de expresión lentivirales utilizados para la generación de las líneas de células indicadoras estables pueden ser vectores bi-cistrónicos autoinactivantes de tercera generación que expresaban varios marcadores de selección de antibióticos bajo el control de promotores/potenciadores constitutivos (EF1alpha o SV40) para permitir la generación de líneas celulares estables. Los vectores lentivirales indicadores usados se modifican a partir del vector pCDH.MCS.EF1a.Puro son vectores disponibles comercialmente (SBI biosciences; N.° de catálogo CD510B-1). Las modificaciones del promotor incluyen la eliminación del promotor mínimo de CMV y la sustitución con varios elementos potenciadores (NFAT, NFkB, etc.), la adición de un promotor mínimo de ARN polimerasa de núcleo (caja TATA) a partir de pRK5.CMV.Luciferase (Osaka, G et al., 1996 J Pharm Sci. 1996, 85:612-618) y la sustitución de diferentes casetes de selección de ADN internos (gen de resistencia a neomicina a partir de pRK5.tk.neo, gen de resistencia a higromicina a partir de pRK5.tk.hygro; y gen de resistencia a blasticidina a partir de pRK5.tk.blastocidin). El impacto de los promotores constitutivos usados para la selección sobre la activación de los elementos potenciadores es mínimo debido a la incorporación de un tramo de ADN no codificante diseñado para minimizar la comunicación promotor/potenciador. La Luciferasa de luciérnaga a partir de pRK5.CMV.Luciferase (Osaka, 1996) se clona en el sitio HindIII-NotI del vector precursor lentiviral modificado. También pueden subclonarse en el sitio HindIII-NotI otras proteínas luminiscentes que incluyen Luciferasa de Renilla y NanoLuciferasa. Las construcciones de empaquetamiento lentiviral (pCMV.HIVdelta, pCMC.VSV-G y pCMV.Rev) utilizadas para generar reservas virales a partir de la transfección transitoria de células 293s (línea celular adaptada a la suspensión 293) se pueden obtener (pCMV.VSV-G) o generar ( pCMV.HIVdelta, pCMV.REV). La cepa de VIH MN (Nakamura, GR et al., 1993, J. Virol. 67(10): 6179-6191) se puede usar para generar el vector de empaquetamiento pCMV.HIVdelta y contiene una deleción de digestión parcial interna EcoRI para inactivar por deleción la envoltura vírica del VIH y modificaciones a los LTR 5 'y 3' por motivos de seguridad. HIV Rev se clona a partir de ARN de células 293s transfectadas con pCMV.HIVdelta mediante RT-PCR y se introduce en el sitio ClaI-Xho de pRK5.tk.neo. El uso de VSV-G para pseudotipar los indicadores lentivirales (sustituyendo la env de VIH por VSV-G) permite la infección de cualquier tipo celular. Los plásmidos de expresión lentiviral y las construcciones de empaquetamiento se amplifican en células competentes Stbl2 (Life Technologies, N.° de Cat. 10268-019) y el ADN se purificó usando el kit Qiagen Maxi Prep (N.° de Cat. 12662). Todas las construcciones de ADN se confirman mediante secuenciación de ADN.
Desarrollo de la línea celular de ensayo de genes indicadores: Se usan la línea de linfocitos T Jurkat CD4+ (DSMZ, N.° de Cat. ACC 282) y la línea de linfocitos T CTLL-2 CD8+ Life Technologies, N.° de Cat. K1653) para evaluar la viabilidad de un ensayo de genes indicadores para monitorizar la activación de linfocitos T por el TDB. Se construyen vectores lentivirales que expresan el gen indicador luciferasa de luciérnaga, Luciferasa de Renilla, o Nanoluciferasa bajo el control de un promotor mínimo de TK regulado por elementos de reconocimiento de ADN para NFAT (factor nuclear de linfocitos T activados), AP-1 (Fos/Jun), NFAT/AP1, NFkB, FOXO, STAT3,5 e IRF. Las reservas virales de genes indicadores se generan mediante transfección transitoria de células 293s y se pseudotipifican con VSV-G, se concentran y se titulan utilizando métodos convencionales (Naldini, L., et al., 1996 Science, 272:263-267). Los linfocitos Jurkat CTLL-2 se infectan con la reserva viral de indicadores lentivirales a una MOI de 10 por espinoculación y después de 3 días las células infectadas se seleccionan por su resistencia a antibióticos. Después de 2 semanas, se generan y evalúan grupos estables para la respuesta a TDB purificado. Se utiliza un método qPCR que evalúa el número de copias y la integración para demostrar que todos los grupos estables están infectados de manera estable con las construcciones indicadoras. El homodímero anti-CD3 purificado es capaz de activar los grupos de indicadores Jurkat tanto NFAT como NPkB. Se observaron respuestas similares para los otros TDB. Basándose en estos experimentos, la dilución limitante de Jurkat/NFKB-luciferasa y Jurkat/NFAT-Luciferasa se establece para permitir la clonación de células sueltas y la generación de líneas de células indicadoras estables únicas.
Desarrollo y evaluación del ensayo de impurezas por activación de linfocitos T: El homodímero anti-CD3 es una impureza relacionada con el producto que puede activar los linfocitos T en ausencia de células diana y, por lo tanto, representa una actividad separada del TDB. Las especies de homodímeros anti-CD3 presentes como impurezas en preparaciones purificadas de TDB pueden estar unidas covalente o no covalentemente y, por lo tanto, pueden adoptar una conformación que permita que la variante se reticule y de ese modo active el TCR en la superficie de los linfocitos T. Como el TDB tiene solo un brazo anti-CD3, el TDB no puede reticular el TCR y no tiene actividad cuando se incuba con linfocitos T solamente. In vivo, el TDB puede ser capaz de reticular TCR en linfocitos T, vía reticulación mediada por FcgR mediada por células efectoras (monocitos, macrófagos, linfocitos NK).
Para cuantificar la cantidad de variante de homodímero aCD3 presente, la cantidad de actividad luciferasa observada en una muestra de TDB se calcula a partir de la curva de mejor ajuste de la actividad luciferasa observada cuando se incuba un patrón de homodímero aCD3 purificado de concentración conocida con la línea celular del clon 2 de Jurkat/NFKB-luciérnaga luciferasa (Fig. 7). Para evaluar los efectos de la matriz y el impacto de la concentración de impurezas en cada muestra, se preparan diluciones en serie y se evalúa la linealidad de la dilución en el ensayo final. La cantidad total de homodímero presente se determina mediante la masa de impureza presente en la masa total de TDB y se expresa como % de homodímero antiCD3. El método es capaz de detectar cuantitativamente tan solo 0,1 microgramos (0,1 ppm) de homodímero anti-CD3 purificado en preparaciones de TDB purificados. También se ha demostrado que el formato de ensayo puede detectar la actividad de las impurezas en el material con TDB que no se ha purificado más allá de las etapas de purificación iniciales del proceso actual y se ha utilizado para evaluar el enfoque de purificación utilizado para que TDB elimine las impurezas. Añadiendo homodímero anti-CD3 purificado, el formato de ensayo muestra una recuperación precisa de hasta un 0,5 % de material enriquecido con homodímero en el material de prueba de TDB (Fig. 7). El método se ha utilizado junto con otros ensayos ortogonales para demostrar que el proceso de purificación actual de TDB elimina el homodímero y otras especies que activan los linfocitos T por debajo del límite de cuantificación del ensayo. Sin embargo, durante el desarrollo del proceso, se demostró que diversas muestras tenían actividad activadora de linfocitos T en el ensayo que no se correlacionó con el ensayo por espec de masas de homodímero anti-CD3. Las correlaciones con otros métodos analíticos ortogonales sugieren que estas otras especies pueden ser alguna forma de agregado o HMWS (Fig. 9). Los agregados de TDB inducirían la agrupación y la actividad de TCR. Se ha observado que tan solo un 1,5 % de HMWS puede inducir una actividad significativa en el ensayo, como se observó durante la evaluación de varios estudios de formulación. La purificación y la evaluación de estas otras especies permiten el desarrollo de un ensayo de impurezas usando varios patrones de referencia de impurezas para evaluar la pureza y seguridad de TDB. El uso de diferentes líneas celulares con genes indicadores puede permitir la clasificación de las diferentes especies presentes. El valor actual indicado de % de homodímero antiCD3 puede, por lo tanto, modificarse a otro valor como resultado de estos esfuerzos. La sensibilidad de un enfoque de ensayo con genes indicadores para detectar impurezas biológicamente activas es un enfoque general útil para la clasificación de variantes de productos y la evaluación de niveles aceptables que pueden estar presentes en un tratamiento.
III. Kits
En algunos aspectos de la invención, se proporciona un kit o artículo de fabricación que comprende un envase que contiene una composición que comprende linfocitos T modificados por ingeniería que comprenden un complejo indicador sensible a la activación de linfocitos T como se describe en el presente documento, y opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. En algunas realizaciones, el kit proporciona un patrón de ensayo de homodímeros anti-CD3 (un homodímero anti-CD3 purificado de concentración conocida) y/o un control de homodímeros anti-CD3. El envase contiene la formulación y la etiqueta en, o asociada con, el envase puede indicar instrucciones de uso. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, cultivo, reactivos para detectar moléculas indicadoras y prospectos con instrucciones de uso.
IV. Polipéptidos
Los polipéptidos a analizar usando los métodos descritos en el presente documento se producen generalmente usando técnicas recombinantes. Se describen métodos para producir proteínas recombinantes, p. ej., en las Patentes de EE.UU. N.° 5.534.615 y 4.816.567.
En algunas realizaciones, la proteína de interés se produce en una célula CHO (véase, p. ej., el documento WO 94/11026). En algunas realizaciones, el polipéptido de interés se produce en una célula de E. coli. Véanse, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 5.648.237; la Patente de EE.UU. N° 5.789.199 y la patente de EE.UU. N° 5.840.523, que describe la región de inicio de la traducción (TIR) y secuencias señal para optimizar la expresión y la secreción. Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), págs.
245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli. Cuando se usan técnicas recombinantes, los polipéptidos se pueden producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio.
Los polipéptidos pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de células hospedadoras. Las células empleadas en la expresión de los polipéptidos pueden romperse por diversos medios físicos o químicos, tal como el ciclo de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o el uso de agentes de lisado celular. Si el polipéptido se produce de forma intracelular, como primera etapa, los restos de partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar polipéptidos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación. Cuando el polipéptido se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de polipéptidos disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.
En algunas realizaciones, se han purificado o purificado parcialmente el polipéptido en la composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes antes del análisis mediante los métodos de la invención. Por ejemplo, el polipéptido de los métodos está en un eluyente de una cromatografía por afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de modo mixto y una cromatografía de interacción hidrófoba. En algunas realizaciones, el polipéptido está en un eluyente de una cromatografía con proteína A.
Ejemplos de polipéptidos que pueden analizarse mediante los métodos de la invención incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas, inmunoadhesinas, anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas de fusión, proteínas que contienen Fc, inmunoconjugados, citocinas e interleucinas.
(A) Anticuerpos
En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el polipéptido para su uso en cualquiera de los métodos de análisis de polipéptidos y formulaciones que comprenden los polipéptidos mediante los métodos descritos en el presente documento es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB).
Las dianas moleculares de los anticuerpos incluyen proteínas CD y sus ligandos, tales como, pero sin limitación: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79a (CD79a) y CD79p (CD79b); (ii) miembros de la familia de receptores ErbB, tales como el receptor EGF, el receptor h ER2, h ER3 o HER4; (iii) moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina av/p3, incluyendo sus subunidades alfa o beta (p. ej., anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDIIb); (iv) factores de crecimiento tales como VEGF; IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, factor tisular, p7, etc; (v) antígenos asociados a tumores (TAA, por sus siglas en inglés) de superficie celular y transmembrana, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. N.° 7.521.541, y (vi) otras dianas tales como FcRH5, LyPDI, TenB2. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20/anti-CD3. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de anticuerpos biespecíficos.
Tabla 1. Anticuer os a modo de eem lo
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continuación
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Otros anticuerpos a modo de ejemplo incluyen aquellos seleccionados de, y sin limitación, anticuerpo antirreceptor de estrógenos, anticuerpo antirreceptor de progesterona, anticuerpo anti-p53, anticuerpo anti-HER-2/neu, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anticatepsina D, anticuerpo anti-Bcl-2, anticuerpo anti-E-cadherina, anticuerpo anti-CA125, anticuerpo anti-CA15-3, anticuerpo anti-CA19-9, anticuerpo anti-c-erbB-2, anticuerpo antiglicoproteína P, anticuerpo anti-CEA, anticuerpo antiproteína de retinoblastoma, anticuerpo antioncoproteína ras, anticuerpo anti-Lewis X, anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD9/p24, anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-CD11a, anticuerpo anti-CD 11c, anticuerpo anti-CD 13, anticuerpo anti-CD 14, anticuerpo anti-CD 15, anticuerpo anti-CD 19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD23, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD41, anticuerpo anti-LCA/CD45, anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, anticuerpo anti-CD39, anticuerpo anti CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo antiubiquitina, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anticitoqueratinas, anticuerpo antivimentina, anticuerpo antiproteínas del VPH, anticuerpo anticadenas ligeras kappa, anticuerpo anticadenas ligeras lambda, anticuerpo antimelanosomas, anticuerpo antiantígeno específico de próstata, anticuerpo anti-S-100, anticuerpo antiantígeno tau, anticuerpo antifibrina, anticuerpo antiqueratinas y anticuerpo antiantígeno-Tn.
(i) Anticuerpos monoclonales
En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo excepto por posibles variantes que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando presentes dichas variantes generalmente en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica que la naturaleza del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse por métodos de ADN recombinante (Patente de EE.UU. N.° 4.816.567).
En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal hospedador adecuado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe en el presente documento para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al polipéptido usado para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. A continuación, se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma así preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma precursoras no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
En algunas realizaciones, las células de mieloma preferentes son aquellas que se fusionan de manera eficaz, apoyan la producción estable de altos niveles del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como un medio HAT. Entre estas, en algunas realizaciones, las líneas de células de mieloma son líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU. y células SP-2 o x63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. También se han descrito líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el que se desarrollan las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. En algunas realizaciones, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Se puede determinar la afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980).
Después de identificarse las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascítico o suero por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, polipéptido A-sefarosa, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos murinos). En algunas realizaciones, las células de hibridoma sirven como fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras, tales como células de E. coli, células COS de simio, Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen polipéptido de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
En una realización adicional, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en el lugar de las secuencias murinas homólogas (Patente de EE.UU. n.° 4.816.567); Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851) (1984), o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no de inmunoglobulina.
Normalmente dichos polipéptidos no de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, el anticuerpo es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG monoclonal.
(ii) Anticuerpos humanizados
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Se han descrito en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en este a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se citan con frecuencia como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de las regiones hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU n.° 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de las regiones hipervariables y, posiblemente algunos restos de la FR están sustituidos por restos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora respecto toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región marco conservada humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Otro método usa una región marco conservada particular procedente de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con la conservación de una afinidad elevada para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, en algunas realizaciones de los métodos, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles habitualmente y son familiares para aquellos expertos en la materia. Están disponibles los programas informáticos que ilustran y presentan posibles estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas de tal forma que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad aumentada por el antígeno o los antígenos diana. En general, los restos de las regiones hipervariables están directamente, y más sustancialmente, implicados en la influencia de la unión al antígeno.
(iii) Anticuerpos humanos
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Como una alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (p. ej., ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen (Jh) de la región de unión de la cadena pesada de anticuerpo en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulinas de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véanse, p. ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); y las Patentes de EE.UU. N.° 5.591.669; 5.589.369; y 5.545.807.
Como alternativa, se puede usar tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al., 348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominios variables de inmunoglobulina (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo en el marco de un gen de polipéptido mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. La presentación en fagos puede realizarse en diversos formatos; para su revisión véase, p. ej., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación en fagos. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas en Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse también, las Patentes de EE.UU. N.° 5.565.332 y 5.573.905.
También pueden generarse anticuerpos humanos por linfocitos B activados in vitro (véanse las Patentes de EE.UU.
5.567.610 y 5.229.275).
(iv) Fragmentos de anticuerpo
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, p. ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente mediante células hospedadora recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. co liy acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., BiolTechnology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse directamente fragmentos F(ab')2 de cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los facultativos cualificados. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véanse el documento WO 93/16185; la Patente de EE.u U. N° 5.571.894; y la Patente de EE.UU. N° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", p. ej., como se describe en la Patente de EE.UU 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
En algunas realizaciones, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un scFv, un Fv y un diacuerpo.
(v) Anticuerpos biespecíficos
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos a modo de ejemplo pueden unirse a dos epítopos diferentes. Como alternativa, un brazo de unión de un anticuerpo biespecífico puede combinarse con un brazo que se une con una molécula desencadenante en un leucocito tal como una molécula de receptor de linfocitos T (p. ej. CD2 o CD3) o receptores Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) con el fin de centrar los mecanismos de defensa celular en la célula. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (p. ej. anticuerpos biespecíficos de F(ab')2). En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB). En algunas realizaciones, el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión al receptor de linfocitos T. En algunas realizaciones, el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3. En algunas realizaciones, el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3e.
Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es demasiado complicada y los rendimientos del producto son bajos. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En algunas realizaciones, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se inserta en vectores de expresión por separado, y se transfectan simultáneamente en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones donde relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da como resultado rendimientos elevados o cuando las relaciones no son de significación particular.
En algunas realizaciones de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha descubierto que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se divulga en el documento WO/94/04690. Para más detalles acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque descrito en la Patente de EE.UU. N.° 5.731.168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede modificar por ingeniería para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. En algunas realizaciones, la interfaz comprende al menos una parte del dominio Ch3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales de más grandes (p. ej., tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (p. ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos "heteroconjugados" o reticulados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE.UU. N° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 0308936). Los anticuerpos heteroconjugados pueden producirse usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la Patente de EE.UU. N°.4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.
Se han descrito también en la bibliografía las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de formación de complejos de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
También se han descrito diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny etal., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios Vh y Vl de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
(v) Anticuerpos Multivalentes
En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos multivalentes. Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápidamente que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (p. ej., anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno aminoterminales a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido en el presente documento comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena polipeptídica (y preferentemente dos cadenas polipeptídicas), en donde la cadena o cadenas polipeptídicas comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender VD1- (X1) n-VD2- (X2) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender: cadena VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-región Fc; o cadena VH-CH1-VH-CH1-región Fc. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede comprender además al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede, por ejemplo, comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en el presente documento comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL. En algunas realizaciones, el anticuerpo multivalente comprende un fragmento de unión a linfocitos T. En algunas realizaciones, el anticuerpo multivalente comprende un fragmento de unión al receptor de linfocitos T. En algunas realizaciones, el anticuerpo multivalente comprende un fragmento de unión a CD3. En algunas realizaciones, el anticuerpo multivalente comprende un fragmento de unión a CD3e.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico. Ejemplos de anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (Vl), donde la unidad VhVl tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios Vl y Vh con cada unidad VhVl de unión a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos, uniéndose cada dominio variable único a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos, triacuerpos, anticuerpos trifuncionales, fragmentos de anticuerpo que se han unido de forma covalente o no covalente. En alguna realización, ese anticuerpo tiene especificidad poliepitópica; por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la misma o diferentes diana(s). En algunas realizaciones, los anticuerpos son monoespecíficos; por ejemplo, un anticuerpo que se une a un solo epítopo. De acuerdo con una realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 |jM a 0,001 pM, 3 j M a 0,001 pM, 1 j M a 0,001 pM, 0,5 j M a 0,001 pM o 0,1 j M a 0,001 pM.
(vi) Otras Modificaciones de Anticuerpos
Puede ser deseable modificar el anticuerpo proporcionado en el presente documento con respecto a la función efectora, p. ej., con el fin de potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Como alternativa, o adicionalmente, pueden introducirse uno o varios restos cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de intemalización mejorada y/o una destrucción de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) aumentadas. Véase Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J., Immunol.
148:2918-2922 (1992). Pueden prepararse también anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, puede modificarse por ingeniería un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y puede de este modo potenciarse la lisis por el complemento y las capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Para aumentar la mitad de la semivida sérica del anticuerpo en suero, se pueden realizar alteraciones de aminoácidos en el anticuerpo como se describe en el documento US 2006/0067930.
(B) Variantes y Modificaciones de Polipéptidos
La modificación o modificaciones de los polipéptidos, incluyendo anticuerpos, descritos en el presente documento se pueden usar en los métodos de purificación de polipéptidos (p. ej., anticuerpos) descritos en el presente documento.
(i) Polipéptidos Variantes
"Variante de polipéptido" significa un polipéptido, preferentemente un polipéptido activo, como se define en el presente documento que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia natural de longitud completa del polipéptido, una secuencia polipeptídica que carece del péptido señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido señal. Tales variantes de polipéptidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos en donde se añaden o eliminan uno o más restos de aminoácidos, en el extremo N o C de la secuencia de aminoácidos natural de longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido TAT tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente cualquiera de un 85%, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos, con una secuencia polipeptídica de secuencia natural de longitud completa, una secuencia polipeptídica que carece del péptido señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido señal. Opcionalmente, los polipéptidos variantes no tendrán más de una sustitución conservativa de aminoácidos en comparación con la secuencia polipeptídica natural, alternativamente, no más de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones conservativas de aminoácidos en comparación con la secuencia polipeptídica natural.
Los polipéptidos variantes pueden truncarse en el extremo N o el extremo C, o pueden carecer de restos internos, por ejemplo, cuando se comparan con un polipéptido natural de longitud completa. Determinados polipéptidos variantes pueden carecer de restos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada. Estos polipéptidos variantes con truncamientos, deleciones e inserciones se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Los polipéptidos variantes deseados pueden sintetizarse químicamente. Otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido variante deseado, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ácido nucleico se emplean en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los polipéptidos variantes comparten al menos una actividad biológica y/o inmunitaria con el polipéptido natural divulgado en el presente documento.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi-terminales que varían en longitud, desde un resto hasta polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del polipéptido. Se preparan variantes de secuencias de aminoácidos del polipéptido introduciendo los cambios de nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos en las secuencias de aminoácidos del polipéptido. Se realiza cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del polipéptido (p. ej., anticuerpo), tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glucosilación.
Se puede encontrar orientación para determinar qué resto de aminoácido se puede insertar, sustituir o delecionar sin afectar de forma adversa la actividad deseada, comparando la secuencia del polipéptido con las de las moléculas polipeptídicas homólogas conocidas y minimizando el número de cambios en las secuencias de aminoácidos realizados en regiones de elevada homología.
Un método útil para la identificación de determinados restos o regiones del polipéptido (p. ej., anticuerpo) que son ubicaciones preferentes para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe en Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). En este punto, se identifican un resto o grupo de restos diana (p. ej., restos con carga tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferente Alanina o Polialanina) que afecta la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación en sí misma esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se llevó a cabo barrido de ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se exploraron las variantes de anticuerpos expresadas para determinar la actividad deseada.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un resto aminoácido en la molécula de anticuerpo sustituido por un resto diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 2 a continuación bajo el título de "sustituciones a modo de ejemplo". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados "sustituciones a modo de ejemplo" en la Tabla 2, o como se describe adicionalmente a continuación, en referencia a clases de aminoácidos, y explorarse los productos.
Tabla 2.
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Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del polipéptido seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento (a) de la estructura principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación de lámina o helicoidal, (b) de la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) del volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry segunda ed., págs. 73­ 75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):
(1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) ácidos: Asp (D), Glu (E)
(4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H)
Como alternativa, los restos de origen natural pueden dividirse en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede sustituirse, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. Por el contrario, pueden añadirse un enlace o enlaces de cisteína al polipéptido para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).
Un tipo particular preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (p. ej. un anticuerpo humano o humanizado). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para el desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo precursor a partir del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes de sustitución implica la maduración por afinidad usando una biblioteca de presentación en fagos. Brevemente, varios sitios en la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) están mutados para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpos generadas de esta manera se presentan de manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto génico III del paquete M13 en cada partícula. Las variantes presentadas en fagos se exploran a continuación para determinar su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) como se divulga en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede llevar a cabo la mutagénesis de barrido de alanina para identificar restos de regiones hipervariables que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. Como alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y la diana. Dichos restos de contacto y restos adyacentes son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a exploración como se describe en el presente documento y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.
Otro tipo de variante de aminoácidos del polipéptido altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. El polipéptido puede comprender restos de no aminoácidos. Por ejemplo, el polipéptido puede estar glucosilado. Tal glucosilación puede producirse de forma natural durante la expresión del polipéptido en la célula hospedadora o en el organismo hospedador, o puede ser una modificación deliberada que surge de la intervención humana. Por alteración se entiende la eliminación de uno o más restos de hidratos de carbono encontrados en el polipéptido y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el polipéptido.
Normalmente, la glucosilación de polipéptidos está ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la unión del resto de hidratos de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono con la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de una de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. La glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más frecuentemente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
Se realiza convenientemente la adición de sitios de glucosilación al polipéptido alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación ligados a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación ligados a O).
La eliminación de restos de hidrato de carbono presentes en el polipéptido se puede realizar de forma química o enzimática o mediante sustitución mutacional de codones que codifican restos de aminoácidos que sirven como dianas para la glucosilación. La escisión enzimática de restos de hidratos de carbono en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de varias endo y exoglucosidasas.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de los restos de glutaminilo y asparaginilo a los restos correspondientes de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los restos serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina, la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de los grupos carboxilo C-terminal.
(ii) Polipéptidos Quiméricos
El polipéptido descrito en el presente documento se puede modificar de una manera para formar moléculas quiméricas que comprenden el polipéptido fusionado con otro, polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. En algunas realizaciones, una molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta de epítopo generalmente se coloca en el extremo amino o carboxilo del polipéptido. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo del polipéptido se puede detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión de la etiqueta de epítopo permite que el polipéptido se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta de epítopo.
En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Una forma bivalente de la molécula quimérica se denominada "inmunoadhesina".
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de un polipéptido heterólogo con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulinas. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es normalmente una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluidas IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.
Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulinas incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1.
(iii) Conjugados de Polipéptidos
El polipéptido para su uso en formulaciones de polipéptidos puede conjugarse con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, toxina (p. ej., una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir,, un radioconjugado).
Pueden usarse agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales conjugados. Además, las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las misma que se pueden usar incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de toxina de la difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Hay varios radionucleidos disponible para la producción de polipéptidos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 1311, 131In, 90Y y 186Re. Pueden producirse conjugados del polipéptido y agente citotóxico usando diversos agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidioésteres (tales como dimetil adipimidato h Cl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (pazidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolieno 2,6-diisocianato) y compuestos de bis-fluorina activa (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación del radionucleótido con el polipéptido.
También se contemplan, en el presente documento, conjugados de un polipéptido y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una calicheamicina, maitansinoides, un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad toxina.
Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África oriental Maytenus serrata. Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de C-3 maitansinol. También se contemplan maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo. Existen numerosos grupos enlazadores conocidos en la técnica para producir conjugados de polipéptido-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los divulgados en la patente de e E.UU. N° 5.208.020. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa o grupos lábiles a esterasa, como se divulga en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter.
El enlazador puede estar fijado a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, se puede formar un enlace éster por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, en la posición C-14 modificada con hidroximetilo, en la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y en la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.
Otro conjugado de interés comprende un polipéptido conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de la calicheamicina es capaz de producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de calicheamicina, véase, p. ej., la Patente de EE.UU.
N° 5.712.374. Los análogos estructurales de calicheamicina que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, Yi1, a2l, a3I, N-acetil-Yi1, PSAG y Bi1. Otro fármaco antitumoral con el que se puede conjugar el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la calicheamicina como QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por polipéptidos (p. ej., anticuerpo) potencia en gran medida sus efectos citotóxicos.
Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288, así como esperamicinas.
En algunas realizaciones, el polipéptido puede ser un conjugado entre un polipéptido y un compuesto con actividad nucleolítica (p. ej., una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; DNasa).
En otra realización más, El polipéptido (p.ej., anticuerpo) puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en el predireccionamiento tumoral en donde el conjugado de polipéptido-receptor se administra paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación usando un agente de aclaramiento y después la administración de un "ligando" (p. ej. avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (p. ej. un radionucleótido).
En algunas realizaciones, el polipéptido puede conjugarse con una enzima activadora de profármacos que convierte un profármaco (p. ej., un agente quimioterapéutico peptidílico) en un fármaco anticanceroso activo. El componente enzimático del inmunoconjugado incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal forma que lo convierte en su forma citotóxica más activa.
Las enzimas que son útiles incluyen, pero sin limitación, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; proteasas, tal como proteasa de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tal como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que escinden hidratos de carbono tales como p-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; p-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con p-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tal como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Como alternativa, se pueden utilizar anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", para convertir los profármacos en fármacos activos libres.
(iv) Otro
Otro tipo de modificación covalente del polipéptido comprende enlazar el polipéptido a uno de varios polímeros no proteicos, p. ej., polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El polipéptido también puede inmovilizarse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización de interfaces (p. ej., microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Gennaro, A.R., Ed., (1990).
V. Obtención de Polipéptidos para su Uso en las Formulaciones y Métodos
Los polipéptidos usados en los métodos de análisis descritos en el presente documento pueden obtenerse usando métodos bien conocidos en la técnica, incluidos los métodos de recombinación. Las siguientes secciones brindan orientación sobre estos métodos.
(A) Polinucleótidos
"Polinucleótido", o "ácido nucleico", tal como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluye ADN y ARN.
Los polinucleótidos que codifican polipéptidos se pueden obtener de cualquier fuente, incluyendo, pero sin limitación, una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del polipéptido y que lo expresa a un nivel detectable. Por consiguiente, los polinucleótidos que codifican polipéptidos se pueden obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica polipéptidos también puede obtenerse de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (p. ej., síntesis automatizada de ácidos nucleicos).
Por ejemplo, el polinucleótido puede codificar una cadena de molécula de inmunoglobulina completa, tal como una cadena ligera o una cadena pesada. Una cadena pesada completa incluye no solo una región variable de cadena pesada (Vh) sino también una región constante de cadena pesada (Ch), que normalmente comprenderá tres dominios constantes: Ch1, Ch2 y Ch3; y una región "bisagra". En algunas situaciones, es deseable la presencia de una región constante. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica una o más cadenas de moléculas de inmunoglobulina de un TDB.
Otros polipéptidos que pueden codificarse por el polinucleótido incluyen fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno tales como anticuerpos de dominio único ("dAb"), Fv, scFv, Fab 'y F (ab')2 y "minicuerpos". Los minicuerpos son (normalmente) fragmentos de anticuerpos bivalentes de los que se ha eliminado los dominios Ch1 y Ck o Cl. Como los minicuerpos son más pequeños que los anticuerpos convencionales, deberían lograr una mejor penetración tisular en el uso clínico/diagnóstico, pero al ser bivalentes, deberían conservar una mayor afinidad de unión que los fragmentos de anticuerpos monovalentes, tal como dAb. Por consiguiente, a menos que el contexto dicte lo contrario, el término "anticuerpo" como se usa en el presente documento abarca no solo moléculas de anticuerpos completas sino también fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos del tipo analizado anteriormente. Preferentemente, cada región marco conservada presente en el polipéptido codificado comprenderá al menos una sustitución de aminoácidos con respecto al marco aceptor humano correspondiente. Por lo tanto, por ejemplo, las regiones marco conservadas pueden comprender, en total, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones de aminoácidos con respecto a las regiones marco conservadas aceptoras.
Todas las características divulgadas en la presente memoria descriptiva pueden combinarse en cualquier combinación. Cada característica divulgada en esta memoria descriptiva puede reemplazarse por una característica alternativa que sirva al mismo, equivalente o similar propósito. Por lo tanto, a menos que se indique de manera expresa lo contrario, cada característica divulgada es únicamente un ejemplo de una serie genérica de características equivalentes o similares.
Los siguientes Ejemplos no limitantes ilustran más detalles de la invención.
Ejemplos
Los ejemplos a continuación están destinados a ser puramente a modo de ejemploes de la invención y no deben considerarse limitantes de la invención de ninguna manera. Los siguientes ejemplos y la descripción detallada se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplo 1. Los homodímeros anti-CD3 activan los linfocitos T
Un Anticuerpo Biespecífico Dependiente de Linfocitos (TDB) (TDB aCD20/aCD3, anti-CD20 (Mab2; VH SEQ ID NO: 31/VL SEQ ID NO: 32)/anti-CD3 (Mab1; VH SEQ ID NO: 19/VL SEQ ID NO: 20)) requiere células que expresan el antígeno CD20 para inducir la activación de linfocitos T y la destrucción de las células con antígenos. Tal como se muestra en la Fig. 1A, los linfocitos T CD8+ se aislaron de sangre periférica humana, se incubaron con una línea celular diana que expresa antígeno en una relación 1:1 y se estimularon con concentraciones crecientes de anticuerpo TDB aCD20/aCD3 purificado. Después de una incubación programada de 24 horas después de la adición de TDB a las células, se evaluaron los Linfocitos T para determinar la cantidad de CD69 (proteína lectina de tipo C) y CD25 (receptor de IL-2) que se indujo en la superficie del linfocito T, que son marcadores de la activación de linfocitos T (Shipkova M, 2012, Clin. Chim. Acta. 413:1338-49 y Ziegler SF, et al., 1994, Stem Cells 12(5): 465-465), mediante citometría de flujo. La expresión en la superficie celular de CD69 y CD25 aumenta de manera dependiente de la dosis tras la estimulación con TDB aCD20/aCD3. En ausencia de células diana (rectángulos azules) no hay activación de linfocitos T como lo demuestra la falta de aumento en la expresión en la superficie celular de CD69 y CD25. Como se muestra en la Fig. 1B, se requiere que los linfocitos T medien en la destrucción de las células diana por TDB aCD20/aCD3. Las PBMC, o PBMC que se agotaron de CD3+ (receptor de linfocitos T/subunidad CD3e) por selección negativa (Milteny Biotec), se incubaron con una línea celular diana que expresaba CD20 en una relación 1:1, y después se estimularon con concentraciones crecientes de TDB aCD20/aCD3. Las PBMC mostraron una disminución dependiente de la dosis en el número de células diana mediante citometría de flujo después de 24 horas (círculos rojos). Sin embargo, no se detectó pérdida de células diana cuando los linfocitos T CD3+ se agotaron del grupo de PBMC (rectángulos azules). Por tanto, el agotamiento de las células diana que expresan CD20 por TDB aCD2o/aCD3 requiere la activación de linfocitos T CD3+, y TDB aCD20/aCD3 no es capaz de inducir la destrucción de las células diana solo.
El homodímero anti-CD3 purificado activa los linfocitos T de donantes humanos. Se trataron PBMC de donantes humanos de dos donantes diferentes con concentraciones crecientes de homodímero anti-CD3 purificado o anticuerpo biespecífico TDB aCD20/aCD3 y se analizaron para determinar el nivel de activación de linfocitos T por FACS después de 24 horas como se describe anteriormente. El donante 1 (Fig. 2, panel izquierdo) y el donante 2 (Fig. 2, panel derecho) se tiñeron con anticuerpo anti-CD8, anticuerpos anti-CD69 y anti-CD25. El porcentaje de linfocitos T CD8+ positivos para los marcadores de activación de linfocitos T CD69 y CD25 se representaron gráficamente frente a la cantidad de homodímero anti-CD3 o tratamiento con TDB aCD20/aCD3. Anti-CD3 y TDB aCD20/aCD3 activa de manera dependiente de la dosis los linfocitos T en presencia de células diana, pero TDB aCD20/aCD3 (CE50: 4-6 ng/ml) es un activador de linfocitos T más fuerte que el homodímero anti-CD3 (CE50: 169-526 ng/ml). A pesar de la variabilidad de los donantes, el homodímero anti-CD3 puede activar los linfocitos T humanos.
El homodímero anti-CD3 puede disminuir la potencia del anticuerpo biespecífico. Se añadió TDB aCD20/aCD3 con concentraciones variables de homodímero anti-CD3 purificado y se midieron las respuestas. El homodímero anti-CD3 disminuye significativamente de manera dependiente de la dosis la potencia de t Db aCD20/aCD3, tanto a nivel de activación de linfocitos T como a nivel de respuesta de células diana a los niveles de homodímero anti-CD3 por encima del 20 % (Fig. 3A y Tabla 3). Los niveles bajos de homodímero anti-CD3 (HD) añadido a TDB aCD20/aCD3 no reducen significativamente la activación de linfocitos T (CD8+, Fig. 3B panel de la izquierda; CD4+, Fig. 3B panel de la derecha) utilizando PBMC. Las PBMC se estimularon con niveles crecientes de TDB que se habían fijado con una cantidad constante (2,5 % o 5 %) de homodímero anti-CD3 purificado y se analizaron mediante citometría de flujo (FACS) para evaluar la activación de linfocitos T (tinción para marcadores de activación de linfocitos T CD69 y CD25). El homodímero anti-CD3 a niveles inferiores al 5 % no afecta a la posible activación de linfocitos T por TDB aCD20/aCD3 de cualquiera de los linfocitos TCD8+ o CD4+.
Tabla 3
Figure imgf000032_0001
El homodímero anti-CD3 puede activar débilmente los linfocitos T CD8+ humanos de varios donantes humanos en ausencia de células diana. En presencia de células diana, TDB aCD20/aCD3 es capaz de activar fuertemente la mayoría de los linfocitos T CD8+ de PBMC aisladas de 6 donantes humanos, y los niveles bajos de homodímero anti-CD3 (2,5 % o 5 %) no activan significativamente el potencial medio de activación de linfocitos T del TDB (Fig. 4A; condición B+). En ausencia de células diana (Fig. 4A; condición B), el homodímero anti-CD3 puede activar linfocitos T CD8+ débilmente (aumento medio leve del potencial de activación). La activación del homodímero anti-CD3 de los linfocitos T humanos muestra una tendencia dependiente de la dosis para el aumento de algunas citocinas representativas. Las PBMC aisladas de 6 donantes humanos se estimularon con 1 mg/ml de TDB aCD20/aCD3 en presencia (condición B+) o ausencia (condición B) de células diana, añadido con o sin homodímero anti-CD3 purificado al 2,5 % o al 5 %, y se evaluó para determinar el potencial de activación de linfocitos T mediante la prueba de citocinas secretadas como una indicación de la activación de linfocitos T. Después 24 horas, se recogió el medio acondicionado y se probó la presencia de citocinas usando un kit de detección de citocinas Luminex. El tratamiento con homodímero anti-CD3 en ausencia de células diana mostró un aumento dependiente de la dosis significativo en algunos niveles de citocinas (IL-10 y MCP-1) de algunas PBMC donantes (Figs. 4B-4E; condición B). Se ha representado gráficamente la respuesta media del nivel medio de citocinas.
Ejemplo 2. Ensayo de impurezas de homodímeros anti-CD3
Se ha desarrollado un ensayo de impurezas biológicas para detectar la presencia de impurezas que activan los linfocitos T en presencia de un anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB). Como el homodímero anti-CD3 es bivalente, cada brazo de la impureza puede potencialmente reticular el TCR que conduce a la activación de linfocitos T. La reticulación mediada por TCR por anticuerpos bivalentes anti-CD3, tal como OKT3, activa las cascadas de transducción de señales de los linfocitos T que conducen a la fosforilación y localización nuclear de los factores de transcripción, incluyendo NFAT y NFkB, dando como resultado la inducción transcripcional de genes diana tal como citocinas o agentes destructores de células tal como Fas, Granzima B y Perforinas (Brown, WM, 2006, Curr Opin Investig Drugs 7:381-388; Ferran, C et al., 1993 Exp Nephrol 1:83-89; Shannon, MF et al., 1995, J. Leukoc. Biol.
57:767-773; Shapiro VS et al., 1998, J. Immunol. 161(12)6455-6458; Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol., 15(12):1441-1450). Los genes indicadores, tal como luciferasa de luciérnaga, bajo el control transcripcional de AP1, NFAT o NFkB, se han utilizado para monitorizar la activación de TCR de las vías de señalización y la activación de linfocitos T (Shannon, MF et al., 1995, J. Leukoc. Biol. 57:767-773; Shapiro, 1998). Como un TDB no activa los linfocitos T en ausencia de células diana (Figs. 1A y 1B), se evaluó un enfoque de ensayo con genes indicadores como una posible estrategia de ensayo para detectar homodímero anti-CD3 en presencia de TDB. Para evaluar inicialmente si los homodímeros anti-CD3 pueden activar los linfocitos T in vitro, se infectaron linfocitos T Jurkat (DSMZ, ACC 282) con reservas lentivirales de genes indicadores recombinantes sensibles a TCR (API-Luciferasa, NFAT-Luciferasa o NFkB-Luciferasa) y grupos estables tratados con homodímero anti-CD3 purificado a 10 |jg/ml durante 4 horas. Los grupos estables de Jurkat/APILuciferasa, Jurkat/NFATLuciferasa y Jurkat/NFKBLuciferasa muestran una inducción de luciferasa dependiente de la dosis tras la estimulación con homodímero anti-CD3 purificado. Se representaron gráficamente las respuestas de luminiscencia (actividad del gen indicador de luciferasa), con la respuesta más alta observada del grupo estable Jurkat/NFKBluciferasa. (Fig. 5A). Los clones estables de Jurkat/NFKBLuciferasa aislados mediante dilución limitante se seleccionaron para determinar su respuesta a 10 jg/m l de homodímero anti-CD3 purificado. Los grupos de linfocitos T Jurkat NFKBLuciferasa demostraron la mayor respuesta al homodímero anti-CD3 en comparación con otros elementos de respuesta a TCR, pero los otros elementos de respuesta también podrían ser potencialmente útiles para detectar homodímero anti-CD3. (Fig. 5B).
Para determinar la respuesta relativa de este clon a TDB aCD20/aCD3 o al homodímero anti-CD3, la línea celular del clon 2 de Jurkat/NFKBLuciferasa se trató con concentraciones crecientes de homodímero TDB aCD20/aCD3 o anti-CD3 en presencia de una línea celular diana que expresaba CD20, y se representó gráficamente la actividad luciferasa (Fig. 6A). Las células se estimularon con TDB aCD20/aCD3 o un homodímero CD3 durante 4 horas en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10 %. Purificado es 1000 veces más activo que el homodímero anti-CD3 purificado, en presencia de células diana coestimuladoras. El nivel de activación de linfocitos T por el homodímero anti-CD3 es más bajo que el de TDB aCD20/aCD3, pero es detectable en presencia de células diana. En ausencia de células diana, TDB aCD20/aCD3 no da como resultado la activación de linfocitos T incluso a niveles altos de TDB, medido por la activación de la transcripción de luciferasa dependiente de NFkB en esta línea celular, pero el homodímero anti-CD3 es capaz de inducir la inducción de luciferasa incluso a niveles bajos de la impureza relacionada con el producto (Fig. 6B). Estas respuestas de activación de linfocitos T observadas para la línea celular con gen indicador del clon 2 de Jurkat/NFKBLuciferasa modificada por ingeniería son comparables a las observadas usando linfocitos T humanos aislados de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) del donante usando otras medidas de activación de linfocitos T, lo que indica que el uso de un gen indicador para monitorizar la respuesta de activación de linfocitos T es comparable (Tabla 4). La línea celular del clon 2 de Jurkat/NFKBluciferasa (Jurkat-NFkBLuc), se utilizó para desarrollar y optimizar un método de ensayo basado en células para la detección de la impureza de homodímeros anti-CD3 en TDB aCD20/aCD3. En conjunto, estos datos demuestran que se puede usar una línea celular con genes indicadores de linfocitos T modificada genéticamente para detectar impurezas relacionadas con el producto de homodímeros anti-CD3 biológicamente activos en un TDB.
Tabla 4
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Ejemplo 3. Método cuantitativo para detectar homodímeros anti-CD3
Se ha desarrollado un método analítico sensible y cuantitativo para detectar impurezas biológicamente activas presentes en presencia de TDB aCD20/aCD3. El ensayo de activación de linfocitos T por TDB aCD20/aCD3 detecta el homodímero anti-CD3 presente en muestras de prueba de TDB midiendo la activación inducida por la reticulación de CD3e/TCR de la vía de señalización Rel/NFKB utilizando una línea celular con genes indicadores de linfocitos T modificadas por ingeniería, Jurkat-NFKBLuc. Debido a que no hay células diana presentes en el ensayo, solo el homodímero anti-CD3 puede activar la línea de células indicadoras de linfocitos T. NFkB activado se trasloca al núcleo, se une a los 8 elementos de respuesta a NFkB en el promotor sintético que impulsa la transcripción de Luciferasa. En el ensayo, se prepararon diluciones del patrón de ensayo de homodímeros anti-CD3, control de homodímero anti-CD3 y muestras de prueba de TDB aCD20/aCD3 y se añadieron a células con gen indicador Jurkat-NFKBLuc cultivadas en una placa de ensayo de 96 pocillos. El patrón de homodímero aCD3 es un lote purificado de homodímero aCD3 aislado del proceso de purificación de TDB aCD20/aCD3. El control de homodímero aCD3 es TDB aCD20/aCD3 añadido con homodímero aCD3 purificado y se usa como criterio de idoneidad del sistema en el ensayo. El uso del control de homodímero aCD3 en el ensayo es específico del método utilizado para la ejecución del ensayo de impurezas. Después de una incubación programada de cuatro horas, se midió la cantidad de actividad luciferasa que se ha inducido por el Patrón de Ensayo de Homodímeros, por el control de homodímero y por las muestras de prueba de TDB aCD20/aCD3 usando un lector de placas de luminiscencia. La cantidad de homodímero anti-CD3 biológicamente activo en una muestra de prueba de TDB aCD20/aCD3 se determinó a partir de una curva patrón de luminiscencia generada a partir del Patrón de Ensayo de Homodímeros anti-CD3 en un conjunto separado de pocillos de placa (Fig. 7). El porcentaje de homodímero anti-CD3 presente en una muestra de prueba se determinó mediante la relación de la cantidad de homodímero anti-CD3 presente con respecto a la cantidad total de TDB aCD20/aCD3 presente en la muestra de prueba. La precisión del método se evaluó añadiendo cantidades conocidas de homodímero anti-CD3 purificado en una preparación de TDB aCD20/aCD3 y midiendo el porcentaje de recuperación de homodímero anti-CD3. El método muestra una buena linealidad general (Fig. 8) y tiene una precisión general del 6,8 % (Tabla 5). En una reserva de 1 mg/ml de TDB aCD20/aCD3, el método fue capaz de detectar de manera reproducible niveles

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un anticuerpo biespecífico dependiente de linfocitos T (TDB) en donde el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método
poner en contacto una población de linfocitos T con la composición, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana,
en donde la expresión del indicador indica la presencia de homodímeros anti-CD3.
2. Un método para cuantificar la cantidad de anticuerpos de homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un TDB en donde el TDB comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, comprendiendo el método poner en contacto la población de linfocitos T con la composición a una o más concentraciones del TDB, en donde los linfocitos T comprenden ácido nucleico que codifica un indicador unido operativamente a un promotor sensible a la activación de linfocitos T y en donde la población de linfocitos T no comprende el antígeno diana,
correlacionar la expresión del indicador en función de la concentración de anticuerpos con una curva patrón generada al poner en contacto los linfocitos T con diferentes concentraciones de homodímeros anti-CD3 purificados.
3. El método de la reivindicación 2, en donde la curva patrón se genera poniendo en contacto los linfocitos T con diferentes concentraciones de anticuerpo anti-CD3 purificado que varían desde 0,01 ng/ml a 50 ng/ml.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el indicador es una luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, una beta lactamasa o una beta galactosidasa, opcionalmente en donde la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T es un promotor NFAT, un promotor AP-1, un promotor de NFkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor IRF.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T comprende elementos sensibles a la activación de linfocitos T de uno o más de NFAT, AP-1, NFkB, FOXO, STAT3, STAT5 y IRF.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde i) la población de linfocitos T es una población de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+, o en donde ii) la población de linfocitos T es una población de linfocitos T Jurkat o linfocitos T CTLL-2.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la población de linfocitos T se pone en contacto con una composición que comprende el anticuerpo biespecífico a una concentración que varía de 0,01 ng/ml a 50 ng/ml.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el indicador es detectado después de una o más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 o 24 horas después de poner en contacto las células con la composición.
10. Un linfocito T modificado por ingeniería para la detección de homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un anticuerpo biespecífico, donde el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, en donde el linfocito T comprende un indicador unido operativamente a un elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T, en donde el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T comprende elementos sensibles a la activación de linfocitos T de uno o más de AP-1, NFkB, FOXO, STAT3, STAT5 y IRF.
11. El linfocito T modificado por ingeniería de la reivindicación 10, en donde el indicador es una luciferasa, una proteína fluorescente, una fosfatasa alcalina, beta lactamasa o beta galactosidasa, opcionalmente en donde la luciferasa es una luciferasa de luciérnaga, una luciferasa de Renilla o una nanoluciferasa.
12. El linfocito T modificado por ingeniería de las reivindicaciones 10 u 11, en donde el elemento de respuesta que es sensible a la activación de linfocitos T es un promotor AP-1, un promotor de NFkB, un promotor FOXO, un promotor STAT3, un promotor STAT5 o un promotor IRF.
13. El linfocito T modificado por ingeniería de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde i) la población de linfocitos T es una población de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+, o en donde ii) la población de linfocitos T es una población de linfocitos T Jurkat o linfocitos T CTLL-2.
14. Un kit para la detección de homodímeros anti-CD3 en una composición que comprende un anticuerpo biespecífico donde el anticuerpo biespecífico comprende un fragmento de unión al antígeno diana y un fragmento de unión a CD3, en donde el kit comprende un linfocito T modificado por ingeniería de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13.
15. El kit de la reivindicación 14, que comprende además un patrón de ensayo de homodímeros anti-CD3 y/o un control de homodímeros anti-CD3.
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