KR102583058B1 - 항-cd3 동종이량체를 검출하기 위한 세포 기반 검정 - Google Patents

항-cd3 동종이량체를 검출하기 위한 세포 기반 검정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T 세포-의존적 이중특이적 항체 (TDB)를 포함하는 조성물에서 항-CD3 동종이량체를 식별하고/하거나 정량화하기 위한 세포 기반 검정을 제공한다. 일부 양태에서, T 세포 활성화 반응성 리포터를 포함하는 본 발명의 T 세포는 항-CD3 동종이량체의 존재를 검출하기 위해 TDB와 접촉된다. 리포터 T 세포의 조성물 및 키트가 또한 고려된다.

Description

항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 세포 기반 검정
관련 출원에 대한 교차참조
본원은 개시내용이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 편입되는, 2015년 5월 28일 목요일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/167,761의 이점을 주장한다.
ASCII 텍스트 파일 상에서의 서열목록 제출
ASCII 텍스트 파일 상에서의 하기 제출된 내용은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: 146392022940SEQLISTING.txt, 기록된 날짜: 2016년 5월 26일 목요일, 크기: 17 KB).
기술 분야
본 발명은 다중특이적 항체의 적어도 하나의 항원 결합 단편이 CD3에 결합하는 다중특이적 항체의 제제를 분석하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 다중특이적 항체의 조성물 내 항-CD3 동종이량체의 존재를 계측하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 다중특이적 항체의 적어도 하나의 항원 결합 단편은 CD3에 결합한다.
T 세포 의존적 이중특이적 (TDB) 항체는 세포 상에 발현된 표적 항원에 결합하고, 종종 T 세포 수용체의 CD3e 하부단위에 결합함으로써 T 세포에 결합하도록 설계된다. 표적 항원의 세포외 도메인 및 T 세포의 CD3 모두에 대한 이중특이적 항체의 결합은 표적 세포로의 T 세포 동원 (recruitment)을 야기하여 T 세포 활성화 및 표적 세포 고갈을 야기한다. 표적 세포의 부재하에, 단일 항-CD3 아암 (arm)은 TCR에 교차결합할 수 없어서 T 세포 활성화 및 표적 세포 사멸을 유도할 수 없다. 항-CD3 동종이량체는 TDB 항체의 제조 공정 동안 형성되고, TCR에 교차결합하여 표적 세포의 존재 또는 부재하에 낮은 수준의 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 생성물 관련 불순물이다. 항-CD3 동종이량체는 또한 시험관내에서 TDB 생물학적 효능의 감소를 야기할 수 있는 높은 수준으로 존재하는 경우 치료 효능에 영향을 미칠 수 있다. 항-CD3 동종이량체는 표적 세포의 부재하에 T 세포에 의해 낮은 수준의 T 세포 활성화 및 염증성 사이토카인을 유도함으로써 오프-타겟 (off-target) 효과를 가질 수 있다. 따라서, TDB의 제조 공정에 존재하는 T 세포를 활성화시키는 생성물 관련 변이체의 수준을 조절하는 것이 바람직하며, 안전하고 효과적인 임상 약물 후보의 개발을 지원하기 위해 정제된 생성물에 존재할 수 있는 항-CD3 동종이량체를 검출하는 민감하고 재현성 있고 정량적인 불순물 검정 방법이 필요하다.
불순물 검정은 생성물/공정 관련 불순물과 원하는 생성물을 구별할 수 있어야 한다. 차이니즈 햄스터 난소 세포 단백질 (CHOP) 불순물 검출을 위한 많은 전통적인 접근법은 생성물 순도 및 안전성을 평가하기 위해 공정 관련 CHO 단백질의 존재를 생성물에서 민감하게 검출할 수 있는 결합 검정 포맷 접근법을 사용한다. 이러한 CHOP 항체는 CHOP 단백질에 특이적이지만, 생성물을 인식하지 못하므로, 일반적으로 최종 생성물의 존재하에 불순물을 민감하게 검출하는데 아무런 영향을 미치지 않는다. 항체가 최종 생성물과 불순물을 구별하는 것으로 식별되면, 이중-특이적 항체에 대해 유사한 접근법이 사용될 수 있다. 유용한 항-CD3 동종이량체 결합 검정 포맷의 구현은 이 항원에 가능하지 않을 수 있는 고도로 전문화된 항체, 또는 일반적으로 다른 이중-특이적 항체의 개발을 필요로 할 것이다. 대안적인 생리화학적 기반 방법 (RP-HPLC, Mass Spec)이 또한 생성물 관련 불순물을 검출하는데 사용될 수 있고, 이는 생성물 관련 불순물을 생성물로부터 적절하게 분리하여, 존재하는 불순물의 양을 검출하는 능력에 의존한다. 불순물의 양은 물질에 존재하는 다른 종에 비례하여 검출되거나, 또는 변이체 표준에 스파이크(spike)하고 존재하는 물질의 백분율을 스파이크된 표준과 비교함으로써 검출된다. 그러나, 이들 방법 중 많은 방법들은 원하는 생성물 물질로부터 변이체를 분리하기 위해 추가의 샘플 처리 및 가공 단계를 포함할 수 있고 이러한 단계는 물질을 변경시키거나 방법의 민감도 및 정확도를 제한할 수 있다. 더욱이, 이중-특이적 시험 물품 (정제된 생성물, DS, DP, 안정성 샘플, 응력 샘플)에 존재할 수 있는 임의의 항-CD3 동종이량체 생성물 관련 불순물의 구조적 이소형(isoform), 또는 다른 잠재적 T 세포 활성화 불순물이 불순물에 적절한 위험을 부여하기 위해 생물학적 활성이라는 것을 아는 것이 또한 바람직하다. 본원에 기재된 신규한 항-CD3 동종이량체 분석 접근법은 생물학적 활성 항-CD3 동종이량체 불순물을 검출하는 세포 기반 접근법을 사용하며, 이에 의해 결합 검정 또는 생리화학적 기반 포맷을 사용하는 이중 특이적 제제에서의 동종이량체 불순물 검출에 대한 문제점 및 한계를 회피한다.
출원 및 문헌들을 비롯하여 본원에 언급된 모든 참조들은 그 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
본 발명은 T 세포 의존적 이중특이적 항체 (TDB)를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 이중특이적 항체는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하며, 상기 방법은 상기 조성물의 T 세포의 집단을 접촉시키는 단계를 포함하되, 여기서 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소에 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 T 세포 집단은 표적 항원을 포함하지 않으며, 그리고 상기 리포터의 발현은 항-CD3 동종이량체의 존재를 표지한다.
상기 구현예 중 일부 구현예에서, 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 추가 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 활성화 반응 요소를 포함한다.
상기 구현예 중 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 주카트 T 세포 또는 CTLL-2 T 세포의 집단이다.
상기 구현예 중 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 0.01 ng/mL 내지 50 ng/mL 범위의 농도의 이중특이적 항체를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일부 구현예에서, 리포터는 세포를 조성물과 접촉시킨 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 또는 24시간 중 어느 하나 이상 이후에 검출된다.
일부 양태에서, 본 발명은 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체 항체의 양을 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 상기 TDB의 하나 이상의 농도에서 상기 조성물과 T 세포의 집단을 접촉시키는 단계 (여기서 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 T 세포의 집단은 표적 항원을 포함하지 않음), 및 정제된 항-CD3 동종이량체의 상이한 농도로 상기 T 세포를 접촉시킴에 의해 생성된 표준 곡선과 항체 농도의 작용으로서 상기 리포터의 발현을 연관시키는 단계를 포함한다.
조성물 내 항-CD3 동종이량체 항체의 양을 정량화하는 상기 중 일부 구현예에서, 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 추가 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다.
조성물 내 항-CD3 동종이량체 항체의 양을 정량화하는 상기 중 일부 구현예에서, 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 추가 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 활성화 반응 요소를 포함한다.
상기 구현예 중 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 주카트 T 세포 또는 CTLL-2 T 세포의 집단이다.
상기 구현예 중 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 0.01 ng/mL 내지 50 ng/mL 범위의 농도의 이중특이적 항체를 포함하는 조성물과 접촉된다. 일부 구현예에서, 리포터는 세포를 조성물과 접촉시킨 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 또는 24시간 중 어느 하나 이상 이후에 검출된다.
일부 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 가공된 T 세포를 제공하며, 여기서 상기 이중특이적 항체는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고, 그리고 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소에 작동가능하게 연결된 리포터를 포함한다.
상기 양태 중 일부 구현예에서, T 세포는 리포터를 포함하고, 여기서 상기 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 추가 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다.
상기 구현예 중 일부 구현예에서, T 세포는 리포터를 포함하고, 여기서 상기 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 추가 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 활성화 반응 요소를 포함한다.
상기 구현예 중 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 주카트 T 세포 또는 CTLL-2 T 세포의 집단이다.
일부 양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 이중특이적 항체는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고, 그리고 상기 키트는 T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소에 작동가능하게 연결된 리포터를 포함하는 가공된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 항-CD3 동종이량체 검정 표준 및/또는 항-CD3 동종이량체 대조군을 추가로 포함한다.
상기 키트 중 일부 구현예에서, 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 추가 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다.
상기 키트 중 일부 구현예에서, 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 추가 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소는 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 활성화 반응 요소를 포함한다.
상기 키트 중 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 주카트 T 세포 또는 CTLL-2 T 세포의 집단이다.
도 1a 및 1b는 CD20 TDB (αCD20 (Mab2; VH 서열번호:31/VL 서열번호:32)/αCD3(Mab1; VH 서열번호:19/VL 서열번호:20))가 T 세포 활성화 및 표적 세포 사멸을 유도하는 항원 CD20 발현 표적 세포를 필요로 한다는 것을 나타낸다. 도 1a는 CD69 및 CD25의 발현에 의해 측정된 바와 같은 CD8+ 세포의 활성화를 나타낸다. 원은 표적 세포를 포함하는 샘플을 나타내고, 정사각형은 T 세포를 함유하나 표적 세포를 함유하지 않는 샘플을 나타낸다. 도 1b는 T 세포의 존재하에 (원) 또는 PBMC 풀 (pool)에서 CD3+ T 세포가 고갈된 샘플에서 (정사각형) 표적 세포의 사멸을 나타낸다.
도 2는 항-CD3 동종이량체가 인간 공여자 T 세포를 활성화할 수 있다는 것을 도시한다. 2명의 상이한 공여자로부터의 인간 PBMC에 증가하는 양의 정제된 항-CD3 동종이량체 (삼각형) 또는 CD20 TDB (원)를 처리하였다. 인간 CD8+ 세포의 집단에서의 % CD69+ 세포에 의해 T 세포 활성화를 측정하였다. CD20 TDB에 대한 EC50 은 공여자 1로부터의 세포의 경우 5.5 ng/ml 및 공여자 2로부터의 세포의 경우 4.4 ng/ml이었다. 항-CD3 동종이량체에 대한 EC50 은 공여자 1로부터의 세포의 경우 526 ng/ml 및 공여자 2로부터의 세포의 경우 169 ng/ml이었다.
도 3a는 항-CD3 동종이량체가 CD20 TDB 효능을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. CD20 TDB에 다양한 양의 항-CD3 동종이량체를 첨가하고, 표적 세포 (정사각형) 및 T 세포 (마름모) 반응을 측정하였다. 도 3b는 CD20 TDB에 첨가된 낮은 수준의 항-CD3 동종이량체가 CD8+ T 세포 활성화 (좌측 패널) 또는 CD4+ T 세포 활성화 (우측 패널)를 유의하게 감소시키지 않는다는 것을 보여준다. CHO TDB는 원으로 표시되고, CHO TBD + 2.5% HD는 정사각형으로 표시되며, CHO TBD + 5% HD는 삼각형으로 표시되어 있다.
도 4a는 항-CD3 동종이량체가 표적 세포의 부재 하에서 다양한 인간 공여자 유래의 인간 CD8- T 세포를 약하게 활성화할 수 있다는 것을 도시한다. 도 4b-4e는 인간 T 세포의 항-CD3 동종이량체 활성화가 일부 대표적인 사이토카인에 대해 용량 의존적 증가 경향을 나타낸다는 것을 보여준다. 평균 사이토카인 수준 반응을 도식화하였다.
도 5a는 항-CD3 동종이량체에 의한 T 세포 활성화가 리포터 유전자 검정을 사용하여 모니터링될 수 있음을 보여준다. 다양한 T 세포 수용체 (TCR) 반응성 전사 반응 요소 (AP-1, NFAT, 및 NFκB)에 의해 구동되는 반딧불 루시퍼라제 리포터 유전자를 안정적으로 발현시키도록 인간 주카트 CD4+ T 세포주를 유전적으로 가공하고, 무변성 세포 풀을 선택하고, 상기 풀을 4시간 동안 10 μg/mL의 정제된 항-CD3 동종이량체 처리에 대한 반응에 대해 평가하였다. 발광 반응 (루시퍼라제 리포터 유전자 활성)을 도식화하였고, 가장 높은 반응은 주카트/NFκB루시퍼라제 무변성 풀로부터 관찰되었다. 도 5b는 주카트/NFκB루시퍼라제 무변성 클론을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 정제된 항-CD3 동종이량체가 표적 세포의 존재 또는 부재하에 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 보여준다. 도 6a는 T 세포를 활성화시키는 정제된 CD20 TDB 및 정제된 항-CD3 동종이량체 잠재성의 비교를 나타낸다. NFκB루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 주카트 T 세포는 표적 항원 발현 세포의 존재하에 CD20 TDB에 의해 용량 의존적으로 활성화된다. CD20 TDB는 표적 항원 발현 세포주의 존재하에 주카트/NFκB-반딧불루시퍼라제 세포를 활성화시킨다. 정제된 CD20 TDB는 공-자극 (co-stimulatory) 표적 항원-발현 세포의 존재하에 정제된 항-CD3 동종이량체보다 1000배 더 활성이다. 도 6b는 표적 항원-발현 세포의 부재하에 (정사각형), CD20 TDB는 주카트/NFκB루시퍼라제 세포를 활성화시키지 않지만, 정제된 항-CD3 동종이량체는 루시퍼라제 활성을 용량 의존적으로 유도한다 (마름모)는 것을 보여준다.
도 7은 CD20 TDB 샘플에 존재하는 항-CD3 동종이량체의 산출을 나타낸다. 발광 플레이트 판독기 (RLU)에 의해 측정된 바와 같이, 주카트/NFκBLuc 샘플 처리된 세포로부터 관찰된 루시퍼라제 활성을 공지된 양의 항-CD3 동종이량체에 의해 생성된 T 세포 활성화 반응과 비교한다. 동종이량체 표준 반응에 적합화된 곡선으로부터 유래된 방정식을 사용하여 샘플 내에 존재하는 항-CD3 동종이량체의 농도를 구한다. 이후, 샘플 내의 검출된 동종이량체의 비율을 샘플 내에 존재하는 CD20 TDB의 총량으로 나누어 샘플 내에 존재하는 항-CD3 동종이량체의 백분율을 계측한다.
도 8은 항-CD3 T 세포 활성화 검정이 0.25% 내지 35%의 CD20 TDB 시험 샘플에 대해 정확하다는 것을 보여준다. 항-CD3 동종이량체의 스파이크 회수율 (Spike recovery)은 상기 분석 방법이 0.99의 R2, 1.05의 기울기 및 0.078의 y 절편을 갖는 방법의 범위에서 선형이며 최소 바이어스 (bias)를 나타낸다는 것을 입증한다.
도 9는 T 세포 활성화 분석이 다른 생성물 관련 불순물을 검출할 수 있음을 보여준다. CD20 TDB 물질에 존재하는 HMWS의 수준은 동종이량체 분석에서 T-세포 활성화에 영향을 미친다.
본 발명은 T 세포 의존적 이중특이적 항체 (TDB)를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 이중특이적 항체는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하며, 상기 방법은 상기 조성물의 T 세포의 집단을 접촉시키는 단계를 포함하되, 여기서 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 T 세포 집단은 표적 항원을 포함하지 않으며, 그리고 상기 리포터의 발현은 항-CD3 동종이량체의 존재를 표지한다.
일부 양태에서, 본 발명은 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체 항체의 양을 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 상기 TDB의 하나 이상의 농도에서 상기 조성물과 T 세포의 집단을 접촉시키는 단계 (여기서 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 T 세포의 집단은 표적 항원을 포함하지 않음), 및 정제된 항-CD3 동종이량체의 상이한 농도로 상기 T 세포를 접촉시킴에 의해 생성된 표준 곡선과 항체 농도의 작용으로서 상기 리포터의 발현을 연관시키는 단계를 포함한다.
기타 양태에서, 본 발명은 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 가공된 T 세포를 제공하며, 여기서 상기 TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고, 그리고 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터를 포함한다.
기타 양태에서, 본 발명은 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 키트를 제공하며, 여기서 상기 TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고, 그리고 상기 키트는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터를 포함하는 가공된 T 세포를 포함한다.
I. 정의
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 나타내는데 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 이는 비-아미노산에 의하여 저해될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 중재술(intervention); 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 가공 또는 변형, 예를 들어, 표지화 성분 또는 독소로의 콘주게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들면, 아미노산 (예컨대, 비천연 아미노산 등 포함)의 하나 이상의 유사체, 뿐만 아니라 당해기술에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 상기 정의내에 포함된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어들 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 항체를 포괄한다.
"정제된" 폴리펩티드 (예컨대, 항체 또는 면역접합체)는, 폴리펩티드의 순도가 증가되어, 이로써 이것이 천연 환경 및/또는 실험실 조건 하에서 초기 합성되고/되거나 증폭될 경우에서 존재하는 것보다 더욱 순수한 형태로 존재한다는 것을 의미한다. 순도는 상대적인 용어이며, 절대적인 순도를 필연적으로 의미하지 않는다.
용어 "길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전하게 차단, 억제, 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 "효능제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자는 특히 하기를 포함한다: 천연 폴리펩티드 등의 효능제 또는 길항제 항체 또는 항체 단편, 단편 또는 아미노 산 서열 변이체. 효능제 또는 길항제를 식별하는 방법은 하기를 포함할 수 있다: 폴리펩티드를 후보 효능제 또는 길항제 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 폴리펩티드와 정상적으로 연관된 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 단계.
관심 항원, 예컨대 종양-관련 폴리펩티드 항원 표적에 "결합하는" 폴리펩티드는 충분한 친화도로 항원에 결합하는 펩티드이므로, 상기 폴리펩티드는 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하고, 다른 폴리펩티드와 유의하게 교차 반응하지 않는다. 이러한 구현예에서, "비-표적" 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드의 결합 정도는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전 (RIA)에 의해 계측 시 그의 특정 표적 폴리펩티드에 대한 폴리펩티드의 결합의 약 10% 미만일 것이다.
표적 분자에 폴리펩티드의 결합에 관하여, 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적인"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과는 다른 측정가능한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들면, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합에 비교된 분자의 결합을 계측함에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어 과량의 비표지된 표적과 유사한 조절 분자와의 경쟁에 의해 계측될 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 저해되는 경우 특이적 결합이 나타난다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 적어도 2종의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대, TDB를 포함하는 이중특이적 항체), 및 이들이 목적 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 용어 "면역글로불린" (Ig)는 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다.
항체는 전부 면역글로불린 접힘을 기반으로 가변 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자이다. 예를 들면, IgG 항체는 작용성 항체를 형성하도록 이황화-결합된 2개의 "중" 쇄 및 2개의 "경" 쇄를 갖는다. 각 중쇄 및 경쇄 자체는 "상수"(C) 및 "가변"(V) 영역을 포함한다. V 영역은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하는 반면, C 영역은 면역 효과기와 비-항원-특이적 상호작용에서 구조적 지지 및 작용을 제공한다. 항체의 항원 결합 특이성 또는 항체의 항원-결합 단편은 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 능력이다.
항체의 항원 결합 특이성은 V 영역의 구조적 특징에 의해 계측된다. 가변성은 가변 도메인의 110-아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9-12 아미노산 길이인 "초가변 영역" (HVR)이라 불리는 극단적인 가변성의 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 상대적으로 불변의 뻗기로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 크게는 β-시트 입체배치를 채택한 4개의 FR을 포함하여, β-시트 구조를 연결하고, 그리고 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 그리고 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 작용을 나타낸다.
각 V 영역은 전형적으로 3개의 HVR, 예컨대 상보성 결정 영역 ("CDR", 각각은 "초가변성 루프"를 포함함) 및 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 특정한 목적 항원에 실질적인 친화도로 결합하는데 요구되는 최소 구조 단위인 항체 결합 부위는 따라서 전형적으로 적절한 형태로 CDR을 보유하고 존재하도록 그 사이에 산재된 3개의 CDR, 및 적어도 3개, 바람직하게는 4개의 프레임워크 영역을 포함할 것이다. 고전적 4개의 쇄 항체는 협력하여 VH 및 VL 도메인에 의해 정의되는 항원 결합 부위를 갖는다. 낙타(camel) 및 상어(shark) 항체와 같은 특정 항체는 경쇄를 결핍하고 중쇄에 의해서만 형성된 결합 부위에 의존한다. 단일 도메인으로 가공된 면역 글로불린은 VH 와 VL 사이의 협력의 부재로 중쇄 또는 경쇄 단독으로 결합 부위가 형성되어 제조될 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에 서열에서 광범위하게 상이하고 그리고 그것의 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 고르게 분포되어 있지 않다. 그것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에서 모두 초가변 영역으로 불리는 3개의 분절에 집중되어 있다. 가변 도메인의 더 고도로 보존 된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 크게는 β-시트 입체배치를 채택한 4개의 FR을 포함하여, β-시트 구조를 연결하고, 그리고 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 근접하여 함께 유지되고, 그리고 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 불변 도메인은 항원에 항체를 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 작용을 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "초가변 영역" (HVR)은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 하기를 포함할 수 있다: "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래의 아미노산 잔기 (예컨대, VL 내에 대략 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내에 대략 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변성 루프" 유래의 이들 잔기 (예컨대 VL 내 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH 내 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)).
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기들은 본원에 정의된 바와 같이 초가변 영역 잔기들 이외의 다른 가변 도메인 잔기들이다.
본원에 사용된 바와 같이, "T 세포 의존적 이중특이적" 항체 또는 "TDB" 는 이중특이적 항체는 세포 상에 발현된 표적 항원에 결합하고, 종종 T 세포 수용체의 CD3e 하부단위에 결합함으로써 T 세포에 결합하도록 설계된다.
"항체 단편"은 바람직하게는 이들의 항원-결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 탠덤 디아바디 (taDb), 선형 항체(예를 들면, 미국 특허 번호 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng 8(10):1057-1062 (1995)); 일편 항체, 단일 가변 도메인 항체, 미니바디, 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들면, 비제한적으로, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv, 또는 탠덤 (di,tri)-scFv를 포함함); 및 이중특이적 T-세포 연관체 (BiTE)를 포함한다.
항체의 파파인 분해는, 각각이 단일 항원-결합 부위, 및 잔류 "Fc" 단편을 가지고, 그의 명칭이 쉽게 결정화하는 이들의 능력을 반영한 것으로, "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완벽한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하고 비-공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. VH-VL 이량체의 표면에 항원-결합 부위를 정의하기 위해 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호 작용하는 것이 이 입체배치에 있다. 종합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 비록 전체 결합 부위보다 낮은 친화도로 이지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 1종의 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본 명세서에서의 지정이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린) "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다.
이의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체가 상이한 "부류"에 배정될 수 있다. 하기 5개 주요 부류의 무손상 항체가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM (이들 중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가 구분될 수 있음). 항체의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 부류의 하부단위 구조 및 3차원 입체배치가 잘 알려져 있다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 구현예에서, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. sFv의 재고를 위해, 하기를 참고한다: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
용어 "디아바디"는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄 상에서 2 개의 도메인 간 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 또 하나의 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2 개의 항원-결합 부위를 생성하도록 유도된다. 디아바디는 하기에 더욱 충분히 기술된다: 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993).
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체를 포괄한다. 그러한 다중특이적 항체는 비제한적으로 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서 VHVL 단위는 하기를 갖는다: 폴리에피토프 특이성, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 VHVL 단위를 가짐), 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 단일 가변 도메인을 가짐), 전장 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 트리아바디, 3작용성 항체), 공유적이거나 비-공유적으로 연결된 항체 단편. "폴리에피토프 특이성"은 동일한 또는 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. "단일 특이적"은 단지의 하나의 에피토프에 결합하는 능력을 언급한다. 일 구현예에 따라서, 다중특이적 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 μM 내지 0.001 pM, 1 μM 내지 0.001 pM, 0.5 μM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 μM 내지 0.001 pM의 친화도로 각 에피토프에 결합하는 IgG 항체이다.
일부 예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체 (예컨대, CD3 및 또 다른 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체)이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 비제한적으로 하기를 포함한다: 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (참고: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655, 1991), 및 "크놉-인-홀" 가공 (참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 5,731,168). 다중 특이적 항체는 또한 다음과 같이 제조될 수 있다: 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과를 가공함에 의해 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교 결합시킴에 의해 (참고: 예를 들면, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생산하기 위하여 류신 지퍼(leucine zipper)를 사용함으로써 (참고: 예컨대, Kostelny et al., J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 제조하디 위한 "디아바디" 기술을 사용함으로써 (참고: 예를 들어, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 및 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함에 의해 (참고: 예를 들어, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 및 다음 문헌에 기재된 바와 같이 3특이적 항체를 제조함에 의해: 예를 들어, Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991).
표현 "단일 도메인 항체" (sdAbs) 또는 "단일 가변 도메인 (SVD) 항체"는 일반적으로 단일 가변 도메인 (VH 또는 VL)이 항원 결합을 부여할 수 있는 항체를 지칭한다. 환언하면, 단일 가변 도메인은 표적 항원을 인식하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없다. 단일 도메인 항체의 예는 낙타과 (라마 및 낙타) 및 연골 어류 (예컨대, 수염 상어(nurse shark)) 및 인간과 마우스 항체로부터 재조합 방법으로 유도된 것들을 포함한다 (Ward, ES et al., Nature (1989) 341:544-546; Dooley, H. et al., Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Muyldemans S et al., Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Holt, LJ et al., Trends Biotechnol (2003):21:484-490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Davies, J et al., Febs Lett (1994) 339:285-290; WO00/29004; WO 02/051870).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 균질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별 항체는, 단클론성 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 항체 (상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대하여 지향된 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제조와 대조되게, 각각의 단클론성 항체는 항원에서 단일 결정인자에 대하여 지향된다. 이들의 특이성에 부가하여, 단클론성 항체는 이들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 실질적으로 균질 한 항체 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라 사용되는 단클론성 항체는 우선 하기에 의해 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다: Kohler et al., Nature 256:495 (1975). 단클론성 항체는 또한 예를 들면 하기에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다: Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991).
본원의 단클론성 항체는 구체적으로 "키메라" 항체(면역글로불린)을 포함하고, 여기서, 중쇄 및/또는 경쇄 부분은 특정 종으로부터 유래된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성이거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하고, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래된 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편 뿐만 아니라 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속한다(미국 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)). 본 명세서에서 관심 키메라성 항체는 비-인간 영장류 (예를 들면 구대륙 원숭이, 예컨대 개코원숭이, 레수스 또는 사이노몰구스 원숭이)로부터 유도된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다 (미국 특허번호 5,693,780).
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래하는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수령체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 가지는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해 만들어졌다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프는 비-인간 면역글로불린의 것과 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다 (상기 주지된 FR 치환(들) 제외). 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대해서는, 하기를 참고한다: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992).
본 명세서에서의 목적상, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들면, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그것의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 효과기 작용을 가진다.
"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2개의 동일한 중 (H) 쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 이황화 연결기의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 중에서 가변한다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 이황화 가교를 가진다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VH)과 그 다음 수많은 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인을(VL) 그리고 그 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 간 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
"네이키드(naked) 항체" (본원에 정의됨)는 이형 분자, 예컨대 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 콘주게이트되지 않은 항체이다.
일부 구현예에서, 항체 "효과기 작용"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 이들 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 가변한다. 항체 효과기 기능의 실례에는 하기가 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체의 하향 조절.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR) (예를 들면 자연 살해 (NK) 세포, 중성구, 및 대식세포)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에서 결합된 항체를 인식하고 그리고 차후에 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개된 반응을 언급한다. ADCC를 매개하기 위한 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 다음 문헌의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). 해당 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된, 시험관내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 해당 분자의 ADCC 활성은 하기와 같이 생체내 평가된다: 예를 들면, 하기에 기술된 바와 같은 동물 모델: Clynes et al., Proc . Natl . Acad . Sci. (USA) 95:652-656 (1998).
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현시키고 ADCC 효과기 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초 혈액 단핵구(PBMC), 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구가 포함되며; PBMCs 및 NK 세포가 바람직하다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원으로 복합된 분자 (예컨대 폴리펩티드 (예컨대, 항체))에 대한 보체계 (C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면 하기에 기술된 CDC 검정이 수행될 수 있다: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996).
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)를 결합하는 것이고 그리고, 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이스된 형태를 포함하여, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이는 이의 세포질 도메인 내에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRlIB는 그 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다. (참고:
Figure 112017127996848-pct00001
, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). FcRs은 하기에 검토된다: Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin . Med. 126:330-41 (1995). 향후 식별될 것들을 포함하는 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어에는 또한 신생아 수용체, FcRn이 포함되며, 이는 모계 IgGs의 태아로의 전달에 관여한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
"불순물"은 목적 폴리펩티드 생성물과 상이한 물질을 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 불순물은 폴리펩티드의 전하 변이체를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 불순물은 항체 또는 항체 단편의 전하 변이체를 포함한다. 본 발명의 기타 구현예에서, 불순물은 비제한적으로 하기를 포함한다: 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 침출 단백질 A; 핵산; 목적 폴리펩티드의 변이체, 단편, 응집물 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스 오염물질; 세포 배양 배지 성분, 등. 일부 예시에서, 불순물은 하기로부터 유래된 숙주 세포 단백질 (HCP)일 수 있다: 예를 들어 비제한적으로, 박테리아 세포 예컨대 이.콜라이 세포, 곤충 세포, 원핵 세포, 진핵 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 균류 세포. 일부 예에서, 불순물은 동종이량체 (예컨대, 항-CD3 동종이량체)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체(immunoadhesin)"는 이종성 폴리펩티드의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 작용과 조합하는 항체-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역접합체는 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열의 융합을 포함하고, 이는 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (즉, "이형"임) 및 면역글로불린 불변 도메인 서열 이외의 것이다. 면역접합체 분자의 접합체 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역접합체 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
"리포터 분자"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 그의 화학 성질에 의해, 항원-결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 식별이능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 검정의 상기 유형에서 가장 통상적으로 사용된 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사성핵종 함유 분자 (즉, 방사성동위원소) 및 화학발광 분자이다.
본원에 사용된 바와 같이 "본질적으로 동일한"은 값 또는 파라미터가 유의한 효과에 의해 변경되지 않았음을 가리킨다. 예를 들어, 칼럼 출구에서의 크로마토그래피 이동상의 이온 강도는 이온 강도가 유의하게 변하지 않으면 이동상의 초기 이온 강도와 본질적으로 동일하다. 예를 들어, 초기 이온 강도의 10%, 5% 또는 1% 이내인 칼럼 출구에서의 이온 강도는 초기 이온 강도와 본질적으로 동일하다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 지칭은 상기 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 변이를 포함한다 (그리고 기재한다). 예를 들면, "약 X"를 언급하는 기술은 "X"의 언급을 포함한다.
본 명세서에서 그리고 첨부되는 청구범위에서, 단수 형태는 달리 명확하게 표시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본원에 기재된 발명의 양태 및 구현예는 "구성되는(consisting)" 및/또는 "~로 본질적으로 구성되는"의 양태 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
II. 세포 기반 리포터 검정
본 발명은 TDB를 포함하는 조성물 내에 존재하는 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 세포 기반 검정을 제공하며, 여기서 TDB의 하나의 항원 결합 단편은 CD3에 결합하고 T 세포를 활성화시킨다.
A. T 세포 활성화
TDB의 작용 기전은 표적 항원 발현 세포를 특이적으로 고갈시키는 것이다. T 세포 수용체 (TCR)의 CD3e 하부단위 및 표적 세포의 표면 상에 발현된 표적 항원에 대한 TDB의 동시 결합은 TCR 군집화를 야기하여, T 세포 활성화 및 표적 세포의 세포독성 고갈을 초래한다. 임상에서 많은 TDB가 존재하였고 (αCD3/αCD19, αCD3/αCD20, αCD3/αHER2; de Gast GC, et al., 1995, Cancer Immunol Immunother . 40(6):390-396; Buhmann R, et al.,2009 Bone Marrow Transplant. 43(5):383-397; Chan JK, et al., 2006, Clin Cancer Res. 12(6):1859-1867), 그리고 TDB-유사 이중특이체의 신규 버젼이 임상적 효능을 개선하기 위하여 평가되고 있다 (Chames, P. and Baty, D. 2009, MAbs 1(6):539-547; Fournier, P. and Schirrmacher, V., 2013, BioDrugs 27(1):35-53). TDB 이중-특이적 항체는, 올바른 표적 발현 세포가 존재한다면, CD4+ 및 CD8+ T 세포 계통 모두를 활성화시킬 수 있다. CD4+ T 세포의 활성화는 사이토카인 유전자 발현 (IL-2 등)을 유도하여, CD8+ T 세포의 확장 및 증식을 포함하는 다른 면역 세포의 동원 및 활성화를 초래할 것이다. TDB-매개 세포 가교를 통한 표적 세포와의 면역학적 시냅스-유사 구조의 형성으로부터 비롯되는 CD8+ CTL 활성화는 CTL의 활성화, 페르포린(Perforin) 및 그란자임(Granzyme)의 전사의 유도 (A, B, C; CTL 하위유형에 따라), 탈과립화 (degranulization), 및 표적 세포의 사멸을 초래하는 표적 및 효과기 세포 간의 '면역학적 시냅스'-유사 계면을 통한 퍼포린 및 그란자임의 국소화된 방출을 야기한다 (Pores-Fernando, Pores-Fernando AT, Zweifach A, 2009, Immunol Rev., 231(1):160-173; Pipkin, ME, et al., 2010, Immunol Rev., 235(1):55-72). 효과기 세포 매개 세포 사멸은 몇 시간 동안 시냅스의 안정화를 필요로 하는 상대적으로 느린 공정이며, 완전한 세포 사멸을 보장하기 위해 prf1 유전자 및 그란자임 유전자의 전사 의존적 활성화를 필요로 한다. 대안적으로, 표적 세포의 CTL-매개 사멸은 또한 Fas-매개 세포자멸사에 의해 발생하는 것으로 나타났다 (Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol ., 15(12):1441-1450). prf1, grB 및 Fas-매개 세포 사멸 기구의 전사 조절은 B 세포 고갈을 매개하는데 필요한 유전자의 프로모터 내에 위치한 NFAT, NFκB 및 STAT 인핸서 요소에 의존한다 (Pipkin, ME, et al., 2010, Immunol Rev., 235(1):55-72; Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol ., 15(12):1441-1450). 표적 및 효과기 세포 간의 상호작용의 강도 (면역학적 시냅스)는 표적 및 효과기 세포 사이의 상호작용을 안정화시키고 유지하기 위해 신호전달이 또한 필요한 다른 공-자극 분자에 의존한다 (Krogsgaard M, et al., 2003, Semin Immunol. 15(6):307-315; Pattu V, et al., 2013, Front Immunol., 4:411; Klieger Y, et al., 2014, Eur J Immunol . 44(1):58-68; Schwartz JC, et al., 2002, Nat Immunol . 3(5):427-434). 따라서, 리포터 유전자 검정의 사용을 통한 표적 유전자의 전사 유도의 모니터링은, TDB에 의해 T 세포의 활성화를 관찰하는 MOA-반사형 대안적인 분석 시스템이다.
T 세포 활성화는 면역학적 시냅스를 형성하기 위해 항원 제시 세포의 접촉 부위에서 세포 표면 단백질 및 신호전달 분자의 공간적 및 운동학적 재편성을 필요로 한다. T 세포 수용체 (TCR) 및 공-자극 수용체 (CD28, CD40, ICOS 등) 및 리간드의 활성화 및 신호전달의 조정은 T 세포 활성화에 필요한 지속시간 및 신호전달 모두를 조절한다. MHC를 통한 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에서의 항원 제시는 T 세포의 표면 상의 TCR에 의해 인식된다. MHC 및 TCR 군집화는 T 세포 활성화를 야기할 수 있는 신호전달 경로의 동원 및 활성화를 개시하며, 이는 T 세포 활성화를 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 공-자극 및 면역조절 수용체의 발현에 의존한다. TCR의 하부단위에 대한 항체, 예컨대 CD3e (OKT3; Brown, WM, 2006, Curr Opin Investig Drugs 7:381-388; Ferran, C et al., 1993 Exp Nephrol 1:83-89)는 TCR과 교차결합하고 이에 의해 면역학적 시냅스에서 TCR의 군집화를 모방함으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있고, 임상적으로 사용되었을 뿐만 아니라 시험관내에서 TCR 신호전달을 연구하기 위한 대리 활성자로서 수년간 사용되었다. 공-자극 없이 항-CD3 항체에 의한 TCR 군집화는 T 세포를 약하게 활성화시키지만, 여전히 T 세포 활성화 및 제한된 사이토카인 전사 및 방출을 야기한다. 항-CD3 매개된 신호전달은 NFAT, AP1, 및 NFκB를 포함하는 몇 가지 전사 인자를 활성화시키는 것으로 나타났다 (MF et al., 1995, J. Leukoc . Biol . 57:767-773; Shapiro VS et al., 1998, J. Immunol . 161(12)6455-6458; Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol., 15(12):1441-1450). 공-자극은 T 세포 활성화 반응의 특성에 영향을 미치는 사이토카인 발현의 전사 조절에 영향을 미치는 신호전달의 조절을 통해 사이토카인 방출의 수준 및 유형을 조절한다 (Shannon, MF et al., 1995, J. Leukoc . Biol. 57:767-773). TDB 이중-특이적 항체는 T 세포 및 표적 항원 발현 세포 사이에 형성된 가교 (bridge)의 결과로서 T 세포의 세포 표면 상에 TCR을 군집화한다. 어떤 사건이 표적 세포의 존재 및 부재하에 TDB에 의해 활성화되는지 결정하기 위해 T 세포 활성화에 의해 전사적으로 유도될 수 있는 리포터 분자의 발현을 유도하는 전사 조절 요소를 T 세포주에서 시험하였다.
B. 리포터 분자
리포터 검정은 세포 내의 리포터의 발현의 유도를 모니터링함으로써 자극의 생물학적 특성을 규명할 수 있는 분석 방법이다. 상기 자극은 세포내 신호전달 경로를 유도하여, 전형적으로 유전자 전사의 조절을 포함하는 세포 반응을 야기한다. 일부 예에서, 세포 신호전달 경로의 자극은 단백질 생산을 야기하는 RNA 전사의 개시에 필요한 DNA의 업스트림 비-암호화 영역에 대한 전사 인자의 조절 및 동원을 통해 유전자 발현의 조절을 야기한다. 자극에 대한 유전자 전사 및 번역의 조절이 세포 증식, 분화, 생존 및 면역 반응과 같은 다수의 생물학적 반응을 유발하는데 필요하다. 인핸서로도 불리는 이러한 DNA의 비-암호화 영역은 유전자 전사의 효율, 및 따라서 자극에 대한 반응으로 세포에 의해 생성된 단백질의 양 및 유형을 조절하는 전사 인자에 대한 인식 요소인 특정 서열을 함유한다. 리포터 검정에서, 자극에 반응성인 인핸서 요소 및 최소 프로모터는 표준 분자생물학 방법을 사용하여 리포터 유전자의 발현을 유도하도록 가공된다. 이후, 상기 DNA를 자극에 대해 특이적으로 반응하는 모든 기작을 함유하는 세포 내로 형질감염시키고, 리포터 유전자 전사, 번역, 또는 활성의 수준을 생물학적 반응의 대리 척도로서 측정한다.
일부 양태에서, 본 발명은 상기 조성물에 T 세포의 집단을 접촉시킴에 의하여 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 T 세포는 CD3 활성화에 반응성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하여, 이로써 상기 리포터의 발현이 항-CD3 동종이량체의 존재를 표지하도록 한다. 리포터 분자는 임의의 분자일 수 있으며, 이를 위해 자극에 대한 반응으로 세포에 의해 생산되는 상기 분자의 양을 측정하는 검정이 개발될 수 있다. 예를 들어, 리포터 분자는 자극; 예를 들어, T 세포 활성화에 반응성인 리포터 유전자에 의해 암호화된 리포터 단백질일 수 있다. 일반적으로 사용되는 리포터 분자의 예는 비제한적으로 실험적으로 측정될 수 있는 기질의 촉매작용의 부산물로서 빛을 방출하는 루시퍼라제와 같은 발광성 단백질을 포함한다. 루시퍼라제는 하기를 포함하는 많은 공급원으로부터 유도된 발광성 단백질의 부류이다: 반딧불 루시퍼라제 (종 포티누스 피랄리스 (Photinus pyralis) 유래), 바다 팬지 (sea pansy)로부터의 레닐라 루시퍼라제 (레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 유래), 방아벌레 (click beetle) 루시퍼라제 (피레아리누스 테르미틸루미난스 (Pyrearinus termitilluminans) 유래), 해양 요각류 가우시아 (marine copepod Gaussia) 루시퍼라제 (가우시아 프린셉스 (Gaussia princeps) 유래), 및 심해 새우 (deep sea shrimp) 나노 루시퍼라제 (오플로포러스 그라실리로스트리스 (Oplophorus gracilirostris) 유래)이다. 반딧불 루시퍼라제는 루시페린의 옥시루시페린으로의 산소화를 촉매하여 빛의 광자의 방출을 야기하는 반면, 레닐라와 같은 다른 루시퍼라제는 코엘렌테라진 (coelenterazine)을 촉매함으로써 빛을 방출한다. 상이한 루시퍼라제 형태 및 변이체에 의해 방출되는 빛의 파장은 상이한 필터 시스템을 사용하여 판독될 수 있으며, 이는 다중화 (multiplexing)를 용이하게 한다. 발광의 양은 세포에서 발현된 루시퍼라제의 양에 비례하며, 루시퍼라제 유전자는 생물학적 반응을 유발하는 자극의 충격을 평가하는 민감한 리포터로서 사용되었다. 리포터 유전자 검정은 기초 연구, HTS 스크리닝, 및 효능을 포함하는 광범위한 목적을 위해 수년간 사용되었다 (Brogan J, et al., 2012, Radiat Res. 177(4):508-513; Miraglia LJ, et al., 2011, Comb Chem High Throughput Screen. 14(8):648-657; Nakajima Y, and Ohmiya Y. 2010, Expert Opin Drug Discovery, 5(9):835-849; Parekh BS, et al., 2012, Mabs, 4(3):310-318; Svobodova K, and Cajtham L T., 2010, Appl Microbiol Biotechnol., 88(4): 839-847).
일부 구현예에서, 본 발명은 TDB 조성물에서 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 세포 기반 검정을 제공하며, 여기서 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 리포터 작제물을 암호화한다. 일부 구현예에서, 리포터 작제물은 루시퍼라제를 포함한다. 일부 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제 (예컨대, 종 포티누스 피랄리스 (Photinus pyralis) 유래), 바다 팬지 (sea pansy)로부터의 레닐라 루시퍼라제 (예컨대, 종 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 유래), 방아벌레 (click beetle) 루시퍼라제 (예컨대, 종 피레아리누스 테르미틸루미난스 (Pyrearinus termitilluminans) 유래), 해양 요각류 가우시아 (marine copepod Gaussia) 루시퍼라제 (예컨대, 종 가우시아 프린셉스 (Gaussia princeps) 유래), 및 심해 새우 (deep sea shrimp) 나노 루시퍼라제 (예컨대, 종 오플로포러스 그라실리로스트리스 (Oplophorus gracilirostris) 유래)이다. 일부 구현예에서, 가공 T 세포 내 루시퍼라제의 발현은 TDB 조성물 내 항-CD3 동종이량체의 존재를 표지한다. 기타 양태에서, 리포터 작제물은 β-글루쿠로니다제 (GUS); 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 및 이의 변이체; 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT); β-갈락토시다제; β-락타마제; 또는 분비된 알칼리 포스파타제 (SEAP)를 암호화한다.
본 발명의 일부 양태에서, 핵산은 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터 및/또는 인핸서에 작동가능하게 연결된 리포터 분자 (예컨대, 리포터 단백질)을 암호화한다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 프로모터 및/또는 인핸서는 발현 조절 서열이다. 발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 폴리펩티드 (예컨대, 리포터 폴리펩티드)를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 적절하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포 (예컨대, T 세포)를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 상기 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되면, 상기 숙주는 T 세포 활성화 후 상기 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현에 적합한 조건 하에 유지된다.
프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되었다. 사실상 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 업스트림에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사의 시작으로부터 70 내지 80 염기 업스트림에서 발견되는 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열은 진핵생물 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
본 발명의 일부 양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터의 조절하에 리포터 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 T 세포를 제공한다. T 세포 활성화에 반응성인 프로모터는 본 기술분야에 알려져 있다.
기타 구현예에서, 본 발명은 T 세포 활성화에 반응성인 인핸서 요소에 작동가능하게 연결된 최소 프로모터의 조절하에 리포터 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 T 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 최소 프로모터는 티미딘 키나제 (TK) 최소 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터의 최소 프로모터, SV40 유래의 프로모터, 또는 최소 신장 인자 1 알파 (minimal elongation factor 1 alpha; EF1α) 프로모터이다. 일부 구현예에서, 리포터 분자를 암호화하는 핵산은 T 세포 활성화 반응성 DNA 인식 요소에 의해 조절되는 최소 TK 프로모터의 조절하에 있다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화 반응성 DNA 인식 요소는 NFAT (활성화된 T 세포의 핵 인자) 인핸서, AP-1 (Fos/Jun) 인핸서, NFAT/AP1 인핸서, NFκB 인핸서, FOXO 인핸서, STAT3 인핸서, STAT5 인핸서 및 IRF 인핸서이다. 인핸서는 폴리펩티드-암호화 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 그러나 일부 구현예에서는 프로모터부터 부위 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 루시퍼라제 유전자가 최소 TK 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 최소 TK 프로모터는 결국 NFκB 반응성 인핸서 요소에 작동가능하게 연결된 T 세포를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다중세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 리포터 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA를 안정화하는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5'의, 그리고 경우에 따라 3'의 미번역된 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 일 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 하기를 참고한다: WO94/11026 및 상기에 개시된 발현 벡터.
일부 구현예에서, 본 발명은 T 세포에서 리포터 분자의 발현을 위한 벡터를 제공한다. 벡터 성분은 일반적으로, 비제한적으로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 많은 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 함유하는 다중 클로닝 부위, 인핸서 요소, 프로모터 (예컨대, T 세포 활성화에 반응성인 인핸서 요소 및/또는 프로모터), 및 전사 종결 서열. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드이다. 기타 구현예에서, 벡터는 재조합 바이러스 게놈; 예컨대, 재조합 렌티바이러스 게놈, 재조합 레트로바이러스 게놈, 재조합 아데노-관련 바이러스 게놈이다. 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, T-세포 반응성 프로모터/인핸서에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자)을 함유하는 벡터는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 T 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 유전자총(biolistics) 또는 바이러스 기반 형질감염이 사용될 수 있다. (참고: 일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989). 포유동물 세포를 변형하는데 사용되는 다른 방법들은 폴리브렌, 원형질 융합, 리포좀, 전기천공, 및 미세주사의 사용을 포함한다.
C. 세포
일부 양태에서, 본 발명은 T 세포 활성화에 반응성인 리포터 복합체를 포함하는 T 세포의 집단을 접촉시킴에 의하여 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하는 세포-기반 검정을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 집단의 T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포이다. 추가의 기타 구현예에서, T 세포는 CD4+/CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 IFN- γ, TNF-α, 및 인터류킨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인의 증가된 방출을 나타낸다. 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 불멸화 T 세포 (예컨대, 불멸화 T 세포주)의 집단이다. 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 TCR/CD3e을 발현한 불멸화 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, T 세포는 주카트 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CTLL-2 T 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 T 세포는 T 세포 수용체를 포함한다. T 세포 수용체는 몇 개의 단백질의 복합체로서 존재한다. T 세포 수용체 자체는 비의존적 T 세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ) 유전자에 의해 암호화된 2개의 별개의 펩티드 쇄로 구성된다. 상기 복합체 내의 다른 단백질은 CD3 단백질을 포함한다: CD3ε (또한 CD3e로서 공지됨), CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ. CD3 단백질은 CD3εγ 및 CD3εδ 이종이량체 및 CD3ζ 동종이량체로서 발견된다. CD3ζ 동종이량체는 이들 단백질 주위에서 신호전달 복합체를 응집시킨다. 일부 구현예에서, TDB의 일 아암은 T 세포 수용체 복합체에 결합한다. 일부 구현예에서, TDB는 CD3에 결합한다. 일부 구현예에서, TDB는 CD3ε (CD3e) 단백질에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 TDB의 조성물에서 항-CD3 동종이량체를 검출하고/하거나 정량하는 세포 기반 검정에서 사용하기 위한 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 CD8+ T 세포이다. 또 다른 구현예에서, 조성물의 T 세포는 CD4+/CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 불멸화 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 주카트 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 CTLL-2 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조성물의 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 리포터 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 복합체는 루시퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, 리포터 (예컨대, 루시퍼라제)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 T 세포 활성화 반응 조절 요소 (예컨대, T 세포 활성화 반응성 프로모터 및/또는 인핸서)에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 프로모터는 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터이다.
일부 구현예에서, T 세포 활성화-반응성 리포터 작제물이 도입된 T 세포 (리포터 T 세포)는 항-CD3 동종이량체에 의한 활성화에 의해 스크리닝된다. 예를 들어, 무변성 클론은 한계 희석에 의해 단리되고 정제된 항-CD3 동종이량체에 대한 이들의 반응에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 무변성 리포터 T 세포는 약 1 μg/mL, 2 μg/mL, 3 μg/mL, 4 μg/mL, 5 μg/mL, 6 μg/mL, 7 μg/mL, 8 μg/mL, 9 μg/mL, 또는 10 μg/mL 중 어느 것을 초과하는 정제된 항-CD3 동종이량체를 이용하여 스크리닝된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 T 세포 활성화 리포터 복합체로 가공된 T 세포의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 리포터는 루시퍼라제, 형광 단백질 (예컨대, aGFP, aYFP, 등), 알칼리 포스파타제, 또는 베타 갈락토시다제이다. 일부 구현예에서, 루시퍼라제는 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 프로모터는 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터이다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화에 반응성인 프로모터는 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, T-세포의 조성물은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 주카트 세포 또는 CTLL-2 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 NFκB 프로모터에 작동가능하게 연결된 루시퍼라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 주카트 세포이다.
D. CD3 동종이량체를 식별하는 방법
일부 양태에서, 본 발명은 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 TDB 항체는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하며, 상기 방법은 상기 조성물의 T 세포의 집단을 접촉시키는 단계를 포함하되, 여기서 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 T 세포 집단은 표적 항원을 포함하지 않으며, 그리고 상기 리포터의 발현은 항-CD3 동종이량체의 존재를 표지한다. 일부 구현예에서, T 세포의 집단은 TDB의 표적 항원 (비-T 세포 항원)을 발현하는 세포를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, T-세포의 집단은 약 0.01 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.05 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 1 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.1 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.05 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 또는 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL 중 어느 하나의 농도 범위의 TDB를 포함하는 조성물과 접촉된다.
일부 구현예에서, 리포터는 상기 세포를 상기 조성물에 접촉시킨 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 16 시간, 약 20 시간, 또는 약 24 시간 초과 중 임의의 시간 이후 검출된다. 일부 구현예에서, 리포터는 세포를 조성물과 접촉시킨 후 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 4시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 16시간 내지 약 24시간, 약 16시간 내지 약 20시간, 또는 약 20시간 내지 약 24시간 중 어느 하나에서 검출된다.
일부 양태에서, 본 발명은 TDB를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체 항체의 양을 정량화하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고, 상기 방법은 상기 TDB의 하나 이상의 농도에서 상기 조성물과 T 세포의 집단을 접촉시키는 단계 (여기서 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고, 상기 T 세포의 집단은 표적 항원을 포함하지 않음), 및 정제된 항-CD3 동종이량체의 상이한 농도로 상기 T 세포를 접촉시킴에 의해 생성된 표준 곡선과 항체 농도의 작용으로서 상기 리포터의 발현을 연관시키는 단계를 포함한다. 항-CD3 동종이량체 검정 표준 (공지된 농도의 정제된 항-CD3 동종이량체), 항-CD3 동종이량체 대조군, 및 TDB 시험 샘플의 희석물을 제조하고 리포터 T 세포에 첨가한다. 시간이 정해진 항온처리 후, 동종이량체 검정 표준, 동종이량체 대조군, 및 TDB 시험 샘플에 의해 유도된 리포터 활성의 양을 측정한다. TDB 시험 샘플 내의 생물학적 활성 항-CD3 동종이량체의 양은 항-CD3 동종이량체 검정 표준으로부터 생성된 표준 곡선으로부터 계측된다. 시험 샘플 내 존재하는 항-CD3 동종이량체의 백분율은 시험 샘플 내 존재하는 TDB의 총량에 대하여 존재하는 항-CD3 동종이량체의 양의 비율에 의해 계측된다.
일부 구현예에서, T-세포의 집단은 약 0.01 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.05 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 40 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 1 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.1 ng/mL, 약 0.01 ng/mL 내지 약 0.05 ng/mL, 약 0.1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 0.5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 약 1 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 또는 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL 중 어느 하나의 농도 범위의 TDB를 포함하는 조성물과 접촉된다.
일부 구현예에서, 항-CD3 동종이량체 검정 표준으로부터의 표준 곡선은 약 0.01 ng/mL 내지 50 ng/mL 중 임의의 하나의 범위의 복수 농도에서 항-CD3 동종이량체와 리포터 T 세포를 접촉시킴에 의하여 생성된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 동종이량체 표준의 복수의 농도는 100/mL ng, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 250 ng/mL, 500 ng/mL, 750 ng/mL, 1 μg/mL, 2.5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 또는 500 μg/mL 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 동종이량체 표준의 복수의 농도는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10을 초과하는 농도이다.
방법의 정확성은 공지된 양의 항-CD3 동종이량체의 정제된 양을 TDB의 제제에 첨가하고 항-CD3 동종이량체의 백분율 회수율을 측정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 동종이량체 및 TDB의 하나 이상의 혼합물은 약 100 ng, 150 ng, 200 ng, 250 ng, 500 ng, 750 ng, 1 μg, 2.5 μg, 5 μg, 10 μg, 25 μg, 50 μg, 100 μg, 250 μg, 또는 500 μg 중 어느 하나를 초과하는 정제된 항-CD3 동종이량체를 αCD20/αCD3 TDB의 약 1 mg/mL 스톡에 첨가함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 리포터는 상기 세포를 상기 조성물에 접촉시킨 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 16 시간, 약 20 시간, 또는 약 24 시간 초과 중 임의의 시간 이후 검출된다. 일부 구현예에서, 리포터는 세포를 조성물과 접촉시킨 후 약 1시간 내지 약 24시간, 약 1시간 내지 약 12시간, 약 1시간 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 약 1시간 내지 약 4시간, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 4시간 내지 약 24시간, 약 4시간 내지 약 12시간, 약 4시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 24시간, 약 8시간 내지 약 12시간, 약 16시간 내지 약 24시간, 약 16시간 내지 약 20시간, 또는 약 20시간 내지 약 24시간 중 어느 하나에서 검출된다.
E. 검정 전개(Assay Development)
하기는 TDB의 제제에서 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 세포 기반 검정을 개발하는 예시적이지만 비제한적인 방법이다.
DNA 작제물: 렌티바이러스는 TDB 이중-특이적 항체의 순도를 평가하기 위해 사용되는 무변성 세포주를 생성하기 위해 사용된다. 렌티바이러스 벡터는 NFAT (활성화된 T 세포의 핵 인자), AP-1 (Fos/Jun), NFAT/AP1, NFκB, FOXO, STAT3,5, 및 IRF에 대한 DNA 인식 요소에 의해 조절되는 최소 TK 프로모터의 조절하에 리포터 유전자 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제를 발현하도록 제작된다. 무변성 리포터 세포주의 생성을 위해 사용되는 렌티바이러스 발현 카세트는 무변성 세포주의 생성을 가능하게 하는 항시적 프로모터/인핸서 (EF1알파 또는 SV40)의 조절하에 다양한 항생제 선별 마커를 발현한 3세대 자가 불활성화 2-시스트론성 (bi-cistronic) 벡터일 수 있다. 사용된 리포터 렌티바이러스 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터 (SBI biosciences; Cat No. CD510B-1)인 pCDH.MCS.EF1a.Puro로부터 변형된다. 프로모터 변형은 CMV 최소 프로모터의 제거 및 다양한 인핸서 요소 (NFAT, NFκB 등)로의 치환, pRK5.CMV.루시퍼라제로부터 최소 코어 RNA 중합효소 프로모터 (TATA 박스)의 부가 (Osaka, G et al., 1996 J Pharm Sci . 1996, 85:612-618), 및 내부 DNA로부터 상이한 선별 카세트의 치환 (pRK5.tk.neo로부터의 네오마이신 내성 유전자, pRK5.tk.hygro로부터의 하이그로마이신 내성 유전자; 및 pRK5.tk.blastocidin으로부터의 블라스티시딘 내성 유전자)을 포함한다. 인핸서 요소의 활성화의 선별에 사용되는 항시적 프로모터의 영향은 프로모터/인핸서 혼선 (cross-talk)을 최소화하기 위해 설계된 DNA의 비-암호화 구간의 혼입으로 인해 최소이다. pRK5.CMV.루시퍼라제로부터의 반딧불 루시퍼라제 (Osaka, 1996)는 변형된 렌티바이러스 친계 벡터의 HindIII-NotI 부위 내로 클로닝된다. 레닐라 루시퍼라제 및 나노루시퍼라제를 포함하는 다른 발광 단백질은 또한 HindIII-NotI 부위 내로 서브클로닝될 수 있다. 293s (293 현탁액 적응된 세포주) 세포의 일시적 형질감염으로부터 바이러스 스톡을 생성하기 위해 사용된 렌티바이러스 패키징 작제물 (pCMV.HIVdelta, pCMC.VSV-G, 및 pCMV.Rev)이 수득될 수 있거나 (pCMV.VSV-G) 또는 생성될 수 있다 (pCMV.HIVdelta, pCMV.REV). HIV 균주 MN (Nakamura, GR et al., 1993, J. Virol . 67(10):6179-6191)은 pCMV.HIVdelta 패키징 벡터를 생성하는데 사용될 수 있고, 이는 안정성 목적을 위해 HIV 바이러스 피막의 결실 및 5' 및 3'LTR에 대한 변형에 의해 불활성화되는 내부 EcoRI 부분적 소화 결실을 함유한다. HIV Rev는 RT-PCR에 의해 pCMV.HIVdelta 형질감염된 293s 세포 RNA로부터 클로닝되고, pRK5.tk.neo의 ClaI-Xho 부위 내로 도입된다. 렌티바이러스 리포터를 위형 (pseudotype)하기 위한 VSV-G의 사용 (HIV env를 VSV-G로 치환)은 임의의 세포 유형을 감염시킨다. 렌티바이러스 발현 플라스미드 및 패키징 작제물은 하기에서 증폭된다: Stbl2 반응능 세포 (Life Technologies, Cat. 번호 10268-019), 및 Qiagen Maxi Prep 키트 (Cat. 번호 12662)를 사용하여 정제된 DNA. 모든 DNA 작제물은 DNA 서열분석에 의해 식별된다.
리포터 유전자 검정 세포주 개발: 주카트 CD4+ T 세포주 (DSMZ, Cat. 번호 ACC 282) 및 CTLL-2 CD8+ T 세포주 (Life Technologies, Cat. 번호 K1653)가 TDB에 의해 T 세포의 활성화를 모니터링하는 리포터 유전자 검정의 실현 가능성을 평가하는데 사용된다. 렌티바이러스 벡터는 NFAT (활성화된 T 세포의 핵 인자), AP-1 (Fos/Jun), NFAT/AP1, NFκB, FOXO, STAT3,5, 및 IRF에 대한 DNA 인식 요소에 의해 조절되는 최소 TK 프로모터의 조절하에 리포터 유전자 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제를 발현하도록 제작된다. 리포터 유전자 바이러스 스톡은 표준 방법을 사용하여 293s 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성되고, VSV-G로 위형화되며, 농축되고, 적정된다 (Naldini, L., et al., 1996 Science, 272:263-267). 주카트 CTLL-2 세포는 원심분리적 접종 (spinoculation)에 의해 10의 MOI의 렌티바이러스 리포터 바이러스 스톡으로 감염되고 3일 후 감염된 세포는 항생제 내성에 대해 스크리닝된다. 2주 후, 무변성 풀이 생성되며 정제된 TDB에 대한 반응에 대해 평가된다. 사본 수 및 통합을 평가하는 qPCR 방법은 모든 무변성 풀이 리포터 작제물로 안정적으로 감염되는지 입증하기 위해 사용된다. 정제된 항-CD3 동종이량체는 NFAT 및 NFκB 주카트 리포터 풀 모두를 활성화시킬 수 있다. 유사한 반응이 다른 TDB에 대해 관찰되었다. 이들 실험에 기초하여, 주카트/NFκB-루시퍼라제 및 주카트/NFAT-루시퍼라제의 한계 희석은 단일 세포 클로닝 및 단일 무변성 리포터 세포주의 생성을 가능하게 하도록 설정된다.
T 세포 활성화 불순물 검정의 개발 및 평가: 항-CD3 동종이량체는 표적 세포의 부재하에 T 세포를 활성화시킬 수 있는 생성물 관련 불순물이며, 따라서 TDB와 별개의 활성을 나타낸다. TDB 정제된 제제에서 불순물로서 존재하는 항-CD3 동종이량체 종은 공유 또는 비공유 결합될 수 있고, 따라서 변이체가 T 세포의 표면 상의 TCR에 가교결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 형태를 채택할 수 있다. TDB는 단지 하나의 항-CD3 아암을 가지므로, TDB는 TCR에 교차결합할 수 없고 T 세포 단독과 함께 항온처리될 때 활성이 없다. 생체내에서, TDB는 효과기 세포 (단핵구, 대식세포, NK 세포)에 의해 매개되는 FcgR 매개 교차 결합을 통해, T 세포 상의 TCR에 교차결합할 수 있다.
존재하는 aCD3 동종이량체 변이체의 양을 정량하기 위해, TDB 샘플에서 관찰된 루시퍼라제 활성의 양은 공지된 농도의 정제된 aCD3 동종이량체 표준을 주카트/NFκB-반딧불루시퍼라제 클론 2 세포주와 함께 항온처리할 때 관찰된 루시퍼라제 활성의 최적 적합 (best fit) 곡선으로부터 산출된다 (도 7). 각 샘플에서 불순물의 농도의 매트릭스 효과 및 영향을 평가하기 위해, 연속 희석물을 제조하고, 희석 선형성을 종점 (end-point) 검정에서 평가하였다. 존재하는 동종이량체의 총량은 TDB의 총 질량에 존재하는 불순물의 질량에 의해 계측되고 % 항CD3 동종이량체로서 표현된다. 상기 방법은 정제된 TDB 제제에서 0.1 마이크로그램 (0.1 ppm) 정도로 적은 정제된 항-CD3 동종이량체를 정량적으로 검출할 수 있다. 상기 검정 포맷은 또한 현재의 공정의 초기 정제 단계를 지나서 정제되지 않은 TDB 물질에서 불순물 활성을 검출할 수 없는 것으로 나타났으며 불순물을 제거하기 위해 TDB에 사용된 정제 접근법을 평가하는데 사용되어 왔다. 정제된 항-CD3 동종이량체의 스파이크 시, 상기 검정 포맷은 TDB 시험 물질에서 0.5% 정도로 낮은 동종이량체 스파이크된 물질에 대해 정확한 회수율을 보여준다 (도 7). TDB의 현재의 정제 공정이 동종이량체 및 다른 T 세포 활성화 종을 검정의 정량 한계치 미만으로 제거한다는 것을 입증하기 위해 상기 방법은 다른 직교 분석과 함께 사용되어 왔다. 그러나, 공정 개발 동안, 다양한 샘플은 항-CD3 동종이량체 질량 분광계 검정과 관련이 없었던 검정에서 T 세포 활성화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 다른 직교 분석 방법과의 상관관계는 이러한 다른 종이 응집물의 일부 형태, 또는 HMWS일 수 있다는 것을 시사한다 (도 9). TDB의 응집물은 TCR 군집화 및 활성을 유도할 것이다. 1.5% 정도로 적은 HMWS는 다양한 제제 연구의 평가 동안 관찰된 바와 같이, 분석에서 유의한 활성을 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다. 이러한 다른 종의 정제 및 평가는 TDB의 순도 및 안정성을 평가하기 위해 다양한 불순물 참조 표준을 사용하는 불순물 검정의 개발을 가능하게 한다. 상이한 리포터 유전자 세포주의 사용은 존재하는 상이한 종의 분류를 가능하게 할 수 있다. 따라서, 항-CD3 동종이량체%의 현재 보고된 값은 이러한 노력의 결과로서 또 다른 값으로 변형될 수 있다. 생물학적 활성 불순물을 검출하는 리포터 유전자 검정 접근법의 민감도는 생성물 변이체의 분류 및 치료제에 존재할 수 있는 허용가능한 수준의 평가를 위한 유용한 일반적인 접근법이다.
III. 키트
본 발명의 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 T 세포 활성화에 반응성인 리포터 복합체를 포함하는 가공된 T 세포를 포함하는 조성물을 보유하는 용기를 포함하는, 키트 또는 제조 물품이 제공되며, 이는 선택적으로 그의 사용을 위한 설명서를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 항-CD3 동종이량체 검정 표준 (공지된 농도의 정제된 항-CD3 동종이량체), 및/또는 항-CD3 동종이량체 대조군을 제공한다. 상기 용기는 제제를 보유하고, 상기 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨은 사용상의 주의사항을 나타낼 수 있다. 제조물품은 다른 완충액, 희석제, 컬쳐웨어, 리포터 분자 검출용 시약, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 그리고 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료들을 더 포함할 수 있다.
IV. 폴리펩티드
본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여 분석되는 폴리펩티드는 재조합 기술을 사용하여 일반적으로 생산된다. 재조합 단백질을 생산하는 방법은, 예컨대, 참고로 본원에 명시적으로 포함된 미국 특허 제5,534,615호 및 제4,816,567호에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 CHO 세포에서 생산된다 (예컨대 WO 제94/11026호 참고). 일부 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 이.콜라이 세포에서 생산된다. 참고: 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237; 미국 특허 번호 5,789,199, 및 미국 특허 번호 5,840,523 (발현 및 분비 최적화를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 기술함). 또한 참고: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254 (이. 콜라이 내 항체 단편의 발현을 기술함). 재조합 기술을 이용하는 경우, 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되거나, 원형질막 주위 공간에서 생산되거나 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다.
폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 폴리펩티드의 발현에 이용된 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 냉각-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 교란, 또는 세포 용해 제제에 의해 교란될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내로 생산되는 경우, 제1 단계로 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 잔해가, 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) 는 이. 콜라이의 원형질막 주위 공간에 분비되는 폴리펩티드를 단리하기 위한 절차를 기재한다. 간략히, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐서 해동시킨다. 세포 파편을 원심분리로 제거할 수 있다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우, 그와 같은 발현 시스템의 상청액은 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 폴리펩티드 농축 필터, 예를 들면 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용해서 농축된다. 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF가 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 전술된 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 우발적인 오염물질의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물 내의 폴리펩티드는 본 발명의 방법에 의해 분석하기 전에 정제되거나 부분적으로 정제되었다. 예를 들어, 상기 방법의 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터의 용리액에 존재한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 단백질 A 크로마토그래피로부터의 용리액에 존재한다.
본 발명의 방법에 의해 분석될 수 있는 폴리펩티드의 예는 비제한적으로 면역글로불린, 면역접합체, 항체, 효소, 호르몬, 융합 단백질, Fc-함유 단백질, 면역콘주게이트, 사이토카인 및 인터루킨을 포함한다.
(A) 항체
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 제제를 본원에 기재된 방법에 의해 분석하는 임의의 방법에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 T 세포-의존적 이중특이적 (TDB) 항체이다.
항체에 대한 분자 표적은 하기를 비제한적으로 포함하는 CD 단백질 및 이들의 리간드를 포함한다: (i) CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD34, CD40, CD79α (CD79a), 및 CD79β (CD79b); (ii) EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체와 같은 ErbB 수용체 패밀리의 구성원; (iii) 이들의 알파 또는 베타 서브유닛을 포함하는, LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린과 같은 세포 접합 분자 (예를 들면 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); (iv) 성장 인자 예컨대 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C, BR3, c-met, 조직 인자, β7, 등; 및 (v) 세포 표면 및 막통과 종양-관련 항원 (TAA) (미국 특허 번호 7,521,541에 기술된 것들과 같음), 및 (vi) 기카 표적, 예컨대 FcRH5, LyPD1, TenB2. 일부 구현예에서, 항체는 항-CD20/항-CD3 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체가 표 1에 제공되어 있다.
예시적 항체
CD3 아암 유형 서열
Mab1 HVR-H1 NYYIH (서열 번호:1)
HVR-H2 WIYPGDGNTKYNEKFKG (서열 번호:2)
HVR-H3 DSYSNYYFDY (서열 번호:3)
HVR-L1 KSSQSLLNSRTRKNYLA (서열 번호:4)
HVR-L2 WASTRES (서열 번호:5)
HVR-L3 TQSFILRT (서열 번호:6)
38E4v1 HVR-H1 SYYIH (서열 번호:7)
HVR-H2 WIYPENDNTKYNEKFKD (서열 번호:8)
HVR-H3 DGYSRYYFDY (서열 번호:9)
HVR-L1 KSSQSLLNSRTRKNYLA (서열 번호:10)
HVR-L2 WTSTRKS (서열 번호:11)
HVR-L3 KQSFILRT (서열 번호:12)
UCHT1v9 HVR-H1 GYTMN (서열 번호:13)
HVR-H2 LINPYKGVSTYNQKFKD (서열 번호:14)
HVR-H3 SGYYGDSDWYFDV (서열 번호:15)
HVR-L1 RASQDIRNYLN (서열 번호:16)
HVR-L2 YTSRLES (서열 번호:17)
HVR-L3 QQGNTLPWT (서열 번호:18)
Mab1 VH (hu) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGDGNTKYNEKFKGRATLTADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDSYSNYYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:19)
VL (hu) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCTQSFILRTFGQGTKVEIK (서열 번호:20)
38E4v1 VH (hu) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPENDNTKYNEKFKDRVTITADTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARDGYSRYYFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:21)
VL (hu) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSFILRTFGQGTKVEIK (서열 번호:22)
UCHT1v9 VH (hu) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKDLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS (서열 번호:23)
VL (hu) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKLELK (서열 번호:24)
표적 아암
Mab2 HVR-H1 GYTFTSYNMH (서열 번호:25)
HVR-H2 AIYPGNGDTSYNQKFKG (서열 번호:26)
HVR-H3 VVYYSNSYWYFDV (서열 번호:27)
HVR-L1 RASSSVSYMH (서열 번호:28)
HVR-L2 APSNLAS (서열 번호:29)
HVR-L3 QQWSFNPPT (서열 번호:30)
Mab2 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GYTFTSYNMH WVRQA PGKGLEWVG AIYPGNGDTSYNQKFKG RFTISVDKSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCAR VVYYSNSYWYFDV WGQGTLVTVSS (서열 번호:31)
VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASSSVSYMH WYQQKP GKAPKPLIY APSNLAS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDFATYYC QQWSFNPPT FGQGTKVEIKR (서열 번호:32)
4D5
Her2		 HVR-H1 DTYIH (서열 번호:33)
HVR-H2 RIYPTNGYTRYADSVKG (서열 번호:34)
HVR-H3 WGGDGFYAMDY (서열 번호:35)
HVR-L1 RASQDVNTAVA (서열 번호:36)
HVR-L2 SASFLYS (서열 번호:37)
HVR-L3 QQHYTTPPT (서열 번호:38)
4D5 VH (hu) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQA PGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYL QMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (서열 번호:39)
VL (hu) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKP GKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (서열 번호:40)
다른 예시적인 항체는, 비제한적으로, 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-프로게스테론 수용체 항체, 항-p53 항체, 항-HER-2/neu 항체, 항-EGFR 항체, 항-카텝신 D 항체, 항-Bcl-2 항체, 항-E-카드헤린 항체, 항-CA125 항체, 항-CA15-3 항체, 항-CA19-9 항체, 항-c-erbB-2 항체, 항-P-당단백질 항체, 항-CEA 항체, 항-망막모세포종 단백질 항체, 항-ras 종양단백질 항체, 항-루이스 X 항체, 항-Ki-67 항체, 항-PCNA 항체, 항-CD3 항체, 항-CD4 항체, 항-CD5 항체, 항-CD7 항체, 항-CD8 항체, 항-CD9/p24 항체, 항-CD10 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD11c 항체, 항-CD13 항체, 항-CD14 항체, 항-CD15 항체, 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD30 항체, 항-CD31 항체, 항-CD33 항체, 항-CD34 항체, 항-CD35 항체, 항-CD38 항체, 항-CD41 항체, 항-LCA/CD45 항체, 항-CD45RO 항체, 항-CD45RA 항체, 항-CD39 항체, 항-CD100 항체, 항-CD95/Fas 항체, 항-CD99 항체, 항-CD106 항체, 항-유비퀴틴 항체, 항-CD71 항체, 항-c-myc 항체, 항-사이토케라틴 항체, 항-비멘틴 항체, 항-HPV 단백질 항체, 항-카파 경쇄 항체, 항-람다 경쇄 항체, 항-멜라로솜 항체, 항-전립선 특이적 항원 항체, 항-S-100 항체, 항-타우 항원 항체, 항-피브린 항체, 항-케라틴 항체 및 항-Tn-항원 항체로부터 선택될 것들을 포함한다.
(i) 단클론성 항체
일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 단클론성 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어지며, 즉 집단을 포함하는 개별적인 항체는 단클론성 항체의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체를 제외하고 동일한 에피토프에 동일하거나 및/또는 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 따라서, 수식어 "단클론성"은 구별되거나 다클론성 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특징을 나타낸다.
예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이, 단클론성 항체는 먼저 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제작될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제작될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터가 본원에 기술된 바와 같이 면역화되어 면역화를 위해 사용된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 림프구는 그런 다음 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합 제제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합된다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된, 친계 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 씨딩하고 성장시킨다. 예를 들어, 만약 친계 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)가 부재하다면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하기를 포함할 것이다: HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인, 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT 배지) (이의 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 예방함).
일부 구현예에서, 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 무변성 고 수준의 항체 생산을 지지하는 것들이고, 이는 예컨대 HAT 배지와 같은 배지에 민감성이다. 무엇보다도, 일부 구현예에서, 골수종 세포주는, 비제한적으로, 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재의 솔크 연구소 세포 분배 센터로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 메릴랜드주 록빌 소재의 미국 종균 협회로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유도된 것들을 포함한다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종성골수종 세포주가 또한, 인간 단클론성 항체의 생산에 대해 하기와 같이 기술되었다: Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대해 지향된 단클론성 항체의 생성에 대해 검정된다. 일부 구현예에서, 하이브리도마 세포에 의하여 생산된 단클론성 항체의 결합 특이성은 하기에 의하여 계측된다: 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA).
단클론성 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 하기에 의하여 계측될 수 있다: 스케쳐드(Scatchard) 분석 (Munson et al., Anal. Biochem . 107:220 (1980).
목적 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 식별된 후, 클론은 희석 절차를 제한함에 의해 서브클로닝되고 그리고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적을 위해 적합한 배양 배지는, 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로 생체내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의하여 분비된 단클론성 항체는 기존 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 폴리펩티드 A-세파로오스(Sepharose), 하이드록실아퍼타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수 유체 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 용이하게 단리시키고 서열분석한다 (예를 들어, 특히 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 일부 구현예에서, 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로서 사용된다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내에 배치될 수 있으며, 그 다음 발현 벡터는 숙주 세포, 예컨대 이.콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 달리는 면역글로불린 폴리펩티드를 생성하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성물을 얻는다. 항체를 암호화하는 DNA의 세균내 재조합 발현에 대한 검토 문헌은 하기를 포함한다: Skerra et al., Curr . Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및
Figure 112017127996848-pct00002
, Immunol . Revs., 130:151-188 (1992).
추가 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은, 예를 들면 하기에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다: McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991)는 각각 파아지 라이브러리를 사용한, 뮤린 및 인간 항체의 단리를 기술한다. 후속의 공보는 매우 큰 파아지 라이브러리(하기 문헌)에 대한 전략으로서 쇄 셔플링(문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)])에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 생산뿐만 아니라 조합 감염 및 생체내 재조합을 기술한다: Waterhouse et al., Nuc . Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). 따라서, 이들 기술은 단클론성 항체의 단리를 위한 전통적인 단클론성 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들면, 상동한 뮤린 서열 [하기 문헌] 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 위한 암호화 서열을 치환함으로써, 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드를 위한 면역글로불린 암호화 서열 모두 또는 암호화 서열의 일부에 공유적으로 연결함으로써 변형될 수 있다: 미국 특허 번호 4,816,567; Morrison et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA 81:6851 (1984)).
전형적으로 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 또는 이들은 항체의 일 항원-결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환되어 항원에 대한 특이성을 갖는 일 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라성 2가 항체를 만든다.
본 명세서에서 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG 단클론성 항체이다.
(ii) 인간화된 항체
일부 구현예에서, 항체는 인간화된 항체이다. 비-인간 항체의 인간화 방법은 당해기술에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 이것내로 도입된 1종 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 도입 가변 도메인으로부터 전형적으로 취해지는 도입 잔기로 지칭된다. 인간화는 Winter와 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라서, 인간 항체의 서열에 상응하는 서열에 대해 초가변 영역 서열을 치환함으로써, 필수적으로 수행될 수 있다. 따라서, 상기 인간화된 항체는 키메라성 항체(미국 특허 번호 4,816,567)이며, 여기서 실질적으로 한개 미만의 무손상 인간 가변 도메인은 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 인간 항체이며, 여기서 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기는 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된다.
인간화 항체를 제조하는 데 있어서 사용되는 인간 가변 도메인, 즉 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝된다. 설치류의 것에 가장 밀접한 인간 서열이 그런 다음 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로 허용된다 (Sims et al., J. Immunol . 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol . Biol . 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위 그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래한 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 가지 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).
항체는 항원에 대한 높은 친화도의 유지 및 다른 유리한 생물학적 특성으로 인간화되는 것이 더 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 상기 방법의 일부 구현예에서, 인간화 항체는 친계 서열의 분석 공정 및 친계 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념의 인간화 산물에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택되는 후보 면역글로불린 서열의 가능성이 있는 3차원 입체 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 표시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 작용에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방법으로, FR 잔기는 수용자 및 유입 서열로부터 선택되고 조합되어 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성된다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 데 직접적이면서 가장 실질적으로 수반된다.
(iii) 인간 항체
일부 구현예에서, 항체는 인간 항체이다. 인간화에 대한 대안으로, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들면, 면역화에 의해, 내인성 면역글로불린 생산의 부재에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들면, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들면, 키메라성 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 저해를 초래한다는 것이 기재되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 전이는 항원 유발에 의한 인간 항체의 생성을 초래할 것이다. 참고: 예를 들면, Jakobovits et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno . 7:33 (1993); 및 미국 특허 번호 5,591,669; 5,589,369; 및 5,545,807.
대안적으로, 파아지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))은 비면역화된 공여체로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내 인간 항체 및 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 섬사상 박테리오파아지, 예컨대 M13 또는 fd의 대 또는 소 피막 폴리펩티드 유전자에 인프레임 클로닝되고, 그리고 파아지 입자의 표면에 기능적 항체 단편으로서 표시된다. 섬사상 입자는 파아지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기반한 선별로 또한 결과적으로 그 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자를 선별한다. 따라서, 파아지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파아지 디스플레이는 다양한 포멧으로 수행될 수 있다; 검토를 위해 하기를 참고한다: 예를 들면, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). V-유전자 분절의 몇 개의 공급원은 파아지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유도된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 비면역화된 인간 공여체로부터 V 유전자의 레퍼토리는 제작될 수 있고 그리고 항원 (자가-항원 포함)의 다양한 배열에 대한 항체는 하기에 기재된 기술을 본질적으로 따라 단리될 수 있다: Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). 또한 참고: 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905.
인간 항체는 또한 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (참고: 미국 특허 5,567,610 및 5,229,275).
(iv) 항체 단편
일부 구현예에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백분해 소화를 통해 유도되었다 (참고: 예를 들면, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 이제 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 고찰된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이에서 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab)2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 구현예에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 참고: WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458. 항체 단편은 또한, 예를 들면, 미국 특허 5,641,870에서, 예를 들어 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체 단편이 제공된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv, Fv, 및 디아바디로 구성된 군으로부터 선택된다.
(v) 이중특이적 항체
추가 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 적어도 2 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체 결합 아암은 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2 또는 CD3), 또는 IgG (FcγR)에 대한 Fc 수용체 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)의 백혈구 상에서 세포에 세포 방어 기전을 집중시키기 위하여 촉발 분자에 결합하는 아암과 조합될 수 있다. 이중특이적 항체 전장 항체 또는 항체 단편 (예컨대, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 T 세포-의존적 이중특이적 (TDB) 항체이다. 일부 구현예에서, TDB는 표적 항원 결합 단편 및 T 세포 수용체 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3e 결합 단편을 포함한다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적 생산은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 공동 발현에 근거하며, 여기서 두 쇄은 상이한 특이성을 갖는다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 집합으로 인하여, 이러한 하이브리도마 (4혼성체(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이중 오직 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의하여 수행되는, 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 산출량은 낮다. 유사한 절차가 하기에 개시된다: WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
상이한 접근에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열로 융합된다. 일부 구현예에서, 융합은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖고, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합의 적어도 1종에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원할 시 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 개별 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 유기체에 공-형질감염된다. 이것은 작제물에서 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등 비가 최적의 수율을 제공하는 경우 구현예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 분율 조정에서 큰 가요성을 제공한다. 그러나, 균등 비에서 적어도 2 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 초래하는 경우 또는 비가 특정한 유의성이 없는 경우 한 발현 벡터에서 2 또는 모든 3개의 폴리펩티드 쇄에 대한 암호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 접근의 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 혼성체 면역글로불린 중쇄 및 다른 아암 내의 혼성체 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 오직 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조는 비목적 면역글로불린 쇄 조합으로부터의 목적 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 발견되었다. 이러한 접근은 WO 94/04690에 개시된다. 이중특이적 항체 생성의 추가적인 세부사항에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참조한다: Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
미국 특허 번호 5,731,168에 기재된 또 다른 접근에 따르면, 항체 분자 페어 간의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체 백분율을 최대화하기 위해 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 것(예로, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체하여 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "내강"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비해 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합되거나, "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 이중특이적 항체에는 가교결합되거나, "이종콘주게이트" 항체가 포함된다. 그러한 항체는, 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포로 표적화하는데 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료에 대하여 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 0308936). 이종콘주게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합 제제 및 기술은 당해기술에서 잘 알려지고, 그리고 미국 특허 번호 4,676,980에 기재된다 (다수의 가교결합 기술과 함께).
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하기 위한 기술은 또한 하기 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 사용하여 제조될 수 있다. [Brennan et al., Science 229: 81 (1985)]은 무손상 항체가 F(ab’)2 단편을 생성하기 위하여 단백질가수분해적으로 절단되는 절차를 기술한다. 이러한 단편은 이웃한 디티올을 안정화하고 분자간 이황화 형성을 방지하기 위하여 디티올 복합화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원된다. 생성된 Fab’ 단편은 이후 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab’-TNB 유도체 중 하나는 이후 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의하여 Fab’-티올로 재전환되고, 기타 Fab’-TNB 유도체의 등몰량으로 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 유래한 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되었다. Kostelny et al., J. Immunol . 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의한 2개의 상이한 항체의 Fab’ 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체를 형성하고, 이후 재-산화되어 항체 이종이량체를 형성하였다. 이러한 방법이 또한 항체 동종이량체의 생산을 위하여 이용될 수 있다. "디아바디" 기술은 하기에 의하여 기술되며: Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993), 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 기전을 제공하였다. 단편은 동일한 쇄 상의 두 도메인 간 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL) 과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VH 및 VL 도메인과 쌍형성하도록 유도되어 두 항원-결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용에 의한, 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 기타 전략이 또한 보고되었다. 참고: Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994).
2 초과의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt et al., J. Immunol . 147: 60 (1991).
(v) 다가 항체
일부 구현예에서, 항체는 다가 항체이다. 다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빨리 내재화(및/또는 이화)될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 3 이상의 항원 결합 부위를 갖는, (IgM 부류 이외의 것인) 다가 항체(예로, 4가 항체)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄을 암호화하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다(또는 이로 구성된다). 이 시나리오에서, 항체는 Fc 영역 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 구성된다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩티드 쇄(그리고 바람직하게는 2개 폴리펩티드 쇄)을 포함하며, 여기서 폴리펩티드 쇄(들)은 둘 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있고, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)은 하기를 포함할 수 있다: VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 적어도 2개 (및 바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 선택적으로, CL 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다가 항체는 T 세포 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 다가 항체는 T 세포 수용체 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 다가 항체는 CD3 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 다가 항체는 CD3e 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 다중특이적 항체의 예시는 비제한적으로 중쇄 가변 도메인 (VH)및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서 VH VL 단위는 하기를 갖는다: 폴리에피토프 특이성, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 VH VL 단위를 가짐), 2개 이상의 단일 가변 도메인을 갖는 항체 (상이한 에피토프에 결합하는 각각의 단일 가변 도메인을 가짐), 전장 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 트리아바디, 3작용성 항체), 공유적이거나 비-공유적으로 연결된 항체 단편. 일부 구현예에서, 상기 항체는 다중에피토프 특이성; 예를 들어, 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 둘 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 단일특이적이며; 예를 들어, 하나의 에피토프에만 결합하는 항체이다. 일 구현예에 따라서, 다중특이적 항체는 5 μM 내지 0.001 pM, 3 mM 내지 0.001 pM, 1 mM 내지 0.001 pM, 0.5 mM 내지 0.001 pM, 또는 0.1 mM 내지 0.001 pM의 친화도로 각 에피토프에 결합하는 IgG 항체이다.mmmmm
(vi) 기타 항체 변형
예를 들면, 항체의 항원-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 고양하기 위해, 효과기 기능에 관해 본원에 제공된 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)은 Fc 영역 내 도입되어, 이로써 상기 영역 내에 쇄간 이황화 결합을 형성하도록 할 수 있다. 이로써 생성된 동종이량체 항체는 하기를 가질 수 있다: 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸, 및 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC). 하기를 참고한다: Caron et al., J. Exp Med . 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J., Immunol . 148:2918-2922 (1992). 증진된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 또한, 하기에 기술된 이종이중작용성 가교결합제를 사용하여 또한 제조될 수 있다: Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 가공될 수 있고, 이로써 증진된 보체 매개된 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. 참고: Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
항체의 혈청 반감기 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 그 전체가 참조로 본원에 포함된 US 제2006/0067930호에 기재된 바와 같이 항체에 아미노산 변경이 이뤄질 수 있다.
(B) 폴리펩티드 변이체 및 변형
본원에 기재된 항체를 포함하는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형(들)은 본원에 기재된 폴리펩티드 (예컨대, 항체)를 정제하는 방법에 사용될 수 있다.
(i) 변이체 폴리펩티드
"폴리펩티드 변이체"는, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 폴리펩티드의 전장 천연 서열, 신호 펩티드를 결하는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드의 유무에 관계없이 폴리펩티드의 세포외 도메인과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 바람직하게는, 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 폴리펩티드 변이체는, 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N 또는 C-말단에서 첨가되거나, 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, TAT 폴리펩티드 변이체는 전장 천연 서열 폴리펩티드, 신호 펩티드를 결하는 폴리펩티드 서열, 신호 펩티드의 유무에 관계없이 폴리펩티드의 세포외 도메인에 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 임의의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 선택적으로, 변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 서열에 비교하여 1 이하 보존적 아미노산 치환, 대안적으로 천연 폴리펩티드 서열에 비교하여 약 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이하 보존적 아미노산 치환을 가질 것이다.
변이체 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서 절단될 수 있고, 또는 예를 들면, 전장 천연 폴리펩티드와 비교될 때, 내부 잔기를 결할 수 있다. 특정 변이체 폴리펩티드는 목적 생물학적 활성을 위해 필수적이지 않은 아미노산 잔기를 갖지 결할 수 있다. 절단, 결실 및 삽입을 갖는 이들 변이체 폴리펩티드는 임의의 수의 종래의 기술에 의해 제조될 수 있다. 목적 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또 다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 목적 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 단편을 단리하고 증폭하는 것을 포함한다. 핵산 단편의 목적 말단을 한정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에서 이용된다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 본 명세서에 개시된 천연 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 공유한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지는 백 개 이상의 잔기를 함유하는 함유하는 폴리펩티드의 길이에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
예를 들어, 상기 폴리펩티드의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성들을 증진시키는 것이 바람직한 일일 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산에 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은, 예를 들면, 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 작제물에 도달하도록 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어지며, 단 최종 작제물은 목적하는 특징, 예컨대, 항원-결합을 가져야 한다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 폴리펩티드(예컨대, 항체)의 번역 후 과정을 변화시킬 수 있다.
목적 활성에 부정적으로 영향을 미침이 없이 아미노산 잔기가 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는가를 계측하기 위한 지침은 폴리펩티드의 서열을 동종의 공지된 폴리펩티드 분자의 서열과 비교하고, 높은 상동성의 영역에서 만들어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함에 의해 알려질 수 있다.
돌연변이유발을 위한 바람직한 위치인, 폴리펩티드 (예컨대, 항체)의 특정 잔기들 또는 영역들의 식별을 위해 유용한 방법은 다음 문헌에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불리운다: Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹이 식별되었고 (예컨대, 하전된 잔기 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu) 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 치환에 대한 작용성 민감성을 입증하는 아미노산 위치는 그런 다음 치환의 부위에 대해 또는 치환 부위에 다른 변이체를 추가로 도입함에 의해 정제된다. 따라서, 아미노산 서열 변동을 도입하기 위한 부위는 예정된 반면, 돌연변이 자체의 특성은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이의 수행을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 그리고 과발현된 항체 변이체가 목적 활성에 대해 선별된다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자 내 적어도 1종의 아미노산 잔기를 가진다. 치환적 돌연변이유발에 관심이 큰 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환은 "예시적 치환"의 표제하에 표 2에 도시된다. 만일 상기 치환이 생물학적 활성에서 변화를 초래한다면, 표 2에서 "치환"으로 명명된, 또는 아미노산 클래스를 참조하여 아래 추가로 기재된 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 스크리닝될 수 있다.
본래
잔기		 치환 예시
치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
폴리펩티드의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 예를 들면, 시트 또는 나선 형태로서, 치환의 구역에서 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크 유지에서 그 효과가 유의미하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 이들의 측쇄의 특성의 유사성에 따라 그룹화될 수 있다 (참고: A. L. Lehninger, Biochemistry second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
대안적으로, 천연 발생 잔기는 하기 공통의 측쇄 특성에 기반하여 그룹으로 분할될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
항체의 적절한 형태 유지에 관여되지 않은 임의의 시스테인 잔기는 또한, 일반적으로 세린과 함께, 치환되어, 분자의 산화적 안정성을 개선할 수 있고 그리고 비정상적인 가교결합을 예방할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은, 특히 폴리펩티드가 항체 단편 예컨대 Fv 단편인 경우, 항체에 부가되어 그 안정성을 개선할 수 있다.
치환형 변이체의 특정 바람직한 유형은 친계 항체 (예컨대 인간화 항체)의 하나 또는 그 초과 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가의 전개를 위해 선택된 수득한 변이체(들)는 이들이 생성된 친계 항체와 비교하여 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환형 변이체를 생성하는데 편리한 방법은 파아지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙을 포함한다. 간단하게는, 몇 개의 초가변 영역 부위(예컨대, 6-7 부위)가 돌연변이화되어 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성한다. 이와 같이 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내 팩키징된 M13의 유전자 III 생성물로의 융합부로서 섬사상 파지 입자로부터의 1가 양상으로 나타난다. 파아지-표시된 변이체는 그런 다음 본 명세서에서 개시된 바와 같은 이의 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)에 대해 선별된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역을 식별하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기들을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 표적 간의 접촉 지점을 식별하기 위한 항원-항체 착물의 결정 구조를 분석하는 것이 이점을 가질 수 있다. 상기 접촉 잔기들 및 이웃하는 잔기들은 본원에서 고안된 기술에 따른 치환을 위한 후보물이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 스크리닝 대상이 되고, 그리고 하나 이상의 관련된 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택될 수 있다.
폴리펩티드의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변경한다. 폴리펩티드는 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있다. 이러한 글리코실화는 숙주세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩티드의 발현 중에 자연적으로 발생할 수 있거나 인간의 중재술로부터의 의도적인 변형일 수 있다. 변경하는 것은 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실하는 것 및/또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. "N-연결됨"은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 모이어티의 측쇄에 결합하는 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드내 상기 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스 또는 자일로스의 부착을 의미하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다.
폴리펩티드에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성되고 이로써 (N-연결 글리코실화 부위에 대한) 상기-기재된 트리펩티드 서열 중 하나 이상을 함유한다. 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대한) 본래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가, 또는 치환에 의해 실시될 수 있다.
폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기에 대해 암호화하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도- 및 엑소- 글리코시다아제의 사용에 의하여 달성될 수 있다.
다른 변형은 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 글루타미닐 및 아스파르기닐 잔기의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 γ-아미노 기의 메틸화, N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.
(ii) 키메라성 폴리펩티드
본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 또 다른, 이종성 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라성 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라성 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합될 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드를 갖는 폴리펩티드의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치된다. 폴리펩티드의 이러한 에피토프-태그된 형태의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 폴리펩티드가 에피토프 태그에 결합하는 항-태그 항체 또는 또 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용하여 친화도 정제에 의해 쉽게 정제되도록 할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과 폴리펩티드와의 융합을 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태는 "면역접합체"로 지칭된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체(immunoadhesin)"는 이종성 폴리펩티드의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 작용과 조합하는 항체-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역접합체는 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열의 융합을 포함하고, 이는 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (즉, "이형"임) 및 면역글로불린 불변 도메인 서열 이외의 것이다. 면역접합체 분자의 접합체 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역접합체 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
Ig 융합은 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 영역 대신에 가용성 (막관통 도메인이 결실되거나 불활성화됨) 형태의 폴리펩티드의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 면역글로불린 융합은 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다.
(iiI) 폴리펩티드 콘주게이트
폴리펩티드 제제에서 사용하기 위한 폴리펩티드는 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 성장 억제제, 독소 (예컨대, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성동위원소 (즉, 방사콘주게이트)에 콘주게이트될 수 있다.
이러한 접합체의 생성에 유용한 화학치료제가 사용될 수 있다. 추가로, 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 비제한적으로 하기를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센). 각종 방사성핵종이 방사콘주게이트된 폴리펩티드의 생산을 위해 이용 가능하다. 예시는 하기를 포함한다: 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re. 폴리펩티드 및 세포독성제의 콘주게이트는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들면, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예를 들면, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들면, 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들면, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들면, 톨리엔(tolyene) 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들면, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 하기에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다: Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 폴리펩티드로의 방사성 뉴클레오티드의 콘주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다.
폴리펩티드 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신 (calicheamicin), 메이탄시노이드, 트리코텐 (trichothene), 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 콘주게이트가 또한 본원에서 고려된다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테너스 세라타(Maytenus serrata)로부터 먼저 단리되었다. 그 뒤에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성한다는 것이 발견되었다. 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체가 또한 고려된다. 예를 들어, 하기에 개시된 것을 포함하는, 폴리펩티드-메이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한 본 기술분야에 공지된 많은 연결 기가 있다: 미국 특허 번호 5,208,020. 연결 기는 상기 식별된 특허에 개시된 바와 같은, 디설파이드 기, 티오에테르 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다제 불안정 기, 또는 에스테라제 불안정 기를 포함하며, 디설파이드 및 티오에테르 기가 바람직하다.
링커는 결합 형태에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 종래의 커플링 기술을 이용하여 하이드록실 기와 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 반응은 하이드록실 기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실 기로 변형된 C-15 위치 및 하이드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 결합은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
또 다른 관심 콘주게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 폴리펩티드를 포함한다. 항생제의 칼리키아미신 패밀리는 서브피코몰 농도로 이중-가닥 DNA 절단물을 생성할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 콘주게이트의 제조를 위해, 예컨대, 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 5,712,374. 사용될 수 있는 칼리키아미신의 구조적 유사체는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1 을 포함한다. 항체가 콘주게이트될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항엽산인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA 둘 모두는 세포내 작용 부위를 가지며 원형질 막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 폴리펩티드 (예컨대, 항체) 매개된 내재화를 통한 이들 제제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 콘주게이트될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조토신, 빈크리스틴 (vincristine) 및 5-플루오로우라실, 총칭해서 LL-E33288 복합체로 공지된 제제의 계열, 뿐만 아니라 에스페라미신 (esperamicin)을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드 및 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예컨대, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이의 콘주게이트일 수 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 폴리펩티드 (예컨대, 항체)는 폴리펩티드-수용체 콘주게이트가 환자에 투여되는 종양 사전-표적화에서 이용하기 위해, 이어서 투명제(clearing agent)를 이용하여 순환으로부터 미결합된 콘주게이트의 제거 및 그 다음 세포독성제 (예를 들면, 방사성뉴클레오티드)에 콘주게이트된 "리간드" (예를 들면, 아비딘)의 투여를 위하여 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 콘주게이트될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 전구약물 (예컨대, 펩티딜 화학치료제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 전구약물-활성화 효소에 콘주게이트될 수 있다. 면역콘주게이트의 효소 성분은 이것을 그것의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환하기 위한 그와 같은 방식으로 전구약물에 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다.
효소는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 알칼리 포스파타제; 설페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항-암 약물, 5-플루오로우라실로 전환시키기에 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 서몰리신, 서브틸리신, 카복시펩티다아제 및 카텝신 (예컨대 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키기에 유용한 D-알라닐카복시펩티다아제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 탄수화물-절단 효소 예컨대 β-갈락토시다아제 및 뉴라미니다아제; β-락탐으로 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 β-락타마제; 및 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기, 각각을 갖는 그의 아민 질소에서 유도된 약물을 유리 약물로 전환시키기에 유용한 페니실린 아미다아제, 예컨대 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제. 대안적으로, 또한 당해 기술에서 "항체효소(abzymes)"로 공지된 효소 활성을 갖는 항체가 전구약물을 무 활성 약물로 전환하기 위해 사용될 수 있다.
(iv) 기타
폴리펩티드의 공유 변형의 또 다른 유형은 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결하는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀젼에 포집될 수 있다. 그와 같은 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Gennaro, A.R., Ed., (1990)]에 개시된다.
V. 제제 및 방법에서 사용하기 위한 폴리펩티드의 수득
본원에 기재된 분석 방법에서 사용되는 폴리펩티드는 재조합 방법을 포함하는 본 기술분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 하기 섹션은 이들 방법에 관한 지침을 제공한다.
(A) 폴리뉴클레오티드
"폴리뉴클레오티드", 또는 "핵산"은, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다.
폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 비제한적으로, 폴리펩티드 mRNA를 가지며 이를 검출가능한 수준으로 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 포함하는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 간편하게 수득될 수 있다. 폴리펩티드-암호화 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지된 합성 절차 (예컨대, 자동화된 핵산 합성)에 의해 수득될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 전체 면역글로불린 분자 쇄, 에컨대 경쇄 또는 중쇄를 암호화할 수 있다. 완전한 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH)뿐만 아니라 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 불변 도메인: CH1, CH2 및 CH3; 및 "힌지" 영역을 포함한다. 일부 상황에서, 불변 영역의 존재가 바람직하다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 TDB의 하나 이상의 면역글로불린 분자 쇄을 암호화한다.
상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 다른 폴리펩티드는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 단일 도메인 항체 ("dAb"), Fv, scFv, Fab' 및 F(ab')2 및 "미니바디"를 포함한다. 미니바디는 CH1 및 CK 또는 CL 도메인이 절제된 (전형적으로) 2가 항체 단편이다. 미니바디는 종래의 항체보다 작기 때문에 임상/진단 용도에서 더 우수한 조직 투과를 달성할 것이지만, 2가이므로, 이들은 dAb와 같은 1가 항체 단편보다 더 높은 결합 친화성을 보유할 것이다. 따라서, 문맥이 달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "항체"는 전체 항체 분자뿐만 아니라 상기 논의된 유형의 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는 암호화된 폴리펩티드에 존재하는 각각의 프레임워크 영역은 상응하는 인간 수용자 프레임워크와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역은 수용자 프레임워크 영역과 비교하여 총 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 각 특징은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 위한 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명확히 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 단지 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예이다.
본 발명의 추가의 세부사항은 하기 비-제한적인 예에 의해 예시된다. 본 명세서의 모든 참조의 개시내용은 본 명세서에 참고로 명확히 편입된다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 순전히 예시적인 것으로 의도되며, 따라서 본 발명을 어떤 식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 하기 실시예 및 상세한 기술은 예시하기 위한 것으로 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1. 항-CD3 동종이량체는 T 세포를 활성화시킨다
T 세포 의존적 이중특이적 (TDB) 항체 (αCD20/αCD3 TDB, 항-CD20 (Mab2; VH 서열번호:31/VL 서열번호:32)/항-CD3 (Mab1; VH 서열번호:19/VL 서열번호:20))는 T 세포 활성화 및 항원 세포 사멸을 유도하기 위해 CD20 항원 발현 세포를 필요로 한다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, CD8+ T 세포를 인간 말초 혈액으로부터 단리하고, 항원 발현 표적 세포주와 1:1 비율로 항온처리하고, 증가하는 농도의 정제된 αCD20/αCD3 TDB 항체로 자극시켰다. TDB를 세포에 첨가한 후 24시간의 정해진 항온처리 후, T 세포를 유세포 분석에 의해 T 세포 활성화의 마커인 T 세포의 표면 상에서 유도된 CD69 (C-형 렉틴 단백질) 및 CD25 (IL-2 수용체)의 양에 대해 평가하였다 (Shipkova M, 2012, Clin . Chim . Acta. 413:1338-49 and Ziegler SF, et al., 1994, Stem Cells 12(5): 465-465). CD69 및 CD25 세포 표면 발현은 αCD20/αCD3 TDB로 자극시 용량 의존적으로 증가된다. 표적 세포의 부재하에 (청색 직사각형), CD69 및 CD25 세포 표면 발현의 증가의 결여에 의해 입증된 바와 같이, T 세포 활성화가 없다. 도 1b에 도시된 바와 같이, T 세포는 αCD20/αCD3 TDB에 의한 표적 세포 사멸을 매개하는데 필요하다. PBMC, 또는 음성 선별 (Milteny Biotec)에 의해 CD3+ (T 세포 수용체/CD3e 하부단위)이 고갈된 PBMC를 CD20 발현 표적 세포주와 1:1 비율로 항온처리한 다음, 증가하는 농도의 αCD20/αCD3 TDB로 자극시켰다. PBMC는 24시간 후 유세포 분석에 의해 표적 세포의 용량 의존적 감소를 나타내었다 (적색 원). 그러나, CD3+ T 세포가 PBMC 풀로부터 고갈되었을 때 표적 세포의 손실이 검출되지 않았다 (청색 직사각형). 따라서, αCD20/αCD3 TDB에 의한 CD20-발현 표적 세포 고갈은 CD3+ T 세포의 활성화를 필요로 하며, αCD20/αCD3 TDB는 표적 세포 사멸만을 유도할 수 없다.
정제된 항-CD3 동종이량체는 인간 공여자 T 세포를 활성화시킨다. 2명의 상이한 공여자로부터의 인간 공여자 PBMC에 증가하는 농도의 정제된 항-CD3 동종이량체 또는 αCD20/αCD3 TDB 이중-특이적 항체를 처리하고 상기 기재된 바와 같이 24시간 후에 FACS에 의해 T 세포 활성화의 수준을 시험하였다. 공여자 1 (도 2, 좌측 패널), 및 공여자 2 (도 2, 우측 패널)를 항-CD8 항체, 항-CD69, 및 항-CD25 항체로 염색하였다. T 세포 활성화 마커 CD69 및 CD25에 대해 양성인 CD8+ T 세포의 백분율을 항-CD3 동종이량체 또는 αCD20/αCD3 TDB 처리의 양에 대해 도식화하였다. 항-CD3 및 αCD20/αCD3 TDB가 표적 세포의 존재하에 T 세포를 용량 의존적으로 활성화시키지만, αCD20/αCD3 TDB (EC50: 4-6 ng/mL)는 항-CD3 동종이량체 (EC50: 169-526 ng/mL)보다 T 세포의 더 강한 활성인자이다. 공여자 가변성에도 불구하고, 항-CD3 동종이량체는 인간 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
항-CD3 동종이량체는 이중특이적 항체 효능을 감소시킬 수 있다. αCD20/αCD3 TDB에 다양한 농도의 정제된 항-CD3 동종이량체로 스파이크하고, 반응을 측정하였다. 항-CD3 동종이량체는 20%를 초과하는 항-CD3 동종이량체의 수준에서 T 세포 활성화의 수준 및 표적 세포 반응의 수준 모두에서, αCD20/αCD3 TDB 효능을 용량 의존적으로 유의하게 감소시켰다 (도 3a 및 표 3). αCD20/αCD3 TDB에 첨가된 낮은 수준의 항-CD3 동종이량체 (HD)는 PBMC를 사용하여 T 세포 활성화를 유의하게 감소시키지 않았다 (CD8+, 도 3b 좌측 패널; CD4+, 도 3b 우측 패널). PBMC를 일정한 양 (2.5% 또는 5%)의 정제된 항-CD3 동종이량체로 고정된 증가하는 수준의 TDB로 자극시키고, 유세포 분석법 (FACS)에 의해 분석하여 T 세포 활성화를 평가하였다 (T 세포 활성화 마커 CD69 및 CD25에 대한 염색). 5% 미만의 수준의 항-CD3 동종이량체는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 αCD20/αCD3 TDB T 세포 활성화 잠재능에 영향을 미치지 않는다.
샘플 T 세포 반응
(상대적 효능%)		 표적 세포 반응
(상대적 효능%)
αCD20/αCD3 TDB + 0 동종이량체 100 100
αCD20/αCD3 TDB + 40% 동종이량체 62 49
αCD20/αCD3 TDB + 30% 동종이량체 71 56
αCD20/αCD3 TDB + 20% 동종이량체 82 69
αCD20/αCD3 TDB + 10% 동종이량체 93 83
αCD20/αCD3 TDB + 5% 동종이량체 102 98
αCD20/αCD3 TDB + 2.5% 동종이량체 99 95
αCD20/αCD3 TDB + 1% 동종이량체 104 101
항-CD3 동종이량체는 표적 세포의 부재 하에서 다양한 인간 공여자 유래의 인간 CD8+ T 세포를 약하게 활성화할 수 있다. 표적 세포의 존재하에 αCD20/αCD3 TDB는 6명의 인간 공여자로부터 단리된 PBMC로부터의 대부분의 CD8+ T 세포를 강하게 활성화시킬 수 있고, 낮은 수준의 항-CD3 동종이량체 (2.5% 또는 5%)는 TDB의 평균 T 세포 활성화 잠재능을 유의하게 활성화시키지 않는다 (도 4a; B+ 조건). 표적 세포의 부재하에 (도 4a; B- 조건), 항-CD3 동종이량체는 CD8+ T 세포를 약하게 활성화시킬 수 있다 (약간의 평균 활성화 잠재능 증가). 인간 T 세포의 항-CD3 동종이량체 활성화가 일부 대표적인 사이토카인에 대해 용량 의존적 증가 경향을 도시한다. 6명의 인간 공여자로부터 단리된 PBMC를 표적 세포의 존재 (B+ 조건) 또는 부재 (B- 조건)하에 1 mg/mL αCD20/αCD3 TDB로 자극시키고, 2.5% 또는 5% 정제된 항-CD3 동종이량체를 첨가하고, T 세포 활성화의 지표로서 분비된 사이토카인에 대해 시험함으로써 T 세포 활성화 잠재능에 대해 평가하였다. 24시간 후, 조건 배지를 수집하고, 루미넥스 (Luminex) 사이토카인 검출 키트를 사용하여 사이토카인의 존재에 대해 시험하였다. 표적 세포의 부재하에 항-CD3 동종이량체 처리는 일부 공여자 PBMC로부터 일부 사이토카인 수준 (IL-10 및 MCP-1)의 유의한 용량 의존적 증가를 나타내었다 (도 4b-4e; B- 조건). 평균 사이토카인 수준 반응을 도식화하였다.
실시예 2. 항-CD3 동종이량체 불순물 검정
T 세포 의존적 이중특이적 (TDB) 항체의 존재하에 T 세포를 활성화시키는 불순물의 존재를 검출하기 위해 생물학적 불순물 검정이 개발되었다. 항-CD3 동종이량체는 2가이므로, 불순물의 각각의 아암은 잠재적으로 TCR에 교차결합하여 T 세포 활성화를 야기할 수 있다. OKT3과 같은 항-CD3 2가 항체에 의한 TCR 매개 교차 결합은 T 세포 신호 전달 캐스캐이드를 활성화시켜 NFAT 및 NFκB를 포함하는 전사 인자의 인산화 및 핵 내재화를 야기하고, 이는 사이토카인과 같은 표적 유전자 또는 Fas, 그란자임 B 및 퍼포린과 같은 세포 사멸제의 전사 유도를 초래한다 (Brown, WM, 2006, Curr Opin Investig Drugs 7:381-388; Ferran, C et al., 1993 Exp Nephrol 1:83-89; Shannon, MF et al., 1995, J. Leukoc . Biol . 57:767-773; Shapiro, 1998; Pardo, J, et al., 2003, Int Immunol ., 15(12):1441-1450). AP1, NFAT, 또는 NFκB의 전사 조절하에, 반딧불 루시퍼라제와 같은 리포터 유전자를, 신호전달 경로의 TCR 활성화 및 T 세포 활성화를 모니터링하는데 사용하였다 (Shannon, MF et al., 1995, J. Leukoc . Biol . 57:767-773; Shapiro, 1998). TDB는 표적 세포의 부재하에 T 세포를 활성화시키지 못하므로 (도 1a 및 1b), 리포터 유전자 검정 접근법을 TDB의 존재하에 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 잠재적인 분석 전략으로서 평가하였다. 항-CD3 동종이량체가 시험관내에서 T 세포를 활성화시킬 수 있는지 초기에 평가하기 위해, 주카트 T 세포 (DSMZ, ACC 282)를 재조합 TCR-반응성 리포터 유전자 렌티바이러스 스톡 (AP1-루시퍼라제, NFAT-루시퍼라제, 또는 NFκB-루시퍼라제) 및 4시간 동안 10 μg/mL의 정제된 항-CD3 동종이량체로 처리된 무변성 풀로 감염시켰다. 주카트/AP1루시퍼라제, 주카트/NFAT루시퍼라제, 및 주카트/NFκB루시퍼라제 무변성 풀은 정제된 항-CD3 동종이량체로 자극시 루시퍼라제의 용량 의존적 유도를 나타낸다. 발광 반응 (루시퍼라제 리포터 유전자 활성)을 도식화하였고, 가장 높은 반응은 주카트/NFκB루시퍼라제 무변성 풀로부터 관찰되었다. (도 5a). 한계 희석에 의해 단리된 주카트/NFκB루시퍼라제 무변성 클론을 10 μg/mL의 정제된 항-CD3 동종이량체에 대한 반응에 대해 스크리닝하였다. 주카트 T 세포 NFκB루시퍼라제 풀은 다른 TCR-반응 요소와 비교하여 항-CD3 동종이량체에 대해 가장 높은 반응을 입증하였지만, 다른 반응 요소들 역시 항-CD3 동종이량체를 검출하는데 잠재적으로 유용할 수 있다. (도 5b).
αCD20/αCD3 TDB 또는 항-CD3 동종이량체에 대한 이 클론의 상대적 반응을 결정하기 위해, 주카트/NFκB루시퍼라제 클론 2 세포주를 CD20 발현 표적 세포주의 존재하에 증가하는 농도의 αCD20/αCD3 TDB 또는 항-CD3 동종이량체로 처리하고, 루시퍼라제 활성을 도식화하였다 (도 6a). 세포를 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 4시간 동안 αCD20/αCD3 TDB 또는 CD3 동종이량체로 자극시켰다. 정제물은 공-자극 (co-stimulatory) 표적 세포의 존재하에 정제된 항-CD3 동종이량체보다 1000배 더 활성이다. 항-CD3 동종이량체에 의한 T 세포 활성화 수준은 αCD20/αCD3 TDB보다 더 낮으나, 표적 세포의 존재하에 검출가능하다. 표적 세포의 부재하에, αCD20/αCD3 TDB는, 이 세포주에서 루시퍼라제 전사의 NFκB-의존적 활성화에 의해 측정된 바와 같이, TDB의 훨씬 높은 수준에서도 T 세포 활성화를 야기하지 않지만, 항-CD3 동종이량체는 생성물 관련 불순물의 낮은 수준에서도 루시퍼라제 유도를 유발할 수 있다 (도 6b). 가공된 주카트/NFκB루시퍼라제 클론 2 리포터 유전자 세포주에서 관찰된 이러한 T 세포 활성화 반응은 T 세포 활성화의 다른 측정을 이용하여 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리된 인간 T 세포를 사용하여 관찰된 것과 대등하며, 이는 T 세포 활성화 반응을 모니터링하는 리포터 유전자의 사용이 대등하다는 것을 가리킨다 (표 4). 주카트/NFκB루시퍼라제 클론 2 세포주 (주카트-NFκBLuc)는 αCD20/αCD3 TDB에서 항-CD3 동종이량체 불순물을 검출하기 위한 세포 기반 검정 방법을 개발하고 최적화하는데 사용되었다. 종합적으로, 이들 데이터는 가공된 T 세포 리포터 유전자 세포주가 TDB에서 생물학적 활성 항-CD3 동종이량체 생성물 관련 불순물을 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
표적 세포의 부재 하에서의 항-CD3 동종이량체 (EC50) 표적 세포의 존재 하에서의 αCD20/αCD3 TDB (EC50)
인간 PBMC (CD69+/CD25+) 공여체 1 526 ng/mL 5.5 ng/mL
인간 PBMC (CD69+/CD25+) 공여체 2 169 ng/mL 4.4 ng/mL
주카트/NFκBLuc 210 ng/mL 1.3 ng/mL
실시예 3. 항-CD3 동종이량체를 검출하기 위한 정량화 방법
αCD20/αCD3 TDB의 존재하에 존재하는 생물학적 활성 불순물을 검출하는 민감하고 정량적인 분석 방법이 개발되었다. αCD20/αCD3 TDB T 세포 활성화 분석은 가공된 T 세포 리포터 유전자 세포주, 주카트-NFκBLuc를 사용하여 Rel/NFκB 신호전달 경로의 CD3e/TCR 교차결합 유도된 활성화를 측정함으로써 TDB 시험 샘플에 존재하는 항-CD3 동종이량체를 검출한다. 검정 내에 표적 세포가 존재하지 않으므로, 항-CD3 동종이량체만이 T 세포 리포터 세포주를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 NFκB는 핵으로 전위되어, 루시퍼라제의 전사를 유도하는 합성 프로모터의 8개의 NFκB 반응 요소에 결합한다. 상기 검정에서, 항-CD3 동종이량체 검정 표준, 항-CD3 동종이량체 대조군, 및 αCD20/αCD3 TDB 시험 샘플의 희석물을 제조하고, 96 웰 분석 플레이트 내의 배양된 주카트-NFκBLuc 리포터 유전자 세포에 첨가하였다. aCD3 동종이량체 표준은 αCD20/αCD3 TDB 정제 공정으로부터 단리된 aCD3 동종이량체의 정제된 롯트 (lot)이다. aCD3 동종이량체 대조군은 정제된 aCD3 동종이량체로 스파이크된 αCD20/αCD3 TDB이며, 검정에서 시스템 적합성 기준으로서 사용된다. 검정에서 aCD3 동종이량체 대조군의 사용은 불순물 검정 실행에 사용되는 방법에 특이적이다. 4시간의 정해진 항온처리 후, 동종이량체 검정 표준, 동종이량체 대조군, 및 αCD20/αCD3 TDB 시험 샘플에 의해 유도된 루시퍼라제 활성의 양을 발광 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. αCD20/αCD3 TDB 시험 샘플 내 생물학적으로 활성인 항-CD3 동종이량체의 양은, 플레이트 웰의 개별 세트 내 항-CD3 동종이량체 검정으로부터 생성된 발광의 표준 곡선으로부터 계측하였다 (도 7). 시험 샘플 내 존재하는 항-CD3 동종이량체의 백분율은 시험 샘플 내 존재하는 αCD20/αCD3 TDB의 총량에 대하여 존재하는 항-CD3 동종이량체의 양의 비율에 의해 계측되었다. 방법의 정확도는, αCD20/αCD3의 제조물 내로 정제된 항-CD3 동종이량체의 공지된 양으로 스파이킹하는 것, 및 항-CD3 동종이량체의 회수 퍼센트를 측정하는 것에 의하여 평가되었다. 상기 방법은 우수한 전반적인 선형성을 나타내며 (도 8), 6.8%의 전반적인 정밀도를 갖는다 (표 5). αCD20/αCD3 TDB의 1 mg/mL 스톡에서, 상기 방법은 150 나노그램, 또는 0.02% 정도로 적은 항-CD3 동종이량체로 스파이크된 수준을 재현성있게 검출할 수 있었다. 수행된 회수율 연구에 기초하여, 최적화된 방법은 TDB의 다양한 제제에 존재하는 0.25% 내지 35% 항-CD3 동종이량체의 항-CD3 동종이량체 수준을 신뢰할 수 있게 정량화할 수 있었고 6.8%의 전반적인 정밀도를 가지고 있었다. 정밀도는 각 스파이크 수준에서 회수율의 평균 %CV로서 결정되었다.
수준 (%) 0.25 0.5 0.75 1.0 2.5 5.0 10.0 20.0 30.0 35.0
회수% 104 103 105 107 97 109 110 114 97 102
CV% 3.14 5.37 6.33 12.33 3.32 12.87 4.61 7.76 5.79 6.53
αCD20/αCD3 TDB T 세포 활성화 분석은 또한 또 다른 생성물 관련 불순물, 항-CD3 응집물 및 αCD20/αCD3 TDB 고분자량 종의 존재에 민감하다. SEC를 사용하여 검출된 바와 같이 2%를 초과하는 HWMS를 함유하는 샘플은, 주카트/NFκB-Luc 세포주의 T 세포 활성화를 야기할 수 있다. HMWS에 의한 이 활성화를 T-세포 활성화 검정으로부터 % 동종이량체로서 정량화하였다 (도 9).
<110> CARY, Kendall <120> CELL-BASED ASSAY FOR DETECTING ANTl-CD3 HOMODIMERS <130> 146392022940 <150> US 62/167,761 <151> 2015-05-28 <160> 40 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asn Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Thr Gln Ser Phe Ile Leu 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Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Gln 85 90 95 Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Phe Ile Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 23 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 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95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (34)

  1. T 세포-의존적 이중특이적 항체 (TDB)를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체를 검출하는 방법이며,
    상기 이중특이적 항체는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고,
    상기 방법은,
    T 세포의 집단을 상기 조성물과 접촉시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소(response element)에 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 T 세포의 집단은 상기 표적 항원을 포함하지 않으며,
    상기 리포터의 발현은 항-CD3 동종이량체의 존재를 나타내는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 리포터가 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 루시퍼라제가 반딧불(firefly) 루시퍼라제, 레닐라(Renilla) 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제(nanoluciferase)인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소가 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소가 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 활성화 반응성 요소를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단이 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 집단인 방법.
  7. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단이 주카트(Jurkat) T 세포 또는 CTLL-2 T 세포의 집단인 방법.
  8. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단이 상기 이중특이적 항체를 0.01 ng/mL 내지 50 ng/mL 범위의 농도로 포함하는 조성물과 접촉되는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 리포터가, 상기 세포를 상기 조성물과 접촉시킨 후, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 또는 24시간 중 어느 하나 이상의 시간 이후에 검출되는 것인 방법.
  10. T 세포-의존적 이중특이적 항체 (TDB)를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체 항체의 양을 정량화하는 방법이며,
    상기 TDB는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고,
    상기 방법은,
    T 세포의 집단을 하나 이상의 농도의 TDB를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계이며,
    여기서 상기 T 세포는 T 세포 활성화에 반응성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터를 암호화하는 핵산을 포함하고,
    상기 T 세포의 집단은 상기 표적 항원을 포함하지 않는 것인 단계, 및
    상기 T 세포를 상이한 농도의 정제된 항-CD3 동종이량체와 접촉시켜 생성된 표준 곡선을 사용하여, 상기 리포터의 발현을 항체 농도의 함수(function)로서 상호관련(correlating)시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 리포터가 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 루시퍼라제가 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제인 방법.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성화에 반응성인 프로모터가 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, T 세포 활성화에 반응성인 프로모터가 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 활성화 반응성 요소를 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단이 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 집단인 방법.
  16. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단이 주카트 T 세포 또는 CTLL-2 T 세포의 집단인 방법.
  17. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, T 세포의 집단이 상기 TDB를 0.01 ng/mL 내지 50 ng/mL 범위의 농도로 포함하는 조성물과 접촉되는 것인 방법.
  18. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 표준 곡선이, 상기 T 세포를 0.01 ng/mL 내지 50 ng/mL 범위의 상이한 농도의 정제된 항-CD3 항체와 접촉시켜 생성되는 것인 방법.
  19. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 리포터가, 상기 세포를 상기 조성물과 접촉시킨 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 또는 24시간 중 어느 하나 이상의 시간 이후에 검출되는 것인 방법.
  20. 이중특이적 항체를 포함하는 조성물 내 항-CD3 동종이량체의 검출을 위한 키트이며,
    상기 이중특이적 항체는 표적 항원 결합 단편 및 CD3 결합 단편을 포함하고,
    상기 키트는, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소에 작동가능하게 연결된 리포터를 포함하는 가공된(engineered) T 세포를 포함하는 키트.
  21. 청구항 20에 있어서,
    항-CD3 동종이량체 검정 표준 및/또는 항-CD3 동종이량체 대조군
    을 추가로 포함하는 키트.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서, 리포터가 루시퍼라제, 형광 단백질, 알칼리 포스파타제, 베타 락타마제, 또는 베타 갈락토시다제인 키트.
  23. 청구항 22에 있어서, 루시퍼라제가 반딧불 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 또는 나노루시퍼라제인 키트.
  24. 청구항 20 또는 21에 있어서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소가 NFAT 프로모터, AP-1 프로모터, NFκB 프로모터, FOXO 프로모터, STAT3 프로모터, STAT5 프로모터 또는 IRF 프로모터인 키트.
  25. 청구항 24에 있어서, T 세포 활성화에 반응성인 반응 요소가 NFAT, AP-1, NFκB, FOXO, STAT3, STAT5 및 IRF 중 어느 하나 이상으로부터의 T 세포 활성화 반응성 요소를 포함하는 것인 키트.
  26. 청구항 20 또는 21에 있어서, T 세포의 집단이 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 집단인 키트.
  27. 청구항 20 또는 21에 있어서, T 세포의 집단이 주카트 T 세포 또는 CTLL-2 T 세포의 집단인 키트.
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