CN107418980B - 一种r-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法 - Google Patents

一种r-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种一种R‑3,5‑双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法，将醇脱氢酶固定化得固定化酶，然后将所得固定化酶作为生物催化剂催化底物3,5‑双三氟甲基苯乙酮生成R‑3,5‑(双三氟甲基)苯乙醇。本发明具有反应条件简单，转化率高，反应周期短，反应选择性高，成本低，反应原材料可重复利用等优点，是一种绿色节能的高效生产工艺。

Description

一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法
技术领域
本发明涉及一种医药中间体，特别涉及一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法。
背景技术
R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇是一种重要的医药中间体。主要应用于合成阿瑞吡坦(Aprepiandi，商品名Emend)。阿瑞吡坦是2003年美国食品和药物管理局(FDA)批准上市的第一个神经激肽-1(NK-1)受体拮抗剂，能预防所有实验性致吐刺激物(包括顺铂)导致的呕吐，是第一个被批准的应用于临床的NK-1受体拮抗剂。
目前，国内合成R-3,5-(双三氟甲基苯)乙醇的文献报道很少，国内专利CN103497911B利用筛选到的ChKRED20作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，但反应周期长(24h)，产物分离比较麻烦(过硅胶柱纯化)。Mathad Vijayavitthal Thippannachar等采用甲醇转移氢法，温度为70℃、酸性条件下，反应8h得到目标产物，产率不到50％。Naud Frederic等采用高压加氢的方法合成了R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇，RuCl2(PPh3)3为催化剂，反应温度为25℃，H2压力为2MPa，甲苯为溶剂，在碱性条件下，反应19h，得到选择性为93％的目标产物，此工艺过程需要高压参与反应，而且甲苯作溶剂，易挥发，长期使用甲苯有致癌的威胁，限制了此方法的使用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的上述问题，提供一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法，具有反应条件简单，转化率高，反应周期短，反应选择性高，成本低，反应原材料可重复利用等优点，是一种绿色节能的高效生产工艺。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法，将醇脱氢酶固定化得固定化酶，然后将所得固定化酶作为生物催化剂催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇。
本发明的反应路线如下所示：
Figure BDA0001323459740000021
该工艺反应步骤简单、可连续操作、成本较低、生产过程的原料都可以重复回收再利用，真正做到无三废排放，是一种绿色生产工艺，具有广阔的工业应用前景。
作为优选，固定化酶催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇的催化体系组成如下：固定化酶50-250g/L，3,5-双三氟甲基苯乙酮浓度为50-200g/L，辅酶Na-NAD 80-300mg/L，余量的溶剂，所述溶剂异丙醇的水溶液。
作为优选，所述异丙醇的水溶液体积组成为：异丙醇30-70％，水30-70％。
作为优选，催化反应的条件为：28-45℃，摇床转速80-220rpm，时间2-6h。
作为优选，所述醇脱氢酶来源于链霉菌Streptomyces yokosukanensis。不是任意醇脱氢酶能够催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇，发明人经过长期研究发现，现有的具有催化作用的醇脱氢酶存在转化率不高，反应选择性不高的问题，因此，发明人进行了长期探索和筛选，从而筛选获得了一种来源于特定链霉菌Streptomyces yokosukanensis的醇脱氢酶，能够催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇，转化率高，反应选择性高。
作为优选，所述醇脱氢酶的基因序列见SEQ ID No.1所示。
作为优选，产物R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇的分离纯化及原料重复利用方法为：
(1)催化反应结束后，一次过滤分离出固定化酶，其中的固定化酶直接用于下一批次的催化反应；
(2)过滤出的反应液在旋转蒸发仪上40-50℃，真空度-0.1Mpa～-0.08Mpa条件下，蒸出溶剂，旋蒸脱溶后的反应液中有白色晶体析出，二次过滤分离出的白色晶体即为产物R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇。
作为优选，蒸出溶剂中分离出的异丙醇重复利用。蒸出溶剂包含异丙醇和丙酮，其中丙酮为副产物，分离出的异丙醇可以在催化反应中重复利用。
作为优选，二次过滤分离的滤液在下一批次的催化反应中重复利用。二次过滤分离的滤液中主要是水，可以在催化反应中重复利用，而且在重复的批次中不用额外再添加辅酶Na-NAD，降低了生产成本。
下一批次的反应，其中固定化酶、异丙醇、水和辅酶Na-NAD都可以用上批回收的。其中固定化酶可重复利用25次。
与现有技术相比，本发明的优点是：
Figure BDA0001323459740000041
附图说明
图1是产物R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇气相检测图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明利用筛选到的来源于链霉菌Streptomyces yokosukanensis(市售，ATCC25520)的醇脱氢酶(SY-ADH)，作为生物催化剂转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇。
实施例1：
一、醇脱氢酶的基因全合成
将来源于Streptomyces yokosukanensis的醇脱氢酶的基因序列全合成，基因合成由上海英杰生物公司完成，基因序列如下：
AAGCTTCATATGACCACCCCGCCGCTGCCGGACTACGCTACCGAATTCACCGGTCGTACCGCTCTGGTTACCGGTGCTGCTTCTGGTATCGGTCTGGCTACCGCTCGTCGTCTGGCTGCTGGTGGTGCTCACGTTGTTCTGGCTGACTTCCACACCGAAGCTGCTGAACAGGCTGCTGCTGACCTGACCGCTGAAGGTGCTTCTGCTGCTGCTGTTCACGTTGACGTTACCGAACCGGCTTCTGTTGAAGCTGCTGTTGCTTTCGCTCAGGACGCTTTCGGTGCTCTGCACCTGGCTGTTAACAACGCTGGTATCGGTGGTCCGTCTACCCCGACCGGTGCTTACGACATCGAAGCTTACCAGCGTGTTATCCGTACCAACCTGGACGGTGTTTTCTACTCTCTGCGTTACGAACTGCCGGTTCTGGAAGCTGCTGGTGGTGGTGCTATCGTTAACGTTGCTTCTATCCTGGGTTCTGTTGGTTTCGCTGGTTCTCCGGCTTACGTTGCTGCTAAACACGGTGTTGTTGGTCTGACCAAAACCGCTGCTGCTGAATACGCTGCTCGTGGTGTTCGTGTTAACGCTGTTGGTCCGGGTTTCATCGAAACCCCGCTGCTGGGTACCTCTATGAACGAATCTGCTCACCAGGCTCTGGTTGCTCTGCACCCGGCTGGTCGTCTGGGTCGTCCGGAAGAAGTTGCTGAACTGATCGCTTTCCTGCTGTCTGACCGTGCTGCTTTCGTTCACGGTTCTTACCACCTGATCGACGGTGCTTACACCACCGTTTAACTCGAGAACGTT(SEQ ID No.1)。
醇脱氢酶蛋白序列为：
MTTPPLPDYATEFTGRTALVTGAASGIGLATARRLAAGGAHVVLADFHTEAAEQAAADLTAEGASAAAVHVDVTEPASVEAAVAFAQDAFGALHLAVNNAGIGGPSTPTGAYDIEAYQRVIRTNLDGVFYSLRYELPVLEAAGGGAIVNVASILGSVGFAGSPAYVAAKHGVVGLTKTAAAEYAARGVRVNAVGPGFIETPLLGTSMNESAHQALVALHPAGRLGRPEEVAELIAFLLSDRAAFVHGSYHLIDGAYTTV(SEQ ID No.2)。
二、构建重组菌
表达系统构建过程如下：
先合成下列扩增引物，
正向引物：TTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACCACCCCGCCGC(SEQ ID No.3)；
反向引物：
TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAACGGTGGTGTAAGCACCG(SEQ ID No.4)。
并加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中。
2mM dNTP mix(2mM each dNTP)10μl
正向引物(10μM)3μl
反向引物(10μM)3μl
10×Pfu buffer 10μl
醇脱氢酶基因模板20ng
Pfu DNA polymerase(10U/μl)0.8μl
最后补加ddH2O，使得反应体系总体积为100μl。
将配制好的PCR反应体系置于基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃预变性30s，后经过35个循环，每个循环包括98℃、30s，55℃、45s，72℃、120s；最后72℃延伸2min。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a载体的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。选择测序成功的克隆抽取质粒，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组菌。
三、重组蛋白溶液的制备
挑取单克隆至LB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中，37℃过夜培养，以1％的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中，37℃培养3h，加入0.5mM IPTG诱导后，30℃继续培养至20-36h。8000rpm，4℃离心收集菌体，用pH值为7.0、0.1M浓度的磷酸钾缓冲溶液洗涤2次，获得湿菌体。取湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.1M)，湿菌体终浓度为50～150g/L，以超声破碎机破细胞，13,000rpm离心后取上清液。
四、固定化酶的制备
所用的固定化酶用的载体购买自天津南开和成科技有限公司，商品号ESR-2。
主要步骤：
1.载体的活化
A.称取载体5.0g置于锥形瓶中，加入K2HPO4-KH2PO4(0.2M，pH＝7.8)70ml，再加入50％的戊二醛8ml，放入摇床25℃下振荡2h，170rpm。
B.取出样品，缓冲溶液清洗5遍，以洗净残留的戊二醛为准，滤干。
2.酶的固定化过程
A.取活化后的载体1g，加入K2HPO4-KH2PO4(2.0M，pH＝7.8)5ml，再加入离心后的酶清液，混合均匀后，密封瓶口于20度下摇床振荡20h，170rpm。
B.滤出固载了的酶的载体，先用纯水洗涤，再用1M NaCl溶液洗至茚三酮检测流出液阴性，待用。
五、固定化酶的催化反应
催化反应体系为：
固定化酶100g/L，3,5-双三氟甲基苯乙酮浓度为150g/L，辅酶Na-NAD 200mg/L，余量的溶剂。异丙醇的水溶液体积组成为：异丙醇60％，水40％。
催化反应的条件为：30℃，摇床转速100rpm，时间4h。转化4h可实现转化率>99％，ee值>99.9％。
六、产物的分离提取
催化反应结束后，用滤纸过滤分离出固定化酶，其中的固定化酶可以直接用于下一批次的催化反应。
过滤出的清液，在旋转蒸发仪上40-50℃，真空度-0.095Mpa，蒸出溶剂(异丙醇和丙酮，其中丙酮为副产物，分离出的异丙醇可以在催化反应中重复利用)。旋蒸脱溶后的反应液中有白色晶体析出，用滤纸过滤分离出白色晶体即为产物R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇(图1)，过滤后的滤液中主要是水，可以在催化反应中重复利用，而且在重复的批次中不用额外再添加辅酶Na-NAD，降低了生产成本。
七、反应原料的重复再利用
按照步骤五的过程，重新做一批反应，其中固定化酶、异丙醇、水和辅酶Na-NAD都可以用上批回收的。反应结束后产物的分离和提取同步骤六。
其中固定化酶按以上步骤操作，可重复利用25次。
实施例2：
本实施例与实施例1不同之处在于步骤五：
催化反应体系为：
固定化酶50g/L，3,5-双三氟甲基苯乙酮浓度为50g/L，辅酶Na-NAD 80mg/L，余量的溶剂。异丙醇的水溶液体积组成为：异丙醇70％，水30％。催化反应的条件为：28℃，摇床转速80rpm，时间6h。其它同实施例1。
实施例3：
本实施例与实施例1不同之处在于步骤五：
催化反应体系为：
固定化酶250g/L，3,5-双三氟甲基苯乙酮浓度为200g/L，辅酶Na-NAD300mg/L，余量的溶剂。异丙醇的水溶液体积组成为：异丙醇30％，水70％。催化反应的条件为：45℃，摇床转速220rpm，时间2h。其它同实施例1。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 义乌欣邦生物科技有限公司
<120> 一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法
<130> 2017.06.16
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 801
<212> DNA
<213> 链霉菌Streptomyces yokosukanensis
<400> 1
aagcttcata tgaccacccc gccgctgccg gactacgcta ccgaattcac cggtcgtacc 60
gctctggtta ccggtgctgc ttctggtatc ggtctggcta ccgctcgtcg tctggctgct 120
ggtggtgctc acgttgttct ggctgacttc cacaccgaag ctgctgaaca ggctgctgct 180
gacctgaccg ctgaaggtgc ttctgctgct gctgttcacg ttgacgttac cgaaccggct 240
tctgttgaag ctgctgttgc tttcgctcag gacgctttcg gtgctctgca cctggctgtt 300
aacaacgctg gtatcggtgg tccgtctacc ccgaccggtg cttacgacat cgaagcttac 360
cagcgtgtta tccgtaccaa cctggacggt gttttctact ctctgcgtta cgaactgccg 420
gttctggaag ctgctggtgg tggtgctatc gttaacgttg cttctatcct gggttctgtt 480
ggtttcgctg gttctccggc ttacgttgct gctaaacacg gtgttgttgg tctgaccaaa 540
accgctgctg ctgaatacgc tgctcgtggt gttcgtgtta acgctgttgg tccgggtttc 600
atcgaaaccc cgctgctggg tacctctatg aacgaatctg ctcaccaggc tctggttgct 660
ctgcacccgg ctggtcgtct gggtcgtccg gaagaagttg ctgaactgat cgctttcctg 720
ctgtctgacc gtgctgcttt cgttcacggt tcttaccacc tgatcgacgg tgcttacacc 780
accgtttaac tcgagaacgt t 801
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> 醇脱氢酶
<400> 2
Met Thr Thr Pro Pro Leu Pro Asp Tyr Ala Thr Glu Phe Thr Gly Arg
1 5 10 15
Thr Ala Leu Val Thr Gly Ala Ala Ser Gly Ile Gly Leu Ala Thr Ala
20 25 30
Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Ala His Val Val Leu Ala Asp Phe His
35 40 45
Thr Glu Ala Ala Glu Gln Ala Ala Ala Asp Leu Thr Ala Glu Gly Ala
50 55 60
Ser Ala Ala Ala Val His Val Asp Val Thr Glu Pro Ala Ser Val Glu
65 70 75 80
Ala Ala Val Ala Phe Ala Gln Asp Ala Phe Gly Ala Leu His Leu Ala
85 90 95
Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Pro Ser Thr Pro Thr Gly Ala Tyr
100 105 110
Asp Ile Glu Ala Tyr Gln Arg Val Ile Arg Thr Asn Leu Asp Gly Val
115 120 125
Phe Tyr Ser Leu Arg Tyr Glu Leu Pro Val Leu Glu Ala Ala Gly Gly
130 135 140
Gly Ala Ile Val Asn Val Ala Ser Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala
145 150 155 160
Gly Ser Pro Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val Gly Leu Thr
165 170 175
Lys Thr Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly Val Arg Val Asn Ala
180 185 190
Val Gly Pro Gly Phe Ile Glu Thr Pro Leu Leu Gly Thr Ser Met Asn
195 200 205
Glu Ser Ala His Gln Ala Leu Val Ala Leu His Pro Ala Gly Arg Leu
210 215 220
Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Glu Leu Ile Ala Phe Leu Leu Ser Asp
225 230 235 240
Arg Ala Ala Phe Val His Gly Ser Tyr His Leu Ile Asp Gly Ala Tyr
245 250 255
Thr Thr Val
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttaactttaa gaaggagata tacatatgac caccccgccg c 41
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagtta aacggtggtg taagcaccg 49

Claims (4)

1.一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法，其特征在于，将醇脱氢酶固定化得固定化酶，然后将所得固定化酶作为生物催化剂催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇；
固定化酶催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇的催化体系组成如下：固定化酶50-250g/L，3,5-双三氟甲基苯乙酮浓度为50-200g/L，辅酶Na-NAD80-300mg/L，余量的溶剂，所述溶剂异丙醇的水溶液；
催化反应的条件为：28-45℃，摇床转速80-220rpm，时间2-6h；
所述醇脱氢酶来源于链霉菌Streptomyces yokosukanensis；所述醇脱氢酶的基因序列见SEQ ID No.1所示；
产物R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇的分离纯化及原料重复利用方法为：
（1）催化反应结束后，一次过滤分离出固定化酶，其中的固定化酶直接用于下一批次的催化反应；
（2）过滤出的反应液在旋转蒸发仪上40-50℃，真空度-0.1Mpa～-0.08Mpa条件下，蒸出溶剂，旋蒸脱溶后的反应液中有白色晶体析出，二次过滤分离出的白色晶体即为产物R-3,5-(双三氟甲基)苯乙醇。
2.根据权利要求1所述的一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法，其特征在于，所述异丙醇的水溶液体积组成为：异丙醇30-70%，水30-70%。
3.根据权利要求1所述的一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法，其特征在于，蒸出溶剂中分离出的异丙醇重复利用。
4.根据权利要求1所述的一种R-3,5-双三氟甲基苯乙醇的清洁生产方法，其特征在于，二次过滤分离的滤液在下一批次的催化反应中重复利用。
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