CN104212782A - 耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法。所述蛋白酶PprI的酶活性启动需要2.0-5.0mM的Mn²⁺离子。酶切反应缓冲液为150-250mMNaCl、10-50mMTris-HCl8.0、1mMDTT、2.0-5.0mMMnCl₂。基因dr2574和dr2340启动子片段与底物DdrO结合后，可提高蛋白酶PprI的酶切活性，缩短反应时间，对该酶的今后利用具有积极贡献。

Description

耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法

技术领域

本发明涉及一种新发现的耐辐射奇球菌蛋白酶PprI，涉及金属离子对酶活性的启动作用、基因启动子对酶切效率的促进作用。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，可以催化蛋白质中肽键的水解。蛋白酶广泛存在于动物、植物和微生物中。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶100种以上。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要来自微生物，利用枯草杆菌、酵母、霉菌、大肠杆菌等微生物提取制备。随着蛋白酶研究的深入，它的工业应用越来越引起了人们的广泛关注。

蛋白酶已广泛应用在毛皮、皮革、丝绸、医药、食品、酿造、石油钻井等领域。利用蛋白酶，皮革工业的脱毛软化，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，例如用于消化不良、支气管炎、脉管炎等症状的治疗。加入蛋白酶的洗衣粉能高效去除衣物上的血渍和蛋白污物。另外，蛋白酶广泛应用于生化分子实验，作为蛋白质的手术刀，是生命科学研究不可或缺的。

耐辐射奇球菌是一种极端环境微生物，以对电离辐射、紫外射线、干燥和氧化压力等极端条件表现极强抗性而著称。它的这种超强抗性有一部分归功于其体内pprI基因（基因名dr_0167，NCBI-GeneID: 1798483）。它是在基因损伤修复中起整体调控作用。pprI基因表达的产物PprI蛋白（NCBI-GI: 15805204）由328个氨基酸组成，含3个功能结构域，分别是锌指-蛋白酶结构域，螺旋-转角-螺旋结构域，GAF结构域。但是至今为止，PprI的蛋白酶活性和酶底物从未被发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动与提高方法。

耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性优化方法，所述的蛋白酶PprI的酶活性启动需要Mn²⁺离子。

所述的Mn²⁺离子浓度为2.0-5.0 mM。

所述的蛋白酶PprI的反应缓冲液含100-200 mM NaCl、10-50mM Tris-HCl 8.0、1mM DTT、2.0-5.0 mM MnCl₂。

 所述的蛋白酶PprI酶活性的提高需要基因启动子。

所述的基因启动子为dr2340基因启动子和dr2574基因启动子。

本发明的有益效果：

    蛋白质的手术刀，是生命科学研究不可或缺的；本发明可以高效提高蛋白酶PprI的酶切活性，缩短反应时间。

附图说明

图1是不同金属离子对蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE图；

 其中，从左至右，分别是不加金属离子的对照反应；加EDTA的对照反应；

加Ca²⁺的反应；加Cu²⁺的反应；加Fe²⁺的反应；加Mg²⁺的反应；加Ni²⁺的反应；

加Mn²⁺的反应；加Zn²⁺的反应。

图2是ddrO基因启动子促进蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE图；

   其中，第1道为不加ddrO基因启动子的对照实验；第2到5道为ddrO基因启动子的量递增的反应，浓度范围从0.04μM/L到0.32μM/L。

图3是recA基因启动子促进蛋白酶PprI的酶活性的SDS-PAGE图。

其中，第1道为不加recA基因启动子的对照实验；第2到5道为recA基因启动子的量递增的反应，浓度范围从0.04μM/L到0.32μM/L。

 图4是非特异性DNA处理对照实验的SDS-PAGE图；

   其中，第1道为不加启动子的对照实验；第2道为加非特异性DNA的对照实

验，浓度为0.32μM/L。

具体实施方式

本发明所用的菌株为耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans，ATCC No.13939）。耐辐射奇球菌是一种极端环境微生物，对电离辐射、紫外射线、干燥和氧化压力等极端条件表现极强抗性。PprI本身和其中锌结合蛋白酶结构域均具有蛋白酶活性，可以切割底物DdrO蛋白。它们在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn²⁺的存在。Mn²⁺是该蛋白酶活性必需的，启动蛋白酶酶切活性。而其他二价离子，如Fe²⁺,Cu²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺等，均对蛋白酶活性存在抑制的作用。另外，recA基因和ddrO基因等启动子均能促进酶切效率。

（1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn²⁺

如图1所示，PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn²⁺的存在，终浓度范围在2-5mM/L之间。在Mn²⁺终浓度为2mM/L时，活性较佳。在没有Mn²⁺存在时，未表现出蛋白酶活性。所以，Mn²⁺是蛋白酶活性必需的。而其他二价离子，终浓度大于0.25mM/L,如Fe²⁺,Cu²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺等，均对蛋白酶活性存在抑制的作用。即使 Mn²⁺存在条件下，加入低浓度的Fe²⁺,Cu²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺等离子，活性都受到阻抑（如图1）。

（2）酶切底物ddrO基因启动子和recA基因启动子均可促进PprI酶切效率

     如图2、3所示，酶切底物蛋白DdrO分别与底物基因启动子和recA基因启动子在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl 8.0,1mM DTT,10mM MgCl₂）中反应40分钟。接着，在两反应液中分别加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的 MnCl₂启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。从SDS-PAGE胶图分析可见，底物蛋白与自身启动子和recA基因启动子之间的相互作用，均在很大程度上促进PprI酶切效率。如图4所示，对照实验证明上述基因启动子的特异性。

实施例1

   （1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn²⁺

    PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn²⁺的存在。在Mn²⁺终浓度为2mM/L时，活性最佳。

（2）酶切底物基因ddrO启动子可促进PprI酶切效率

酶切底物蛋白DdrO与底物基因启动子在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl 8.0,1mM DTT,10mM MgCl₂）中反应40分钟。接着，在反应液中加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的MnCl₂启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。实验表明，底物蛋白与自身启动子之间的相互作用，可很大程度上促进PprI酶切效率。

实施例2

（1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn²⁺

    PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn²⁺的存在。在Mn²⁺终浓度为2mM/L时，活性最佳。其他二价离子，如Ni²⁺,Zn²⁺等，终浓度大于0.25mM/L,均对蛋白酶活性存在抑制的作用。

（2）recA基因启动子可促进PprI酶切效率

  酶切底物蛋白DdrO与recA基因启动子在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl 8.0,1mM DTT,10mM MgCl₂）中反应40分钟。接着，在反应液中加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的MnCl₂启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。实验表明，底物蛋白与recA基因启动子之间的相互作用，可很大程度上促进PprI酶切效率。

实施例3

（1）PprI的蛋白酶活性依赖于金属离子Mn²⁺

    PprI蛋白在行使蛋白酶活性时，需要金属离子Mn²⁺的存在。在Mn²⁺终浓度为5mM/L时，活性仍然存在。其他二价离子，如Fe²⁺,Cu²⁺等，终浓度大于0.25mM/L,均对蛋白酶活性存在抑制的作用。

（2）非特异性DNA不可促进PprI酶切效率

     酶切底物蛋白DdrO与非特异性DNA在反应缓冲液（150mM NaCl,20mM Tris-HCl 8.0,1mM DTT,10mM MgCl₂）中反应40分钟。接着，在反应液中加入纯化的PprI蛋白。然后，加入终浓度为2.0mM的MnCl₂启动反应。在40分钟后，终止反应，用 SDS-PAGE电泳检测。实验表明，非特异性DNA不可促进PprI酶切效率。

本发明实施例中所用的菌株为耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans，ATCC No.13939），耐辐射奇球菌蛋白酶PprI，但是根据本发明的教导和启示，任何人工合成或者其他自然含有的蛋白酶以及衍生物，如具有与耐辐射奇球菌蛋白酶PprI同源的序列和类似的结构和功能，也在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种耐辐射奇球菌蛋白酶PprI的酶活性启动和提高方法，其特征在于，所述的蛋白酶PprI的酶活性启动需要Mn²⁺离子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Mn²⁺离子浓度为2.0-5.0 mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶PprI的反应缓冲液含150-250 mM NaCl、10-50mM Tris-HCl 8.0、1mM DTT、2.0-5.0 mM MnCl₂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于,所述的蛋白酶PprI酶活性提高进一步需要基因启动子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的基因启动子为dr2574基因启动子或dr2340基因启动子。