CN116042584A - 一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体 - Google Patents

一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明采用PCR和Gibson连接技术在角蛋白酶KerZ1的C端通过连接肽成功融合表达来自于里氏木霉的底物结合功能域，得到角蛋白酶变体KerZ1/CBM‑L8。酶活测定结果显示角蛋白酶变体KerZ1/CBM‑L8酶活只有KerZ1的41.5％，但羽毛水解实验结果显示角蛋白酶变体KerZ1/CBM‑L8平均酶活的羽毛水解能力是KerZ1的2.71倍，更具有应用价值与潜力。

Description

一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体
技术领域
本发明涉及一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
角蛋白酶是一类可催化角蛋白分解的水解酶，在饲料、化妆品、制药、制革等行业都有广泛的应用。但羽毛、羊毛等都是强疏水性底物，酶与底物的结合能力在水解过程中尤为重要，因此提高角蛋白酶与底物的结合能力对提高角蛋白酶的水解能力有着重要的意义。为了提升角蛋白酶的水解能力，本发明通过融合底物结合功能域来提高角蛋白酶与底物的碰撞几率进而提高其水解能力。
虽然发明人课题组前期已经构建获得一株角蛋白酶重组菌株，该菌株在15L发酵罐上可发酵获得426.60KU/mL以上的角蛋白水解活性的角蛋白酶产品，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平。但是该角蛋白酶在羽毛水解的应用实验中并未体现出显著的优势。
而在工业实际应用中，一种大大提高酶制剂在羽毛水解等角蛋白废弃物回收利用方面的应用价值的角蛋白酶，成为研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体。
本发明提供了一种通过融合底物结合功能域提升水解能力的角蛋白酶变体，所述变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域进行融合表达，命名为KerZ1/CBM-L8。
在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域，通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS进行融合表达得到的。
在本发明的一种实施方式中，编码所述底物结合功能域核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶角蛋白酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了编码上述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pP43NMK为表达载体。
本发明还提供了表达上述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB600。
本发明还提供了提高角蛋白酶对于蛋白的水解能力的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS进行融合表达。
本发明还提供了一种降解羽毛角蛋白的产品，所述产品中含有上述角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8或含有上述重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述降解羽毛角蛋白的产品包括但不限于：脱毛膏、羽毛水解酶制剂或皮革脱毛剂。
本发明还提供了一种降解羽毛角蛋白的方法，所述方法以羽毛为底物，利用角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8降解含有角蛋白的物质。
在本发明的一种实施方式中，所述含有角蛋白的物质包括禽类羽毛、动物皮毛等。
本发明还提供了上述重组细胞的构建方法，所述重组细胞的构建方法为将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。
本发明提供了一种所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在畜牧业、饲料业、制革业中的应用。
本发明还要求保护所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在降解羽毛、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛料、指甲、鳞片角蛋白中的应用。
有益效果
本发明提供了一种角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8，该变体的羽毛水解测定结果显示，本发明的角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8有着比原始酶KerZ1更高的羽毛水解效率，因此该角蛋白酶变体可以大大提高酶制剂在羽毛水解等角蛋白废弃物回收利用方面的应用价值。该变体虽然拥有更低的酶活，但羽毛水解效率大幅提升，所以通过融合底物结合功能域的方法可以提升角蛋白酶对疏水底物的结合能力进而提升其水解效率。因此，本发明提供的通过融合底物结合功能域的角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8更具有应用价值与潜力。
(1)本发明采用PCR和Gibson连接技术在角蛋白酶KerZ1的C端通过连接肽成功融合表达来自于里氏木霉的底物结合功能域。
(2)虽然KerZ1/CBM-L8的摇瓶发酵酶活只有KerZ1的41.5％，但羽毛水解实验结果显示角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8平均酶活的羽毛水解能力是KerZ1的2.71倍，更具有应用价值与潜力。
附图说明
图1为不同类型连接肽组合的角蛋白酶变体的初步筛选。
图2为不同类型连接肽组合的角蛋白酶变体的二次筛选。
图3为角蛋白酶KerZ1和角蛋白酶KerZ1/CBM的SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分子量标准，不同泳道代表不同的角蛋白酶，箭头指示目的蛋白条带位置。
图4为不同角蛋白酶水解效果图。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109购自北纳生物；下述实施例中涉及的pP43NMK质粒购自丰晖生物；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600记载于公开号为CN102492645A的专利申请文本中。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5g·L-1、胰蛋白胨10g·L-1、NaCl 10g·L-1。
LB固体培养基：酵母粉5g·L-1、胰蛋白胨10g·L-1、NaCl 10g·L-1、琼脂粉20g·L-1。
发酵培养基：蛋白胨20g·L-1、酵母粉10g·L-1、蔗糖20g·L-1、KH2PO4 3g·L-1、Na2HPO4 6g·L-1、MgSO4 0.3g·L-1。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
角蛋白水解活性测定方法：
取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL 50mM的Gly/NaOH溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编码：K0043)作为底物，混匀后于60℃下反应20min；加入200μL 4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温8000r/min离心3min。
取上清200μL，加入1mL4％(w/v)的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。
酶活力单位定义：在60℃，pH 10条件下，OD660每升高0.001所需酶量为一个酶活力单位(U)。
羽毛水解效率测定方法：
取0.2g鸡羽毛，20mL发酵上清液，0.2mg亚硫酸钠，60℃保温暖4h后用已知质量的滤纸过滤得到未被水解的羽毛残留物，105℃烘干至恒重。通过羽毛残留物的质量计算出水解的羽毛量，进而计算平均酶活的羽毛水解能力。
羽毛水解效率的计算公式：羽毛水解效率(g/U)＝水解的羽毛量(g)/酶活力(U)。
实施例1：角蛋白酶变体的构建
1、融合表达质粒的构建
(1)pP43NMK-ker重组载体的构建方法记载于公开号为US20210079371A1的专利中，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)pP43NMK-ker/CBM重组载体的构建
具体步骤如下：
化学合成来源于里氏木霉的底物结合功能域CBM的基因(核苷酸序列如SEQIDNO.4)，并使用Gibson连接技术将获得的基因与pP43NMK-ker质粒进行连接(将底物结合功能域CBM连接至角蛋白酶KerZ1的C端)，得到连接产物。
其中Gibson连接反应体系为：5×Reaction buffer 100μL,T5 exonuclease(10U/μL)0.31μL,Phusion polymerase(2U/μL)6.25μL,Taq ligase(40U/μL)50μL,H2O 218.44μL。
将连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB固体培养基，于37℃培养8-10h，用添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB液体培养基将LB固体培养平板上的单菌落清洗下转移到15mL摇菌管中，于37℃、220r/min培养3～4h后提取质粒，并送公司测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-ker/CBM(电泳图如图3所示)。
(3)不同类型连接肽组合的角蛋白酶重组质粒的构建
根据不同类型连接肽的序列(如表1所示)分别设计引物(如表2所示)，对携带底物结合功能域的重组质粒pP43NMK-ker/CBM进行PCR扩增，以扩增连接肽序列。
表1：不同类型连接肽的氨基酸序列
Figure BDA0004070096630000041
Figure BDA0004070096630000051
表2：引物
Figure BDA0004070096630000052
PCR反应体系均为：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA 1μL，加入双蒸水至50μL；
PCR产物扩增条件均为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃保温10min；
PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增产物大小正确后，将扩增产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB固体培养基，于37℃培养8～10h，将平板上长出的单菌落接种至添加氨苄青霉素(终浓度100mg·L1)的LB液体培养基中，于37℃、220r/min培养3～4h后提取质粒，并送公司测序验证，验证正确即获得不同类型连接肽组合的角蛋白酶重组质粒pP43NMK-KerZ1/CBM-L1、pP43NMK-KerZ1/CBM-L2、pP43NMK-KerZ1/CBM-L3、pP43NMK-KerZ1/CBM-L4、pP43NMK-KerZ1/CBM-L5、pP43NMK-KerZ1/CBM-L6、pP43NMK-KerZ1/CBM-L7、pP43NMK-KerZ1/CBM-L8、pP43NMK-KerZ1/CBM-L9、pP43NMK-KerZ1/CBM-L10、pP43NMK-KerZ1/CBM-L11、pP43NMK-KerZ1/CBM-L12、pP43NMK-KerZ1/CBM-L13、pP43NMK-KerZ1/CBM-L14。
实施例2：重组质菌的构建及角蛋白酶的表达
具体步骤如下：
(1)将实施例1获得的重组质粒pP43NMK-KerZ1/CBM-L1、pP43NMK-KerZ1/CBM-L2、pP43NMK-KerZ1/CBM-L3、pP43NMK-KerZ1/CBM-L4、pP43NMK-KerZ1/CBM-L5、pP43NMK-KerZ1/CBM-L6、pP43NMK-KerZ1/CBM-L7、pP43NMK-KerZ1/CBM-L8、pP43NMK-KerZ1/CBM-L9、pP43NMK-KerZ1/CBM-L10、pP43NMK-KerZ1/CBM-L11、pP43NMK-KerZ1/CBM-L12、pP43NMK-KerZ1/CBM-L13、pP43NMK-KerZ1/CBM-L14分别转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600感受态，分别将转化产物涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基，于37℃培养10～12h，分别制备得到重组菌株KerZ1/CBM-L1、KerZ1/CBM-L2、KerZ1/CBM-L3、KerZ1/CBM-L4、KerZ1/CBM-L5、KerZ1/CBM-L6、KerZ1/CBM-L7、KerZ1/CBM-L8、KerZ1/CBM-L9、KerZ1/CBM-L10、KerZ1/CBM-L11、KerZ1/CBM-L12、KerZ1/CBM-L13、KerZ1/CBM-L14。
分别将平板培养基上长出的单菌落接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm培养10～12h后，分别制备得到种子液；
(2)分别将步骤(1)得到的种子液按照5％的比例转接至发酵培养基，在37℃、220rpm条件下培养24h，获得发酵液。
(3)分别将发酵液于4℃5000rpm离心10min后，获得发酵上清液。
按照上述方法，将pP43NMK-ker转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中，制备得到重组菌株KerZ1。
(4)分别检测步骤(3)的上清液中的角蛋白酶活，结果如表3所示。
表3：含有不同连接肽的菌株表达的角蛋白酶酶活
Figure BDA0004070096630000071
实施例3：角蛋白酶变体羽毛水解效率的测定
具体步骤如下：
1、水解羽毛能力的初步筛选：
(1)分别将实施例2得到的角蛋白酶变体按连接肽长度分为三组(分别是：n＝1组、n＝2组、n＝3组)进行水解实验：
分别将实施例2得到的发酵上清液稀释至相同角蛋白酶活，取10mL相同酶活的酶液加入到含有0.1g鸡羽毛和0.1g无水亚硫酸钠的50mL离心管中得到反应体系；
其中：n＝1组(添加的酶活为：58810U)：KerZ1/CBM-L1、KerZ1/CBM-L2；
n＝2组(添加的酶活为：58550U)：KerZ1/CBM-L3、KerZ1/CBM-L4、KerZ1/CBM-L5、KerZ1/CBM-L6；
n＝3组(添加的酶活为：57477U)：KerZ1/CBM-L7、KerZ1/CBM-L8、KerZ1/CBM-L9、KerZ1/CBM-L10、KerZ1/CBM-L11、KerZ1/CBM-L12、KerZ1/CBM-L13、KerZ1/CBM-L14。
(2)将反应体系置于60℃反应4h，期间每半小时取一次样，每次取20μL反应液，加入到980μL去离子水中以终止反应同时稀释50倍，混匀，8000r/min离心3min。取上清200μL，加入1mL 4％(w/v)的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定吸光值；
实验组3个平行，空白对照是原始发酵上清液(KerZ1)，其余操作同上。
结果如图1所示，角蛋白酶变体n＝1与n＝2两组的显色后吸光值相比，对照仅有有限提升，反应4h后吸光值最大仅为对照的1.09倍，而n＝3组的吸光值相比对照有大幅提升，最高达对照的1.34倍(KerZ1/CBM-L7)，因此对n＝3组的变体进行了二次筛选。
2、水解羽毛能力的二次筛选：
(1)取0.2g鸡羽毛，20mL重新发酵的n＝3组角蛋白酶变体的发酵上清液，0.2mg亚硫酸钠，60℃反应4h后，用已知质量的滤纸过滤得到未被水解的羽毛残留物，105℃烘干至恒重。通过羽毛残留物的质量计算出水解的羽毛量，进而计算平均酶活的羽毛水解能力，水解效果如图4所示。
羽毛水解能力的计算方法：
羽毛水解能力(g/U)＝水解的羽毛质量(g)/初始发酵上清液酶活(U)，结果如表4及图2所示。
表4：KerZ1/CBM Linker复筛
Figure BDA0004070096630000081
Figure BDA0004070096630000091
结果显示，角蛋白酶变体的羽毛水解能力相比对照均有明显提升，其中KerZ1/CBM-L8单位酶活的羽毛水解能力达到KerZ1的2.71倍，说明通过融合底物结合功能域，角蛋白酶水解羽毛的能力得到了大幅提升，具有很大应用潜力。
实施例4：融合不同来源底物结合功能域的角蛋白酶变体筛选
(1)根据实施例3的筛选结果，Linker为L8即氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS时，角蛋白酶变体的羽毛水解能力最佳，因此以L8为最佳Linker筛选来源于源于黑曲霉的底物结合功能域CBM1、来源于土曲霉的底物结合功能域CBM2。
(2)不同来源的底物结合功能域的角蛋白酶重组质粒的构建
根据实施例1～2的步骤，构建并表达KerZ1/CBM1-L8、KerZ1/CBM2-L8。
具体实施方式同实施例1的步骤(1)～(2)、实施例2，区别在于，调整来源于里氏木霉的底物结合功能域CBM的基因分别为：化学合成来源于黑曲霉的底物结合功能域CBM1基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、来源于土曲霉的底物结合功能域CBM2基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，并使用Gibson连接技术将获得的基因与pP43NMK-ker质粒进行连接(将底物结合功能域CBM连接至角蛋白酶KerZ1的C端)，制备得到重组质粒pP43NMK-ker/CBM1-L8、pP43NMK-ker/CBM2-L8，所涉及的引物如表5所示。
表5引物
Figure BDA0004070096630000092
Figure BDA0004070096630000101
按照上述方法，分别制备得到含有KerZ1/CBM-L8的粗酶液、含有KerZ1/CBM1-L8的粗酶液、含有KerZ1/CBM2-L8的粗酶液。
(2)对KerZ1/CBM-L8、KerZ1/CBM1-L8、KerZ1/CBM2-L8进行羽毛水解实验；方法为：取0.2g鸡羽毛，分别向羽毛中添加20mL酶活分别为：128565U/mL、49245U/mL、81560U/mL、81750U/mL的KerZ1粗酶液、KerZ1/CBM-L8的粗酶液、KerZ1/CBM1-L8的粗酶液、KerZ1/CBM2-L8的粗酶液，0.2mg亚硫酸钠，60℃反应4h后，用已知质量的滤纸过滤得到未被水解的羽毛残留物，105℃烘干至恒重。通过羽毛残留物的质量计算出水解的羽毛量，进而计算平均酶活的羽毛水解能力。
羽毛水解能力的计算方法：
羽毛水解能力(g/U)＝水解的羽毛质量(g)/初始发酵上清液酶活(U)，结果如表6所示。
表6：不同角蛋白酶的水解能力
Figure BDA0004070096630000102
结果显示，本发明采用PCR和Gibson连接技术在角蛋白酶KerZ1的C端通过连接肽成功融合表达来自于里氏木霉的底物结合功能域，得到的角蛋白酶变体KerZ1/CBM-L8水解率最高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种角蛋白酶变体，其特征在于，所述角蛋白酶变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域进行融合表达得到的。
2.根据权利要求1所述的角蛋白酶变体，其特征在于，所述角蛋白酶变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域，通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS进行融合表达得到的。
3.编码权利要求1或2所述角蛋白酶变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pP43NMK为表达载体。
6.表达权利要求1或2所述蛋白酶变体，或携带权利要求3所述基因，或携带权利要求3或4所述重组载体的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
8.一种提高角蛋白酶对于蛋白的水解能力的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶与氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的底物结合功能域，通过连接肽GGGGSGGGGSGGGGS进行融合表达。
9.一种降解角蛋白的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1或2所述的角蛋白酶变体或含有权利要求6或7所述的重组细胞。
10.一种降解角蛋白的方法，其特征在于，所述方法以含有角蛋白的物质为底物，利用权利要求1或2所述角蛋白酶变体降解角蛋白；优选的，所述含有角蛋白的物质包括羽毛、弹性蛋白、鳞片、纤维。
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