CN105132304A - 一株高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一种高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌。所述克劳氏芽孢杆菌是通过紫外诱变方法获得的突变株，保藏编号为CCTCC？NO：M2015429。所述突变株在发酵过程中不产芽孢，并且产酶效果没有损失，500mL摇瓶发酵酶活为181？U/ml，较出发菌提高了30%。此外，所述克劳氏芽孢杆菌突变株分泌表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域，市场前景广阔。

Description

一株高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌及其应用。

背景技术

碱性蛋白酶(alkalineprotease)具有巨大的市场潜力。我国的碱性蛋白酶研究较国外晚，国内工业生产蛋白酶的菌株多是经枯草芽孢杆菌2709选育而来。碱性蛋白酶是工业酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年工业酶总销量的60％左右(MalaB.R.等，1998，MicrobiologyandMolecularBiologyReviews)，其能够广泛应用于洗涤、食品、医疗、酿造、丝绸和制革等行业，尤其是作为市场上畅销的洗涤和皮革脱毛添加剂，有着良好的市场价值。目前碱性蛋白酶这巨大的市场份额还是被国外两大巨头诺维信和杰能科占据着。开发新菌种也是未来众多研究者的发展新方向。

作为碱性蛋白酶天然分泌的优势菌株之一，克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)的菌落小，呈乳白色，粘稠，边缘不整齐，不透明，具有很好的耐受性，能在极端环境下生长，并且生存范围十分广泛。在环境恶劣或养分不足时，克劳氏芽孢杆菌可产生芽孢，休眠体，称为隐藏的生命，在营养充足时又重新萌发为营养体。产生芽孢这一特性虽然在遗传上较有优势，使得克劳氏芽孢杆菌在恶劣环境下不易死亡，但在工业生产中却是急需解决的难题之一。因为在发酵过程中，如果发生停电等短时间发酵条件的突变，菌体会马上产生休眠体芽孢，条件恢复后也不再萌发产酶，发酵不得不停止。所以如何使芽孢杆菌菌体丧失产芽孢的能力，是进行菌株改造的一个重要环节，对于提高生产菌株的发酵能力具有重要的意义。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌。所述克劳氏芽孢杆菌是通过紫外诱变的方法筛选到的一种突变菌株，不仅不产芽孢，还能高效分泌表达碱性蛋白酶，为碱性蛋白酶的低成本、规模化生产奠定了基础。

本发明一方面涉及一种克劳氏芽孢杆菌突变株，为克劳氏芽孢杆菌TDB1(BacillusclausiiTDB1)，已于2015年7月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2015429。

本发明另一方面涉及上述克劳氏芽孢杆菌的应用。

本发明通过紫外诱变的方法获得了一株克劳氏芽孢杆菌突变株。所述突变株在发酵过程中不产芽孢，并且产酶效果没有损失，500mL摇瓶发酵酶活为181U/ml，较出发菌提高了30％。此外，所述克劳氏芽孢杆菌突变株分泌表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域，市场前景广阔。

附图说明

图1为出发菌株克劳氏芽孢杆菌TDB和突变菌株平板培养60h显微镜切片比较。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：

1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T25327-2009)。

2、酶活单位的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。

3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0g/L)。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。

实施例1克劳氏芽孢杆菌TDB的紫外诱变与筛选

1.1菌悬液制备

将克劳氏芽孢杆菌TDB(该菌株由发明人齐建于2014年1月筛选自青岛市崂山区林场土壤中)在含1μg/mL红霉素的牛肉膏蛋白胨斜面(牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，pH7.2)上划线接种，37℃培养48h；加入5mL0.9％生理盐水，将斜面上的菌全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中；涡旋振荡10min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15mL离心管，6000rpm离心3min收集菌体；去上清，用10mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至OD₆₀₀＝0.2。

1.2紫外诱变处理及诱变剂量确定

打开9W紫外灯开关，预热约30min。取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为OD₆₀₀＝0.2的菌悬液10mL，放入一根无菌磁力搅拌器；打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，在垂直距离为15cm处，分别搅拌照射0s、5s、10s、15s、20s、25s、30s，盖上皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30min。

将照射后的菌悬液用0.9％生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10^-1～10^-5，对照0s稀释到10^-6；取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布牛肉膏蛋白胨平板，每个稀释度涂布三个平板，均匀涂满整个平板表面；以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液稀释10^-4、10^-5、10^-6涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置37℃过夜培养。

统计不同照射时间时每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下平板上长出的单菌落数在30～300个之间，则认为该稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度(CFU/mL)＝某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

经计算，不同紫外诱变剂量下克劳氏芽孢杆菌TDB的致死率如表1所示。

表1：紫外线诱变致死率

从表1的数据可以看出，菌悬液经紫外照射5s后致死率就达到95％以上，但因时间太短不便于控制，因此最终确定诱变时间为10s。

1.3透明圈初筛

紫外照射处理10s后，菌悬液中活细胞浓度约10⁶个/mL；在每个牛肉膏蛋白胨平板(含红霉素1μg/mL)上均匀涂布100μL上述菌悬液；用黑布或报纸包好，37℃培养3天，获得菌落明显透明而不是乳白色的形态突变子200多个。重新点种牛肉膏蛋白胨平板(含红霉素1μg/mL)，37℃培养72h，每个菌落分别制作切片观察有无产孢，生长状态是否比出发菌好。最终申请人筛选出经5次传代后，72h内仍不产芽孢，并且生长状态较出发菌株好的突变菌株共5株，分别命名为TDB1，TDB2，TDB3，TDB4，TDB5。

1.4摇瓶复筛

挑取上述五株突变菌的单菌落分别接种于100mLLB液体培养基中(pH9.0)，37℃培养72h，同时以出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB作为对照。酶活测定结果显示，上述突变菌株中TDB1的发酵上清液酶活最高，达181U/mL，比出发菌提高了约30％。通过进一步对突变菌株TDB1进行显微镜观察发现，在摇瓶发酵过程中，突变菌株TDB1均不产芽孢(图1)，保持了遗传上的稳定性。

实施例2克劳氏芽孢杆菌TDB1所产蛋白酶的酶学性质分析

2.1最适pH分析

分别用pH值为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的缓冲液稀释突变菌克劳氏芽孢杆菌TDB1和出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB的发酵上清液，在40℃条件下分别测定其发酵上清液的酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果表明，本发明获得的突变菌克劳氏芽孢杆菌TDB1产碱性蛋白酶的最适作用pH值为11.5，与出发菌株TDB产碱性蛋白酶的最适作用pH值一致。

2.2最适温度分析

分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，pH10.5的条件下测定突变菌克劳氏芽孢杆菌TDB1和出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB发酵上清液的酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果表明，本发明获得的突变菌克劳氏芽孢杆菌TDB1产碱性蛋白酶的最适作用温度为60℃，与出发菌株TDB产碱性蛋白酶的最适作用温度一致。

综上，本发明通过紫外诱变方法获得的突变菌株克劳氏芽孢杆菌TDB1不但具有不产芽孢的表型，还能显著提高碱性蛋白酶的表达量，摇瓶发酵酶活高达181U/ml，而出发菌TDB提高了30％，而且，与出发菌相比，其所产碱性蛋白酶的酶学性质也没有发生改变，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于碱性蛋白酶的生产，有利于提高碱性蛋白酶的产量，降低生产成本。

申请人已于2015年7月5日将克劳氏芽孢杆菌TDB1(BacillusclausiiTDB1)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2015429。

Claims (3)

1.一种克劳氏芽孢杆菌，其特征在于，所述的克劳氏芽孢杆菌的保藏号为CCTCCNO：M2015429。

2.包含权利要求1所述的克劳氏芽孢杆菌的微生物制剂。

3.权利要求1所述的克劳氏芽孢杆菌在碱性蛋白酶生产中的应用。