CN113621540A - 克劳氏芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开克劳氏芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用。克劳氏芽孢杆菌菌株为两线对峙法与玉米根腐病菌(拟轮枝镰孢菌)进行对峙试验获得。与目前已知的克劳氏芽孢杆菌相比，本发明的菌株能产生三羟基氧肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体两种铁载体，并能够促进植株生长。对玉米主要病害病原菌具有较好的抑菌效果，具有广谱防治作用。

Description

克劳氏芽孢杆菌菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的特定菌株及其筛选方法和应用。

背景技术

玉米是我国重要的粮食作物，也是重要的饲料来源和工业原料，其种植面积和产量在我国粮食作物中位居第一位，随着对玉米需求量的不断增加，保证玉米的产量与质量具有举足轻重的意义。然而，因长期单一种植玉米、频繁使用化肥和化学药剂造成土壤板结化的问题越来越严重，导致玉米根腐病、鞘腐病、穗腐病等病害也越发严重，其中根腐病在我国的主要玉米产区有不同程度的发生，一般年份发病率为10％左右，重病地区发病率50％以上，常造成缺苗断垅等现象，严重的影响了我国玉米生产。

生防细菌以种类多、分布广、防效稳定，配置生防菌剂成本低等优点而倍受重视，同时生物菌剂对环境和非靶标生物安全，特异性好，能够较好地维持生态系统的平衡，目前生物菌剂已成为防治玉米病害的新途径。克劳氏芽孢杆菌是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性菌，该菌在农业领域具有生物防治，生物降解及促进植物生长等功能，生防细菌的促生机制表现在可以通过分泌铁载体、固氮、解磷、产吲哚乙酸等方式，提高植物对营养物质的利用和增强植物对病害的抵御能力，但是其分泌铁载体能力有限，使得其促生能力受到限制。

近几年来，国内外关于生防细菌的剂型主要以悬浮剂、颗粒剂等形式予以应用，不利于吸收，促生效果有待提高。

发明内容

本发明从土壤资源中筛选分离出克劳氏芽孢杆菌菌株Bcjcm062，其能够解决现有技术中的至少部分技术问题，从而基于此完成本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种经两线对峙法筛选的克劳氏芽孢杆菌菌株(有时也称作“本发明的菌株”)，其为两线对峙法与拟轮枝镰孢菌进行对峙试验获得，能够产生三羟基氧肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体。与目前已知的克劳氏芽孢杆菌相比，本发明的菌株能产生三羟基氧肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体两种铁载体，并能够促进植株生长。对玉米主要病害病原菌具有较好的抑菌效果，具有广谱防治作用。

根据本发明的克劳氏芽孢杆菌菌株，优选地，所述菌株于2021年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.21694。

本发明的第二方面，提供一种克劳氏芽孢杆菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：

步骤一、将土壤样品做成10^-2-10^-6倍五个梯度的土壤悬浮液，采用平板涂布法在培养基平板上均匀涂布至完全吸收，多次重复，优选重复三次，28℃恒温培养24h-48h；优选地，恒温培养时间为48h；

步骤二、挑取颜色、形态不同的单菌落在培养基上划线纯化1-3次，28℃恒温培养24h-48h；优选地，划线纯化3次，恒温培养时间为48h；

步骤三、将拟轮枝镰孢菌饼转接到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，在距离靶标菌两侧25mm处，等距离划线纯化后的细菌单菌落，28℃恒温培养5d，记录抑菌距离；

步骤四、通过两线对峙法，克劳氏芽孢杆菌对拟轮枝镰孢菌的抑菌距离为12mm。

本发明从土壤资源中筛选出来高效拮抗细菌，在土壤中具有较强的竞争作用，有效的抑制了土壤中病菌的扩繁和定殖。进而开发克劳氏芽孢杆菌的多种功能：广谱防效性、产铁载体能力、对植物促生能力以及防治玉米土传病害。

本发明采用的两线对峙法代替试验中常见的两点对峙法或三点对峙法，克劳氏芽孢杆菌运动性较强，细菌穿刺接种法和细菌菌饼接种法容易与水运动，使得细菌面积扩大，造成平板对峙试验的不稳定性，两线对峙法是克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062进行抑菌活性测定最稳定、最直观的平板对峙法。

在某些实施方案中，所述步骤一中和所述步骤二中，所述培养基包括牛肉膏蛋白胨。

本发明的第三方面，提供一种发酵方法，包括在适于微生物生长的条件下使根据本发明第一方面所述的克劳氏芽孢杆菌或根据本发明第二方面所述的筛选方法筛选的克劳氏芽孢杆菌在发酵液中进行发酵以得到培养物的步骤。

在某些实施方案中，本发明的发酵方法中使用的所述发酵液包含麦芽糖2v％、蛋白胨1.5v％和氯化钙1v％，其余为蒸馏水。

在某些实施方案中，本发明的发酵方法中的发酵培养条件为：发酵时间48h，发酵温度31℃，转速180r/min，pH＝5-6。优选地，pH＝5.5。

本发明的第四方面，提供一种种衣剂的制备方法，其包括本发明的发酵方法作为其步骤。

在某些实施方案中，本发明的种衣剂的制备方法进一步包括将发酵液过滤、将发酵滤液与玉米种子混匀加入成膜剂的步骤；其中，发酵滤液与玉米种子的质量比为1:20～100，优选为1:50；成膜剂与玉米种子的质量比为1:100。

本发明的种衣剂制备方法简单，包衣容易，高效低毒，对环境相对安全，对引起玉米主要病害的病原菌具有较好的抑菌效果。

本发明的第五方面，提供一种种衣剂，其通过本发明的第四方面的方法制备得到。

与现有技术相比，本发明的从土壤资源中采用两线对峙法筛选分离出克劳氏芽孢杆菌菌株Bcjcm062，能产生三羟基氧肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体两种铁载体，并能够促进植株生长，对玉米主要病害的病原菌具有较好的抑菌效果，具有广谱防治作用。制备的种衣剂能有效促进玉米植株根系的发育并对玉米具有良好的促生效果。

附图说明

图1为克劳氏芽孢杆菌的菌落图。

图2为克劳氏芽孢杆菌的革兰氏染色图。

图3为克劳氏芽孢杆菌的运动性说明图。

图4为基于16S rDNA序列构建的部分芽孢杆菌属系统发育树。

图5为克劳氏芽孢杆菌对玉米根腐病菌的抑制效果对比图。

图6为克劳氏芽孢杆菌对玉米鞘腐病菌的抑制效果对比图。

图7为克劳氏芽孢杆菌对玉米小斑病菌的抑制效果对比图。

图8为克劳氏芽孢杆菌对玉米弯孢叶斑病菌的抑制效果对比图。

图9为克劳氏芽孢杆菌产生铁载体检测示意图。

图10为克劳氏芽孢杆菌产生的三羟基氧肟酸型铁载体的检测结果。

图11为克劳氏芽孢杆菌产生的儿茶酚型铁载体的检测结果。

图12为铁螯合剂(DFO)的标准曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

实施例1

本实施例为克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062的筛选。从黑龙江省、吉林省、内蒙古自治区、云南省、宁夏回族自治区、贵州省、江苏省7个省份采集土壤样品152份，通过两线对峙法与拟轮枝镰孢菌(Fusariumverticillioide)进行对峙试验，从中筛选出一种克劳氏芽孢杆菌，其对靶标菌抑菌距离可达12mm。

其筛选步骤如下：

步骤一、将供试土壤样品做成10^-2-10^-6倍五个梯度的土壤悬浮液，采用平板涂布法在牛肉膏蛋白胨培养基(NA)平板上均匀涂布至完全吸收，设三次重复，28℃恒温培养48h。

步骤二、挑取颜色、形态不同的单菌落在NA培养基上划线纯化3次，28℃恒温培养48h。

步骤三、采用平板对峙法，将拟轮枝镰孢菌饼转接到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基中央，在距离靶标菌两侧25mm处，等距离划线纯化后的细菌单菌落，28℃恒温培养5d，记录抑菌距离。

步骤四、通过两线对峙法，测量对拟轮枝镰孢菌的抑菌距离。

克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062的保存方法如下：

长期保存：用无菌白色枪头挑取生长1-2d的单菌落，放置装有5mL/50mL LB离心管中，28℃，180r/min摇床中振荡培养，直至液体浑浊看不见白色枪头为准，吸取1mL菌悬液加430μL的50％灭菌甘油至灭菌冻存管中，摇匀后放置-80℃冰箱保存。

短时保存：吸取上述1-2mL菌悬液到灭菌离心管中于4℃保存；也可以将划线纯化的菌落平板直接4℃保存。

实施例2

本实施例为克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062的菌株鉴定例：

1.菌株活化：将实施例1筛选的Bcjcm062划线到PDA平板，28℃恒温培养箱生长1d。

2.克劳氏芽孢杆菌发酵液制备：挑取菌株单菌落于5mL/50mLLB液体离心管中，28℃，180r/min摇床中培养18h后，以7％的接种量接种到60mL/250mLBcjcm062发酵培养基三角瓶中(发酵培养基中：麦芽糖2v％，蛋白胨1.5v％，氯化钙1v％，其余为蒸馏水，pH＝5.5)于31℃，180r/min摇床中发酵培养48h，经0.22μL滤膜过滤，于4℃冰箱保存备用。

对筛选出的克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062做如下测试及表征：

1.克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062的鉴定，具有如下特征：

1.1形态学特征：如图1所示，菌落多为圆形，白色，培养时间稍长产生红色色素，边缘整齐，不透明，隆起，表面粗糙，其细胞呈杆状。如图2所示，革兰氏染色阳性；如图3所示，菌体运动能力强。

1.2生理生化特征：

采用生理生化鉴定管，检测的生理生化特征如下表所示。

注：“+”阳性；“-”阴性；“V”利用效果微弱

1.3分子生物学鉴定

根据DNA提取试剂盒说明书的步骤，提取细菌基因组的DNA，用细菌通用引物扩增出16S rDNA，进行测序，测序结果显示菌株Bcjcm062的测序长度为1421bp，其序列经NCBIblast检索比对，与克劳氏芽孢杆菌同源性为99.89％，该菌株Bcjcm062为芽杆菌属，利用软件MEGA7构建系统发育树(图4)的结果显示，其DNA序列与克劳氏芽孢杆菌B.clausii亲缘关系最近。

结合生防细菌的形态学特征、生理生化特征及分子生物学(16S r DNA)的鉴定方法，明确菌株Bcjcm062的分类地位为克劳氏芽孢杆菌B.clausii。

克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062的16S rDNA核甘酸序列：

GGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGTGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCCCCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGCA

发明人已经将菌株于2021年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.21694。

2.测定筛选出的克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062的抑菌谱：

以玉米(表1)大斑病菌(Exserohilumturcicum)、北方炭疽病菌(Aureobasidiumzeae)、小斑病菌(Bipolarismaydis)、弯孢叶斑病菌(Curvularialunata)、根腐病菌(Fusariumverticillioides)、茎腐病菌(Fusariumverticillioides)、穗腐病菌(Fusariumverticillioides)、禾谷炭疽病菌(Colletotrichumgraminicola)、鞘腐病菌(Fusariumproliferatum)、纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)为靶标菌，采用两线对峙法，28℃恒温培养5d，记录抑菌距离。

表1克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062对玉米主要病害抑菌谱

克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062对上述病害具有良好的广谱防治效果，图5中5A为对照组玉米根腐病菌，5B为克劳氏芽孢杆菌与玉米根腐病菌的对峙培养，如图5所示，克劳氏芽孢杆菌对玉米根腐病菌抑菌距离达12mm；图6中，6A为对照组鞘腐病菌，6B为克劳氏芽孢杆菌与鞘腐病菌的对峙培养，如图6所示，对鞘腐病菌抑菌距离达8mm；图7中，7A为对照组小斑病菌，7B为克劳氏芽孢杆菌与小斑病菌的对峙培养，如图7所示，克劳氏芽孢杆菌对小斑病菌抑菌距离达13mm；图8中，8A为对照组弯孢叶斑病菌，8B为克劳氏芽孢杆菌与弯孢叶斑病菌的对峙培养，如图8所示，克劳氏芽孢杆菌对弯孢叶斑病菌抑菌距离达12mm。充分证明了筛选出的克劳氏芽孢杆菌具有广谱防效性。

3.克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062产铁载体能力及铁载体类型的检测：

3.1产铁载体能力检测：

培养克劳氏芽孢杆菌株Bcjcm062，采用点接法，在CAS检测平板(0.1mol/L CaCl₂1mL，磷酸盐缓冲液5mL，10％酸水解酪蛋白30mL，20％蔗糖10mL，CAS染液50mL，H₂0 1000mL)上接种，28℃恒温培养5d，菌株若产铁载体，会在CAS检测平板上出现肉眼可见的晕圈，晕圈越大，说明菌株产铁载体的能力越强(图9)。

3.2克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062产铁载体类型的检测，具体方法如下：

铁载体类型的检测：将4mL发酵滤液与800μL的FeCl₃(100mmol/L)混合，如果颜色变为桔色则表明存在三羟基氧肟酸型铁载体；取2mL克劳氏芽孢杆菌发酵滤液加入等体积的浓度为2％的氯化铁溶液，充分混合均匀，若有颜色变化且在紫外分光光度计495nm处有光吸收值，则表明该发酵液中存在的铁载体类型为儿茶酚型。结果如图10和11所示。图10中左侧为对照组仅为FeCl₃，右侧为发酵滤液与FeCl₃的混合液，右侧显示为桔色，说明右侧中存在三羟基氧肟酸型铁载体，证明克劳氏芽孢杆菌能产生三羟基氧肟酸型铁载体；图11中左侧为对照组仅为氯化铁溶液，右侧为克劳氏芽孢杆菌发酵滤液与氯化铁溶液的混合液，右侧相对于左侧发生颜色变化，说明右侧中存在儿茶酚型铁载体，证明克劳氏芽孢杆菌能产生儿茶酚型铁载体。

3.3克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062抑菌过程中，铁载体起关键作用，试验方法如下：

发酵液中加入铁离子可以抑制菌株铁载体的生成，通过设置Fe³⁺梯度试验，可以得出Fe³⁺浓度与菌株铁载体产量的影响，如表2所示。以甲磺酸去铁铵为标准品，制作铁载体含量与紫外分光度之间关系的标准曲线(图12)，得出铁载体含量与紫外分光度之间呈反比，结果表明，随着Fe³⁺浓度的增加，克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062的铁载体产量逐渐降低，抑菌能力也逐渐降低，由此可以说明铁载体对克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062抑菌过程起着关键的作用。

表2 Fe³⁺浓度与克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062菌株分光值及靶标菌抑制距离

3.4克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062中三羟基氧肟酸型铁载体的含量测试：

根据表2数据得出，当铁离子的浓度为0时，铁载体的生成未受到抑制，将其吸光值带入图12的标准曲线方程中，即得出克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062产三羟基氧肟酸型铁载体的含量为1144.1μmol/L。

实施例3

本实施例为克劳氏芽孢杆菌种衣剂的制备方法。

将实施例2得到的克劳氏芽孢杆菌发酵滤液与玉米种子按质量比1:50充分混匀，加入成膜剂(成膜剂与玉米种子质量比为1:100，其有效成分是树脂及蜡乳液)，即得Bcjcm062种衣剂。

对比例

发酵滤液拌种制作方法：发酵滤液与玉米种子质量比1:50充分拌种，晾干后4℃保存，即为发酵液拌种。

测试克劳氏芽孢杆菌种衣剂对盆栽玉米的促生效果：

配置有机育苗基质：大田土与有机土1:1(V/V)的比例配置花盆土，每个花盆(29.5cm×20cm)中装有6kg灭菌土壤。每盆播种6粒种子，第一组花盆中加入Bcjcm062种衣剂，第二组花盆中加入发酵液拌种，第三组加入空白种子加成膜剂(对照)，每组包括3个花盆，在温室内培养，自然光照，保持盆内土壤湿度15％左右。在播种21d后，将三组花盆的玉米植株冲洗干净后，等玉米植株晾干无明显水渍时，测量各项生长指标：株高，直尺测量茎基部到玉米顶端的距离；根长，将根伸直后测量其长度；茎粗，用软尺测量茎基部的周长；鲜重；干重，在称量玉米的鲜重后，将玉米植株放入90℃烘箱内90min。每组花盆的数据取该组3个花盆数据的平均值，结果见表3。

表3克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062种衣剂包衣后对玉米生长的影响

在5项生理指标中，克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062种衣剂相较于对照组分别提高9.01％、19.34％、4.66％、17.48％、35.71％，发酵液拌种相较于对照组分别提高5.14％、11.67％、2.22％、11.11％、18.54％，该结果表明，克劳氏芽孢杆菌可以促进玉米植株根系的发育并对植株有促生作用。而克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062种衣剂的促生作用优于发酵液拌种，说明制备成种衣剂能将克劳氏芽孢杆菌的促生效果发挥到最大。

克劳氏芽孢杆菌种衣剂对根腐病防效试验：

将接种根腐病菌的麦粒培养基培养7-10d，玉米种子选用上述的三组种子，在玉米播种时，麦粒接种在种子周围，每穴10g麦粒接种物，每个处理接种18穴，在玉米6-10叶期进行调查，同批次接种的材料应在同一天中完成调查。接种植株根部主胚根、主根发生腐烂、变褐为发病株，记录每个处理的总株数和发病株数，同时记录由于主胚根腐烂所致玉米幼苗枯死的植株数，根据相对应的植株发病株率划分病情分级(表4)，根据计算公式计算病情指数及种衣剂防效，结果见表5。

(S1)病情指数＝[(病级株数×该病级代表数值)/总株数×发病最重级的代表数值)]×100％

(S2)种衣剂防效＝[(对照病情指数-种衣剂处理的病情指数)/对照病情指数]×100％

表4玉米抗镰孢菌根腐病鉴定病情级别划分

表5克劳氏芽孢杆菌Bcjcm062种衣剂包衣后玉米根腐病的防效

根据计算公式(S1、S2)可得出：空白种子加成膜剂处理根腐病的病情指数13.99％，Bcjcm062种衣剂的病情指数是4.32％，发酵液拌种的病情指数为4.91％，对比三组数据，第二组和第一组的病情指数明显低于第三组的，表明克劳氏芽孢杆菌能减轻玉米根腐病；而第一组的病情指数低于第二组，第一组的防效为69.12％，第二组的防效为64.9％，表明将克劳氏芽孢杆菌包衣后制成种衣剂能将克劳氏芽孢杆菌菌株的防效性发挥到最大。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种克劳氏芽孢杆菌菌株，其特征在于，其为两线对峙法与拟轮枝镰孢菌进行对峙试验获得，能够产生三羟基氧肟酸型铁载体和儿茶酚型铁载体。

2.根据权利要求1所述的克劳氏芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株于2021年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.21694。

3.一种克劳氏芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将土壤样品做成10-²-10-⁶倍五个梯度的土壤悬浮液，采用平板涂布法在培养基平板上均匀涂布至完全吸收，多次重复，28℃恒温培养24h-48h；

步骤二、挑取颜色、形态不同的单菌落在培养基上划线纯化1-3次，28℃恒温培养24h-48h；

步骤三、将拟轮枝镰孢菌饼转接到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基中央，在距离靶标菌两侧25mm处，等距离划线纯化后的细菌单菌落，28℃恒温培养5d，记录抑菌距离；

步骤四、通过两线对峙法，克劳氏芽孢杆菌对拟轮枝镰孢菌的抑菌距离为12mm。

4.根据权利要求3所述的克劳氏芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于，所述步骤一中和所述步骤二中，所述培养基包括牛肉膏蛋白胨。

5.一种发酵方法，其特征在于，包括在适于微生物生长的条件下使根据权利要求1或2所述的克劳氏芽孢杆菌或根据权利要求3或4所述的筛选方法筛选的克劳氏芽孢杆菌在发酵液中进行发酵以得到培养物的步骤。

6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵液包含麦芽糖2v％、蛋白胨1.5v％和氯化钙1v％，其余为蒸馏水。

7.根据权利要求5或6所述的发酵方法，其特征在于，发酵培养条件为：发酵时间48h，发酵温度31℃，转速180r/min，pH＝5.5。

8.一种种衣剂的制备方法，其特征在于，包括权利要求5-7任一项所述的发酵方法作为其步骤。

9.根据权利要求8所述的种衣剂的制备方法，其特征在于，进一步包括将发酵液过滤、将发酵滤液与玉米种子混匀加入成膜剂的步骤；其中，发酵滤液与玉米种子的质量比为1:20～100；成膜剂与玉米种子的质量比为1:100。

10.一种种衣剂，其通过根据权利要求8或9所述的方法制备得到。

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