CN112694995B - 一株褐藻胶降解菌Bacillus HZ-1及其在海参养殖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株芽孢杆菌，命名为芽孢杆菌Bacillus sp.HZ‑1，该菌株已于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21134。该菌具有良好的褐藻胶降解能力，同时该菌具有较高的氨氮降解活性，可用于清除养殖池塘中的氨氮废物。该菌可用于海参养殖过程中褐藻胶降解的促进剂和水体氨氮的清除，同时该菌可制成微生物菌剂。

Description

一株褐藻胶降解菌Bacillus HZ-1及其在海参养殖中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株褐藻胶降解菌Bacillus HZ-1及其在海参养殖中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

海参作为一种优质的天然营养保健食品，近年来需求不断增加，国内海参总产值已超过600亿元，成为产值最大、利润最高的渔业品种。海参主要以集约化人工养殖为主，包括围堰养殖、池塘养殖和大棚养殖等。在人工养殖过程中通常会添加人工饵料以促进海参生长。最常见的人工饵料包括鼠尾藻、马尾藻、海带等海藻是刺参饲料中最常见的饲料原料，其中海带等大型藻类是廉价的饵料来源，但这些大型藻类往往含有较高的不容易降解的褐藻胶成分。海参本体消化酶活性较低，限制了这些大型藻类的高效利用。因此筛选具有降解褐藻胶活性的菌体，添加到海参饵料或养殖水体中，使其在海参体内或体外起到降解褐藻胶的作用，从而促进海参对褐藻胶的利用具有重要意义。

发明内容

为改善现有技术的不足，本发明提供了一株褐藻胶降解菌Bacillus HZ-1，并提供了包含菌的菌剂以及该菌或其菌剂在海参养殖中的应用。本发明的Bacillus HZ-1同时具有降解褐藻胶和氨氮的功能。

在本发明的第一方面，本发明提供了一株芽孢杆菌，其命名为芽孢杆菌Bacillussp.HZ-1(以下简称为Bacillus HZ-1或HZ-1)，该菌株已于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21134。

Bacillus HZ-1分离自海参肠道内容物，可在LB固体或液体培养基中培养，菌体在固体培养基表面形成圆形或椭圆形菌落，边缘较整齐，菌落呈白色或淡黄色，易于挑取。菌体形态为短杆状，长度在2-4μm。经16S rDNA基因序列比对，Bacillus HZ-1与Bacillusaryabhattai B8W22相似性最高达99.93％，此外，发明人构建了Bacillus HZ-1的系统发育树，如图4所示。

本发明的Bacillus HZ-1可高效降解褐藻胶，同时具有较高的氨氮降解活性，可作为褐藻胶降解的促进剂以及用于清除水体中的氨氮废物。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种菌剂，其包含Bacillus HZ-1和/或其发酵物和/或其代谢产物。

在本发明的一些实施方式中，所述代谢产物为菌体胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。

术语发酵物用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养Bacillus HZ-1细菌的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但在一些实施方式中并不必然需要含有细菌。液体优选地含有由本发明的Bacillus HZ-1细菌产生的代谢物。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内可含有Bacillus HZ-1的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有Bacillus HZ-1的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种复合菌剂，其包含Bacillus HZ-1或上述第二方面中所述菌剂与蛋白质降解菌和/或脂肪酸降解菌。

比如，在本发明的一些实施方式中，Bacillus HZ-1发酵液可结合蛋白质降解菌、脂肪酸降解菌等制成混合菌剂可以达到更加全面的有机物降解功效。本领域技术人员可根据需要选择合适的蛋白质降解菌和/或脂肪酸降解菌。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种海参饲料或海参饲料添加剂，其包含Bacillus HZ-1或上述第二方面中所述的任一种菌剂。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种海参饵料，其包含Bacillus HZ-1或上述第二方面中所述的任一种菌剂和藻类。

在本发明的一些实施方式中，所述藻类为海藻，比如可以为马尾藻、大叶藻、鼠尾藻、海带、紫菜、鹿角菜、裙带菜中的一种或几种。

本发明的Bacillus HZ-1和/或其菌剂具有高效的褐藻胶降解能力，可促进海参对褐藻胶的降解，促进大型藻类在海参养殖饵料中的应用。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种海参养殖水体添加剂，其包含BacillusHZ-1或上述第二方面中所述的任一种菌剂或上述第三方面中所述的复合菌剂。

在本发明的第七方面，本发明提供了Bacillus HZ-1或上述第二方面中所述的菌剂或上述第三方面中所述的复合菌剂在制备海参养殖产品或海参养殖水处理产品中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述产品可以为海参饲料、海参饲料添加剂、海参饵料、海参养殖水体添加剂。

在本发明的第八方面，本发明提供了Bacillus HZ-1或上述第二方面中所述的菌剂或上述第三方面中所述的复合菌剂在制备降解褐藻胶的产品，或在制备降解氨氮的产品中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述产品可以为海参饲料、海参饲料添加剂、海参饵料、海参养殖水体添加剂、水污染处理剂、水质改良剂。

相较于现有技术，本发明的优势在于：

本发明的Bacillus HZ-1菌株筛选于健康海参的肠道内容物，经扩大培养或制成菌剂应用于海参饲料和水体添加剂等产品时对海参和水体潜在危害风险更小。BacillusHZ-1菌株具有高效的降解褐藻胶的能力，可促进海参对褐藻胶的降解，能够促进大型藻类在海参养殖饵料中的应用。Bacillus HZ-1菌株还同时具备较高的氨氮降解活性可用于水体中氨氮的清除，比如可具体应用与海参养殖环境中氨氮的清除，作用功能广泛。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为菌株Bacillus HZ-1海藻酸钠降解活性。

图2为菌株Bacillus HZ-1固体平板菌落形态。

图3为菌株Bacillus HZ-1液体培养条件下菌株形态。

图4为菌株Bacillus HZ-1系统发育进化树。

图5示出了菌株Bacillus HZ-1的氨氮降解能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1一株褐藻胶降解菌株Bacillus HZ-1的筛选和鉴定

1.1样品采集：

样品采集于山东威海地区海参养殖池塘，采集健康海参，使用无菌水清洗海参体表，使用无菌解剖剪解剖海参，取其肠道内容物，4℃运回待用。

1.2培养基：

1.2.1富集培养基1：海藻酸钠3g，硝酸钾1g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。

1.2.2富集培养基2：海藻酸钠5g，硝酸钾1g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。

1.2.3分离培养基：海藻酸钠5.0g，硝酸钾1g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠10.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，琼脂粉20g，水1000ml。

1.2.4基础培养基LB:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000ml。

1.2.5氨氮降解检测培养基：葡萄糖5.0g，氯化铵0.4g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。

1.3菌株筛选：

1.3.1海藻酸钠降解菌富集：250ml三角瓶加入50ml富集培养基1，接入1g肠道内容物样品，28℃摇床培养3天。随后取5ml培养液加入到50ml富集培养基2中进行二次富集培养。

1.3.2将两次富集后菌液进行梯度稀释至10^-3-10^-5，分别取100ul稀释液涂布于分离培养基，28℃条件下培养5天。

1.3.3挑取菌落，每种典型菌落挑取3个在LB固体培养基中进行多次划线纯化，直至得到纯菌株。

1.3.4具有海藻酸钠降解能力菌株筛选，采用固体平板法筛选菌体降解海藻酸钠的能力。菌体接种到富集培养基中进行活化，将活化好的菌中接种到分离培养基中，28℃静置培养3天，观察菌体周围是否有透明圈产生，降解活性以透明圈直径比菌圈直径，即R/r(R表示透明圈，r表示菌圈)表征。结果如图1所示，菌株Bacillus HZ-1具有菌体生长迅速，并且具有较大透明圈，选取其作为目标菌株。

1.4菌株形态观察：

采用划线法在LB固体培养基表面获得Bacillus HZ-1菌株单菌落，观察菌落形态，结果如图2所示，菌体在培养基表面形成圆形或椭圆形菌落，边缘较整齐，菌落呈白色或淡黄色，易于挑取。接种Bacillus HZ-1菌体到LB液体培养基，培养到对数中期，取少量菌液涂布载玻片，并用结晶紫染色，观察菌体形态。结果如图3所示，菌体为的短杆状，长度在2-4μm。

1.5菌株鉴定:

采用土壤细菌基因组提取试剂盒提取菌株的总DNA，采用细菌通用测序引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT进行PCR扩增。反应体系为：H₂O25uL，Mix Buffer 22ul，Primer1 2uL，Primer2 2uL，DNA模板1uL，总体积50uL；反应条件：95℃预变性5min，33循环的95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸10min。反应产物采用琼脂糖凝胶电泳检测纯度。随后进行序列测序。测序结果在Ezbiocloud网站与模式菌株进行16S rDNA基因序列比对。结果表明，该菌株与Bacillusaryabhattai B8W22相似性最高达99.93％。菌体系统进化树图如图4所示。其核苷酸序列如下所示：

CGGTTACTCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACGAGCAGTTACTCTCGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGCCCATCTGTAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTCAATCATCTCCCATGAAGGAGAAGATCCTATCCGGTATTAGCTTCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCATAGAAGCAAGCTTCTAATCG

实施例2一株褐藻胶降解菌株Bacillus HZ-1的褐藻胶降解活性检测

菌株采用LB液体培养基进行活化，接种5％发酵液到新的LB培养基中，28℃震荡培养24h。褐藻胶降解反应体系：1ml菌液，1ml 0.5％褐藻胶溶液，2ml 0.1M的Tris-HCl缓冲液，混合后在40℃条件下孵育30min。用1m水替代菌液作为对照。反应结束后立即煮沸10min，8000g×10min离心收集上清液。上清液用水稀释5倍，测定235nm处OD值。结果Bacillus HZ-1菌株反应液稀释后OD值为0.72，对照为0.1。表明菌株Bacillus HZ-1可以降解褐藻胶产生褐藻胶寡糖。

实施例3一株褐藻胶降解菌株Bacillus HZ-1的氨氮降解活性检测

采用LB液体培养基活化Bacillus HZ-1菌种，接种5％菌体发酵液到氨氮降解培养基中，在28℃、200rpm条件下培养菌体36h，测定剩余氨氮含量。结果如图5所示，菌株Bacillus HZ-1在28℃条件下具有较强的氨氮降解活性，在初始浓度为123mg/ml时，在36h氨氮降解率为90％。

实施例4以褐藻胶降解菌株Bacillus HZ-1为主体的微生物制剂的制备

采用LB液体培养基活化菌体至OD值为0.8得到种子液，接种5％菌种至新的LB液体培养基在28℃条件下进行液体发酵，培养36h即可得到菌体发酵液。发酵液可单独作为菌剂使用作为饲料添加剂或水体菌剂。另外Bacillus HZ-1发酵液可结合蛋白质降解菌、脂肪酸降解菌等制成混合菌剂以达到更加全面的有机物降解功效。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省科学院生物研究所

<120> 一株褐藻胶降解菌Bacillus HZ-1及其在海参养殖中的应用

<130> 202028431

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）

<400> 1

cggttactcc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60

aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc 120

atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg ttttatggga ttggcttgac 180

ctcgcggtct tgcagccctt tgtaccatcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240

ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 300

agagtgccca actaaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360

cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgtcccccg 420

aaggggaacg ctctatctct agagttgtca gaggatgtca agacctggta aggttcttcg 480

cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540

agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact 600

aaagggcgga aaccctctaa cacttagcac tcatcgttta cggcgtggac taccagggta 660

tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc gcctcagcgt cagttacaga ccaaaaagcc 720

gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc tacgcatttc accgctacac gtggaattcc 780

gcttttctct tctgcactca agttccccag tttccaatga ccctccacgg ttgagccgtg 840

ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggat 900

aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 960

ttaggtaccg tcaaggtacg agcagttact ctcgtacttg ttcttcccta acaacagagt 1020

tttacgaccc gaaagccttc atcactcacg cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt 1080

gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1140

ggccgatcac cctctcaggt cggctatgca tcgttgcctt ggtgagccgt tacctcacca 1200

actagctaat gcaccgcggg cccatctgta agtgatagcc gaaaccatct ttcaatcatc 1260

tcccatgaag gagaagatcc tatccggtat tagcttcggt ttcccgaagt tatcccagtc 1320

ttacaggcag gttgcccacg tgttactcac ccgtccgccg ctaacgtcat agaagcaagc 1380

ttctaatcg 1389

Claims (10)

1.一株芽孢杆菌，命名为Bacillus sp.HZ-1，该菌株已于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21134。

2.一种菌剂，其包含权利要求1所述的芽孢杆菌。

3.一种复合菌剂，其包含权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂与蛋白质降解菌和/或脂肪酸降解菌。

4.一种海参饲料或海参饲料添加剂，其包含权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2中所述的菌剂。

5.一种海参饵料，其包含权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2中所述的菌剂和藻类。

6.一种海参养殖水体添加剂，其包含权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂或权利要求3中所述的复合菌剂。

7.权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂或权利要求3中所述的复合菌剂在制备海参养殖产品或海参养殖水处理产品中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为海参饲料、

海参饲料添加剂、海参饵料、海参养殖水体添加剂。

9.权利要求1所述的芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂或权利要求3中所述的复合菌剂在制备降解褐藻胶的产品或在制备降解氨氮的产品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品为海参饲料、

海参饲料添加剂、海参饵料、海参养殖水体添加剂、水污染处理剂。

Images