CN101461312A - 离褶伞母种的千倍转代方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种离褶伞母种的千倍转代方法，属于食药用菌母种的生产方法。包括马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基、综合培养基、木屑浸汁培养基，选取上述具体配方，称量溶化、取汁和补水，测定、调整酸碱度；添加琼脂和分装，试管装量为试管高度的1/2～2/3；加硅胶塞装锅灭菌，灭菌后，将试管垂直放入塑料筐中，将筐一头支起成15度斜面，制成半高层培养基；母种转管在洁净空气平稳的环境中，按照无菌操作规程接种，接种于培养基中央，恒温暗光培养。优点在于：加入过氧化钙与麦芽浸膏，使培养基变得更适于离褶伞等食药用菌生长，而且活力旺盛。

Description

离褶伞母种的千倍转代方法

技术领域

本发明属于食药用菌母种的生产方法。

背景技术

目前，食药用菌产业发展迅猛，已经成为继粮、棉、油、果、菜之后第六大出口创汇农林产品，2008年我国食药用菌产量达1470多万吨，占世界食药用菌产量的76.5％。食药用菌产业以其投资少、效益高、推广普及快的优点在农业产业，服务“三农”中已呈现出强大的生命力和美好的前景，成为农业结构优化的重要角色。

我国食药用菌菌种生产国家标准技术规程中规定，采用母种(一级种)→原种(二级种)→栽培种(三级种)三级制种程序。母种又称一级种，是食用菌孢子分离或组织分离所得的纯培养物。由于母种菌丝体是在试管斜面培养基上生长，故母种又称斜面菌种或试管菌种。由于生产中分离得到的母种有限，一般可将菌丝再次转接到新的斜面培养基进行转管繁殖，得到更多母种，称为再生母种。通常一支满管母种可分移为25～35支再生母种，但为确保母种质量，母种转管繁殖不能超过三次，试管种若不马上使用，可置于4℃的冰箱中保存备用。

母种培养基传统配方：

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)

马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml。

(2)马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA培养基)

马铃薯(去皮)200g、蔗糖20g、琼脂20g、水1000ml。

(3)综合培养基

马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.5～1.0g、磷酸氢二钾0.5～1.0g、硫酸镁0.5～0.75g、蛋白胨2～5g、酵母膏2～5g、琼脂20g、水1000ml。此培养基可以用于菌种复壮和保藏，也可以用于多孢分离。

(4)木屑浸汁培养基

锯木屑(阔叶树)200g、蔗糖20g、硫酸铵3g、琼脂20g、水1000ml。

母种培养基传统制作方法：

(1)称量溶化、取汁和补水  ①对易溶物质，按配方称取后置于烧杯中，加入其量1/3～1/4的水，搅成糊状；对难溶物质按配方称取适量水后，加热不断搅拌，促其溶解；②对去皮切块的马铃薯、苹果、黄豆芽、棉子壳、菇类子实体等，按配方称后置容器中，加清水500～1000毫升(料水比约1：5)。文火煮沸25分钟左右，用4层纱布过滤取汁；③玉米粉加1000毫升清水，加热到70℃左右，保持1个小时，用4层纱布过滤取汁；④对木屑浸出汁所用的去心、带皮木材，切成薄片，加水700毫升，煮沸20分钟，用4层纱布过滤取汁，所用之米糠加入80℃温水300毫升，浸泡30分钟，用4层纱布过滤取汁，然后将两汁混合。最后均要补足水量到1000毫升。

(2)测定、调整酸碱度  方法是用镊子夹一小段pH精密试纸伸入培养基液中，然后取出与标准比色板比较，找到与比色板上色带相对应的数值，即为该培养基的pH值。然后按照所培养菌类生长对pH值的要求进行调整。培养基过酸，用5％的氢氧化钠溶液调整；过碱用5％的稀盐酸溶液调整。

(3)添加琼脂和分装  将称好的琼脂剪成小块，加入配好的液体培养基中，文火煮沸，边加热边搅拌，待琼脂完全溶化后，用湿纱布(纱布经热水浸后拧干)迅速进行过滤，过滤后趁热进行分装。

分装所用的容器事先一定要清洗、干燥。新购进的试管管内一般都残留烧碱，应先用稀硫酸液在烧杯中煮沸，然后用清水冲洗干净，口朝下晾干后备用，不能现洗现用，以免因管壁附有水膜，导致培养基在试管内滑动。

分装试管时尽量避免培养液黏附试管口，以免培养基粘住棉塞增加污染机率。试管装量，制斜面培养基一般为试管高度的1/5～1/4；制半高层培养基一般为试管高度的1/4～1/3；制高层培养基一般为试管高度的1/3～1/2。

(4)加棉塞装锅灭菌。棉塞要用的普通棉花制作，不能用脱脂棉，做棉塞是制作菌种过程中相当重要的一环，是不容忽视的一道工序。做法很多，不论采用哪种方法，都要求做好后的棉塞边缘平，顶端光。这里介绍两种常用的棉塞制作程序。

棉塞的大小、松紧要适度，过松达不到滤菌的目的，过紧妨碍空气流通，松紧度以手抓棉塞，整个试管能提起为宜。标准的棉塞应是塞头略大，不易变形，一般塞入试管口2～3厘米，占塞总长的2/3，1/3裸露在试管口外，比管口略大。将塞好棉塞的试管每9～11支捆成一把，用牛皮纸包住棉塞一端，再用线绳扎紧，然后将试管装进铁丝筐里，再用塑料薄膜包扎好，防止灭菌时棉塞被冷凝水淋湿。这时即可装入手提式高压锅内进行灭菌，装锅时试管要竖放，切忌倾斜。待压力升到0.015兆帕，维持30分钟，灭菌结束后当压力降到0时，将锅盖打开，提出铁丝筐，除去包扎的薄膜。

试管取出后，一定要趁热摆成斜面，斜面做法，在桌面平放2厘米厚的木条，将试管斜放在木条上，培养基冷却后即凝固成斜面。培养基在试管里的斜面一般为试管长度的3/4。用于保藏菌种的试管斜面应短些，以减少蒸发面积。天气凉爽时制作斜面，最好在摆好后，立即覆盖洁净的棉垫，以免斜面管壁上产生大量水珠，影响接种和培养。摆放好的斜面，在培养基未凝固前，不能移动，以免培养基断裂和表面不平。培养基凝固后，方可收藏备用。

母种转管培养传统程序是将一支长满斜面培养基的试管在无菌操作下，分别接入多只试管中培养，一般每支母种可分移25～35支新的斜面试管。

(1)所用接种箱(室)，要预先清洗消毒，使其成为无菌状态。

(2)接种培养基及一切用具，也要预先放进接种箱(室)，经过消毒。

(3)工作人员洗手，换上消过毒的衣帽鞋，戴上口罩，带上菌种进入接种区。

(4)将双手和菌种管外壁用75％酒精棉球涂擦。

(5)点燃酒精灯。

(6)将菌种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间的部分。斜面向上，并使它们位于水平位置。

(7)先将棉塞用右手拧转松动，以利接种时拔出。

(8)右手拿接种针(和拿钢笔一样)，在火焰上将凡在接种时可能进入试管的部分，全部用火烧过。

以下操作都要使试管口靠近火焰旁。

(9)用右手小指，无名指和手掌拔掉棉塞。

(10)以火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口(靠手腕的动作)，将试管口沾染的少量菌烧死。

(11)将烧过的接种针伸入菌种管内，先接触没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后轻轻接触菌种取出少许，将接种针抽出试管，不要使其碰到管壁。

(12)迅速将接种针在火焰旁伸进另一试管，接种于培养基中央。

(13)灼烧管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。

(14)放回接种针前，将其在火焰上再烧红灭菌。

离褶伞属Lyophyllum Karst.系担子菌门Basidomycota，层菌纲Hymenomycetes，伞菌目Agaricales，离褶伞科Lyophylleae真菌。广泛分布于我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、云南、甘肃、湖南、四川、广东、江苏、青海、内蒙、河南、河北、山西、陕西、宁夏、新疆等地。离褶伞属绝大多数种类味道鲜美、药食兼用，具有很高的应用前景和开发价值。

首先，离褶伞属真菌大部分难以栽培，目前栽培成功的几个品种也因培养周期长而备受限制。

其次，我国的部分食药用菌如黑木耳、白灵菇、金针菇、杏鲍菇、美味扇菇等大都采用二级制种程序，所需母种数量巨大。而母种的再生现在一直使用25～35倍扩繁，无形中增加了转代次数，造成优良品种的退化严重。

检索了国内外所有文献：均未发现有关离褶伞等食药用菌母种的千倍转代技术。

发明内容

本发明提供一种食药用菌母种的千倍转代方法，以解决母种扩繁次数过多，因母种的再生现在一直使用25～35倍扩繁，无形中增加了转代次数，造成优良品种的退化严重的问题。本发明采取的技术方案是：

一、母种培养基配方：具体包括：

(1)改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

去皮马铃薯180～220g、葡萄糖18～22g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g，水1000ml；

(2)改良的马铃薯蔗糖琼脂培养基；

去皮马铃薯180～220g、蔗糖18～22g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g，水1000ml；

(3)改良的综合培养基，用于菌种复壮和保藏，或用于多孢分离；

去皮马铃薯180～220g、葡萄糖18～22g、磷酸二氢钾0.5～1.0g、磷酸氢二钾0.5～1.0g、硫酸镁0.5～0.75g、蛋白胨2～5g、酵母膏2～5g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g、水1000ml；

(4)改良的木屑浸汁培养基；

阔叶树锯木屑180～220g、蔗糖18～22g、硫酸铵2～4g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g、水1000ml。

二、母种培养基制作方法：

(1)根据实际需要选取上述具体配方，称量溶化、取汁和补水，测定、调整酸碱度；

(2)添加琼脂和分装，试管装量为试管高度的1/2～2/3；

(3)加硅胶塞装锅灭菌，灭菌后，将试管垂直放入塑料筐中，将筐一头支起成15度斜面，制成半高层培养基，冷却后即可；

三、母种转管

在洁净空气平稳的环境中，用酒精灯和接种勾，按照无菌操作规程接种，挑取千分之一菌丝，接种于培养基中央，恒温暗光培养。

本专利的优点在于：

1、在原来母种培养基配方基础上，加入过氧化钙与麦芽浸膏，使培养基变得更适于离褶伞等食药用菌生长，而且活力旺盛。过去没加过氧化钙与麦芽浸膏的培养基，大部分离褶伞长满试管需要20～30天，菌丝生长纤弱，而加过氧化钙与小麦提取物成分的培养基，15天可长满试管。

2、斜面试管制作时，改变以往分装试管、斜面制作工艺流程，使培养基制作简便快捷，大大提高劳动效率。过去两人每天可以制作试管2000支，利用本专利技术，一人每天可生产30000支。

3、转管培养，过去每只斜面试管可转接再生25～35支。利用本专利转管技术，可使一支母种扩繁1000倍，简化了过程，提高了效率，增加了菌丝定植率，降低了污染率。可使污染率下两到0.1％以下。大大提高了生产效能。

4、经大量实验和三年实际生产证明，千倍转管后的母种菌丝生长健壮，洁白浓密，在以后二级种生产时分解培养料的能力加强。

5、本专利方法在离褶伞研究过程中发现，但在食药用真菌中实验发现平菇、香菇、木耳、银耳、猴头、虫草、金针菇、滑菇、灵芝、双孢菇、杏鲍菇、白灵菇、蟹味菇均可使用。

具体实施方式

实施例1

一、母种培养基配方：具体包括：

(1)改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

去皮马铃薯180g、葡萄糖18g、琼脂18g、过氧化钙1g、麦芽浸膏2g，水1000ml；

(2)改良的马铃薯蔗糖琼脂培养基；

去皮马铃薯180g、蔗糖18g、琼脂18g、过氧化钙1g、麦芽浸膏2g，水1000ml；

(3)改良的综合培养基，用于菌种复壮和保藏，或用于多孢分离；

去皮马铃薯180g、葡萄糖18g、磷酸二氢钾0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、蛋白胨2g、酵母膏2g、琼脂18g、过氧化钙1g、麦芽浸膏2g、水1000ml；

(4)改良的木屑浸汁培养基；

阔叶树锯木屑180g、蔗糖18g、硫酸铵2g、琼脂18g、过氧化钙1g、麦芽浸膏2g、水1000ml。

二、母种培养基制作方法：

(1)根据实际需要选取上述具体配方，进行称量溶化、取汁和补水，测定、调整酸碱度；

(2)添加琼脂和分装，试管装量为试管高度的1/2；

(3)加硅胶塞装锅灭菌，灭菌后，将试管垂直放入塑料筐中，将筐一头支起成15度斜面，制成半高层培养基，冷却后即可；

三、母种转管

在洁净空气平稳的环境中，用酒精灯和接种勾，按照无菌操作规程接种，挑取千分之一菌丝，接种于培养基中央，恒温暗光培养。

实施例2

一、母种培养基配方：具体包括：

(1)改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、过氧化钙2g、麦芽浸膏3g，水1000ml；

(2)改良的马铃薯蔗糖琼脂培养基；

去皮马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g、过氧化钙2g、麦芽浸膏3g，水1000ml；

(3)改良的综合培养基，用于菌种复壮和保藏，或用于多孢分离；

去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾0.75g、磷酸氢二钾0.75g、硫酸镁0.6g、蛋白胨3g、酵母膏4g、琼脂20g、过氧化钙2g、麦芽浸膏3g、水1000ml；

(4)改良的木屑浸汁培养基；

阔叶树锯木屑200g、蔗糖20g、硫酸铵3g、琼脂20g、过氧化钙2g、麦芽浸膏3g、水1000ml。

二、母种培养基制作方法：

(1)根据实际需要选取上述具体配方，称量溶化、取汁和补水，测定、调整酸碱度；

(2)添加琼脂和分装，试管装量为试管高度的1/2；

(3)加硅胶塞装锅灭菌，灭菌后，将试管垂直放入塑料筐中，将筐一头支起成15度斜面，制成半高层培养基，冷却后即可；

三、母种转管

在洁净空气平稳的环境中，用酒精灯和接种勾，按照无菌操作规程接种，挑取千分之一菌丝，接种于培养基中央，恒温暗光培养。

实施例3

一、母种培养基配方：具体包括：

(1)改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

去皮马铃薯220g、葡萄糖22g、琼脂22g、过氧化钙3g、麦芽浸膏4g，水1000ml；

(2)改良的马铃薯蔗糖琼脂培养基；

去皮马铃薯220g、蔗糖22g、琼脂22g、过氧化钙3g、麦芽浸膏4g，水1000ml；

(3)改良的综合培养基，用于菌种复壮和保藏，或用于多孢分离；

去皮马铃薯220g、葡萄糖22g、磷酸二氢钾1.0g、磷酸氢二钾1.0g、硫酸镁0.75g、蛋白胨5g、酵母膏5g、琼脂22g、过氧化钙3g、麦芽浸膏4g、水1000ml；

(4)改良的木屑浸汁培养基；

阔叶树锯木屑220g、蔗糖22g、硫酸铵4g、琼脂22g、过氧化钙3g、麦芽浸膏4g、水1000ml。

二、母种培养基制作方法：

(1)根据实际需要选取上述具体配方，称量溶化、取汁和补水，测定、调整酸碱度；

(2)添加琼脂和分装，试管装量为试管高度的2/3；

(3)加硅胶塞装锅灭菌，灭菌后，将试管垂直放入塑料筐中，将筐一头支起成15度斜面，制成半高层培养基，冷却后即可；

三、母种转管

在洁净空气平稳的环境中，用酒精灯和接种勾，按照无菌操作规程接种，挑取千分之一菌丝，接种于培养基中央，恒温暗光培养。

Claims (1)

1、一种离褶伞母种的千倍转代方法，其特征在于包括：

一、母种培养基配方：具体包括：

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基；

去皮马铃薯180～220g、葡萄糖18～22g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g，水1000ml；

(2)马铃薯蔗糖琼脂培养基；

去皮马铃薯180～220g、蔗糖18～22g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g，水1000ml；

(3)综合培养基，用于菌种复壮和保藏，或用于多孢分离；

去皮马铃薯180～220g、葡萄糖18～22g、磷酸二氢钾0.5～1.0g、磷酸氢二钾0.5～1.0g、硫酸镁0.5～0.75g、蛋白胨2～5g、酵母膏2～5g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g、水1000ml；

(4)木屑浸汁培养基；

阔叶树锯木屑180～220g、蔗糖18～22g、硫酸铵2～4g、琼脂18～22g、过氧化钙1～3g、麦芽浸膏2～4g、水1000ml；

二、母种培养基制作方法：

(1)根据实际需要选取上述具体配方，称量溶化、取汁和补水，测定、调整酸碱度；

(2)添加琼脂和分装，试管装量为试管高度的1/2～2/3；

(3)加硅胶塞装锅灭菌，灭菌后，将试管垂直放入塑料筐中，将筐一头支起成15度斜面，制成半高层培养基，冷却后即可；

三、母种转管

在洁净空气平稳的环境中，用酒精灯和接种勾，按照无菌操作规程接种，挑取千分之一菌丝，接种于培养基中央，恒温暗光培养。