CN103449914A - 海藻糖在延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命方面的应用、培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的方法，发明人通过在液体培养基中添加海藻糖延长了糙皮侧耳菌种贮藏寿命。该方法包括液体培养基的配制→接种→菌丝培养→离心→再悬浮→短期培养→再离心→常温贮藏→使用前常温下活化菌种→接种于原种或栽培养种等步骤。本发明涉及到三种培养基，培养基A用于菌丝培养，培养基B用于菌丝贮藏，培养基C用于菌种使用前的活化。本发明实现了常温贮藏糙皮侧耳，具有占用空间小、节约电能、节约了续代接种的材料与劳动力、货架寿命长和运输方便等优点。

Description

海藻糖在延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命方面的应用、培养基及方法

技术领域

本发明属于食用菌贮藏领域，尤其涉及一种海藻糖在延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命方面的应用、培养基及方法。

背景技术

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）又称平菇，是世界上第三大人工栽培的食用菌。糙皮侧耳肉质肥嫩，营养丰富，每100克干品中含蛋白质30．5克、脂肪3．7克、纤维5．3克，含氨基酸达18种之多，其中有8种是人体所必需的，并含有维生素B、C、D及铁、磷、钾、钼、锌、钙等多种矿物质。平菇不仅营养丰富，且有较高的药用价值，经常食用有改善人体新陈代谢、增强人体体质和调节神经系统的功能。目前糙皮侧耳菌种的贮藏方式主要以固体为主，其不足之处在于：需4-10℃低温冷藏，1-2个月内需续代一次，固体菌种通常是玻璃试管，运输不方便。

海藻糖（Trehalose）是一种安全、可靠的天然糖类。近年科学研究发现，海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，它在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖独特的功能特性使其除了可以作为天然食用甜味糖外，还作为优良活性保护剂在蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品上有较多的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种海藻糖在延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命方面的应用、培养基及方法，以实现常温贮藏糙皮侧耳菌种，减少菌种保存过程中的继代次数，方便运输和菇农使用及学校教学科研。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：海藻糖在延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命方面的应用。

延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基A用于菌丝培养，每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、蔗糖20g、海藻糖10g，其余为水。

培养基A按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基B用于菌丝贮藏，每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、酵母粉0.25g、海藻糖30g，其余为水。

培养基B按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基C用于菌种使用前的活化，每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、酵母粉0.25g、海藻糖10g、蔗糖15g、麦芽糖5g，其余为水。

培养基C按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的方法，包括以下步骤：

（1）将培养基A分装于250ml三角瓶，每瓶培养液100ml，120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，28℃室温下震荡培养，摇床摇速60次/分，培养时间120小时(5天)；

（2）将步骤（1）得到的培养物在4000转/分下离心5分钟，去掉上清液，用培养基B再悬浮菌丝体，再悬浮液体积为原培养液体积的1/3（约33ml），摇床震荡培养6小时，然后4000转/分下离心5分钟，去掉上清液，获得的菌丝体沉淀物；

（3）将步骤（2）得到的菌丝体沉淀物平均分为5份，转移至无菌的聚丙烯塑料试管内，在低于30℃的室温下贮藏待用。

上述延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的方法，还包括以下步骤：

（4）菌种使用之前，将步骤（3）得到的1份贮藏菌种加灭过菌的培养液C100ml，常温下震荡培养4小时，然后根据需要，接种于原种或栽培种上。

针对现有糙皮侧耳低温贮藏要求高、续代次数多、运输不便等问题，发明人结合液体培养基中添加海藻糖可延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的研究成果，据此配制了相应的培养基，并建立了延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的方法，实现了其常温贮藏。与现有的固体菌种低温贮藏技术相比，本发明具有以下突出优点：

（1）占用空间小

传统固体菌种多用18mm×180mm玻璃试管，占用空间较大，经本发明获得的菌丝经过离体，可以贮藏于5ml体积的塑料容器中，节省了菌种的存放空间；

（2）节约电能

传统固体菌种需在4-10℃下低温贮藏，使用者需配置有冰箱，本发明属常温贮藏，省去了设备成本也节约了电能；

（3）节约了续代接种的材料与劳动力

传统固体菌种需1-2个月继代一次（通常1个月一次，2个月是最大极限），而本发明无此环节，既降低了菌种成本，也方便了使用者；

（4）货架寿命长，运输方便

应用本发明，室温下放置6个月内菌丝始终具有生长活力，塑料品包装运输使用均十分方便。

具体实施方式

实施例1

（1）培养基配制

培养基A用于菌丝培养，每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、蔗糖20g、海藻糖10g，其余为水。培养基A按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

培养基B用于菌丝贮藏，每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、酵母粉0.25g、海藻糖30g，其余为水。培养基B以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

培养基C用于菌种使用前的活化，每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、酵母粉0.25g、海藻糖10g、蔗糖15g、麦芽糖5g，其余为水。培养基C按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

（2）将培养基A分装于250ml三角瓶，每瓶培养液100ml，120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，28℃室温下震荡培养，摇床摇速60次/分，培养时间120小时(5天)；

（3）将步骤（2）得到的培养物在4000转/分下离心5分钟，去掉上清液，用培养基B再悬浮菌丝体，再悬浮液体积为原培养液体积的1/3（约33ml），摇床震荡培养6小时，然后4000转/分下离心5分钟，去掉上清液，获得的菌丝体沉淀物；

（4）将步骤（3）得到的菌丝体沉淀物平均分为5份，转移至无菌的聚丙烯塑料试管内，在低于30℃的室温下贮藏待用。

利用实施例1所贮藏的菌种制做原种与栽培种

取常温贮藏5个月的菌种，每份贮藏菌种加灭过菌的培养液C100ml，常温下震荡培养4小时。根据需要（按每份接种原种10份或每份接种栽培种5份），接种于原种培养瓶（750ml罐头瓶），25-28天可长满菌瓶；或将原种接入栽培种袋中（袋规格20-25cm×45cm），25-30天可长满菌袋。所得到的栽培种按常方法接种入出菇菌袋中（袋规格20-25cm×45cm），25-30天左右可长满菌袋，在15-25℃的温度下5-10天可形成菇原基，当菇长到成熟期采收。一潮菇生物转化率39%，二潮菇生物转化率27%，三潮菇生物转化率19%，共采收三潮，总生物转化率85%。

利用实施例1所贮藏的菌种直接制做栽培种

取常温贮藏5个月的菌种，每份贮藏菌种加灭过菌的培养液C100ml，常温下震荡培养4小时。根据需要（按每份接种栽培种5份），接种于栽培种袋中（袋规格20-25cm×45cm），25-30天可长满菌袋。所得到的栽培种按常方法接种入出菇菌袋中（袋规格20-25cm×45cm），25-30天左右可长满菌袋，在15-25℃的温度下5-10天可形成菇原基，当菇长到成熟期采收。一潮菇生物转化率40%，二潮菇生物转化率28%，三潮菇生物转化率17%，共采收三潮，总生物转化率84%。

实施例2

将传统低温贮藏菌种与本发明菌种的生长、出菇性状进行比较试验，结果如下：

（一）两种贮藏方式的菌种接入原种后对原种菌丝生长的影响

将传统固体培养基方式制做，并在低温下贮藏了不同时间的菌接(CK)，与本发明常温下贮藏制做的菌种同时接入原种培养基中（原种培养基配方为：棉子壳86%，米糠13%，石膏1%，过磷酸钙1%；）中，观察菌丝生长情况，结果见表1。

表1 两种贮藏方式的菌种对原种菌丝生长的影响比较

表1中的防效（%）为各重复平均值。试验结果采用邓肯氏新复极差（DMRT）法进行分析，表中数据后相同大小写字母表示在1%和5%水平上差异不显著，表2同。

从表1可以看出，传统固体种低温贮藏方式下，菌种能够在原种培养基上正常生长的最适贮藏时间为15-45天，当低温贮藏时间延长至60天时，菌丝生长时间明显降低，菌种长满瓶的时间出延长。当低温贮藏时间延长至75天时，菌丝已无再生能力。

而采用本发明所制做的菌种接入原种培养基，在所试验的15-75天内，各处理菌丝生长速度分别为8.1、7.5、7.2、7.0、6.7mm/天，处理之间无显著差异。

（二）本发明菌种在不同贮藏时间下接入原种、栽培种中对菌丝体生长的影响

表2 本发明菌种不同贮藏时间对原种、栽培种菌丝生长的影响

表2中CK为传统方式低温贮藏1.5个月的菌种。从表2可以看出，采用本发明所制做的菌种接入原种培养基，在所试验的1-8个月内，1-4个月的各处理菌丝生长速度分别为7.4、7.1、6.9、6.7mm/天，处理之间无显著差异；贮藏5-6个月时，菌丝生长速度有一定的下降，但仍等同于对照；7、8二个月的菌丝则无再生能力。

相似的，采用本发明所制做的菌种接入栽培种培养基，在所试验的1-8个月内，1-4个月的各处理菌丝生长速度分别为7.2、7.0、6.8、6.5mm/天，处理之间无显著差异；贮藏5-6个月时，菌丝生长速度有一定的下降，但仍等同于对照；7、8二个月的菌丝则无再生能力。

（三）两种贮藏方式的菌种制成的栽培种接入栽培袋后对栽培袋出菇产量的影响

按传统固体培养基方式制做，并在低温下贮藏了不同时间的菌种与常温下贮藏的本发明制做的菌种接入栽培养培养基中（栽培种培养基配方为：棉子壳86%，米糠13%，石膏1%，过磷酸钙1%）中。得到的栽培种接入出菇菌袋进行培养出菇（出菇菌袋培养基配方为：棉子壳90%，米糠8%，石膏1%，过磷酸钙1%），观察了出菇情况，结果见表3。

表3 传统低温贮藏菌种与本发明菌种生产的栽培种对产量的影响比较

表3中，生物转化率=三潮菇产量总和/菌袋培养料干种×100%。

从表3可以看出，传统固体种低温贮藏的菌种，在贮藏期为15-45天时，出菇袋的生物转化率为90-82%，贮藏期为60天时，出菇袋的生物转化率降为74%。本发表的菌种制做的栽培种所产生的出菇袋，在15-75天内，生物转化率均在88%以上。

（四）不同贮藏时间下的本发明菌种制成的栽培种接入栽培袋后对栽培袋出菇产量的影响

将不同贮藏期的本发明菌种接入栽培种培养基中（栽培种培养基配方为：棉子壳86%，米糠13%，石膏1%，过磷酸钙1%）中。得到的栽培种中接入出菇菌袋进行培养出菇（出菇菌袋培养基配方为：棉子壳90%，米糠8%，石膏1%，过磷酸钙1%），观察了出菇情况，结果见表4。

表4 不同贮藏时间下的本发明菌种生产的栽培种产量的影响比较

贮藏时间（月）	生物转化率（%）
		CK	83.4
1	90.3
		2	89.5
3	88.7
		4	85.2

5	84.4
		6	80.8
7	45.1
		8	_

表4中，生物转化率=三潮菇产量总和/菌袋培养料干种×100%；CK为传统方式低温贮藏1.5个月的菌种。

从表4可以看出，在贮藏期为1-6个月时，出菇袋的生物转化率为80-90%，贮藏期为7个月，出菇袋的生物转化率降为45.1%。

Claims (9)

1.海藻糖在延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命方面的应用。

2.一种延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基A，其特征在于每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、蔗糖20g、海藻糖10g，其余为水。

3.根据权利要求2所述的延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基A，其特征在于按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

4.一种延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基B，其特征在于每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、酵母粉0.25g、海藻糖30g，其余为水。

5.根据权利要求4所述的延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基B，其特征在于按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

6.一种延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基C，其特征在于每1000ml培养基中含有马玲薯200g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.5g、香蕉膏5.0g、酵母粉0.25g、海藻糖10g、蔗糖15g、麦芽糖5g，其余为水。

7.根据权利要求6所述的延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的培养基C，其特征在于按以下步骤配制：按质量称取马玲薯，加适量的水，加热至沸腾，然后小火保持沸腾10分钟，过滤去马玲薯渣，留滤液；将马玲薯滤液与其他各成份混合，加水定容，PH调至7.0。

8.一种延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将培养基A分装于250ml三角瓶，每瓶培养液100ml，120℃灭菌30分钟，灭菌后冷却至室温，接入大约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的固体母种，28℃室温下震荡培养，摇床摇速60次/分，培养时间120小时；

（2）将步骤（1）得到的培养物在4000转/分下离心5分钟，去掉上清液，用培养基B再悬浮菌丝体，再悬浮液体积为原培养液体积的1/3，摇床震荡培养6小时，然后4000转/分下离心5分钟，去掉上清液，获得的菌丝体沉淀物；

（3）将步骤（2）得到的菌丝体沉淀物平均分为5份，转移至无菌的聚丙烯塑料试管内，在低于30℃的室温下贮藏待用。

9.根据权利要求5所述的延长糙皮侧耳菌种贮藏寿命的方法，其特征在于还包括以下步骤：

（4）菌种使用之前，将步骤（3）得到的1份贮藏菌种加灭过菌的培养液C100ml，常温下震荡培养4小时，然后根据需要，接种于原种或栽培种上。