CN109914141A - 一种细菌纤维素提纯分离的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素纯化分离的方法，首先将培养出的细菌纤维素浸于去离子水中去除细菌纤维素内部的培养基，将细菌纤维素浸泡溶菌酶溶液中；通过加入乙二胺四乙酸或胰蛋白酶加快溶菌酶破坏细菌细胞壁；随后通过表面活性剂和超声处理加速细菌细胞膜破裂易于分离去除细菌残体；最后进行反复清洗得到纯化的细菌纤维素。本发明通过使用溶菌酶，制备出纯化的细菌纤维素，避免使用氢氧化钠或者碳酸钠等碱性物质带来的环境污染以及对细菌纤维素原位复合物中高分子材料结构和性能的影响，纯化后的细菌纤维素维持原有的三维形貌。本发明具有操作简便、成本低廉、缩短了纯化时间、绿色无污染和易实现规模化生产等优点。

Description

一种细菌纤维素提纯分离的方法

技术领域

本发明属于细菌纤维素提纯分离技术领域，它涉及一种细菌纤维素提纯分离的方法。

背景技术

纤维素可以由植物、动物以及微生物合成，其中由微生物发酵合成的纤维素称之为细菌纤维素。细菌纤维素是目前最细的天然纤维，与植物纤维素相比，细菌纤维素没有木质素、果胶和半纤维素等其它物质，所以细菌纤维素具有高的结晶度和优异的力学性能；此外，细菌纤维素有很强的持水能力和较好的生物相容性。这些众多的优点使其在生物医学领域具有广阔的应用前景。

由于由发酵获得细菌纤维素水凝胶中含有许多杂质和细菌的尸体，因此，发酵得到的细菌纤维素需要清洁处理，以彻底消除杂质和菌体。目前，细菌纤维素的纯化方式主要是先通过去离子水多次清洗(去除杂质)，热水中长时间浸泡处理后，再采用一定浓度的热碱溶液多次浸泡处理(去除菌体)。这种使用碱性溶液的方法不仅造成环境污染，而且能耗大。更为重要的是，热碱溶液多次浸泡处理会破坏绝大多数高分子材料的结构和性能(如明胶、胶原、丝素蛋白、聚氨酯、聚己内酯、聚乳酸等)，这使得人们无法采用原位复合的方法制备细菌纤维素与常用生物医用高分子材料的复合材料，从而严重影响其在生物医学领域的应用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种细菌纤维素提纯分离的方法，使用溶菌酶溶液对细菌纤维素进行清洁处理以除去木醋杆菌的菌体。这是因为溶菌酶可破坏细菌细胞壁，然后通过超声与表面活性剂结合的方式加速细菌细胞膜破裂易于分离去除细菌残体。通过此方法处理的细菌纤维素能够快速高效的除去细菌纤维素内部的细菌及其内毒素，并且操作简便，对环境友好，使得这种细菌纤维素的处理方法可在诸多领域得到应用。

为了解决上述技术问题，本发明提出一种细菌纤维素提纯分离的方法，在未使用碱性溶剂前提下，通过溶菌酶作用使其细菌的细胞壁分解、破裂，再经超声与表面活性剂处理加速细菌细胞膜破裂易于分离去除细菌残体并反复清洗以除去菌体获得无细菌及内毒素的细菌纤维素；具体实施步骤如下：

步骤1)：以pH为6.5的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液为溶剂，配制溶菌酶溶液，并与乙二胺四乙酸或胰蛋白酶溶液等体积均匀混合配制成溶菌酶混合溶液，备用；其中，溶菌酶溶液的质量体积浓度为0.5g/L，乙二胺四乙酸溶液的质量体积浓度为1.0g/L，或是胰蛋白酶质量浓度为2.5％；

步骤2)：将培养3-5天的细菌纤维素水凝胶取出，浸泡在去离子水中10-12h，更换去离子水，反复多次，直至细菌纤维素内部培养基和杂质被去离子置换出来；

步骤3)：将步骤2)处理后的细菌纤维素水凝胶浸泡在步骤1)制得的溶菌酶混合溶液中，其中，细菌纤维素与溶菌酶混合溶液的质量体积浓度为0.05-0.25g/mL；置于摇床进行振荡，摇床转速范围为100-200r/min，温度为30-40℃，浸泡振荡时间为3-12h；

步骤4)：将步骤3)获得的细菌纤维素水凝胶浸泡在表面活性剂中进行超声，超声时间为3-6h，超声功率为100-300W；

步骤5)：将步骤4)获得的细菌纤维素水凝胶多次清洗，去除细菌纤维素内部残留的表面活性剂，制备出纯化的细菌纤维素水凝胶。

本发明中，所述表面活性剂包括但不限于Triton X-100、TWEEN-20、Span-80及烷基糖苷中的一种。

与现有纯化方法相比，该方法实现了在未使用碱性溶剂前提下，通过溶菌酶及表面活性剂辅以超声的方法将细菌纤维素进行快速纯化分离，所获产物与碱性溶剂处理的细菌纤维素相同，并且不会破坏细菌纤维素的内部结构。此外，该方法具有操作简便、耗时较短、对设备没有特定要求、成本较低以及环境友好的优点。本发明的方法能够缩短细菌纤维素的纯化时间，简化细菌纤维素纯化步骤，使细菌纤维素在许多研究领域能够被研究工作者加以利用。

附图说明

图1(a)是未处理的培养3天的细菌纤维素水凝胶的SEM照片；

图1(b)是溶菌酶处理6h后的细菌纤维素水凝胶的SEM照片；

图1(c)是经过表面活性剂和超声处理后的细菌纤维素水凝胶的SEM照片；

图1(d)是清洗纯化后的细菌纤维素的SEM照片。

具体实施方式

本发明的设计思路是，提出一种在未使用碱性溶剂的前提下对细菌纤维素进行纯化处理，过程简便绿色的方法。本发明使用溶菌酶及表面活性剂辅以超声相结合的方法对细菌纤维素进行提纯分离，该方法包含以下步骤：首先将培养出的细菌纤维素浸于纯水中去除细菌纤维素内部的培养基，将细菌纤维素浸泡溶菌酶溶液中；通过加入EDTA或胰蛋白酶加快溶菌酶破坏细菌细胞壁，随后通过表面活性剂和超声处理细菌纤维素内部的细菌残体分离出来；最后进行反复清洗得到纯化的细菌纤维素。

本发明通过使用溶菌酶，制备出纯化的细菌纤维素，避免使用氢氧化钠或者碳酸钠等碱性物质带来的环境污染以及对细菌纤维素原位复合物中高分子材料结构和性能的影响，所制备的细菌纤维素维持原有的三维形貌。此外，本发明具有操作简便、成本低廉、缩短了纯化时间、绿色无污染和易实现规模化生产等优点，

下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细描述，所描述的具体实施例仅对本发明进行解释说明，并不用以限制本发明。

实施例1、

一种细菌纤维素提纯分离的方法，包括以下步骤：

步骤1)：称量1.212g三羟甲基氨基甲烷(Tris)粉末配置1000mL 0.1M的Tris溶液，使用HCl溶液调节pH至6.5，加入溶菌酶粉末配制成质量体积浓度为0.5g/L的溶菌酶溶液；配制1000mL质量体积浓度为1.0g/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液；将上述溶菌酶溶液和EDTA溶液等体积均匀混合后，即得溶菌酶-EDTA混合溶液；

步骤2)：将培养3天的细菌纤维素水凝胶(如图1(a)所示)取出，浸泡在去离子水中12h。更换去离子水，反复多次，直至细菌纤维素内部培养基被去离子置换出来，细菌纤维素水凝胶呈现白色不透明的状态；

步骤3)：将步骤2)处理后的细菌纤维素水凝胶，按照细菌纤维素与溶菌酶-EDTA混合溶液的质量体积浓度为0.10g/mL浸泡在步骤1)制得的所述溶菌酶-EDTA混合溶液中；进行摇床振荡，转速为100r/min，温度为35℃，浸泡振荡时间为3h；

步骤4)：将步骤3)获得的细菌纤维素水凝胶(如图1(b)所示)浸泡在质量浓度为0.1％的Triton X-100的表面活性剂中进行超声处理，超声功率是100W，超声时间6h；

步骤5)：将步骤4)获得的细菌纤维素水凝胶(如图1(c)所示)经多次清洗，去除细菌纤维素内部残留的表面活性剂，制备出纯化的细菌纤维素水凝胶。图1(d)示出了纯化后的细菌纤维素的SEM照片。

实施例2、

一种细菌纤维素提纯分离的方法，包括以下步骤：

步骤1)：称量1.212g三羟甲基氨基甲烷(Tris)粉末配置1000mL 0.1M的Tris溶液，使用HCl溶液调节pH至6.5，加入溶菌酶粉末配制成质量体积浓度为0.5g/L的溶菌酶溶液；配制质量浓度为2.5％的胰蛋白酶溶液，将上述溶菌酶溶液和胰蛋白酶溶液等体积均匀混合后，即得溶菌酶-胰蛋白酶混合溶液；

步骤2)：将培养4天的细菌纤维素水凝胶取出，浸泡在去离子水中10h。更换去离子水，反复多次，直至细菌纤维素内部培养基被去离子置换出来，细菌纤维素水凝胶呈现白色不透明的状态；

步骤3)：将步骤2)处理后的细菌纤维素水凝胶，按照细菌纤维素与溶菌酶-胰蛋白酶混合溶液的质量体积浓度为0.05g/mL浸泡在步骤1)制得的溶菌酶-胰蛋白酶混合溶液中，并进行摇床振荡，转速为150r/min，温度为30℃，浸泡振荡时间为4h；

步骤4)：将步骤3)获得的细菌纤维素水凝胶浸泡在质量浓度为0.1％的TWEEN-20中进行超声处理，超声功率是200W，超声时间4h；

步骤5)：将步骤4)获得的细菌纤维素水凝胶用去离子水清洗，去除细菌纤维素内部残留的表面活性剂，制备出纯化的细菌纤维素水凝胶。

实施例3

一种细菌纤维素提纯分离的方法，包括以下步骤：

步骤1)：按照实施例1的方法制备溶菌酶-EDTA混合溶液，备用；

步骤2)：将培养5天的细菌纤维素取出，浸泡在去离子水中12h。更换去离子水，反复多次，直至细菌纤维素内部培养基被去离子置换出来，细菌纤维素水凝胶呈现白色不透明的状态；

步骤3)：将步骤2)处理后的细菌纤维素水凝胶，按照细菌纤维素与溶菌酶-EDTA混合溶液的质量体积浓度为0.25g/mL浸泡在步骤1)制得的所述溶菌酶-EDTA混合溶液中；并进行摇床振荡，转速为200r/min，温度为40℃，浸泡时间为12h，

步骤4)：将步骤3)获得的细菌纤维素水凝胶浸泡在质量浓度为0.1％的Span-80中进行超声处理，超声功率是300W，超声时间3h；

步骤5)：将步骤4)获得的细菌纤维素水凝胶用去离子水清洗，去除细菌纤维素内部残留的表面活性剂，制备出纯化的细菌纤维素水凝胶。

综上，本发明细菌纤维素提纯分离的方法中，在细菌纤维素与溶菌酶混合溶液的质量体积浓度低于0.1g/mL时，随着体积浓度的增加，对细菌细胞壁的处理效果显著增加；当细菌纤维素与溶菌酶混合溶液的质量体积浓度高于0.1g/mL时，随着体积浓度的增加，对细菌细胞壁的处理效果不明显。

尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (3)

1.一种细菌纤维素纯化分离的方法，其特征在于，该方法在未使用碱性溶剂的前提下对细菌纤维素进行纯化分离处理，通过溶菌酶作用使其细菌的细胞壁分解、破裂，再经表面活性剂辅以超声处理加速细菌细胞膜破裂易于分离去除细菌残体，最后，经反复清洗除去菌体获得无细菌及内毒素的细菌纤维素。

2.根据权利要求1所述细菌纤维素纯化分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：以pH为6.5的三羟甲基氨基甲烷溶液为溶剂，配制溶菌酶溶液，并与乙二胺四乙酸或胰蛋白酶溶液等体积均匀混合配制成溶菌酶混合溶液，备用；其中，溶菌酶溶液的质量体积浓度为0.5g/L，乙二胺四乙酸溶液的质量体积浓度为1.0g/L，或是胰蛋白酶质量浓度为2.5％；

步骤2)：将培养3-5天的细菌纤维素水凝胶取出，浸泡在去离子水中10-12h，更换去离子水，反复多次，直至细菌纤维素内部培养基和杂质被去离子置换出来；

步骤3)：将步骤2)处理后的细菌纤维素水凝胶浸泡在步骤1)制得的溶菌酶混合溶液中，其中，细菌纤维素与溶菌酶混合溶液的质量体积浓度为0.05-0.25g/mL；置于摇床进行振荡，摇床转速范围为100-200r/min，温度为30-40℃，浸泡振荡时间为3-12h；

步骤4)：将步骤3)获得的细菌纤维素水凝胶浸泡在表面活性剂中进行超声使细菌细胞膜破解充分，超声时间为3-6h，超声功率为100-300W；

步骤5)：将步骤4)获得的细菌纤维素水凝胶多次清洗，去除细菌纤维素内部残留的表面活性剂，制备出纯化的细菌纤维素水凝胶。

3.根据权利要求1或2所述细菌纤维素纯化分离的方法，其特征在于，所述表面活性剂包括但不限于Triton X-100、TWEEN-20、Span-80及烷基糖苷中的一种。