CN103233049B

CN103233049B - 一种利用出芽短梗霉突变株发酵生产木糖醇的方法

Info

Publication number: CN103233049B
Application number: CN201310170056.7A
Authority: CN
Inventors: 陈叶福; 肖冬光; 李军侠; 郭学武; 张翠英; 董健; 杜丽平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: CN103233049A

Abstract

本发明公开了一株耐高渗出芽短梗霉，及利用该菌株生产木糖醇的方法。所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)EK13于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.7153。该菌株能以木糖或木糖母液为碳源发酵生产木糖醇，并且没有任何副产物。利用该菌株发酵生产木糖醇，实现了可再生资源半纤维素（木糖）的充分利用，提高了木糖的利用率，为木糖的高效利用开辟了新道路。

Description

一种利用出芽短梗霉突变株发酵生产木糖醇的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株耐高渗出芽短梗霉生产木糖醇。

背景技术

木糖醇(Xylitol)，又称戊五醇，是一种五碳糖醇，其分子式为C₅H₁₂O₅，分子量152.15。木糖醇的理化性质类似于蔗糖，甜度在0.65～1.05之间，与蔗糖的1.0相当;它是糖醇中最甜的一种，入口后无杂味，清凉似薄荷；溶于水，热值为16.79J/g，低于蔗糖，是一种低能量甜味剂，热稳定性好；广泛存在于各种果蔬中，如草毒、葛芭、青梅、菠菜和蘑菇等，但含量仅为0.014-0.09mg/100g；桦木、按树、玉米芯、甘蔗渣、稻壳等富含多缩戊糖植物原料是其良好来源。木糖醇所具有的这些特性，使它广泛应用于食品、医药、皮革、化工等众多领域，发展前景十分广阔，备受国内外的重视。

根据已有的研究发现，酵母菌是比较容易将木糖转化生成木糖醇的菌株。常见的产木糖醇较优越的菌株主要集中在Candida属（假丝酵母属），如C.guilliermondii，C.tropicalis，C.monii，C.parasilosis；部分属于Debaryomyces属（德巴利酵母属），如D.hansenii和Pachysolen（管囊酵母属），如P.tannophilus。这些酵母菌主要是在其体内木糖还原酶的作用下，以NADPH或NADH为辅酶，将D-木糖还原为木糖醇。由于酵母具有耐高渗环境的优良特性，适合于在高浓度糖的条件下生长，所以耐高渗酵母是生产木糖醇的理想菌种，有研究发现随着木糖浓度的增加，木糖醇的产生速率也随之增加。

中国专利申请200910092915.9公开了一种木糖醇的制备方法，发明涉及一种木糖醇的制备方法,包括如下步骤:将经过培养的木糖醇酵母菌种接种到发酵罐中的发酵培养基中培养,进行有氧、微氧两段组合发酵,发酵过程中分段控温,在溶解氧需求上采取分段调控的手段,使得木糖醇生产菌种在微好氧状态下代谢产生木糖醇。本发明的木糖醇制备方法采用分段通风和高温发酵,节约了无菌空气和冷却水用量,降低了成本;生产过程简单、安全、节能;并且避免了传统方法中的镍催化剂的使用,保护了环境。

中国专利申请：200910087819.5，名称为一种利用木糖母液生产木糖醇和L-阿拉伯糖的方法。发明涉及一种利用木糖母液生产木糖醇和L-阿拉伯糖的方法,其利用木糖醇生产菌种发酵木糖母液,然后去除发酵液中的菌体、色素和杂质后浓缩结晶,获得木糖醇晶体和木糖醇母液,其中木糖醇母液经色谱系统分离得到L-阿拉伯糖相,L-阿拉伯糖相浓缩结晶能够得到L-阿拉伯糖晶体。本发明方法充分利用工业废弃物木糖母液为原料同时生产木糖醇和L-阿拉伯糖,首先利用木糖母液中的木糖和葡萄糖发酵合成木糖醇,不仅增加了生产木糖醇的产量,也能够降低从中分离L-阿拉伯糖的难度。本发明方法原材料来源广泛且价格低廉,因此节约资源且生产成本低,同时能够降低工业废弃物所造成的环境污染。

木质纤维原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，木质纤维资源的转化利用已成为必然趋势。半纤维素占木质纤维原料的20%-35%，其水解液中的主要单糖为木糖，它是自然界中含量仅次于葡萄糖的单糖，因此寻找木糖发酵的天然微生物和选育高效的木糖发酵菌株成为了研究热点。迄今为止已发现一百多种微生物能代谢木糖,包括细菌、真菌和酵母菌，主要用来生产燃料乙醇。

本发明以能够代谢木糖并能生产木糖醇的出芽短梗霉为出发菌株，经过诱变筛选得到了一株能够利用木糖有效生产木糖醇的突变株，实现了可再生源资源半纤维素（木糖）的充分利用，为木糖的有效利用开辟了新途径。。

发明内容

本发明提供了一株出芽短梗霉发酵生产木糖醇的方法，该菌株可发酵木糖有效生产木糖醇。

本发明的技术方案：

所述应用出芽短便霉EK13生产木糖醇的方法，具体步骤为：

（1）制备种子液：斜面菌种培养获得种子液；

（2）发酵培养：以5～15%的接种量，接入木糖发酵培养基发酵，木糖发酵培养基以木糖为主要碳源。

摇床发酵条件为：装液量10-30%、摇床转速140～180r/min、温度26～32℃、发酵时间为96～144h。

发酵罐发酵条件为：装液量20-60%、溶氧为55%～75%、温度26～32℃、pH值5～8的条件下培养24～96h。

所述种子培养基的组成为：木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

所述木糖发酵培养基的组成为：木糖（80～160）g/L、酵母浸粉（2～8）g/L、脲素（0.5～1.5）g/L、(NH₄)₂SO₄（1～3）g/L。

所述发酵培养基优选使用木糖母液培养基，组成为：以木糖母液替换发酵培养基中的木糖，所述木糖母液组成成份如下：木糖35-40%，阿拉伯糖8-16%，半乳糖9-15%，葡萄糖8-11%，其余为水；稀释至木糖母液培养基中的总糖含量为50g/L。

木糖母液是木糖生产的下脚料，木糖母液为木糖生产过程中木糖结晶后留下的废液。

一株耐高渗出芽短梗霉EK13，所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)EK13，保藏于2013年1月18日，该菌株可发酵木糖生产木糖醇。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.7153。

耐高渗出芽短便霉EK13利用木糖发酵后木糖醇产量达到12g/L-63g/L,木糖转化为木糖醇的转化率达到18-73%。

本发明的优点和有益效果：

本发明通过紫外诱变结合耐高渗特性筛选得到耐高渗、木糖醇产量提高的出芽短梗霉突变株EK13，并且通过发酵培养基和发酵条件优化，有效提高了该突变株以木糖为碳源时的木糖醇产量。应用本发明菌种可将木糖有效转化为木糖醇，木糖和木糖母液摇瓶发酵木糖醇产量分别可达到63.42g/L和14.31g/L,转化率分别为73.26%和21.45%；5L发酵罐木糖和木糖母液发酵木糖醇产量分别可达到49.34g/L和12.46g/L,转化率分别为61.75%和18.43%。本发明为木糖的有效利用开辟了新途径，也为木糖醇生产开发提供了新原料，可有效提高木质纤维素生物转化过程的原料利用率。

具体实施方式

实施例1：耐高渗、可利用木糖生产赤藓糖醇的出芽短梗霉突变株EK13的诱变筛选

以能利用木糖的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)CGMCC3.00837为出发菌株，选择致死率为85%的紫外诱变剂量（照射240s）对出芽短梗霉进行诱变，将诱变后的菌液均匀涂布于含有30g/L木糖的高渗平板上，30℃避光培养2～3d后挑选生长快、菌落大的单菌落点接于TTC固体平板上，最后获得120株颜色比较深的突变株，命名为EK1～EK120。将突变株进行木糖醇发酵实验，发酵144h后测定发酵液中木糖醇含量，与出发株做对照，得到一株木糖醇产量明显提高的突变株EK13，木糖醇产量较出发菌株提高了1倍；转化率提高37.71%，结果见表1。

表1：木糖醇高产突变株与出发菌株的对比

表2:出发菌株和突变株EK13木糖耐受情况

“+++”表示生长良好；“++”表示生长一般；“+”表示生长较弱；“－”表示不生长

实施例2：木糖和木糖母液摇瓶发酵

以突变株EK13为实验菌株，以木糖为碳源，通过培养基和发酵条件优化，得到较化木糖发酵培养基1为：木糖120g/L、酵母浸粉5g/L、脲素1g/L、(NH₄)₂SO₄2g/L，0.1MPa灭菌15min；优化发酵条件为：接种量10%，装液量50mL/250mL，摇床转速180r/min，温度30℃，pH值6.5，培养时间为144h。木糖发酵培养基2的制备方法如下：将木糖母液稀释4倍左右，使其木糖浓度为121g/l，同时含有葡萄糖44g/L、阿拉伯糖46g/L、半乳糖18g/L，按照所述木糖发酵培养基1的组成，添加除木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖之外的其他培养基成分。木糖母液为木糖生产工厂山东龙力提供或在依据现有技术制备木糖母液。

从活化斜面上挑取一环EK13菌体接种至装有50mL一级种子培养基的250mL三角瓶中培养，30℃180r/min摇床培养12h，得一级种子液。将一级种子液以10%的接种量，接入二级种子培养基中，30℃、180r/min摇床培养10h，得二级种子液；一、二级种子培养基组成为：木糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L。种子液以10%接种量，接入上述木糖和木糖母液发酵培养基中，30℃180r/min摇瓶发酵，培养144h，结果见表3。

表3突变株EK13摇瓶发酵实验结果

由表3可知，突变株EK13能够高效利用木糖生产木糖醇，虽然还有少量木糖没有被利用，但相比于其它生产木糖醇的菌株来说木糖的利用率还是比较高的，下一步可对该菌株进行进一步研究，提高其木糖利用率，使更多的木糖能够转化为木糖醇。

实施例3：5L发酵罐发酵

在摇瓶发酵的基础上，通过5L发酵罐进行EK13木糖发酵产木糖醇实验，考察了发酵罐培养中木糖醇生产和菌体生物量情况。种子培养基和种子培养方法，木糖液发酵培养基组成与实施例2中相同。

5L发酵罐发酵条件具体为：发酵罐装液量为罐容的60%，接种量10%，初始pH值为6.5，发酵温度为30℃，溶氧为60%，发酵96h。间隔一定时间取样，测定木糖醇产量、残糖量和生物量，结果见表4。

表4突变株EK135L罐发酵实验结果

在5L的罐上，木糖和木糖母液发酵木糖醇产量和转化率相对于摇瓶均比较稳定，产物形成时间缩短，菌体生长较快，为后续研究奠定了基础。

Claims

1.一种应用出芽短梗霉EK13生产木糖醇的方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)种子培养：斜面菌种接入种子培养基进行逐级培养获得种子液；

(2)发酵培养：以5～15％的接种量，接入木糖发酵培养基发酵，木糖发酵培养基以木糖为主要碳源；所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan)EK13，保藏编号为CGMCC No.7153；所述木糖发酵培养基的组成为：木糖80～160g/L、酵母浸粉2～8g/L、脲素0.5～1.5g/L、(NH₄)₂SO₄1～3g/L。

2.根据权利要求1所述应用出芽短梗霉EK13生产木糖醇的方法，其特征在于，所述发酵条件为：摇瓶装液量10-30％、摇床转速140～180r/min、温度26～32℃、发酵时间96～144h。

3.根据权利要求1所述应用出芽短梗霉EK13生产木糖醇的方法，其特征在于，所述发酵条件为：发酵罐装液量20-60％、溶氧55％～75％、温度26～32℃、pH值5～8的条件下培养24～96h。

4.根据权利要求1-3所述应用出芽短梗霉EK13生产木糖醇的方法，其特征在于，所述发酵培养基使用木糖母液培养基，组成为：以木糖母液替换发酵培养基中的木糖，所述木糖母液组成成份如下：木糖35-40％，阿拉伯糖8-16％，半乳糖9-15％，葡萄糖8-11％，其余为水；稀释至木糖母液培养基中的总糖含量为50g/L。