CN103255067B

CN103255067B - 一株利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉及其应用

Info

Publication number: CN103255067B
Application number: CN201310173920.9A
Authority: CN
Inventors: 陈叶福; 肖冬光; 郭建; 郭学武; 张翠英; 董健; 杜丽平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2013-05-10
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2033-05-10
Also published as: CN103255067A

Abstract

本发明公布了一株利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉及其生产方法。本发明以出芽短梗霉为出发菌株，经紫外诱变，得到高产普鲁兰糖且分泌色素较少的突变菌株。所述出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)突变菌株AY82于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.7154。该菌株能利用木糖发酵生产普鲁兰糖，且普鲁兰糖产量较高，木糖发酵培养基摇瓶培养七天后普鲁兰糖产量达到16.61g/L，5L发酵罐培养七天后产量达到16.23g/L。研究出芽短梗霉利用木糖产普鲁兰糖，能够为木糖的合理利用提供新思路，能够有效提升其附加值。

Description

一株利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉及其应用

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株利用木糖产普鲁兰糖的出芽短梗霉及其应用。

背景技术：

普鲁兰糖是出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)产生的一种无支链胞外同聚多糖，它是由α-(1，4)和α-(1，6)糖苷键构成的麦芽三糖不断聚合而成的。规整的化学结构赋予普鲁兰糖独特的性质，它的结构富有韧性且易溶于水。普鲁兰糖可以作为增稠剂，少量的普鲁兰糖溶解在水中，便能产生很大粘度。普鲁兰糖制成的透明薄膜防油并且不能透过氧气，良好的性能使它可以用作食品和药品的包衣及可降解包装材料。普鲁兰糖还能替代淀粉作为一种低卡路里食品，也能作为化妆品乳剂使用。普鲁兰糖是一种极具应用前景的微生物胞外多糖。

木糖作为一种巨大的潜在资源，引起了研究者们的极大关注。已有报道利用木糖生产乙醇、木糖醇、丁醇等产物。然而，微生物利用木糖效率普遍不高，这些产物的产率也较低。研究出芽短梗霉利用木糖生产普鲁兰糖能为木糖的合理利用提供了一种新的路径。目前，出芽短梗霉生产普鲁兰糖主要利用蔗糖和葡萄糖，未见利用木糖生产普鲁兰糖的报道。木糖在自然界中是以各种各样的形式存在着的，例如木糖母液和木质纤维素中就含有较为可观的木糖。

酸处理甘蔗渣或玉米芯的水解液，经两到三轮的浓缩、冷却，分离出木糖结晶体后的液体称为木糖母液。木糖母液中35～40％的成分为木糖，此外，还有少量的葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。中国每年产生超过5万吨木糖母液，研究如何更好的利用这些廉价的富含木糖成分的液体具有深远的意义。采用物理方法将木糖母液中的各组份分离后加以利用，工序复杂且成本较高。相比较而言，生物分离或者生物转化的方法更具优势。

木质纤维素在自然界中存在广泛，它主要包含纤维素、半纤维素、木质素三类物质。它是地球上储存量最大的可再生资源，但木质纤维素的合理利用却一直是个难题。现今，只有少量的木质纤维素原料被用于造纸及化工等行业，大多数都被直接焚烧或者丢弃。木糖作为半纤维素水解物的主要产物，是整个木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的糖类物质。

这些广泛存在的资源可以通过微生物的作用，转化为更具价值的物质。普鲁兰糖在各行业应用很广，具有很高的商业价值。因而，研究出芽短梗霉利用木糖产普鲁兰糖就显得很有必要，它能够为木糖的合理利用提供新思路，能够有效提升其附加值。

发明内容：

本发明提供了一株出芽短梗霉菌株，该菌株能够利用木糖或木糖母液或半纤维素水解液有效生产普鲁兰糖。

本发明的技术方案如下：

一株利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉AY82(Aureobasidium PullulanAY82)，所述出芽短梗霉AY82于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.7154，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

所述出芽短梗霉AY82，能以木糖为碳源发酵生产普鲁兰糖，摇瓶发酵产量达到16.61g/L，5L发酵罐发酵产量达到16.23g/L。

一种应用上述出芽短梗霉AY82生产普鲁兰糖的方法，包括如下步骤：

种子液的制备：斜面菌种经转接培养获得种子液；

发酵培养：将种子液接入发酵培养基中发酵培养；发酵培养在摇瓶或发酵罐中进行；所述发酵培养基以木糖为主要碳源，添加其他氮源和微量元素组成。

所述发酵培养基组成为：木糖40～80g/L、(NH₄)₂SO₄0.8～1.2g/L、K₂HPO₄4～6g/L、MgSO₄·7H₂O0.2～0.4g/L、NaCl2～4g/L、酵母浸粉0.6～1.0g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述摇瓶发酵还可以用木糖母液培养基，组成为：以木糖母液替换发酵培养基中的木糖，所述木糖母液组成成份如下：木糖35-40％，阿拉伯糖8-16％，半乳糖9-15％，葡萄糖8-11％，其余为水；稀释至木糖母液培养基中的总糖含量为50g/L。

所述摇瓶发酵还可以用半纤维素水解液培养基，组成为：以半纤维素水解液替换发酵培养基中的木糖，所述半纤维素水解液组成成份如下：木糖70％，葡萄糖12％，阿拉伯糖7％，其余为水；浓缩至半纤维素水解液培养基中的总糖含量为50g/L。

摇瓶发酵条件为：发酵培养基装量20％，接种量6～10％，摇床转速180～240r/min，温度26～30℃，初始pH6.0～6.5，发酵时间为144～168h。

发酵罐发酵条件为：接种量6～8％，发酵培养基装量60～70％，培养温度26～28℃，转速200～300r/min，通气量1.0～1.5vvm，pH控制在5.5±0.1，罐压0.03Mpa，培养7d结束发酵。

本发明所述出芽短梗霉AY82可应用于发酵生产普鲁兰糖。

有益效果：

第一，通过紫外诱变，在高浓度木糖培养基上筛得一株利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉，该菌株产色素较少，利于多糖的分离纯化。第二，经傅里叶红外光谱分析，证实分离纯化的多糖为普鲁兰糖。第三，利用本发明菌种，木糖摇瓶培养七天后普鲁兰糖产量达到16.61g/L，木糖发酵培养基5L发酵罐培养七天后产量达到16.23g/L，木糖母液摇瓶发酵普鲁兰糖产量为6.73g/L，半纤维素水解液摇瓶发酵普鲁兰糖产量为9.25g/L。研究出芽短梗霉利用木糖产普鲁兰糖，能够为木糖的合理利用提供新思路，能够有效提升其附加值。

附图说明：

图1为普鲁兰糖的红外光谱图。

其中，A为普鲁兰糖标品，B为出芽短梗霉AY82利用木糖产的普鲁兰糖。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉突变菌株筛选

以出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)CGMCC3.00837为出发菌株，选择致死率为82.4％的紫外诱变剂量(照射5min)对出芽短梗霉进行诱变，将诱变后的菌液稀释后均匀涂布于高浓度木糖平板(木糖浓度100g/L)上，30℃避光培养4-5d后挑取突变株。将突变株进行摇瓶发酵实验复筛，发酵168h后测定普鲁兰糖生成量，与出发株做对照，得到一株利用木糖高产普鲁兰糖的突变菌株AY82，普鲁兰糖产量较出发菌株有大幅提升，发酵结果见表1。

表1突变菌株AY82与出发菌株普鲁兰糖生成量比较

实施例2：木糖培养基摇瓶发酵

以突变株AY82为实验菌株，以木糖为碳源，通过培养基和发酵条件优化，得到优化的木糖发酵培养基为：木糖50g/L、(NH₄)₂SO₄1.2g/L、K₂HPO₄6g/L、MgSO₄·7H₂O0.4g/L、NaCl2g/L、酵母浸粉1.0g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min；优化的发酵条件为：接种量8％，摇床转速200r/min，温度28℃，初始pH值6.5，培养时间为168h。

从活化斜面上挑取一环AY82菌体接种至装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中培养，28℃、200r/min摇床培养24～48h，得种子液。种子培养基组成为：木糖20g/L、(NH₄)₂SO₄1.0g/L、K₂HPO₄4g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L、NaCl4g/L、酵母浸粉2.0g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。种子液以8％接种量接入上述木糖发酵培养基中，28℃、200r/min摇瓶发酵，培养168h，发酵结果见表2。

所述活化斜面培养基为：木糖20g/L、酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，pH5.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

表2AY82木糖培养基发酵结果

实施例3：木糖母液培养基摇瓶发酵

种子液的制备和摇瓶发酵条件基本同实施例2。

发酵培养基组分为：木糖母液(木糖35-40％，阿拉伯糖8-16％，半乳糖9-15％，葡萄糖8-11％)稀释至培养基中总糖含量为50g/L、(NH₄)₂SO₄1.2g/L、K₂HPO₄6g/L、MgSO₄·7H₂O0.4g/L、NaCl2g/L、酵母浸粉1.0g/L，初始pH6.5。121℃高压蒸汽灭菌20min。发酵结果见表3。

表3AY82木糖母液培养基发酵结果

实施例4：半纤维素水解液摇瓶发酵

种子液的制备和摇瓶发酵条件基本同实施例2。

发酵培养基组分为：半纤维素水解液(木糖70％，葡萄糖12％，阿拉伯糖7％)浓缩至培养基中总糖含量为50g/L、(NH₄)₂SO₄1.2g/L、K₂HPO₄6g/L、MgSO₄·7H₂O0.4g/L、NaCl2g/L、酵母浸粉1.0g/L，初始pH6.5。121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述半纤维素水解液的制备方法为：将甘蔗渣粉碎至粒径30目左右，按固液比1∶12(质量∶体积)加入0.7％的NaOH，于40℃条件下处理2h。过滤除去废液，将固形物清洗至中性后烘干。烘干后的粉末按同样的固液比加入柠檬酸缓冲溶液、0.01％的吐温80和20％～30％的木聚糖酶并在50℃下酶解60h，即得半纤维素水解液。其中，柠檬酸缓冲液配制方法为：取11.468g一水柠檬酸和32.54g Na₂HPO₄溶于蒸馏水中，并定容至1L，调pH至4.8±0.05备用。

结果见表4。

表4AY82半纤维素水解液培养基发酵结果

实施例5：5L发酵罐木糖发酵

种子培养基组成为：木糖20g/L、(NH₄)₂SO₄1.0g/L、K₂HPO₄4g/L、MgSO₄·7H₂O0.2g/L、NaCl4g/L、酵母浸粉2.0g/L，初始pH6.0。121℃高压蒸汽灭菌20min。

发酵培养基组成为：木糖50g/L、(NH₄)₂SO₄1.2g/L、K₂HPO₄6g/L、MgSO₄·7H₂O0.4g/L、NaCl2g/L、酵母浸粉1.0g/L。121℃高压蒸汽灭菌20min。

种子液培养：从活化斜面上挑取一环AY82菌体接种至装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中培养，28℃、200r/min摇床培养24～48h，作为一级种子。将一级种子按8％接种量接入装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，28℃、200r/min摇床培养24～48h，作为二级种子。

5L发酵罐发酵：将二级种子按8％接种量接入到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，培养温度28℃，转速300r/min，通气量1.5vvm，pH控制在5.5±0.1，罐压0.03Mpa，培养7d结束发酵，普鲁兰糖产量为16.23g/L。

Claims

1.一株利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉AY82，其特征在于，所述出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)AY82，保藏编号为CGMCC No.7154；所述出芽短梗霉AY82能以木糖为碳源发酵生产普鲁兰糖，摇瓶发酵产量达到16.61g/L，5L发酵罐发酵产量达到16.23g/L。

2.如权利要求1所述的一株利用木糖高产普鲁兰糖的出芽短梗霉AY82在发酵生产普鲁兰糖中的应用。