CN116832151A - 一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其产品和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其产品和应用，所述纳米颗粒佐剂包括壳聚糖和免疫激活剂，对壳聚糖进行季铵化修饰以及对卷曲乳杆菌胞外多糖进行硫酸化修饰，将硫酸化卷曲乳杆菌胞外多糖作为物理交联剂加入季铵化壳聚糖搅拌混合。本发明合成的纳米颗粒佐剂，其表面能够高效吸附装载抗原，实现了抗原和疫苗佐剂的共同递送，显著提高抗原的免疫原性，有效减少抗原的使用量。同时纳米颗粒佐剂显著提高机体细胞免疫和体液免疫水平，诱导产生更高水平的特异性抗体，提高疫苗保护效果。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其产品和应用。
背景技术
近年来，随着生物纳米材料技术飞速发展和新型疫苗佐剂平台的迅速开发，纳米递送系统凭借高效安全和可修饰性的优势成为十分有潜力的新型疫苗佐剂。目前常用的佐剂包括铝佐剂与油包水佐剂等，这些传统佐剂虽然能诱导体液免疫但却无法有效诱导细胞免疫应答，导致免疫增强效果有限。而与传统佐剂相比纳米佐剂的优势体现在纳米尺寸效应、携载抗原能力、抗原缓释和可修饰性方面，能够快速的诱导抗体产生并维持更长的免疫持续期，同时有效地促进机体细胞免疫应答的产生，从而增强免疫效果。
纳米颗粒作为纳米递送系统中的一种，能够通过修饰吸附或包埋抗原，实现缓释、靶向等多种功能，在提高机体体液免疫的同时通过激活抗原呈递细胞和淋巴细胞提高细胞免疫水平从而增强抗原免疫原性，获得更强的免疫应答效果和抗体水平。目前作为抗原递送系统的纳米颗粒主要包括脂质体、金属纳米粒子、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、多糖类物质等。
在众多纳米颗粒材料中，多糖类物质来源广泛易得、成本低廉、生物安全性高、易于修饰，常用于纳米递送系统的构建。壳聚糖作为一种天然阳离子多样，具有良好的生物相容性，通过对其进行季铵化修饰可以进一步提高壳聚糖的水溶性，并且引入电荷以提高其生物功能。多糖可促进免疫调节，具有多靶点、多功能和多因子效应，作为疫苗佐剂具有广泛的应用前景。多糖的化学成分、结构和构象在很大程度上决定其生物活性，通过修饰改变其结构和构象能够增强其生物活性。硫酸化修饰后的多糖聚阴离子特性显著增强，可显示出强负电荷特征并能够显著提高与阳离子和细胞膜结合的能力。目前，已有多糖作为佐剂的相关研究，但仍存在很多问题，例如佐剂成分复杂、水溶性差、免疫增强效果参差不齐等。这些问题导致了多糖佐剂制作和保存运输成本高，且在临床使用时免疫增强效果并不理想。因此，亟需研制一种新型、高效的佐剂，能有效激活细胞免疫及体液免疫，提高抗体水平，为机体提供安全稳定、强大的免疫保护。
发明内容
本发明的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖来自于卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529菌种，该菌种为已公开菌种，其保藏编号为GDMCCNO.62094，记载于专利文献CN114891657A中。
本发明的目的是提供一种纳米颗粒佐剂的制备方法及其应用，通过对壳聚糖进行季铵化修饰以及对卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖进行硫酸化修饰，通过季铵化壳聚糖与硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖自组装形成纳米颗粒，该纳米颗粒能有效吸附装载抗原，从而实现了抗原和疫苗佐剂的共同递送。该纳米颗粒佐剂能够高效诱导体液免疫与细胞免疫应答，显著提高血清中特异性抗体的滴度。
一方面，本发明提供一种纳米颗粒佐剂的制备方法，包括壳聚糖和免疫刺激剂，上述免疫刺激剂为卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖，壳聚糖与卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖自组装形成纳米颗粒，本发明上述自组装形成纳米颗粒的方法包含：
对壳聚糖进行季铵化修饰，同时对卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖进行硫酸化修饰，将得到的硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖作为物理交联剂，将季铵化修饰的壳聚糖滴加于硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖溶液中，20℃混合30min，即得自组装纳米颗粒。优选地，上述季铵化修饰的壳聚糖溶液中季铵化修饰的壳聚糖的初始浓度为0.25-0.5mg/mL，上述硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖初始浓度为0.05-0.1mg/mL。所述的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529为本实验室分离保存的益生菌菌株。
优选的，上述季铵化壳聚糖的制备方法包括：将壳聚糖溶于10％乙酸溶液中(PH＝4.5)，40℃搅拌12h充分溶胀，加入苯甲醛搅拌反应1h，离心收集沉淀，甲醇洗涤后烘干；产物溶于异丙醇中，加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，70℃搅拌16h，离心收集沉淀，甲醇洗涤后烘干；产物溶于盐酸乙醇溶液中，20℃搅拌24h，加入丙酮后离心收集沉淀，得到季铵化修饰的壳聚糖(OHTCC)。
优选的，上述硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖制备方法包括：0℃条件下向无水吡啶中缓慢滴加氯磺酸，剧烈搅拌30min，将卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖粉末加入无水甲酰胺中，溶解后加入无水吡啶与氯磺酸混合物中，50℃搅拌反应3h，P H调至中性，加入无水乙醇静置16h，离心收集沉淀，冷冻干燥收集得到硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖。
本发明中，上述纳米颗粒佐剂的制剂为液体形式。通过自组装制得的纳米颗粒形态规则、粒径均一且分散性良好，能够有效吸附抗原，有利于抗原呈递细胞识别抗原，提高抗原的免疫原性，进一步的激活机体细胞免疫和体液免疫应答，有效提高特异性抗体水平和中和抗体效价，同时本发明制备得到的纳米颗粒具有良好的稳定性，4℃保存4周内纳米颗粒性状稳定，方便运输、储存和使用。
本发明还提供了一种上述纳米颗粒佐剂在制备疫苗中的用途，目的是制备一种能够减少抗原用量，诱导更高水平细胞免疫与体液免疫反应的纳米级疫苗组合物。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
上述疫苗组合物包括纳米颗粒佐剂与抗原，所述纳米颗粒佐剂包括壳聚糖和卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖，所述壳聚糖与卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖自组装形成纳米颗粒，所述抗原吸附装载于纳米颗粒表面；
上述抗原吸附装载于纳米颗粒表面的方法为：对壳聚糖进行季铵化修饰，同时对卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖进行硫酸化修饰，将得到的硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖作为物理交联剂，将季铵化修饰的壳聚糖滴加于硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖溶液中，在20℃下400rpm混合30min，随后将抗原蛋白逐滴加入至纳米颗粒溶液中，在20℃下400rpm混合30min，既得吸附装载有抗原蛋白的纳米颗粒。
优选地，上述季铵化壳聚糖与硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatusDC529胞外多糖体积比为1∶1-2，抗原蛋白与纳米颗粒体积比为1∶2。
优选的，上述疫苗组合物的粒径可达到35.58nm，抗原蛋白吸附装载率达65.66％。
本发明中，上述抗原包括但不限于重组蛋白抗原、合成的多肽抗原、灭活病毒或DNA疫苗等。
与现有传统疫苗佐剂相比，本发明具有以下优点：
1、本发明中利用季铵化壳聚糖和硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatusDC529胞外多糖制备的纳米颗粒性状均一、稳定性较好，能够有效吸附装载抗原，将抗原高效递送至免疫细胞，有利于抗原递呈细胞对抗原的识别和结合。
2、本发明中的纳米颗粒作为佐剂能够诱导产生有效的免疫反应，显著提高机体细胞免疫和体液免疫水平，诱导产生更高水平的特异性抗体和中和抗体效价。
3、本发明中的纳米颗粒佐剂能有效递送不同类型的抗原，显著提高抗原的免疫原性，有效减少抗原的使用量。本发明纳米佐剂中含有的硫酸化卷曲乳杆菌lactobacilluscrispatus DC529胞外多糖能够有效激活机体免疫应答，快速产生高水平抗体，增加亚单位疫苗的保护效果。
4、本发明中的纳米颗粒佐剂为水性佐剂，性质稳定易于吸收，所选择的成分生物安全性高，对机体无副反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明研究例1中纳米颗粒的透射电镜图片与粒径测定结果；
图2为本发明研究例1中OVA蛋白的装载率的测定结果；
图3为本发明研究例2中细胞存活率的测定结果；
图4为本发明研究例2中细胞炎性因子、趋化因子水平的测定结果；
图5为本发明研究例3中小鼠脾脏淋巴细胞的分群检测测定结果；
图6为本发明研究例3中小鼠脾脏淋巴细胞增殖率测定结果；
图7为本发明研究例3中小鼠脾脏淋巴细胞IL-6和IL-1β水平的测定结果；
图8为本发明研究例3中OVA特异性IgG抗体滴度；
图9为本发明研究例4中Fiber 2特异性IgG抗体滴度；
图10为本发明研究例5中Cap特异性lgG抗体滴度；
图11位本发明对照例1中细胞炎性因子、趋化因子水平的测定结果。
具体实施方式
实施例1：
一种季铵化修饰的壳聚糖的制备方法，具体步骤如下：
(1)壳聚糖(脱乙酰度≥95％)3g溶于10％乙酸溶液100ml中(PH＝4.5)，40℃下过夜搅拌充分溶胀。向壳聚糖溶液中加入苯甲醛15.8g，20℃搅拌反应1h，用1mol/L的NaOH溶液调节反应液PH至中性，12000rpm离心收集沉淀，甲醇洗涤沉淀物3次，烘干得到N-苯亚甲基壳聚糖；
(2)圆底烧瓶中加入N-苯亚甲基壳聚糖和150ml异丙醇，搅拌溶解后加热至70℃，逐滴加入GTMAC 27g，搅拌反应12h。12000rpm离心收集沉淀，甲醇洗涤沉淀物3次，烘干得到6-O-2′-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖；
(3)将6-O-2′-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖溶于100ml盐酸乙醇溶液(0.25mol/L)中，20摄氏度搅拌24h。氮吹仪吹干残留溶剂，加入500ml丙酮沉淀过夜，离心收集沉淀，透析纯化48h。透析后冷冻干燥，得到季铵化壳聚糖(命名为：OHTCC)。
实施例2：
一种硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖的制备方法(卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529菌种保藏号：GDMCC NO.62094)，具体步骤如下：
(1)取卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529按体积比1：100接种于ManRogosa Sharpe(MRS)琼脂培养基中，37℃静置培养24h，菌液中加入4％的三氯乙酸4℃静置12h，6000rpm离心20min，随后加入3倍体积的无水乙醇静置24h，6000rpm离心20min后收集沉淀溶于超纯水中，透析纯化48h，冷冻干燥后得到卷曲乳杆菌lactobacillus crispatusDC529胞外多糖；
(2)取无水吡啶100mL于三颈烧瓶中，经冰盐浴冷却至0℃后，剧烈搅拌并缓慢滴加40mL氯磺酸，随后400rpm搅拌反应30min；
(3)将10g卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖溶解于350mL无水甲酰胺中，随后缓慢加入到步骤(1)所述三颈烧瓶中，50℃搅拌反应3h；使用1mol/L的NaOH溶液中和至中性，透析纯化48h，加入3倍体积无水乙醇，静置过夜后12000rpm离心，沉淀物冷冻干燥后得到硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖(命名为：SEPS 7-4)。
实施例3：
一种纳米颗粒免疫佐剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)季铵化修饰的壳聚糖的制备：同实施例1。
(2)硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖的制备：同实施例2。
(3)季铵化修饰的壳聚糖与硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatusDC529胞外多糖自组装纳米颗粒的制备：将实施例1与实施例2中制备好的OHTCC(0.5mg/ml)与SEPS 7-4(0.1mg/ml)分别溶解于PBS中，以体积比1：1的比例向SEPS 7-4溶液中逐滴加入OHTCC溶液，400rpm 20℃搅拌30min，得到季铵化壳聚糖与硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖自组装纳米颗粒(SEPS 7-4/OHTCC NPs)。
实施例4：
一种疫苗组合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)纳米颗粒免疫佐剂的制备：同实施例3。
(2)抗原蛋白的制备：鸡卵白蛋白(OVA)购自北京索莱宝科技有限公司，取1mg OVA干粉溶解于1ml PBS溶液中既得1mg/ml抗原蛋白母液，使用时根据所需浓度使用PBS溶液稀释即可。
(3)吸附装载OVA的纳米颗粒的制备：取0.4mg/ml的OVA抗原蛋白，逐滴加入至SEPS7-4/OHTCC N Ps溶液中，体积比为1：2，400rpm 20℃搅拌30min，既得吸附装载有OVA抗原的纳米颗粒疫苗溶液。在下述研究例中，使用的疫苗制剂为利用PBS对疫苗溶液进行稀释所得。
实施例5：
抗原蛋白的制备：构建包含组氨酸和禽四型腺病毒Fiber 2蛋白的重组质粒，将重组质粒转化入表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，使用卡那霉素筛选获得表达Fiber2蛋白的菌株，加入IPTG溶液诱导表达目的蛋白。诱导表达完成后离心收集菌液上清，通过镍亲和层析柱纯化重组蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，使用PBS稀释至所需浓度。
其他部分和实施例4完全一致。
实施例6：
抗原的制备：将猪二型圆环病毒(LG株)接种于PK-15细胞中，37℃培养72h，反复冻融细胞后离心收集上清液，经测定TCID50为1×106.7/ml。按1∶2000体积比向病毒液中加入β-丙内酯(BPL)，4℃条件下搅拌48h，再置于37℃水浴2h使病毒充分灭活，使用PBS稀释至所需浓度。
吸附装载猪二型圆环病毒灭活病毒的纳米颗粒的制备：取灭活后的猪二型圆环病毒，逐滴加入至SEPS 7-4/OHTCC NPs溶液中，体积比为1∶1，400rpm20℃搅拌30min，既得吸附装载有灭活病毒的纳米颗粒疫苗溶液。
其他部分和实施例4完全一致。
研究例1：
1.1纳米颗粒的表征检测：
将实施例1中制备的纳米颗粒溶液滴加至铜网上，使用2％的磷钨酸染色30s，干燥后置于透射电子显微镜下观察纳米粒子的形态，用Zetasizer Nano ZS激光粒度分析仪进行粒径检测，纳米颗粒的透射电镜图与粒径检测结果见图1。
由图1的结果可以看出实施例3和实施例4制得的纳米颗粒与疫苗复合物均达到纳米级，呈现为球形，表面光滑，分散性良好。加入抗原蛋白制得的实施例4比实施例3粒径更小，均一性更好，分散性更好。这说明使用季铵化壳聚糖与硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖能够自组装形成纳米颗粒并吸附装载抗原蛋白，从而形成稳定的纳米疫苗复合物，粒径更小，均一性更好。
1.2纳米颗粒吸附蛋白的装载率的测定：
将实施例1、实施例2、实施例3中的纳米颗粒吸附装载不同抗原蛋白，随后12000rpm离心10min，取上清液使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定游离的蛋白浓度并计算纳米颗粒对抗原蛋白的吸附率。
吸附率＝(W总-W清)/W总×100％。公式中，W总为加入抗原蛋白的初始量，W清为离心后上清中抗原蛋白的含量。抗原蛋白吸附装载率的测定结果见图2。
由图2的结果可以看，实施例1和实施例3都能有效的吸附装载抗原蛋白，而实施例2对抗原蛋白的吸附效果较差，实施例3的抗原吸附率最佳，并且实施例3对不同抗原的吸附率差异不大。这些结果说明，季铵化壳聚糖起到了吸附装载抗原蛋白的作用，而与硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖自组装制成纳米颗粒后增强了对抗原蛋白的吸附能力，提高了装载率，更为高效。
研究例2：
2.1纳米颗粒的细胞毒性检测：使用CCK-8试剂盒对细胞毒性进行测定：
THP-1细胞以1×107cell/ml的细胞密度铺于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，在孔内分别加入用RPMI 1640培养基配制的不同浓度的实施例3中制得的纳米颗粒溶液100μl，对照孔中加入1640培养基100μl和细胞悬液100μl，实验孔加入100μl含有不同浓度(0、5、25、125、250、500μg/mL)实施例3制得的纳米颗粒的培养基，空白孔中加入1640培养基200μl，每组3个重复。37℃5％CO2的条件下培养24h，随后每孔中加入20μl的CCK-8试剂，37℃孵育1.5h后，使用酶标仪检测450nm处的吸光度值，细胞存活率计算公式如下：
细胞存活率＝(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100％。THP-1细胞增殖率见图3。
图3的结果显示，实施例3制得的纳米颗粒佐剂对THP-1细胞没有明显的细胞毒性，在250μg/mL的浓度下细胞存活率为91.56％，这表明纳米颗粒佐剂对细胞的安全性较好。
2.2SEPS与OHTCC的协同作用与纳米颗粒对THP-1细胞炎性因子、趋化因子基因表达水平的激活作用：
THP-1细胞以1×107cell/ml的细胞密度铺于6孔板中，每孔加入2ml细胞悬液，使用RPMl 1640培养基配制终浓度为25μg/ml的实施例1、实施例2及实施例3溶液，5％CO2条件下孵育THP-1细胞不同时间(2、4、8、16h)，孵育完成后使用细胞总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。随后以提取的总RNA为模板，使用II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行RT-qPCR，RT-qPCR反应体系为：10μL HieffqPCR/>Green Master Mix，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，8μLNuclease/DNasefree Water，1μL cDNA。反应条件：95℃30s，95℃10s，60℃30s，共循环40次。TNF-α的上游引物为：5′-CCAGGGACCTCTCTCTAATCA-3′，下游引物为：5′-TCAGCTTGAGGGTTTGCTAC-3′；IL-1β的上游引物为：5′-GTTCCCTGCCCACAGACC-3′，下游引物为：5′-TGGACCAGACATCACCAAGC-3′；CXCL9的上游引物为：5′-GAAGCAGCCAAGTCGGTTAGTG-3′，下游引物为：5′-AATCATCAGCAGTGTGAGCAGTG-3′；CXCL10的上游引物为：5′-CCATTCTGATTTGCTGCCTTATC-3′，下游引物为：5′-TACTAATGCTGATGCAGGTACAG-3′；内参基因GAPDH的上游引物为：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物为：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。各基因的mRNA相对表达水平见图4。
由图4的结果可以看出，实施例1、实施例2和实施例3都能够明显促进THP-1细胞中促炎细胞因子和趋化因子的表达，炎性因子TNF-α、IL-1β和趋化因子CXCL-9、CXCL-10的mRNA表达水平显著升高，其中实施例3制得的纳米颗粒佐剂的效果显著优于实施例1和实施例2。以上结果表明纳米颗粒佐剂能作为先天免疫反应的激动剂，有利于招募免疫细胞，从而增强免疫效果，并且在同等浓度条件下，由实施例1和实施例2构建的实施例3纳米颗粒具有协同增效作用，具有更高水平的先天免疫激活作用，激活效果明显优于实施例1与实施例2。
研究例3：
免疫方案：
共选取6周龄BALB/c小鼠共随机分为6组，每组6只，雌雄各半。进行2次免疫，接种时间分别为第0天和第14天。接种时对小鼠大腿外侧肌肉进行注射给药，给药剂量为100μl/只，阴性对照组每只小鼠注射100μlPBS。小鼠免疫抗原剂量为10μg/只，纳米颗粒剂量为50μg/只。
首免后第7d、14d、28d分别对小鼠进行尾尖采血，室温静置1h后4℃条件下4000rmp离心20min，吸取血清用于抗体滴度检测。首免后第28天脊椎脱臼处死小鼠，采集脾脏，进行脾脏淋巴细胞分群、细胞增殖率、细胞因子水平的检测。
3.1小鼠脾脏淋巴细胞的分群检测测定：
采集免疫28天后的小鼠脾脏分离脾脏淋巴细胞，以1×107cell/mL的浓度接种至12孔板中，每孔1mL细胞悬液，使用卵白蛋白(20μg/mL)再次刺激脾脏淋巴细胞，37℃培养48h，PBS洗涤细胞，离心后加入流式抗体FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8a、PE-CD69，4℃避光孵育1h。用含有1％FBS的PBS溶液洗涤重悬细胞。过200目细胞筛，使用流式细胞仪检测。脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+、CD69+T细胞的分群情况见图5。
由图5可以看出，实施例2和实施例4明显促进了CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞的比率，CD69+淋巴细胞的比率也显示出与CD4+细胞相似的实验结果，而实施例1对于促进T细胞分群没有明显作用。这些结果表明纳米颗粒佐剂对T细胞分群的促进效果是硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖造成的，并且这种促进作用在与季铵化壳聚糖自组装为纳米颗粒后更为明显。
3.2小鼠脾脏淋巴细胞增殖率测定：
将分离得到的小鼠脾脏淋巴细胞悬液以1×107cell/ml的密度铺于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，用20μg/mL的卵白蛋白作为刺激抗原加入到各个试验孔中，设置空白组，每组3个重复。37℃5％CO2的条件下刺激细胞48h，随后每孔中加入20μl的CCK-8试剂，37℃孵育1.5h后，使用酶标仪检测450nm处的吸光度值，细胞存活率计算公式如下：
细胞存活率＝(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100％。脾脏淋巴细胞增殖率见图6。
图6的结果显示，实施例1、实施例2和实施例4都可以明显促进脾脏淋巴细胞的增殖，其中实施例4制得的疫苗复合物的促进效果最明显。
3.3小鼠脾脏淋巴细胞IL-6和IL-1β分泌水平的测定结果：
将分离得到的小鼠脾脏淋巴细胞以1×107cell/ml的密度铺于12孔板中，每孔1mL单细胞悬液，用20μg/mL的卵白蛋白作为刺激抗原加入到各个试验孔中体外刺激脾脏淋巴细胞，37℃5％CO2的条件下继续培养72h，随后离心吸取上清，根据ELISA试剂盒说明书检测上清中细胞因子TNF-α、IL-4的水平。TNF-α、IL-4的分泌水平见图7。
由图7的结果可以看出，实施例1、实施例2、实施例4均明显增加了脾脏淋巴细胞细胞因子的分泌水平，其中实施例的促进效果最佳。此外与铝佐剂相比，实施例4对Th1型细胞因子TNF-α的促进水平比Th2型细胞因子IL-4更为显著，这表明纳米颗粒佐剂与传统铝佐剂相比能够更有效的增强Th1型免疫反应，刺激引发更高水平的细胞免疫，从而增强免疫效果。
3.4小鼠血清中的OVA特异性抗体lgG水平测定：
采用间接ELISA法测定小鼠血清中的OVA特异性抗体IgG滴度，将卵白蛋白用碳酸盐包被液稀释至2μg/mL，每孔100μL，4℃过夜包被；弃掉包被液，加入PBST洗板三次，每孔200μl；每孔加入2％BSA封闭液200μl，37℃孵育封闭1h；弃掉封闭液，加入PBST洗板三次，每孔200μl；加入倍比稀释后的小鼠血清，每孔100μl，37℃孵育1h；加入PBST洗板三次，每孔200μl；加入稀释后的HRP标记羊抗鼠lgG抗体(稀释度1∶10000)，每孔100μl，37℃静置45min；加入PBST洗板三次，每孔200μl；加入ELISA显色液，每孔100μl，室温避光显色约10min；加入终止液，每孔50μl；在酶标仪上读取450nm处的吸光值，结果判定标准：P/N大于2.1为有效阳性值。小鼠血清中特异性lgG抗体滴度见图8。
由图8的结果可以看出，随着免疫时间的增加与加强免疫的进行，各组小鼠血清中特异性lgG的抗体滴度有明显上升，这种上升在第14天加强免疫后更为明显。在第28天时，与实施例1、实施例2和铝佐剂相比，实施例4的特异性lgG抗体滴度更高，这说明实施例4制得的疫苗复合物能更高效的提高OVA蛋白的抗原性，提高免疫小鼠体内的特异性IgG抗体水平。
研究例4：
免疫方案：
将100只7日龄SPF鸡随机均分为5组，每组10只。其中1-3组为免疫组，分别皮下注射不合佐剂的Fiber 2亚单位疫苗、实施例5中制备的Fiber 2亚单位疫苗组合物、含灭菌白油佐剂的Fiber 2亚单位疫苗；第4组为攻毒对照组，不免疫只攻毒；第5组为空白对照组，不作处理。免疫剂量为200μl/只，免疫抗原剂量为2μg/只，纳米颗粒剂量为50μg/只。每组鸡中10只用于记录鸡只临床表现和死亡情况，计算存活率；10只作为试验采血测定抗体滴度。
4.1鸡只血清中的Fiber 2特异性IgG水平测定：
采用间接ELISA法测定鸡只血清中的Fiber 2特异性抗体lgG滴度，实验方法同研究例3.4，使用稀释后的HRP标记羊抗鸡IgG抗体(稀释度1∶2000)作为二抗，每孔100μl。显色完成后在酶标仪上读取450nm处的吸光值，结果判定标准：P/N大于2.1为有效阳性值。鸡只血清中特异性IgG抗体滴度见图9。
由图9的结果可以看出，鸡只血清中的特异性IgG抗体水平随着免疫时间的增加抗体滴度均有上升，实施例5表现出的对于特异性IgG抗体水平的提高效果要优于传统的白油佐剂，这说明实施例5制得的疫苗复合物能在鸡只体内促进Fiber2特异性lgG抗体水平，从而起到更好的保护作用。
4.2疫苗复合物的保护性检验
免疫后第21天，第1-5组的实验动物均肌肉注射FAdV-4病毒液进行攻毒试验，攻毒剂量为2×106.5TCID50，观察记录鸡只临床表现和死亡情况。鸡只死亡情况见表1。
表1攻毒实验鸡只死亡情况
图9与表1的结果显示，注射实施例5疫苗复合物的鸡只均未出现死亡，注射单独抗原的鸡只死亡了10只，注射白油佐剂的鸡只分别死亡了5只，而攻毒对照的鸡只全部死亡。攻毒保护实验的结果显示，本发明实施例5制备的疫苗复合物的对禽四型腺病毒的免疫保护率能达到100％。纳米颗粒佐剂增加了Fiber2蛋白的免疫原性，同时可以较快产生高水平的特异性抗体，保护率高于常规疫苗。
研究例5：
免疫方案：取20日龄健康仔猪20头，随机分成4组，每组5头，所有仔猪在相同条件下饲养管理。1-3组为免疫组，分别颈部肌肉注射不合佐剂的猪二型圆环病毒灭活病毒、实施例6中制备的疫苗组合物、含弗氏不完全佐剂的猪二型圆环病毒灭活病毒；第4组为空白对照组，每头肌肉注射生理盐水1mL。免疫剂量为1ml/只，纳米颗粒剂量为250μg/头。免疫后第14天相同剂量加强免疫一次，免疫后第7天、14天、21天、28天采集血液进行抗体水平的测定。
5.1仔猪血清中的猪二型圆环病毒抗体水平测定：
使用猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒(MEDIAN)测定仔猪血清中的抗体水平，严格根据说明书操作。显色完成后在酶标仪上读取450nm处的吸光值，结果判定标准：P/N大于2.1为有效阳性值。仔猪血清中猪圆环病毒2型抗体水平见图10。
图10的结果显示，仔猪血清中的猪圆环病毒2型抗体水平随免疫时间增加逐步上升，免疫后14天抗体开始逐步转阳，实施例6对抗体水平的提高效果要优于弗氏不完全佐剂，这说明实施例6制得的疫苗复合物能更好的激活仔猪的免疫反应，提高体内的抗体水平，从而对猪二型圆环病毒起到更好的预防效果。
5.2纳米颗粒佐剂的接种安全性试验
免疫完成后，每日观察仔猪的精神状态、采食情况，观察免疫仔猪有无临床异常症状以及注射部位有无病变。接种安全性试验结果见表2。
表2结果显示，除弗氏佐剂组有一头仔猪注射部位出现红肿和炎症反应外，其他所有仔猪的精神状态、采食、体温等均正常，实施例6免疫后的仔猪均未出现因为疫苗接种而引起的临床异常症状。结果表明了纳米颗粒佐剂的安全性良好，免疫后对机体刺激较小，无不良反应。
表2纳米颗粒佐剂接种安全性试验
对照例1：
按照实施例2的方法，分别对卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529、约氏乳杆菌3-3、唾液乳杆菌8-5、罗伊氏乳杆菌9-1、植物乳杆菌20-8的细菌胞外多糖进行硫酸化修饰，得到的胞外多糖分别命名为：SEPS 7-4、SEPS 3-3、SEPS 8-5、SEPS 9-1、SEPS20-8，通过对先天免疫指标激活水平作为评判依据筛选更为有效的益生菌胞外多糖。按照实验例2.2的操作方法，将不同益生菌硫酸化胞外多糖(25μg/ml)孵育THP-1细胞，测定炎性因子、趋化因子mRNA的相对表达水平，THP-1细胞中炎性因子、趋化因子mRNA表达水平见图11。图11的结果表明，不同硫酸化胞外多糖均能促进炎性因子TNF-α、IL-1β和趋化因子CXCL-9、CXCL-10的mRNA表达水平，其中硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖处理组炎性因子和趋化因子的mRNA表达水平较其他益生菌胞外多糖处理组水平更高。这表明硫酸化卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖对先天免疫反应的激活效果更好，使用SEPS7-4作为纳米颗粒的免疫激活剂更有利于激活先天免疫反应并招募免疫细胞，从而增强疫苗免疫效果。
对照例2：
按照实施例3的方法，分别将SEPS 7-4与OHTCC的体积比调整为1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、2∶1、5∶1、10∶1，搅拌反应时间分贝为0.5h、1h，检测各纳米材料的粒径和抗原蛋白吸附率，见表3。
表3纳米颗粒制备条件筛选
因此优选反应条件为：两者体积比为1∶1，搅拌反应时间为0.5h。
对照例3：
按照研究例4的方法，分别将免疫抗原剂量调整为2μg/只、20μg/只、200μg/只，免疫后第21天进行攻毒试验，攻毒剂量为2×106.5TCID50，观察记录鸡只临床表现和死亡情况。鸡只临床表现和死亡情况见表4。
表4的结果表明，使用纳米颗粒作为佐剂时，2μg抗原蛋白即可对鸡只提供100％保护率，而免疫单独抗原和白油佐剂的鸡只抗原蛋白达到200μg鸡只才未出现死亡。结果表明纳米颗粒佐剂使抗原蛋白的使用量减少了100倍，显著增加了Fiber2蛋白的免疫原性，效果优于常规疫苗佐剂。
表4攻毒实验鸡只死亡情况
| 组别 | 死亡数量 | 死亡率(％) |
| 2μg抗原 | 10 | 100 |
| 20μg抗原 | 10 | 100 |
| 200μg抗原 | 0 | 0 |
| 2μg抗原+纳米颗粒 | 0 | 0 |
| 20μg抗原+纳米颗粒 | 0 | 0 |
| 200μg抗原+纳米颗粒 | 0 | 0 |
| 2μg抗原+白油佐剂 | 10 | 50 |
| 20μg抗原+白油佐剂 | 3 | 0 |
| 200μg抗原+白油佐剂 | 0 | 0 |
| 攻毒对照组 | 10 | 100 |
| 阴性对照组 | O | 0 |
综合以上结果，实施例3制备的纳米颗粒作为卵白蛋白、禽四型腺病毒Fiber2蛋白以及猪二型圆环病毒灭活疫苗的佐剂，均能够有效吸附装载抗原，提高免疫效果。纳米颗粒佐剂能通过激活细胞免疫和体液免疫，促进免疫细胞增殖、活化、成熟以及一系列系统性免疫应答。同时研究结果显示，季铵化修饰的壳聚糖与硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖自组装并产生协同作用，制备的纳米颗粒佐剂增加了抗原的免疫原性，减少了抗原的使用量，并且能够快速有效的提高抗体水平和保护率，对疾病起到显著的预防作用。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其它实施例中实现。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (10)
1.一种纳米颗粒佐剂的制备方法，其特征在于：所述纳米颗粒佐剂由季铵化修饰的壳聚糖和免疫激活剂组成，所述免疫激活剂为硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacilluscrispatus DC529胞外多糖，所述季铵化修饰的壳聚糖与硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖自组装形成纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述自组装，其过程为：将0.1mg/ml硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖溶液作为物理交联剂，逐滴加入0.5mg/ml的季铵化修饰的壳聚糖溶液中，两种溶液的体积比为1∶0.5～2，反应30～60min，得到纳米颗粒溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：两种溶液的体积比为1∶1，在20～25℃下搅拌反应30min，得到纳米颗粒溶液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述胞外多糖溶液，溶剂为PBS缓冲液，所述季铵化修饰的壳聚糖溶液，溶剂为PBS缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述季铵化修饰的壳聚糖，其制备方法为：
步骤1：壳聚糖溶于PH＝4.5的10％乙酸溶液中，40℃搅拌充分溶胀后加入苯甲醛，搅拌反应1h，离心收集沉淀，甲醇洗涤后烘干，得到N-苯亚甲基壳聚糖；
步骤2：所述N-苯亚甲基壳聚糖溶于异丙醇中，加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵，70℃搅拌16h，离心收集沉淀，甲醇洗涤后烘干，得到6-O-2′-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖；
步骤3：所述6-O-2′-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖溶于0.25mol/L盐酸乙醇溶液中，20℃搅拌24h后氮吹仪蒸发溶剂，丙酮沉淀后离心收集沉淀，透析纯化后冷冻干燥收集得到季铵化修饰的壳聚糖。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述硫酸化修饰的卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖，其制备方法为：取无水吡啶于三颈烧瓶中，经冰盐浴冷却后，剧烈搅拌并缓慢滴加氯磺酸，随后搅拌反应30min得到溶液1；将卷曲乳杆菌lactobacillus crispatus DC529胞外多糖加入到无水甲酰胺中，溶解后加入到所述溶液1中，50℃搅拌反应3h，PH调至中性，反应物离心透析48h，加入3倍体积无水乙醇静置16h，离心收集沉淀，冷冻干燥收集。
7.权利要求1所述的制备方法制得的纳米颗粒佐剂。
8.权利要求7所述的纳米颗粒佐剂在制备疫苗中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述疫苗包括所述纳米颗粒佐剂与抗原，所述抗原吸附装载于纳米颗粒表面。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗原包括重组亚单位蛋白抗原、合成的多肽抗原、灭活病毒或DNA疫苗抗原。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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