CN117165481A - 一株可降解苹果酸的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌ZG‑3及其在葡萄酒酿造中的应用。所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZG‑3，保藏号为CGMCCNo.27170。该菌株与酿酒酵母同时接种发酵可使葡萄酒中苹果酸从8.10g/L降至0.39g/L，降酸率可达95.19％；与酿酒酵母混合顺序接种发酵可使葡萄酒中苹果酸从8.30g/L降至0.49g/L，降酸率可达94.10％。并且与对照组相比，同时接种和顺序接种发酵的葡萄酒中腐胺和尸胺的含量都有所下降，且同时接种方式下腐胺和尸胺降幅较大，分别为39.67％、46.51％。本发明利用该菌株建立了降酸工艺，这对于改善葡萄酒口感和提高葡萄酒品质具有重要意义。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌ZG-3及其在葡萄酒酿造中的应用。
背景技术：
苹果酸又名L-2-羟基丁二酸，是葡萄果实成熟过程中形成的一种重要的有机酸，它的含量因葡萄品种以及葡萄成熟的条件不同而不同，过量苹果酸会影响葡萄酒的酸度和感官品质。
目前常用的降酸方法主要有以下三种：①化学降酸，即利用一些降酸剂(如碳酸钙、碳酸氢钾等)与酒中的有机酸起化学中和反应从而降低酸度；②物理降酸，即利用酒石酸同K+合成酒石酸氢钾而在低温条件下析出晶体；③生物降酸，即是利用苹果酸-乳酸发酵或使用裂殖酵母来分解苹果酸。
化学降酸因会给降酸的酒体中引入过多的Na+或Ca2+，而使酒体风味及质地下降，且在贮存期间因温度的变化会产生不同程度的钙盐沉淀；而苹果酸-乳酸发酵中乳酸菌在葡萄酒的特殊环境(如低pH值、高SO2、高乙醇、中链脂肪酸等)生长和发酵缓慢，且可能会产生生物胺(如腐胺、组胺、酪胺和尸胺)、氨基甲酸乙酯等有害物质。MLF结束后，如果乳酸菌发酵终止不彻底，葡萄酒可因乳酸菌生长而产生生物浑浊，进而降低葡萄酒品质。因此筛选既不产生生物胺，又能耐受葡萄酒的特殊环境进行降酸的乳酸菌，可在某种程度上解决葡萄酒苹乳发酵存在的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容：
本发明的目的在于提供一株可降解葡萄酒中苹果酸的乳酸菌及其在葡萄酒发酵中的应用。
本发明提供的技术方案之一，是一株乳酸菌，具体为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZG-3，该菌株已于2023年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院三号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.27170。
本发明提供的技术方案之二，是上述植物乳杆菌ZG-3在葡萄酒生产中的应用；
进一步地，是植物乳杆菌ZG-3在降解苹果酸中的应用；
进一步地，是植物乳杆菌ZG-3在降解生物胺中的应用；
更进一步地，所述应用，是将酿酒酵母和植物乳杆菌ZG-3同时接种用于葡萄酒发酵中；
更进一步地，所述应用，是将酿酒酵母和植物乳杆菌ZG-3顺序接种用于葡萄酒发酵中，在酿酒酵母完成酒精发酵后，接入植物乳杆菌ZG-3进行苹乳发酵降解苹果酸，同时降解生物胺；
植物乳杆菌ZG-3与酿酒酵母同时或顺序接种于葡萄酒发酵中，不仅不产生生物胺，还可有效降解部分生物胺并且还具有降解葡萄酒中苹果酸含量的能力。
有益效果：
本发明通过对乳酸菌的产胺性能、耐性、降苹果酸能力等方面进行研究，筛选出一株可降解葡萄酒中苹果酸的乳酸菌——植物乳杆菌ZG-3。该菌株与酿酒酵母混合同时接种发酵可使葡萄酒中苹果酸从8.10g/L降至0.39g/L，降酸率可达95.19％；与酿酒酵母混合顺序接种发酵可使葡萄酒中苹果酸从8.30g/L降至0.49g/L，降酸率可达94.10％。并且与对照组相比，同时接种和顺序接种发酵的葡萄酒中腐胺和尸胺的含量都有所下降，且同时接种方式下腐胺和尸胺降幅较大，分别为39.67％、46.51％。本发明利用该菌株建立了降酸工艺，这对于改善葡萄酒口感和提高葡萄酒品质具有重要意义。
附图说明：
图1为实施例1中不同植物乳杆菌株对pH(a)和乙醇(b)的耐受性。
图2为实施例1中不同SO2浓度对不同植物乳杆菌生长的影响。
图3为实施例1中不同植物乳杆菌在葡萄酒中降解苹果酸与生成乳酸的能力。
图4为实施例3不同接种方式苹果酸-乳酸发酵动力学变化。
图5为实施例3中不同接种方式发酵葡萄酒的生物胺含量。
具体实施方式：
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施案例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。
以下将通过具体实施例对本发明技术方案作进一步的说明。
实施例1菌株的筛选、分离
1.初筛
称取10g葡萄皮和叶于100mL无菌生理盐水中，于37℃摇床培养箱振荡培养30min。吸取悬浮液梯度稀释至10-6，吸取100μL适宜梯度稀释液分别均匀涂布于MRS固体培养基，37℃培养32-48h，选取不同形态单菌落进行划线分离纯化并保存。
将纯化的菌株接种于MRS液体培养基中进行活化，调整菌液浓度达到1×108CFU/mL，涂布于生物胺检测双层培养基上，37℃培养48h后，以不接种菌种的培养基为空白对照，记录实验结果，观察培养基颜色变化，紫色的为阳性(产胺菌)，不变色即黄色为阴性(不产胺菌)，将56株乳酸菌分别接种至生物胺检测双层培养基培养48h后，经显色反应筛选出28株不产生物胺的菌株。将阴性菌落挑出，在对应培养基上划线分离纯化3次，得初筛菌株，然后于4℃保藏备用。
所述MRS培养基配方为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，乙酸钠2g/L，柠檬酸三铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，其余为水，pH5.4。
所述生物胺检测双层培养基配方为：(1)底层培养基(g/L)：蛋白胨5.0，牛肉膏5.0，酵母膏5.0，葡萄糖0.5，NaCl 2.5，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4 0.03，K2HPO4 2.0，柠檬酸三铵2.0，CaCO3 0.1，FeSO4 0.04，维生素B1 0.01，磷酸吡哆醛0.05，琼脂18.0，吐温80mL，氨基酸底物(色氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、鸟氨酸盐酸)各5.0，其余为水，pH 5.2；115℃灭菌20min。(2)上层培养基(g/L)：溴甲酚紫0.06、琼脂20.0，pH 5.2；115℃灭菌20min。
2.二级筛选
将初筛菌株接种于MRS液体培养基中活化2-3次，并调整菌液浓度为108CFU/mL，以5％(V/V)的接种量接种于含10mg/L 8种生物胺的MRS培养基中(即生物胺降解培养基)，37℃条件下培养4d，以空白MRS培养基(不接入菌的培养基)为对照组，取1mL菌液加入1mL0.1mol/L HCl溶液中断菌株生长繁殖后，12000r/min离心10min，取上清液，采用高效液相色谱法测定生物胺含量，并与空白进行对照，选取降解生物胺种类多且降解能力好的菌株，根据菌株降解生物胺的能力与种类，最终选取11株乳酸菌用于后续研究，分别是ZG-1、ZG-2、ZG-3、ZG-4、ZG-6、ZG-7、ZG-8、ZG-11、GG-2、GG-3和WG-2。
所述生物胺降解培养基配方为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，乙酸钠2g/L，柠檬酸三铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，8种生物胺各0.01g/L(色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺)，其余为水，pH5.4，115℃灭菌20min。
高效液相色谱测定生物胺降解率测定结果：
表1不同菌株对8种生物胺的降解率
3.三级筛选
将上述筛选得到的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后分别按5％(V/V)的接种量接种于耐受培养基中，于37℃条件下继续培养24h，筛选耐受性较好的菌株。
所述耐受培养基分别为：
耐酸培养基：将MRS培养基用硫酸调节pH值分别为3.0，3.2，3.4，3.6和3.8，115℃高温灭菌20min；
耐乙醇培养基：将MRS培养基于115℃高温灭菌20min，待室温冷却后添加酒精，使其乙醇体积分数分别为8％、10％、12％、14％和16％；
耐二氧化硫培养基：将MRS固体培养基于115℃高温灭菌20min，待室温冷却后添加亚硫酸，使其二氧化硫质量浓度分别为30、40、50、60和70mg/L。
培养24h后，其耐性结果如图1和图2所示。
由图1(a)pH耐受性结果可知，11株乳酸菌菌株的OD600 nm值随着pH的升高而显著升高。在pH 3.0条件下，所有菌株的生长均受到了抑制。在pH 3.2～
3.8时，菌株ZG-3、ZG-11、ZG-8、WG-2和ZG-7这5株菌比其余菌株表现出较好的性能。
由图1(b)乙醇耐受性结果可知，ZG-1、ZG-2、ZG-3、ZG-7、ZG-8、ZG-11、GG-2和GG-3可耐受12％vol的酒精度。
而由图2可知，随着二氧化硫质量浓度的逐步增加，与对照培养基相比，11株菌的生长均逐渐受到抑制，但是它们均可耐受70mg/L的二氧化硫质量浓度。葡萄酒优良乳酸菌需耐受二氧化硫质量浓度为60mg/L，因此所筛选的11株乳酸菌均满足要求。
综合11株乳酸菌对pH、乙醇和二氧化硫耐受性分析结果可知，植物乳杆菌ZG-3、ZG-7和ZG-11在这三个方面表现的性能优于其他菌株。
4.降苹果酸能力
取经酒精发酵结束后的河北昌黎赤霞珠葡萄酒发酵液，用0.45μm水系膜对葡萄酒发酵液进行过滤除菌，然后将过滤之后的发酵液短期贮藏在4℃，用于接下来苹乳发酵(MLF)。
将上述得到性能相对优良的乳酸菌菌株(ZG-3、ZG-7和ZG-11)分别接种于MRS液体培养基中活化两次，以5％(V/V)接种量接种于经过滤除菌的葡萄酒发酵液三角瓶(150mL)，在25℃培养箱中进行MLF过程。每24h取一次样，采用高效液相色谱法测定L-苹果酸和L-乳酸含量，同时以商业酒类酒球菌(Oenococcus oeni)B7作为对照(来自LAFFORT的B7 DIRECT)，结果如图3和表2所示。
由图3可知，菌株ZG-3消耗L-苹果酸能力明显优于商业酒类酒球菌B7，菌株ZG-7L-苹果酸消耗能力略微优于对照菌株B7。其中，菌株ZG-3降L-苹果酸能力最强，第1天便将苹果酸由3.30g/L降低到1.73g/L，第4天能够降到0.45g/L。菌株ZG-7在前4天时降L-苹果酸能力强于对照菌株B7，而在培养至第5天时，对照菌株B7将L-苹果酸瞬间降至0.89g/L，与菌株ZG-7发酵葡萄酒中L-苹果酸含量相差不大。葡萄酒中L-乳酸含量的变化规律与L-苹果酸相反，随着培养时间的延长，菌株逐步将L-苹果酸转化为L-乳酸。综上，与商业酒类酒球菌B7相比，菌株ZG-3能够更好地适应葡萄酒环境，具有更强的降解苹果酸的能力。
表2葡萄酒发酵液中L-苹果酸含量(g/L)
实施例2菌株ZG-3的鉴定
挑取纯种ZG-3菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h活化。取适量活化后的菌液，离心收集菌体，采用试剂盒提取的方法提取纯培养目标菌株的基因组DNA，以上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-ACG GCT ACC TTG TTACGA CTT-3’扩增其26SrDNA基因保守区并送至测序公司进行测序分析。
PCR反应条件是：变性95℃，15s；退火55℃，15s；延伸72℃，15s；30个循环，72℃延伸5min。
使用NCBI的BLAST功能在GenBank数据库中进行序列比对，分析确定菌株的分类为：Lactobacillus plantarum，因此将其命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZG-3，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCCNo.27170。
菌株ZG-3的26SrDNA基因序列如下(SEQ ID NO.1)：
TAATACATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTGCTTGCACTGAATGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCCTGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTGAGAGTAACTGTTCACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCCAACCTAAGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAAACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCTAAGT。
实施例3植物乳杆菌ZG-3不同接种方式在赤霞珠葡萄酒中的应用
菌种活化：挑取少量纯化好的酿酒酵母J-1菌株接种于YPD液体培养基中，于30℃下，180r/min摇床培养18h，两次传代后得到的种子液(J-1菌株为申请人实验室保藏的一株酿酒酵母，在本实施例中用于完成葡萄酒的酒精发酵。也可以替换为其他的酿酒酵母，均不影响植物乳杆菌ZG-3的性能，此处使用酿酒酵母J-1仅作为示例。)；挑取少量纯化好的植物乳杆菌ZG-3菌株接种于MRS液体培养基中于37℃下静置培养24h，两次传代后得到的菌液，将菌液离心并用生理盐水洗两次，然后加入到等体积的葡萄汁中即可作为植物乳杆菌ZG-3种子液，菌浓约1×108CFU/mL。
挑选新鲜的赤霞珠葡萄，除梗破碎后分装于三角瓶中，每个三角瓶中装有150mL果浆，添加果胶酶(30mg/L果浆)和SO2(50mg/L果浆)，低温浸渍24h后按照以下三种酿造工艺分别进行：
(1)只接种酿酒酵母J-1，接种量为2×106CFU/mL，然后于24～26℃进行酒精发酵。当总糖浓度≤4g/L时，酒精发酵结束，记为CK，作为对照组。
(2)酿酒酵母J-1与植物乳杆菌ZG-3在酒精发酵开始时同时接种，然后于24～26℃进行发酵，记为JZT；酿酒酵母J-1接种量2×106CFU/mL，植物乳杆菌ZG-3接种量为5％，待苹果酸含量不变时，发酵结束。
(3)先接种酿酒酵母J-1，于24～26℃发酵，待酒精发酵结束后(即总糖浓度≤4g/L)再接种植物乳杆菌ZG-3，于18～20℃发酵，待苹果酸含量不变时，发酵结束，记为JZS；酿酒酵母J-1接种量2×106CFU/mL，植物乳杆菌ZG-3接种量为5％。
发酵过程利用高效液相色谱法检测苹果酸浓度的变化，待苹果酸含量不变时，苹乳发酵结束，分析葡萄酒品质。
结果如图4所示，同时接种的降酸过程在9天内完成，苹果酸浓度由8.10g/L降低至0.39g/L，苹果酸降解率为95.19％。顺序接种的降酸过程在13天内完成，苹果酸浓度由8.30g/L降低至0.49g/L，苹果酸降解率为94.10％。CK组未进行苹乳发酵，因此苹果酸含量一直未变。总之，该植物乳杆菌ZG-3能较彻底的降解葡萄酒中的苹果酸，改善酸涩口感(图4中，JZT组是将酿酒酵母J-1与植物乳杆菌ZG-3共同接种时记为第0d；JZS组是将接种植物乳杆菌ZG-3时记为第0d)。
同时接种和顺序接种方式发酵获得的葡萄酒的基本理化指标结果如表3。各组基本理化指标均符合GB/T 15037-2006的要求。L.plantarum ZG-3发酵酒样总酸含量在顺序接种下降幅较大，下降14.21％，pH值随着总酸含量的降低而升高。两种接种方式发酵酒样的色度值均降低，色调值均升高，但JZT组色度值降幅小于JZS组。
表3不同接种方式对葡萄酒基本理化指标的影响
注：同行不同小写字母表示差异显著(邓肯检验，P＜0.05)；CK：对照组，仅进行酒精发酵；JZT：同时接种；JZS：顺序接种。
对不同接种方式下葡萄酒的生物胺含量进行测定，结果见图5。由图5可知，在CK、JZT和JZS三种酒样中检测到了2种生物胺，即腐胺和尸胺。不同接种方式下进行MLF后酒样的腐胺含量JZT(0.73mg/L)<JZS(0.94mg/L)<CK(1.21mg/L)，尸胺含量JZT(0.23mg/L)<JZS(0.36mg/L)<CK(0.43mg/L)，均低于国际标准。与CK相比，JZT和JZS中腐胺和尸胺的含量都有所下降，且同时接种方式下腐胺和尸胺降幅较大，分别为39.67％、46.51％。这说明两种接种方式下，L.plantarum ZG-3发酵葡萄酒具有安全性，且同时接种更有利。
此外，发酵结束后，采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱质谱联用(GC-MS)技术对不同接种方式的赤霞珠葡萄酒的挥发性组分进行萃取和检测，以明确ZG-3对葡萄酒芳香品质的影响。
表4的检测结果表明，同时接种增加了乙酸乙酯、辛酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、乳酸异戊酯、苯甲醇、乙醛、苯甲醛和α-松油醇等香气组分的含量。顺序接种增加了3-羟基丁酸乙酯、壬酸乙酯、丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、4-羟基丁内酯、苯甲醇、苯甲醛和大马士酮等香气组分的含量。这些芳香化合物具有花香或果香类香气特征，会赋予葡萄酒更浓郁的花香和果香，提高其感官品质。
表4不同接种方式发酵葡萄酒样挥发性组分的影响
注：同行不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)；“ND”表示未检出。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株植物乳杆菌，其特征在于，具体为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZG-3，保藏号为CGMCC No.27170。
2.权利要求1所述植物乳杆菌ZG-3的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是植物乳杆菌ZG-3在葡萄酒生产中的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是植物乳杆菌ZG-3在降解苹果酸中的应用。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是植物乳杆菌ZG-3在降解生物胺中的应用。
6.如权利要求3-5任意一项所述的应用，其特征在于，是将酿酒酵母和植物乳杆菌ZG-3同时接种用于葡萄酒发酵中。
7.如权利要求3-5任意一项所述的应用，其特征在于，是将酿酒酵母和植物乳杆菌ZG-3顺序接种用于葡萄酒发酵中。
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