CN113943663B - 一种红茶菌中的星形假丝酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种星形假丝酵母Y3‑13，以及包含其的微生物制剂、由所述假丝酵母或微生物制剂生产的发酵制品、及其应用，该星形假丝酵母Y3‑13保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.18970，保藏日期为2019年11月19日，分类名称为Candida stellata。本发明的星形假丝酵母Y3‑13可明显增加红茶菌饮料的香气；并且可快速制得风味优良的红茶菌饮料。另外，使用本发明的星形假丝酵母Y3‑13的发酵过程易于控制，最终产品品质稳定，味道具有传统红茶菌饮料特色，适合规模化生产。

Description

一种红茶菌中的星形假丝酵母及其应用
技术领域
本发明涉及食品微生物技术，具体而言，本发明涉及一种星形假丝酵母Y3-13，以及包含其的微生物制剂、由所述假丝酵母或所述微生物制剂生产的发酵制品、及其应用。
背景技术
红茶菌饮料是我国传统酸性饮料，目前在欧美广泛流行，被称为“Kombucha Tea”，译为康普茶。其中，红茶菌是能够将糖茶水和/或果汁发酵成红茶菌饮料的酵母菌和醋酸菌共生菌群，还可能含有少量乳酸菌。红茶菌饮料是指用红茶菌对茶底(即茶糖水)和/或果汁以及果干、草本成分或天然香料等进行发酵制得的饮料。红茶菌饮料含有多种功能性物质，包括葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、醋酸、乳酸、多糖类物质、多酚类物质、氨基酸、蛋白质、矿物质和维生素等。红茶菌本身的酸度抑制了有害细菌的生长。大量研究表明红茶菌饮料具有抗菌性、抗氧化性，可增强免疫力、降低血脂、血压和血糖等功效，还能调节肠道菌群、保护肝脏、排除重金属、控制体重、预防胃肠癌和改善胰腺功能。随着经济高速发展和工作生活的节奏加快，健康饮食日益受到重视。近几年，红茶菌饮料在世界范围广泛流行，成为增长最快的功能性饮料产品。
但是，现有传统红茶菌发酵技术方案存在以下几个方面的问题：
1.发酵慢：传统红茶菌发酵通常需要7-10天左右，发酵时间长，不利于工业化大规模生产；
2.菌种繁杂、不易控制：采用传统红茶菌发酵，菌种繁杂，易带入杂菌，导致终产品的品质不稳定，发酵产物不可控。
然而，市场上工业化生产的红茶菌饮料大多采用标准菌株，并非分离自红茶菌，普遍香气不如传统红茶菌丰富。例如，中国专利申请CN109294957A公开了一种直投式红茶菌发酵剂，其中使用活菌数比例为1:0.8:0.5的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、汉逊酵母(Hansenula sp.)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)发酵制得一种红茶菌饮料，其菌种总添加量均为2×108CFU/mL。
另外，目前少有利用从传统红茶菌中分离的纯菌发酵菌剂的研究。例如，中国专利申请CN109593664A公开了一种嗜酒假丝酵母及其应用，用所分离得到保藏编号为CGMCCNO.14815的嗜酒假丝酵母(Candida ethanolica)对原料进行发酵可提高发酵制品中皂苷和/或有机酸的含量；但是该申请主要关于皂苷和/或有机酸的含量，并未涉及红茶菌饮料的风味的改善。此外，中国专利申请CN107699506A公开了一种红茶菌中的酿酒酵母及其应用，具体提供了一种新的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)T3，保藏编号为CCTCC NO：M2017624，用于茶酒酿制，具有起酵快、发酵活力强、酒精转化率高、风味独特等优势；进一步，中国专利申请CN109554318A公开了一种红茶菌中的葡糖酸醋杆菌及其应用，利用所分离的保藏编号为CCTCC NO：M2018745的葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)C2与保藏编号为CCTCC NO：M2017624的酿酒酵母T3共同发酵，能够快速稳定制备出风味宜人且具有保健功能的红茶菌饮料。
然而，现有专利所使用的菌种较为单一，不能赋予等同于传统红茶菌饮料的独特风味。对此，本发明人采用红茶菌中分离的菌种进行纯菌复配发酵，既能保留传统红茶菌的风味，又可以避免由未知微生物引起的潜在食品安全问题。
发明内容
本发明人从传统红茶菌中筛选得到一株星形假丝酵母Y3-13，其可明显增加红茶菌饮料的香气；并且可快速制得风味优良的红茶菌饮料。另外，使用本发明的星形假丝酵母Y3-13的发酵过程易于控制，最终产品品质稳定，味道具有传统红茶菌特色，适合规模化生产。
因此，在一方面，本发明提供了一种星形假丝酵母Y3-13(Candida stellata Y3-13)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.18970，保藏日期为2019年11月19日，分类名称为Candida stellata。
在另一方面，本发明提供了微生物制剂，所述微生物制剂包含如上所述的星形假丝酵母Y3-13。
在本发明中，所述微生物制剂还包含醋酸菌，并任选包含接合酵母和酒香酵母中的一种或多种。优选地，所述微生物制剂为冻干菌剂。
在另一方面，本发明提供了包含如本发明所述的星形假丝酵母Y3-13的红茶菌。
在另一方面，本发明提供了由本发明所述的星形假丝酵母Y3-13或上述微生物制剂生产的发酵制品。
在另一方面，本发明提供了如上所述的微生物制剂的制备方法。
在另一方面，本发明提供了制备所述发酵制品的方法，所述方法包括使用本发明的星形假丝酵母Y3-13或微生物制剂来制备所述发酵制品。
在另一方面，本发明提供了制备红茶菌饮料的方法，所述方法包括使用本发明所述的包含星形假丝酵母Y3-13的红茶菌进行发酵的步骤。
在另一方面，本发明提供了本发明所述的星形假丝酵母Y3-13和/或包含星形假丝酵母Y3-13的微生物制剂在制备红茶菌和/或红茶菌饮料中的用途。
在另一方面，本发明提供了本发明所述的星形假丝酵母Y3-13在制备其它发酵产品中的应用，所述其它发酵产品例如无酒精发酵制品或低酒精发酵制品。
有益效果
本发明提出了以从红茶菌中筛选分离的星形假丝酵母Y3-13与醋酸菌为主要发酵剂复配发酵糖茶水，星形假丝酵母Y3-13可将可利用碳源(例如蔗糖)快速转化为乙醇供醋酸菌利用，令红茶菌饮料快速发酵至发酵终点，即pH值为2.6-3.3。另外，所述星形假丝酵母Y3-13可以在茶底发酵过程中合成β-葡萄糖苷酶及其它胞外酶，从而提高红茶菌饮料的香味，使终产品风味浓郁，适宜饮用。制备酵母菌剂和醋酸菌冻干物能够更好地保存发酵剂，并便于控制接种量；选用常存在于红茶菌中的菌种纯菌复配发酵能够避免杂菌污染，并还原传统红茶菌的正宗风味。采用此方法发酵的红茶菌饮料，发酵时间和终产物可控，安全性和品质稳定性均有保障。
附图说明
图1为星形假丝酵母26S rDNA的基因序列。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
定义
红茶菌是指能够将糖茶水和/或果汁以及任选的配料发酵为红茶菌饮料的包含酵母菌和醋酸菌的共生菌群，所述红茶菌可以以如下形式提供：发酵得到的含活跃菌株的发酵液、菌膜、以及如果摇床发酵为发酵液中的菌体，或者为复配的微生物混合物，但不限于此。例如，红茶菌可包括本发明所述的微生物制剂。
红茶菌饮料是指用红茶菌对茶底(即茶糖水)和/或果汁以及任选的配料进行发酵后的产品，可包括但不限于以下：不经灭菌/除菌的发酵产品、或经灭菌/除菌的发酵产品。
所述配料可包括发酵红茶菌饮料常用的配料，例如水果干、食用花卉或草本植物食品原料(例如香草、姜等)和/或天然香料(例如八角、肉桂等)，但不限于此。
发酵茶底是指用茶叶(红茶、绿茶、乌龙茶、普洱茶、花茶)及糖类(蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜、蜂蜜)经水冲泡后的糖茶水。所述发酵茶底也可用作本发明的微生物制剂的扩培培养液。
本发明中，本发明人从传统红茶菌中分离、筛选出一株星形假丝酵母酵母，将其命名为星形假丝酵母Y3-13。
因此，本发明提供了一种星形假丝酵母Y3-13，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日：2019年11月19日，保藏号：CGMCC No.18970。
星形假丝酵母(Candida stellata)属于假丝酵母属，子囊菌门酵母目，其分类学历史经历过很多变化，是传统食物及饲料中的常用菌种。星形假丝酵母常分离于未发酵的葡萄汁中，对于增强葡萄酒的香气与风味有着一定的作用。星形假丝酵母细胞成圆形或卵圆形，可以排列为星形结构，不形成菌丝或假菌丝。
对星形假丝酵母Y3-13的分离和鉴定方法如下所述：
从购买的红茶菌中以无菌方式取5g，均质混匀，用无菌生理盐水梯度稀释，以涂布的方式将稀释液均匀涂布于YPD固体培养基上，在30℃下培养48小时；选取单菌落，转接至新的YPD固体培养基上，得到生长出来的菌落，观察其大小、颜色、边缘、光滑度、透明度等特点，选择在YPD固体培养基上形成的奶油色、边缘整齐、表面光泽、锥状凸起、不透明的菌落，得菌株Y3-13。YPD培养基成分为2wt％葡萄糖、2wt％蛋白胨、1wt％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟；其中，YPD固体培养基中进一步含有2wt％琼脂。
对获得的菌株26S rDNA序列(SEQ ID NO.:1)进行测序，与NCBI数据库进行比对，进行分子生物学鉴定。同时，根据生理生化特征的鉴定结果(参照J.A.巴尼特的《酵母菌的特征与鉴定手册》，青岛海洋大学出版社，1991年进行鉴定)，最终将该菌株鉴定并命名为星形假丝酵母Y3-13(Candida stellata)。
对于本发明的星形假丝酵母Y3-13，可采用本领域公知的程序来进行培养和保存。以举例的方式，可用YPD培养基对本发明的星形假丝酵母Y3-13进行培养。具体而言，挑取YPD平板培养的星形假丝酵母Y3-13菌株2-3环接入YPD液体培养基中，培养参数为：温度25-32℃，150-220rpm，恒温振荡培养2-3天至活菌数不少于108CFU/mL。所述YPD液体培养基成分为2wt％葡萄糖、2wt％蛋白胨、1wt％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。应当指出的是，培养条件只要适用于星形假丝酵母的生长繁殖的条件即可，本领域技术人员可根据实际需要对培养条件和培养基进行修改或优化，这些修改和/或优化也在本发明的范围内。
在另一方面，本发明提供了微生物制剂，所述微生物制剂包含本发明所述的星形假丝酵母Y3-13。
在本发明的实施方式中，所述微生物制剂还包含醋酸菌，并任选地包含接合酵母和酒香酵母中的一种或多种。在优选的实施方式中，所述微生物制剂包含星形假丝酵母Y3-13、醋酸菌、接合酵母和酒香酵母。在优选的实施方式中，所述醋酸菌为驹形杆菌、液化葡糖醋杆菌(Gluconacetobaceter liquefaciens)、醋化醋酸杆菌(Acetobacter aceti)、巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)中的至少一种。所述驹形杆菌优选选自莱迪亚驹形杆菌(Komagataeibacter rhaeticus)、中间驹形杆菌(Komagataeibacter intermedius)、木驹形杆菌(Komagataeibacter xylinus)、汉森驹形杆菌(Komagataeibacter hansenii)。
对于接合酵母、酒香酵母和醋酸菌，可以是从市场上商购的，也可使用本领域已知的分离和/或筛选接合酵母、酒香酵母和醋酸菌的方法从含有它们的来源(例如传统红茶菌)中分离和/或筛选得来，只要是可用于制备红茶菌或者分离自红茶菌的菌株均可。接合酵母、酒香酵母和醋酸菌的来源选择并不会限制本发明的范围。
仅作为举例，接合酵母可选自二孢接合酵母(Zygosaccharomyces bisporus)、佛罗伦萨接合酵母(Zygosaccharomyces florentina)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)和鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)中的至少一种，优选二孢接合酵母。酒香酵母可选自布鲁塞尔/德克酒香酵母(Brettanomyces/Dekkera bruxellensis)、间型酒香酵母(Brettanomyces intermedius)、异酒香酵母(Brettanomyces anomala)和卡斯酒香酵母(Brettanomyces custersii)中的至少一种，优选布鲁塞尔德克酵母。醋酸菌可选自莱迪亚驹形杆菌、中间驹形杆菌、木驹形杆菌、汉森驹形杆菌、液化葡糖醋杆菌、醋化醋酸杆菌、巴氏醋酸杆菌、氧化葡糖杆菌中的至少一种，优选莱迪亚驹形杆菌。
在优选的实施方式中，所述微生物制剂为冻干菌剂。在一些优选的实施方式中，所述微生物制剂进一步包含茶粉或着色剂，以及任选地冻干保护剂。
其中，所述茶粉能够在调节微生物制剂颜色、气味的同时增加发酵液的茶香。优选地，茶粉包括绿茶粉、红茶粉、乌龙茶粉、茉莉花茶粉；优选地，所述茶粉为>600目，添加量为所述微生物制剂的1w/v％-50w/v％。
优选地，所述着色剂选自红曲红、叶绿素铜钠、姜黄、栀子黄、胡萝卜素、藻蓝素、柠檬黄、新红、靛蓝、亮蓝，或它们的任意组合。
优选地，所述冻干保护剂选自脱脂乳、谷氨酸钠、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸、甘油，或它们的任意组合。
在本发明的优选实施方式中，可将各菌株单独制备成冻干菌剂，然后按照比例进行混合，得到复配的微生物制剂。在优选的实施方式中，所述冻干菌剂中的活菌数为106-1011CFU/g、优选108-1010CFU/g。
在复配的微生物制剂中，各种冻干菌粉的比例可根据实际需求进行调整，因为红茶菌本身的酸度抑制了有害细菌的生长并且适宜于本发明的微生物制剂的生长。例如，在所述复配的微生物制剂中，所述星形假丝酵母与醋酸菌的比例可为1-50:1-50的质量比。在一个实施方式中，所述星形假丝酵母、醋酸菌、与接合酵母(或酒香酵母)的比例为1-50:1-50:1-50的质量比。在优选的实施方式中，所述星形假丝酵母、醋酸菌、接合酵母、和酒香酵母的比例为1-10:1-10:1-10:1-10的质量比。
在另一方面，本发明提供了包含如本发明所述的星形假丝酵母Y3-13的红茶菌。在一些实施方式中，所述红茶菌可为本文所述的复配微生物制剂。另外，所述红茶菌还可包括但不限于：茶底发酵液、菌膜、发酵液中的菌体，其可以作为菌种继续制备红茶菌或红茶菌饮料。
在另一方面，本发明提供了由包含本发明所述的星形假丝酵母Y3-13的微生物制剂生产的发酵制品。所述发酵制品为本发明的微生物制剂或本发明的红茶菌对原料进行发酵后发酵而成，经过或不经过杀菌处理。所述原料包括但不限于茶底(即茶糖水)、果汁、和/或果汁稀释液(其中果汁的含量为15v/v％-30v/v％)，以及任选的配料。所述配料可包括水果干、食用花卉或草本植物食品原料(例如香草、姜等)和/或天然香料(例如八角、肉桂等)。
在优选的实施方式中，所述果汁选自苹果汁、葡萄汁、橙汁、桃汁、梨汁、石榴汁中的一种或多种。所述果汁稀释液可用饮用水(包括纯净水、矿泉水、蒸馏水等)来进行稀释。在优选的实施方式中，所述原料中还可额外包含碳源，所述碳源可选自所述微生物制剂可代谢的碳源，例如，葡萄糖、蔗糖、乙醇等。
在本发明中，果汁是指以水果为原料经过物理方法如压榨、离心、萃取等得到的汁液产品，一般是指纯果汁或100％果汁。
所述发酵制品可为无酒精发酵制品，也可为低酒精发酵制品。其中，无酒精发酵品的酒精含量小于0.5w/v％，低酒精发酵制品的酒精含量为0.5-1.5w/v％。
在另一方面，本发明提供了如上所述的微生物制剂的制备方法，所述方法包括对所述星形假丝酵母Y3-13进行培养。
对星形假丝酵母Y3-13的培养方法和参数如上所述。
在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括对醋酸菌、接合酵母、和/或酒香酵母进行培养的步骤。
对于醋酸菌、接合酵母、和/或酒香酵母，其定义如上。
对于醋酸菌、接合酵母、和/或酒香酵母，可采用本领域公知的程序来进行培养。
例如，对于接合酵母和酒香酵母，可用YPD培养基对其培养。具体而言，挑取YPD平板培养的接合酵母或酒香酵母2-3环分别接入YPD培养基中，培养参数为：温度25-32℃，150-220rpm，恒温振荡培养2-3天至活菌数不少于108CFU/ml。
例如，对于醋酸菌，可用YPM培养基对其培养，所述YPM培养基成分为2.5wt％甘露醇、0.3wt％蛋白胨、0.5wt％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。具体而言，挑取YPM平板培养的醋酸菌2-3环接入YPM培养基中，培养参数为：温度30-35℃，150-220rpm恒温振荡培养3-4天，或恒温静置培养3-5天，至活菌数不少于108CFU/ml。
在优选的实施方式中，本发明的微生物制剂的制备方法还包括对所述微生物进行冻干的步骤。
所述冻干菌剂是指将本发明的星形假丝酵母Y3-13以及其它菌株的菌体经冻干处理后获得的菌剂，通常为干粉状形式。在优选的实施方式中，所述冻干菌剂中的活菌数为106-1011CFU/g、优选108-1010CFU/g。制备所述冻干菌剂的方法是本领域技术人员已知的，例如将菌株的培养液经离心后收集菌体/菌泥，加入冻干保护剂采用真空冷冻干燥技术制备得到。所述冻干保护剂可使用本领域熟知的冻干保护剂，例如多糖或多元醇。在进一步优选的实施方式中，所述冻干保护剂成分为10％脱脂乳、5％蔗糖、1％山梨醇、0.1％谷氨酸钠，115℃蒸汽灭菌15分钟。
在另一方面，本发明提供了制备红茶菌的方法，所述方法包括使用本发明的星形假丝酵母Y3-13或微生物制剂来制备所述红茶菌。在一个实施方式中，所述红茶菌可为本发明所述微生物制剂，所述微生物制剂包含星形假丝酵母Y3-13和醋杆菌。
在另一方面，本发明提供了一种制备所述发酵制品的方法，所述方法包括：
使用本发明所述的微生物制剂对原料进行发酵，从而得到所述发酵制品；优选地，发酵的条件为：在25-33℃下，兼性厌氧发酵，并当培养液的pH值在2.9-3.2之间时，终止发酵。
所述原料包括但不限于茶底(即茶糖水)、果汁、和/或果汁稀释液(其中果汁的含量为15v/v％-30v/v％)，以及任选的配料。所述配料可包括水果干、食用花卉或草本植物食品原料(例如香草、姜等)和/或天然香料(例如八角、肉桂等)。
在优选的实施方式中，所述果汁选自苹果汁、葡萄汁、橙汁、桃汁、梨汁、石榴汁中的一种或多种。所述果汁稀释液可用饮用水(包括纯净水、矿泉水、蒸馏水等)来进行稀释。在优选的实施方式中，所述原料中还可额外地包含碳源，所述碳源可选自所述微生物制剂可代谢的碳源，例如，葡萄糖、蔗糖、乙醇等。
在本发明的实施方式中，所述微生物制剂的添加量为所述原料的1w/v％-5w/v％。
在优选的实施方式中，所述制备发酵制品的方法进一步包括制备扩培发酵液的步骤，所述步骤包括将本发明所述的微生物制剂在扩培培养液中进行培养。优选地，所述培养条件为在25-33℃下，静置培养3-5天，直至pH降至2.9-3.2之间。
所述扩培培养液可为YPD培养液，和/或发酵茶底。所述发酵茶底可为含有4％-10％的糖和5w/w％-20w/w％的食用醋的茶水。其中，所述茶水可通过常规的方式获得。例如，用75℃-100℃的水冲泡质量比例为0.4w/w％-0.9w/w％的茶叶5-20min。在本发明中，所述茶叶可选自红茶、绿茶、乌龙茶、花茶、普洱茶或它们的组合。所述糖只要为星形假丝酵母可代谢食用的糖即可。所述糖可选自蔗糖，糖蜜、葡萄糖、果糖、蜂蜜等，优选蔗糖。所述食用醋为市售食品级白醋(总酸3.5-5g/100mL)。本领域技术人员能够根据白醋中醋酸的含量对白醋添加量进行调整，并且些许的差别不会对发酵结果造成影响。
在优选的实施方式中，所述扩培培养液通过以下方法制备：用75℃-100℃的水冲泡0.4w/w％-0.9w/w％的茶叶5-20min，过滤后，向茶水中加入4w/w％-10w/w％的糖和5w/w％-20w/w％的食用醋，快速降温至20℃-30℃而获得。
其中，将本发明所述的微生物制剂以1w/v％-5w/v％的量添加至所述扩培培养液中。
在一个实施方式中，所述扩培发酵液的制备方法包括向扩培培养液中加入1w/v％-5w/v％的本发明所述的微生物制剂，用8-10层纱布封口，在25-33℃下，培养3-5天，直至pH降至2.9-3.2之间。
作为可选的实施方式，由发酵茶底所获得的发酵液也包含在本发明所述的发酵制品的范畴中。
在一些实施方式中，在用发酵茶底制备扩培发酵液过程中，在发酵的第3天pH降低至3以下；在发酵的第4天，pH＝2.8±0.1。经GB5009.139-2014方法测定在发酵的第4天咖啡因含量降低30％。在一些实施方式中，经GB5009.225-2016方法测定在发酵的第4天无酒精检出。其中，所述发酵茶底通过以下方法制备：用75℃-100℃的水冲泡0.4w/v％-0.9w/v％的茶叶5-20min，过滤后，向茶水中加入4w/v％-10w/v％的糖和5w/w％-20w/w％的食用醋，快速降温至20℃-30℃；制备扩培发酵液的方法如下：向发酵茶底中加入1w/v％-5w/v％的本发明所述的微生物制剂，用8-10层纱布封口，在25-33℃下，培养3-5天，直至pH降至2.9-3.2之间。
本领域技术人员可以根据实际需要对发酵液中的活菌数、发酵时间、环境条件和接种比例进行选择和调整，这一点并不会对本发明进行限制。
在一个优选的实施方式中，所述制备发酵制品的方法包括：向本发明的扩培发酵液中加入果汁，所述果汁添加量为15v/v％-30v/v％，所述果汁为苹果汁、葡萄汁、橙汁、桃汁、梨汁、石榴汁中的一种，在25-33℃下，静置密闭培养1-2天，然后过滤并进行杀菌，从而得到所述红茶菌饮料。
在优选的实施方式中，所述杀菌过程为巴氏杀菌，优选在70℃-90℃的条件下巴氏杀菌15-30min。所述储存方法可使用本领域熟知的储存方法，如冷藏储存。
实施例
以下结合具体实施例对本文进行详细描述。下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1星形假丝酵母菌株的筛选与鉴定
从红茶菌中分离与鉴定星形假丝酵母Y3-13的具体步骤如下：
从购买的正宗特级“海宝”中以无菌方式取5g，均质混匀，用无菌生理盐水梯度稀释，以涂布的方式将稀释液均匀涂布于平皿中的YPD固体培养基上，将平皿倒置于30℃下培养48小时至可见明显的单菌落。选取单菌落，将挑选的各单菌落分别在YPD固体培养基反复划线后在30℃培养，直至菌落在颜色、大小和形态完全一致。观察其大小、颜色、边缘、光滑度、透明度等特点，选择在YPD固体培养基上形成的奶油色、边缘整齐、表面光泽、锥状凸起、不透明菌落的菌株，得到纯化的菌株Y3-13。所述YPD培养基成分为2wt％葡萄糖、2wt％蛋白胨、1wt％酵母提取物、2wt％琼脂，115℃蒸汽灭菌30分钟。
将纯化后的单菌落转接至5mL YPD液体培养基中，于30℃下200rpm振荡扩大培养24小时。使用DNA提取试剂盒提取该菌落的基因组DNA，通过26S序列对所选菌株进行分类学上的鉴定。用26S rDNA通用引物进行26S rDNA PCR扩增。
将扩增产物进行测序，将所得序列结果在NCBI中进行BLAST比对，该菌株与Candida stellata strain CBS843 26S同源性最高，同源性为99.18％。结合该菌株的形态特征和生理生化分析，该筛选出的纯化菌在分类学上属于星形假丝酵母，将其命名为星形假丝酵母Y3-13。该酵母保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCNo.18970)，保藏日期为2019年11月19日，分类学名称为星形假丝酵母(Candidastellata)。
实施例2由星形假丝酵母制备的红茶菌饮料
将星形假丝酵母用于制备红茶菌饮料，具体过程如下：
1)酵母菌的制备：挑取YPD平板培养的星形假丝酵母Y3-13、二孢接合酵母(60348TM)或布鲁塞尔德克酵母(/>10560TM)3环分别接入YPD培养基，温度30℃，220rpm，振荡培养2天至活菌数不少于108CFU/ml，离心去上清，沉淀加入适量保护剂重悬，-80℃预冻后真空冷冻干燥，得到冻干粉活菌数为1×1010CFU/g。
所述YPD培养基成分为2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。所述保护剂成分为10％脱脂乳、5％蔗糖、1％山梨醇、0.1％谷氨酸钠，115℃蒸汽灭菌15分钟。
2)醋酸菌的制备：挑取YPM平板培养的莱迪亚驹形杆菌Gan9-10(BAA-2831TM或者宝鸡鼎力生物科技有限公司LB2002醋酸菌种)3环接入YPM培养基，温度30℃，静置培养5天至活菌数不少于108CFU/ml，浓缩后加入适量保护剂，-80℃预冻后真空冷冻干燥，得到冻干物活菌数为1×1010CFU/g。
所述YPM培养基成分为2.5％甘露醇、0.3％蛋白胨、0.5％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。所述保护剂成分为10％脱脂乳、5％蔗糖、1％山梨醇、0.1％谷氨酸钠，115℃蒸汽灭菌15分钟。
3)复配发酵剂的制备：将星形假丝酵母Y3-13、接合酵母、酒香酵母和驹形杆菌以质量比例为1：1：1：1行混合，其活菌数为1×1010CFU/g。
4)发酵茶底的制备：用90℃的水冲泡质量比例为0.7w/w％的红茶5min，过滤后，向茶水中加入8％的蔗糖和15w/w％的总酸不低于3.95g/100mL的白醋，快速降温至20℃后得到发酵用茶底。
5)茶底发酵液的制备：向所述茶底中加入5w/w％的复配发酵剂用8-10层纱布封口，在30℃下培养，连续测定pH值，当pH值降至2.9时终止发酵，记录发酵时间(表1)。
6)红茶菌饮料的制备：取出菌膜，向茶底发酵液加入15v/v％的果汁，密闭培养2天，其中，所述果汁为葡萄汁。所得红茶菌饮料过滤后，在90℃的条件下巴氏杀菌15-30min后冷藏储存。
7)红茶菌饮料的感官评价：由15位具有饮料产品评判经验的工作人员对实施例制作的红茶菌饮料从色泽、气味、滋味和口感进行感官评价(表2)。
对比例1由传统红茶菌菌膜制备的红茶菌饮料
将传统红茶菌菌膜用于制备红茶菌饮料，具体过程如下：
1)发酵茶底的制备：用90℃的水冲泡质量比例为0.7w/w％的红茶5min，过滤后，向茶水中加入8％的蔗糖和15w/w％的总酸不低于3.95g/100mL的白醋，快速降温至20℃后得到发酵用茶底。
2)茶底发酵液的制备：向所述茶底中加入10w/w％的市售菌膜(电商购买)，用8-10层纱布封口，在30℃下培养，连续测定pH值，当pH值降至2.9时终止发酵，记录发酵时间(表1)。
3)红茶菌饮料的制备：取出菌膜，向茶底发酵液加入15v/v％的果汁，密闭培养2天，其中，所述果汁为葡萄汁。所得红茶菌饮料过滤后，在90℃的条件下巴氏杀菌15-30min后冷藏储存。
4)红茶菌饮料的感官评价：由15位具有饮料产品评判经验的工作人员对实施例制作的红茶菌饮料从色泽、气味、滋味和口感进行感官评价(表2)。
由表1可以看出，相比于传统红茶菌，本发明的红茶菌能够使发酵更快到达发酵终点。
表1红茶菌发酵过程中pH值变化趋势
对比例2由酿酒酵母制备的红茶菌饮料
使用酿酒酵母(安琪产品)代替星形假丝酵母Y3-13制备红茶菌饮料，其余条件与实施例2相同。具体过程如下：
1)酵母菌的制备：挑取YPD平板培养的市售安琪酿酒酵母、二孢接合酵母(60348TM)或布鲁塞尔德克酵母(/>10560TM)3环分别接入YPD培养基，温度30℃，220rpm，振荡培养2天至活菌数不少于108CFU/ml，离心去上清，沉淀加入适量保护剂重悬，-80℃预冻后真空冷冻干燥，得到冻干粉活菌数为1×1010CFU/g。
所述YPD培养基成分为2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。所述保护剂成分为10％脱脂乳、5％蔗糖、1％山梨醇、0.1％谷氨酸钠，115℃蒸汽灭菌15分钟。
2)醋酸菌的制备：挑取YPM平板培养的莱迪亚驹形杆菌Gan9-10(BAA-2831TM或者宝鸡鼎力生物科技有限公司LB2002醋酸菌种)3环接入YPM培养基，温度30℃，静置培养5天至活菌数不少于108CFU/ml，浓缩后加入适量保护剂，-80℃预冻后真空冷冻干燥，得到冻干物活菌数为1×1010CFU/g。
所述YPM培养基成分为2.5％甘露醇、0.3％蛋白胨、0.5％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。所述保护剂成分为10％脱脂乳、5％蔗糖、1％山梨醇、0.1％谷氨酸钠，115℃蒸汽灭菌15分钟。
3)复配发酵剂的制备：将酿酒酵母、接合酵母、酒香酵母和驹形杆菌以质量比例为1：1：1：1行混合，其活菌数为1×1010CFU/g。
4)发酵茶底的制备：用90℃的水冲泡质量比例为0.7w/w％的红茶5min，过滤后，向茶水中加入8％的蔗糖和15w/w％的总酸不低于3.95g/100mL的白醋，快速降温至20℃后得到发酵用茶底。
5)茶底发酵液的制备：向所述茶底中加入5w/w％的复配发酵剂用8-10层纱布封口，在30℃下培养，连续测定pH值，当pH值降至2.9时终止发酵。
6)红茶菌饮料的制备：取出菌膜，向茶底发酵液加入15v/v％的果汁，密闭培养2天，其中，所述果汁为葡萄汁。所得红茶菌饮料过滤后，在90℃的条件下巴氏杀菌15-30min后冷藏储存。
7)红茶菌饮料的感官评价：由15位具有饮料产品评判经验的工作人员对实施例制作的红茶菌饮料从色泽、气味、滋味和口感进行感官评价(表2)。
对比例3由星形假丝酵母CGMCC 2.2188(或52826TM)制备的红茶菌饮料
使用星形假丝酵母CGMCC 2.2188(或52826TM)代替星形假丝酵母Y3-13制备红茶菌饮料，其余条件与实施例2相同。具体过程如下：
1)酵母菌的制备：挑取YPD平板培养的星形假丝酵母CGMCC 2.2188(或52826TM)、二孢接合酵母(/>60348TM)或布鲁塞尔德克酵母(/>10560TM)3环分别接入YPD培养基，温度30℃，220rpm，振荡培养2天至活菌数不少于108CFU/ml，离心去上清，沉淀加入适量保护剂重悬，-80℃预冻后真空冷冻干燥，得到冻干粉活菌数为1×1010CFU/g。
所述YPD培养基成分为2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。所述保护剂成分为10％脱脂乳、5％蔗糖、1％山梨醇、0.1％谷氨酸钠，115℃蒸汽灭菌15分钟。
2)醋酸菌的制备：挑取YPM平板培养的莱迪亚驹形杆菌Gan9-10(BAA-2831TM或者宝鸡鼎力生物科技有限公司LB2002醋酸菌种)3环接入YPM培养基，温度30℃，静置培养5天至活菌数不少于108CFU/ml，浓缩后加入适量保护剂，-80℃预冻后真空冷冻干燥，得到冻干物活菌数为1×1010CFU/g。
所述YPM培养基成分为2.5％甘露醇、0.3％蛋白胨、0.5％酵母提取物，115℃蒸汽灭菌30分钟。所述保护剂成分为10％脱脂乳、5％蔗糖、1％山梨醇、0.1％谷氨酸钠，115℃蒸汽灭菌15分钟。
3)复配发酵剂的制备：将星形假丝酵母CGMCC 2.2188(或52826TM)、接合酵母、酒香酵母和驹形杆菌以质量比例为1：1：1：1行混合，其活菌数为1×1010CFU/g。/>
4)发酵茶底的制备：用90℃的水冲泡质量比例为0.7w/w％的红茶5min，过滤后，向茶水中加入8％的蔗糖和15w/w％的总酸不低于3.95g/100mL的白醋，快速降温至20℃后得到发酵用茶底。
5)茶底发酵液的制备：向所述茶底中加入5w/w％的复配发酵剂用8-10层纱布封口，在30℃下培养，连续测定pH值，当pH值降至2.9时终止发酵。
6)红茶菌饮料的制备：取出菌膜，向茶底发酵液加入15v/v％的果汁，密闭培养2天，其中，所述果汁为葡萄汁。所得红茶菌饮料过滤后，在90℃的条件下巴氏杀菌15-30min后冷藏储存。
7)红茶菌饮料的感官评价：由15位具有饮料产品评判经验的工作人员对实施例制作的红茶菌饮料从色泽、气味、滋味和口感进行感官评价(表2)。
由表2中可以看出，与使用酿酒酵母或其它星形假丝酵母制备的红茶菌相比，使用本发明的星形假丝酵母Y3-13的红茶菌进行发酵能够达到传统红茶菌的风味水平，并对风味的提升有正向作用。由此可见，本发明传统红茶菌能够快速制得风味优良的红茶菌饮料。
表2红茶菌饮料感官评价
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序列表
<110> 中粮集团有限公司;中粮营养健康研究院有限公司
<120> 一种红茶菌中的星形假丝酵母及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 488
<212> DNA
<213> Candida stellata
<400> 1
aaaccaacag ggattgccct agtaacggcg agtgaacagg caagagctca gatttgaaag 60
gcacttgtgc cattgtattc tgaagttagg attcttggaa ccgataccta agttttctgg 120
aaagaaacgc catagagggt gatagccccg tacggtattg acccaatata gtttcctaac 180
atggagtcga gttgtttggg aatgcagctc aaatgggtgg tatgctccat ctaaggctaa 240
atatttgcga gagaccgata gcgaacaagt actgtgaagg aaagatgaaa agaactttga 300
aaagagagtg aaatagtacg tgaaattgtt gaaatggaag ggtaggctgc taaccatgta 360
gaaccgtgtt tggggggaag ataaaagctg cagaacgtaa ctcctcggag cattatagct 420
gcagtccata ttcccatccg agcgcgagga tctcaggttc tactaaatgg tggtctacca 480
cccgtctt 488

Claims (28)

1.一种星形假丝酵母Y3-13，所述星形假丝酵母的保藏编号为CGMCC No.18970。
2.一种微生物制剂，所述微生物制剂包含权利要求1所述的星形假丝酵母Y3-13。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂还包含醋酸菌。
4.如权利要求3所述的微生物制剂，其中，所述醋酸菌为驹形杆菌、液化葡糖醋杆菌、醋化醋酸杆菌、巴氏醋酸杆菌、氧化葡糖杆菌中的至少一种。
5.如权利要求4所述的微生物制剂，其中，所述驹形杆菌选自莱迪亚驹形杆菌、中间驹形杆菌、木驹形杆菌、汉森驹形杆菌。
6.如权利要求3所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂还包含接合酵母和酒香酵母中的一种或多种。
7.如权利要求6所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂同时包含接合酵母和酒香酵母。
8.如权利要求2-7中任一项所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂进一步包含茶粉或着色剂，以及任选的冻干保护剂。
9.如权利要求8所述的微生物制剂，其中，所述茶粉选自绿茶粉、红茶粉、乌龙茶粉和茉莉花茶粉。
10.如权利要求8所述的微生物制剂，其中，所述茶粉为>600目，添加量为所述微生物制剂的1w/v％-50w/v％。
11.如权利要求8所述的微生物制剂，其中，所述着色剂选自红曲红、叶绿素铜钠、姜黄、栀子黄、胡萝卜素、藻蓝素、柠檬黄、新红、靛蓝、亮蓝，或它们的任意组合。
12.如权利要求8所述的微生物制剂，其中，所述冻干保护剂选自脱脂乳、谷氨酸钠、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸、甘油，或它们的任意组合。
13.如权利要求2-7中任一项所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂为冻干菌剂。
14.如权利要求13所述的微生物制剂，其中，所述冻干菌剂中的活菌数为106-1011CFU/g。
15.如权利要求13所述的微生物制剂，其中，所述冻干菌剂中的活菌数为108-1010CFU/g。
16.如权利要求8所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂为冻干菌剂。
17.一种发酵制品，其中，所述发酵制品由如权利要求2-16中任一项所述的微生物制剂制造。
18.如权利要求17所述的发酵制品，其中，所述发酵制品为无酒精发酵制品或低酒精发酵制品。
19.一种制备如权利要求17或18所述的发酵制品的方法，所述方法包括：
使用如权利要求2-16中任一项所述的微生物制剂对原料进行发酵，从而得到所述发酵制品；
其中，所述原料选自果汁和/或果汁稀释液。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述发酵的条件为：在25-33℃下，兼性厌氧发酵，并当培养液的pH值在2.9-3.2之间时，终止发酵。
21.如权利要求19所述的方法，其中，所述果汁选自苹果汁、葡萄汁、橙汁、桃汁、梨汁、石榴汁中的一种或多种。
22.如权利要求19所述的方法，其中，所述果汁稀释液为果汁含量15v/v％-30v/v％的稀释液。
23.如权利要求19中任一项所述的方法，所述方法进一步包括制备扩培发酵液的步骤，所述步骤包括将如权利要求2-16中任一项所述的微生物制剂在扩培培养液中进行培养。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述培养条件为在25-33℃下，静置培养3-5天，直至pH降至2.9-3.2之间。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述扩培培养液通过以下方法制备：用75℃-100℃的水冲泡0.4w/v％-0.9w/v％的茶叶5-20min，过滤后，向茶水中加入4w/v％-10w/v％的糖和5w/w％-20w/w％的食用醋，快速降温至20℃-30℃而获得。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述茶叶为红茶、绿茶、乌龙茶、普洱茶、花茶或它们的组合；或者，所述糖为蔗糖、糖蜜、葡萄糖、果糖或蜂蜜。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述糖为蔗糖。
28.如权利要求25所述的方法，其中，将如权利要求2-16中任一项所述的微生物制剂以1w/v％-5w/v％的量添加至所述扩培培养液中。
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