HU192162B - Process for preparing antibiotica 47934 - Google Patents

Process for preparing antibiotica 47934 Download PDF

Info

Publication number
HU192162B
HU192162B HU832446A HU244683A HU192162B HU 192162 B HU192162 B HU 192162B HU 832446 A HU832446 A HU 832446A HU 244683 A HU244683 A HU 244683A HU 192162 B HU192162 B HU 192162B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibiotic
water
medium
vitamin
fermentation
Prior art date
Application number
HU832446A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert L Hamill
Ralph E Kastner
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HU192162B publication Critical patent/HU192162B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/19—Antibiotic
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/27—Cyclic peptide or cyclic protein

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

(57) KIVONAT
A találmány tárgya eljárás az (I) képletű A 47 934 antibiotikum vagy farmakológiai szempontból alkalmazható bázikus sóinak előállítására Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 mikroorganizmus vagy annak A 47 934 antibiotikumot termelő variánsának vagy mutánsának tenyészetével asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, illetve szervetlen sókat tartalmazó táptalajban, süllyesztett aerob fermentációs körülmények között. Az A 47 934 antibiotikum számos Gram pozitív patogén baktériummal szemben aktív, ezáltal egyes humán vagy állati fertőzöttségek kezelésére vagy megelőzésére antibiotikumként használható.
OH Cl
-119? 16?
A találmány tárgya eljárás új antibiotikus tulajdonságú fermentációs termékek előállítására egy eddig még le nem írt mikroorganizmus, a Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 tenyészetével.
Sok mikroorganizmus patogén, s mint ilyenek kiváltó okai humán, valamint állati betegségek fellépésének.
Ma már nagyszámú antibiotikum ismeretes, köztük olyanok, melyek egy vagy több patogén mikroorganizmussal szemben aktívak. Nagy szükség van azonban új antibiotikumokra, mert fennáll az antibiotikum-rezisztens patogén mikroorganizmusok megjelenésének komoly lehetősége és állandó veszélye. Különösen a Gram pozitív Staphylococcus és Streptococcus nemzetség patogén tagjai rezisztensek gyakran az olyan általánosan használt antibiotikumokkal szemben, mint amilyen a penicillin és az eritromicin [lásd pl. W.O. Foye Principles of Medicinái Chemistry, 684-686. oldal, (1974.)].
A glikopeptid típusú antibiotikumok csoportjába tartozó A 47 934 jelű antibiotikum a Gram pozitív mikroorganizmusokkal szemben aktív.
A glikopeptid antibiotikumok már ismertek, ilyen többek között a vankomicin (3,067.099 sz. US szabadalmi leírás), melynek szerkezetét Villiamson és munkatársai írták le. (J. Am. Chem. Soc. 103, 6580-6585, (1981); az aktaplanin (A-4696 antibiotikum; 3,952.095 sz. US szabadalmi leírás), mely szerkezetének egy részletét a 4,322.343 sz. US szabadalomban írják le; a risztocetin A, a risztocetin komplex egyik tagja, amit Kálmán és munkatársai írtak le. (J. Am. Chem. Soc. 102, 897-905, (1980), és az avoparcin (3,338.786 sz. US szabadalmi leírás), melynek szerkezetéről Ellestad és munkatársai számoltak be (J. Am. Chem. Soc. 103, 6522-6524, (1981).
A találmány szerint az A 47 934 antibiotikum vagy annak farmakológiai szempontból alkalmazható sója hasznos antibiotikum.
Az A 47 934 jelű antibiotikumot az eddig még le nem írt Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 törzzsel, illetve annak A 47 934 antibiotikumot termelő mutánsának vagy variánsának tenyésztésével állíthatjuk elő süllyesztett tenyészetben, aerob körülmények között, asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon.
Az A 47 934 jelű antibiotikum infravörös spektrumát (KBr-ban) az 1. ábrán mutatjuk be.
A találmány tárgya eljárás az (I) képletű, új antibiotikus hatású anyag és farmakológiai szempontból alkalmazható sóinak előállítására.
Az A 47 934 antibiotikum fehér, kristályos vegyület, olvadáspontja > 225 ’C (bomlik). Az antibiotikum gyors-atom bombázású (FAB) tömegspektroszkópiával megállapított molekulasúlya 1311.
Az A 47 934 antibiotikum ‘H mágneses magrezonancia spektrumát dimetilszulfoxidban határoztuk meg, szobahőmérsékleten. A szerkezeti képlet hattagú gyűrűit az ABC betűvel jelöljük, ahogy azt a (II) képletben feltüntettük.
Az alábbi táblázatban a kémiai eltolódás adatait foglaltuk össze.
1. táblázat
Az A 47 934 kémiai eltolódás adatai*
A gyűrű kémiai eltolódás
-NH - 2' 6,78 4,12
-1' 5,02
-2 7,63
-5 7,19
-6 7,45
B gyűrű kémiai eltolódás
-NH 7,62
-1' 5,57
-2 5,67
-6 5,03
C gyűrű kémiai eltolódás
-NH 7,45
-2' 4,86
-1' 3,30
-1' 2,82
-2 7,68
-3 7,16
-6 7,20
D gyűrű kémiai eltolódás
-NH 8,29
-1' 4,43
-2 6,26
-4 6,37
E gyűrű kémiai eltolódás
-NH 8,64
-1' 4,55
-2 7,24
-6 6,78
F gyűrű kémiai eltolódás
-NH 7,65
-1' 5,21
— 2 6,38
— 4 6,35
-6 6,30
G gyűrű kémiai eltolódás
-1' 4,76
-2 6,57
-5 7,65
-6 7,12
* A cserélhető protonok nincsenek feltüntetve.
A molekulasúly, a mágneses magrezonancia és az elemanalízis adatai alapján az A 47 934jelű antibiotikum a ChH^CIjNtÓhS tapasztalati képlettel írható le.
Az új antibiotikum 66%-os vizes dimetilformamidban végzett potenciometriás titrálása három titrálható csoportot jelez 5,85, 7,9 és 10,3 pKa értékkel (kezdeti pH 6,44). Minthogy a titriméter pH 4,0 alatt nem regisztrál, nem tudjuk meghatározni az —SOjH csoportra vonatkozó pKa értéket.
192 162
A titrációs eredmények azt mutatják, hogy az A 47 934 jelű antibiotikum könnyen képez bázisokkal sókat. A pH 3 vagy ez alatti kémhatású erős savakkal szintén képez sókat az antibiotikum.
Az A 47 934 fajlagos forgatóképessége, [aj? = - 1,99 ’ (H2O, C = 10 mg/ml).
Az A 47 934 jelű antibiotikum KBr-ban felvett infravörös abszorpciós spektrumát az 1. ábrán mutatjuk be. A kővetkező megkülönböztető abszorpciós csúcsok figyelhetők meg: 3700-2700 (nagyon széles, intenzív), 1658 (erős), 1615 (közepes), 1590 (közepes), 1510 (közepes), 1491 (közepes), 1472 (gyenge), 1429 (közepes), 1398 (közepes), 1326 (nagyon gyenge), 1265 (közepes), 1231 (erős), 1205 (gyenge), 1005 (közepes), 849 (közepes), 754 (gyenge) és 719 (gyenge) cm-1.
Az A 47 934 jelű antibiotikum ultraibolya spektrumának maximuma mind savas, mind semleges vizes oldatban 281 nm-nél van (ε = 10 850). Az A 47 934 antibiotikum lúgos vizes oldatának ultraibolya spektruma 297 nm-nél mutat maximumot (ε = 18 900).
Az A 47 934 jelű antibiotikus hatású anyagot ez ideig le nem irt Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 törzs tenyészetével állítjuk elő.
Ezt a tenyészetet laboratóriumokban az A 47 934.1 kultúraként jelöltük meg.
Az A 4Π 934.1 kultúra az A 47 934 kultúrából származik természetes szelekcióval, mint annak variáns törzse. Az A 47 934 kultúrát eredetileg a Washington állam-beli Clayton Bayban gyűjtött apályos homokmintából izolálták.
Találmányunkban az antibiotikus hatású anyagot A 47 934 antibiotikumnak jelöljük.
Az A 47 934.1 kultúrát a Streptomyces toyocaensis egyik törzsének határoztuk meg a Streptomyces griseoflavus ATCC 25 456 Shirling és Gottlieb által közzétett leírásával (Cooperative description of type cultures of Streptomyces, Int. J. Syst. Bacteriol., 79(4), 391-512, (1969), valamint a Streptomyces toyocaensis Nishimura, Katagiri, Sato, Mayama és Shimaoka, ATCC 19 814 Shirling és Gottlieb által közölt leírásával (Cooperative description of type cultures of Streptomyces., Int. J. Syst. Bacteriol., 75(2) 174, (1968) való összehasonlítás és bizonyos kiegészítő vizsgálatok alapján.
Az A 47 934.1 spóratömegének színe a szürke (GY) színsorozathoz tartozik, ami különbözik a Streptomyces griseoflavus spóratömegének Waksman által sárgás-szürkésnek leírt színétől [The Actinomycetes, II. kötet, 222. old., The Williams and
- Wilkins Co., Báltimore, (1961)]. További különbség, hogy a Streptomyces griseolflavus hasznosítja a mannitot és a ramnózt, az A 47 934.1 viszont v nem.
Az A 47 934.1 morfológiailag, fiziológiailag és a tenyészet sajátosságait illetően hasonló a Streptomyces toyocaensis Nishimura, Katagisi, Sato, Mayama és Shimaoka ATCC 19 814-hez.
Az A 47 934.1 törzs leírását és jellemzését az alábbiakban írjuk le.
Morfológiája: Az A 47 934.1 törzs jól fejlett, nem-fragmentált, monopódiálisan elágazó légmicéliumokat fejleszt. A spóratartók nyitott, rövid, 2-3 kanyarulatú laza spirálisokban helyezkednek el, ezért az A 47 934.1 törzset Pridham és munkatársai rendszerében a Spira (S) csoportba soroljuk [A guide fór the classification of Streptomyces according te selected groups., Appl. Microbiol., 6, 52-79, 1957)].
Az ismertetett morfológia legjobban az ISP2 és az ISP3 táptalajokon figyelhető meg. Az érett spórafüzér rendszerint 10—50 spórát tartalmaz füzérenként. A spórák alakja nyújtottól oválisig változik, felületük tüskés. A spórák 0,58-0,71 pm szélesek, 0,75-0,88 pm hosszúak; átlagméretük: 0,65 pm szélesség és 0,83 pm hosszúság.
Az A 47 934.1 kultúra különböző táptalajon mutatott növekedési sajátosságait a 2. táblázatban foglaljuk össze.
A színek meghatározásánál az ISCC-NBS Centroid Color Chars Sample No. 2106 (National Bureau of Standards, U.S. Department of Comerce, (1958) és a Color Harmony Manual,) 4. kiadás (Color Standards Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois,) (1958), összehasonl tó mintáit vesszük figyelembe.
2. táblázat
Különböző táptalajon nőtt tenyészetek jellemzői
Táptalaj Jellemző tulajdonságok
élesztő kivonatos-maláta kivonatos agar (ISP2 táptalaj) N: erőteljes F: 68.S.OY LM: jól fejlett, 2ih light olive gray OP: nincs
N: jó F: 91.d.gy.Y
zablisztes agar LM: jól fejlett, 2ih light olive gray OP: nincs N: erőteljes
szervetlen F: 94.1.01Br
sós-keményítős agar LM: erőteljes, 2ih light
(ISP4 táptalaj) olive gray OP: nincs
N: erőteljes
Glicerines-aszparagi- F: 67.brill.OY
nos agar (ISP5 LM: jól fejlett, 2ih light
táptalaj) olive gray OP: nincs
N: jó F: 91.d.gy.Y
Czapek-féle agar LM: jól fejlett, 2ih light olive gray OP: nincs N: erőteljes
Paradicsom F: 94.1.01 BR
pasztás-zablisztes LM: erőteljes, 2ih light
agar olive gray OP: nincs
N = növekedés F = fonák
LM = légmicélium OP = oldható pigment
Az A 47 934.1 és a Streptomyces toyocaensis ATCC 19 814 szénhasznosításának összehasonlítását ISP9 alaptáptalajon végeztük, melyhez az egyes
192 162 sterilre szűrt szénforrásokat 1%-os végkoncentrációban adtuk hozzá. A tenyészeteket 30 ’C hőmérsékleten végzett, tizennégy napos inkubáció után értékeltük. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. 5
3. táblázat
Az A 47 934.1 és a S. toyocaensis ATCC 19 814 szénhasznosítása _:_ 10
Szénforrás A 47 934.1 ATCC 19 814
nincs — —
D-glükóz + +
L-arabinóz + +
Cellobióz n.v.
D-fruktóz + +
D-galaktóz + n.v.
i-inozit + +
D-mannit - +
Melibióz - n.v.
Rafinóz - -
D-ramnóz — -
Ribóz + n.v.
Szalicin - n.v.
Szacharóz - -
D-xilóz + ±
4. táblázat (folytatás)
Jellemző tulajdonságok A 47 934.1 ATCC 19 814
ISP6 — —
ISP7 - -
ISP7, módosított - n.v.
Morfológia s S
NaCl tűrés, százalék 9 n.v.
Nitrátredukció + “H
A fonák oldal színe sárgás-barna (Y-Br) Y. Br.
Fölözött tej hidrolizálás ± +
Oldható pigmentek Spóra alakja Spóra felszíne Keményítő hidrolízis Hőmérséklet nyújtott tüskés + 15—40 nyújtott tüskés + n.v.
tartomány ’C
n.v. = nem vizsgált
S = Spira
Az A 47 934.1 és a Streptomyces toyocaensis ATCC 19 814 közötti hasonlóságokat és különbségeket az 5. táblázatban foglaljuk össze.
5. táblázat
Az A 47 934.1 és a 5. toyocaensis ATCC 19 814 összehasonlítása
Hasonlóság Különbség
- = nincs hasznosítás + = hasznosítás van 30 ± = kétséges a hasznosítás n.v. = nem vizsgált
A teljes sejt hidrolizátumban meghatároztuk egyes diagnosztikai jelentőséggel bíró cukrok jelenlétét. A sejtfal cukorkomponenseit M.P. Lechavalier módosított eljárásával határoztuk meg (Chemical methods as criteria fór the separation of Actynomycetes intő genera. The State Univ. of New Jersey, 1971).
A teljes sejt falának hidrolizátumát használtuk a diaminopimelinsav izomerek meghatározására.
A diaminopimelinsav izomereket Becker és munkatársai módszerével határoztuk meg (Appl. Mikrobiol., 11, 421-423, 1964).
E vizsgálatok ereményeként a következőket álla- 45 píthatjuk meg. A diagnosztikai jelentőséggel bíró cukrok közül glükózt és ribózt mutattunk ki, a
2,6-diaminopimelinsav LL-izomemek adódott.
Az A 47 934.1 és a Streptomyces toyocaensis ATCC 19 814 jellemzőinek összehasonlítását a 4. 50 táblázatban mutatjuk be.
4. táblázat
Az A 47 934.1 és az ATCC 19 814 tulajdonságainak összehasonlítása
Jellemző tulajdonságok A 47 934.1 ATCC 19 814
A spóratömeg színe szürke szürke
Szénhasznositás + + 60
(D-mannit) - +
(D-xilóz) + ±
Zselatin elfolyósítás + +
Melanoid pigment — -
ISP1 — 65
spóratömeg színe (GY) szénhasznositás megkülönböztető pigmentek hiánya zselatin elfolyósítás melanoid pigmentek hiánya morfológia (S) nitrátredukció fölözött tej teszt oldható pigmentek hiánya spórafüzér hossza (10-50 spóra) spórafelszín (tüskés) keményítő hidrolízis a 5. toyocaensis ATCC 19 814 hasznosítja a mannitot
Az A 47 934.1 törzset 1982. január 25-én letétbe helyeztük és az NRRL 15 009 számon hozzáférhető a Northern Régiónál Research Center-ben (Northern Régiónál Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois 61 604).
Az A 47 934 jelű antibiotikum savas jellegű, minthogy karboxilcsoportot és —SO3H csoportot tartalmaz, ezért könnyen képez bázisokkal sókat. Az antibiotikum egy aminocsportot is tartalmaz, ami a pH 3 vagy ennél savasabb kémhatású erős savakkal is képezhet sókat. A bázisokkal képzett, farmakológiai szempontból alkalmazható sók szin-41
192 162 tén szerepelnek a találmányban. A „farmakológiai szempontból alkalmazható sók” kifejezés alatt a melegvérű állatok kemoterápiájában használható sókat értjük.
Az A 47 934 jelű antibiotikum sóit reprezentáló, alkalmazható sók a karboxilcsoport vagy —SO3H csoport és bázisok, például nátriumhidroxid, káliumhidroxid, nátriumkarbonát, káliumkarbonát, kálciujnhidroxid, trimetilamin, ammónium-hidroxid vagy dietanolamin, illetve az aminocsoport és pH3 vagy ennél erősebb savak, például kénsav, sósav vagy foszforsav szabályos reakciójával keletkező addíciós sók.
Az 47 934 antibiotikum Gram pozitív mikroorganizmusokkal szemben aktív. Ez az antibiotikum ugyancsak aktívnak bizonyult a növekedés elősegítését és a tápanyaghasznosítás javítását illetően baromfinál, sertésnél és szarvasmarhánál.
A mikroorganizmusok növekedését gátló A 47 934 jelű antibiotikum szintet különféle vizsgálati eljárásokkal határoztuk meg.
A 6. táblázatban felsoroljuk azokat az anaerob baktériumokat, melyekkel az A 47 934 antibiotikumot megvizsgáltuk és amelyekkel szemben az aktívnak bizonyult. A minimális gátlási koncentráció (MIC) értékeket az agar higításos módszerrel állapítottuk meg.
6. táblázat
Az A 47 934 antibiotikum aktivitása anaerob baktériumokkal szemben
Teszt organizmus MIC (pg/ml)
Clostridium difficile 2994 0,5
Clostridium perfringens 81 0,5
Clostridium septicum 1128 0,5
Eubacterium aerofaciens 1235 1,0
Peptococcus asaccharolyticus 1302 0,5
Peptococcus prevoti 1281 1,0
Peptostreptoccoccus anaerobius 1428 0,25
Peptostreptoccoccus intermedius 1264 1,0
Propionilbacterium acnes 79 1,0
Bacteroides fragilis 111 32,0
Bacteroides fragilis 1877 32,0
Bacteroides fragilis 1936B 32,0
Bacteroides thetaiotaomicron 1438 32,0
Bacteroides melaninogenicus 1856/ 28 > 128,0
Bacteroides melaninogenicus 2736 16,0
Bacteroides vulgáris 1211 32,0
Bacteroides corrodens 1874 32,0
Fusobacterium symbiosum 1470 Fusobacterium necrophorum 6054A 2,0 . 0,25
Az A 47 934 antibiotikum ugyancsak aktív számos Clostridium difficile törzzsel szemben is, amint azt az agarhígitásos módszerrel megállapítottuk. A vizsgálati eredményeket a 7. táblázatban foglaltuk össze.
7. táblázat
Az A 47 934 antibiotikum aktivitása Clostridium difficile törzzsel szemben
Clostridium difficile törzs MIC (pg/ml)
8484 <0,5
6890 <0,5
2634 <1,0
78 <0,5
A-194 <0,5
A-195 <0,5
A-196 <0,5
A-279 <1,0
A-280 <0,5
A-281 <0,5
WAL2112 <0,5
WAL-3657 ^0,5
WAL-4268 <Ξ0,5
107B <í0,5
111F ^0,5
1153 ^0,5
3424-5B <0,5
3816 ^0,5
3950D ^0,5
Az A 47 934 jelű antibiotikum számos Gram
pozitív patogén baktériummal szemben aktív, amint azt a standard agarhígitásos módszerrel megállapítottuk. Az így megállapított minimális gátlási koncertráció értékeket a 8. táblázatban mutatjuk be.
8. táblázat
Az A 47 934 antibiotikum aktivitása különféle baktériumokkal szemben
Mikroorganizmus MIC (pg/ml)
Staphylococcus aureus XI. 1 Staphylococcus aureus V41 Staphylococcus aureus X400 Staphylococcus aureus S13E Staphylococcus epidermidis EPI1 Staphylococcus epidermidis EPI2 Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pneumoniae Park 1 Streptococcus Group D X66 Streptococcus Group D 9960 Haemophilus influenza C.L. Haemophilus influenza 76 Shigella sonnei N9 0,06 0,125 0,25 0,125 0,25 2,0 0,25 0,06 0,5 0,5 2,0 4,0 > 128,0
Escherichia coli N10 > 128,0
Escherichia coli EC14 > 128,0
Escherichia coli TEM > 128,0
Klebsiella pneumoniae X26 > 128,0
Klebsiella pneumoniae KAE > 128,0
Klebsiella pneumoniae X68 > 128
Enterobacter aerogenes C32 >128
Enterobacter aerogenes EBI7 >128
Enterobacter cloacae EB5 >128
Enterobacter cloacae 265A > 128
Salmonella typhi X514 > 128
Salmonella typhi 1335 > 128
192 162
8. táblázat (folytatás)
Mikroorganizmus MIC (pg/ml)
Pseudomonas aeruginosa X528 >128
Pseudomonas aeruginosa X239 >128
Pseudomonas aeruginosa Psl8 >128
Pseudomonas aeruginosa Ps72 >128
Serratiamarcescens X99 >128
Serratia marcescens SE3 >128
Proteus morganii PR 15 >128
Proteus inconstans PR33 >128
Proteus rettgeri PR7 >128
Proteus rettgeri C24 >128
Citrobacter freundii CF17 >128
Az A 47 934 jelű antibiotikum in vivő antimikrobiális aktivitást mutat kísérletes bakteriális fertőzésekkel szemben. A vizsgálati vegyület két dózisát adva be szubkután az illusztratív mikroorganizmussal fertőzött egérbe, az aktivitást a EDS0-érték alapján mérjük EDJ0 = a mg/kg-ban kifejezett hatékony dózis, mely a vizsgálati állatok 50%-át megvédi. Lásd: Warren Wick és munkatársai, J. Bacteriol., 81, 233-235, 1961). Az A 47 934 jelű antibiotikumnál megfigyelt EDS0 értékeket a 9. táblázatban adjuk meg.
9. táblázat
Az A 47 934 jelű antibiotikum in vivő aktivitása
ED50 (mg/kg)
antibiotikum S. pyogenes C 203 S. pneumatiae (Park I) S. aureus 3055
A 47 934 3,38 1,77 0,3
Ha az A 47 934 jelű antibiotikumot intraperitoneálisan adjuk egérbe, az akut toxicitás 300 mg/kgnál nagyobb dózisnál jelentkezik.
A találmány szerinti eljárással előállítható vegyület és sói alkalmasak humán vagy állati fertőzőttség kezelésére, az A 47 934 jelű antibiotikumot vagy annak farmakológiai szempontból alkalmazható sóját adva be a fertőzött emberbe vagy állatba 25-2000 mg közötti antibiotikus hatású dózisban.
Humán fertőzöttség kezelésekor parenterálisan adhatjuk be az antibiotikumot, azaz i.m. injekcióval vagy i.v. infúzióval. Injekciónál az antibiotikumot vagy annak farmakológiai szempontból alkalmazható sóját fiziológiailag alkalmas oldószerben kívánt töménységben oldva juttatjuk be. Alkalmas oldószer lehet például az injekciók számára szolgáló víz, a 0,9%-os sóoldat, az 5%-os dextróz oldat, a Ringer oldat, vagy más általánosan használt oldószer. Intravénás infúzióhoz az antibiotikumot vagy sóját fiziológiás sóoldatban vagy hígított tápoldatban oldjuk fel megfelelő koncentrációban, például 5-10%-ban, és lassan oldjuk be az infúziós oldatot. Alternatív eljárásként az antibiotikumot valamilyen hordozóhoz kötve is bejuttathatjuk a szervezetbe.
Az antibiotikum vagy farmakológiai szempontból alkalmazható sója egységnyi adagokat tartalmazó légmentesen leolvasztott csövekben, steril, gumidugós üvegcsékben vagy műanyag tasakokban forgalmazható. Az egységnyi dózisú kiszerelés tartalmazhat még adalékanyagokat is, például antioxidánsokat, oldódást elősegítő anyagokat, diszpergáló anyagokat, puffereket és hasonlókat. Az egy egységnyi dózisú csomagolás 100 mg A 47 934 jelű antibiotikumot vagy annak farmakológiai szempontból alkalmazható sóját tartalmazhatja gumidugós (butilgumi) üvegcsében. Más egységnyi dózisú csomagolás 250 mg A 47 934 jelű antibiotikumot vagy sóját tartalmazhatja steril, leolvasztott ampullában. Az i.v. infúzióhoz a találmány szerinti egységnyi dózisú csomag előnyösen 5 g A 47 934 jelű antibiotikumot vagy farmakológiai szempontból alkalmazható sóját tartalmazza műanyag tasakban.
Amikor az A 47 934-et antibiotikumként alkalmazzuk, szájon át vagy parenterálisan adjuk be. Az A 47 934 antibiotikumot általában farmakológiai szempontból alkalmazható hordozó vagy hígító adalékanyaggal visszük be. Az A 47 934jelű antibiotikum dózisát a mindenkori körülmények határozzák meg, például a kezelendő konkrét fertőzés természete és súlyossága. A beadagolásra szánt dózisegységet és/vagy az alkalmazandó összmennyiséget a kapott minimális gátlási koncentráció, az EDJ0 érték, a toxicitási adatok, a beteget vagy a gazdaszervezetet jellemző tényezők és a fertőző mikroorganizmus figyelembevételével határozhatjuk meg.
Az A 47 934 jelű antibiotikum felhasználható a bélben pszeudomembrános vastagbélgyulladást okozó Clostridium difficile növekedésének gátlására is. A pszeudomembrános vastagbélgyulladás kezelésére az antibiotikumnak vagy farmakológiai szempontból alkalmazható sójának hatásos adagja szájon át beadható farmakológiailag alkalmazható dozírozott formában. Ily módon való alkalmazásakor az antibiotikumot zselatin kapszulában vagy folyékony szuszpenzióként adhatjuk be.
A találmányban szereplő antibiotikumot állatgyógyszerként is használhatjuk fertőzéses betegségek, például emlőgyulladás kezelésére háztáji és gazdasági állatoknál. Az A 47 934 jelű antibiotikum az állattenyésztésben is használható, például a szarvasmarha és más kérődzők növekedésének serkentésére. Az antibiotikum ily módon történő alkalmazását részletesebben az alábbiakban tárgyaljuk.
Felismertük, hogy az A 47 934 antibiotikum hatással van a fejlett bendőműkődésű kérődzők bendőjében termelődő illékony zsírsavak arányának módosulására. Minthogy a kérődzők szénhidrát hasznosítása fokozódik olyan kezelések hatására, melyek arra serkentik az állatok bendőfióráját, hogy acetátok vagy butirátok helyett inkább propionátokat termeljen (1. Church és munkatársai, „Digestive physiology and nutrition of ruminants”
2. kötet, 622. és 625. oldal, 1971), az A 47 934 antibiotikum képes fokozni ezeknek az állatoknak a tápanyag hasznosítását.
Az A 47 934 jelű antibiotikumnak a bendőben termelődő illékony zsírsavak arányának módosítására gyakorolt hatásosságát a 3 928 571 sz. US. szabadalomban leírt in vitro vizsgálattal állapítjuk meg. Az A 47 934 antibiotikummal végzett vizsgálatok eredményeit a 10. táblázatban ismertetjük.
192 162
10. táblázat
Az A 47 934 antibiotikum hatása az illékony zsírsavak arányára
ható- koncentrá- acetát pro- butirát
anyag ció pionát
A 47 934 4 mcg./ml 0,81 1,32 1,03
A 47 934 10 mcg./ml 0,95 1,12 1,00
A 47 .934 2 mcg./ml 1,09 1,10 1,03
A 47 934 1 mcg./ml 0,99 1,11 1,01
A 10. táblázat adatai az antibiotikumot különböző koncentrációkban tartalmazó, vizsgálatoknál keletkező egyes illékony zsírsavak arányát tüntetik fel. Az adatok leírásának ez a módja mutatja be legvilágosabban a bendő kémiájában történő azon változásokat, melyeket a tápanyaghasznosítás javításának jelenlegi új módszere váltott ki.
A 10. táblázatban megadott eredmények mutat' ják, hogy az A 47 934 antibiotikum hatással van a bendő propionát termelésének fokozódására.
A találmányban szereplő antibiotikus hatású vegyület adagolása megakadályozza és gyógyítja a ketózist, valamint növeli a tápanyaghasznosítást. A ketózis oka a propionátok elégtelen termelődése. A jelenleg ajánlott kezelés propionsav adagolásból vagy propionátok képződését elősegítő táplálék etetéséből áll. Nyilvánvaló, hogy a találmányban ismertetett módszer, mely a szokásos takarmányok esetén is fokozza a propionátok termelődését, csökkenteni fogja a ketózis eshetőségét.
Minthogy az A 47 934 jelű antibiotikum szerkezetileg rokon azzal a többi glikopeptid antibiotikummal, melyeket a fejlett bendőmüködésű tejelő tejtermelésének a javítására használnak, várható, hogy az A 47 934 antibiotikum szintén rendelkezik ilyen irányú hasznosíthatósággal.
Úgy találtuk, hogy a találmányban szereplő antibiotikum növeli a kérődzők tápanyaghasznosítását. Az antibiotikum bejuttatásának legkönnyebb módja, ha azt az állatok takarmányába keverjük.
Ily módon az A 47 934 jelű antibiotikumot könnyen elkeverhetjük a szokásos napi takarmánynyal. Ezt a keveréket azután az ismert módon feletetjük a jószággal.
A tejtermelő állatok szokásos takarmánya különféle szemes takarmánynövényekből - például kukorica és zab - és ezek keverékéből, valamint szálas és darabos takarmányokból - például széna, gyapotmaghéj, rizshéj és silózott takarmány - áll. 30-300 gramm A 47 934 jelű antibiotikum kevert hető el tonnánként (szárazanyagra számítva) ezekkel a takarmánykeverékekkel.
Az A 47 934 jelű antibiotikumnak a tejtermelés javítását célzó kereskedelmi felhasználásához kívánatos a hatóanyagnak előre összeállított takarmány-adalékanyagként vagy koncentrátumként való alkalmazása. Az ilyen készítményekben az antibiotikum egyenletesen eloszlatható a hordozóanyagként szolgáló valamelyik szokásos szerves vagy szervetlen takarmánykomponensben, például az őrölt kukoricában, árpában, szójaporban, búzaés szójalisztben vagy hasonló olcsó, elfogyasztható takarmány alkotórészben. Az így előre összeállított keveréket azután az etetés előtt egyenletesen elkeverjük a tejelő kérődző napi takarmányadagjában. Az adalékkeveréket olyan mértékben adagoljuk az állatnak, hogy az A 47 934 jelű antibiotikum kellő, propionát növelő mennyiségét megkapja.
Az alábbiakban egy tejelő kérődző számára öszszeállított tipikus keveréket adunk meg, melyhez A 47 934 jelű antibiotikum adható a tejtermelést növelő mennyiségben:
alkotórész tömeg %
kukorica 33,15
árpa 10,0
melasz 7,5
zab 10,0
olajipari szójapor (48% protein) 13,8
répakása 2,5
kukorica sikér 12,5
cefre 7,5
nyomelem keverék 0,05
só 1,0
kálc um-hidrogénfoszfát 2,0 100,00
A fenti komponenseket egyenletesen összeőröljük, és azután adhatunk hozzá annyi A 47 934 jelű antibiotikumot, hogy az állatok, jelen esetben tehenek körülbelül 600 mg-ot kapjanak fejenként és naponként.
Az antibiotikum azonban más módon is eredményesen beadható. Adagolható az állatoknak például tablettában, gyógyszer folyadékban, vagy pilulákban, kapszulákban. Az antibiotikum ilyen dozírozctt formában történő elkészítését a jól ismert eljárásokkal el lehet végezni. Minden egyes dózisegységnek a tápanyaghasznosítást fokozó anyag olyan mennyiségét kell tartalmaznia, ami közvetlen arányban van a kezelendő állat sajátos napi adagjával.
A kapszulák könnyen elkészíthetők zselatin kapszuláknak a kívánt formában levő antibiotikummal történő megtöltésével. Ha szükséges, az antibiotikum hígítható inért, por alakú hígítókkal, például cukorral, keményítővel vagy tisztított kristályos cellulózzal azért, hogy a térfogatát növelve, a kapszulák töltését még jobban megkönnyítsük.
Az antibiotikum tabletták a szokásos gyógyszerészeti eljárásokkal készíthető. A tabletták ipari előállítása jól ismert és alaposan kidolgozott folyamat. A hatóanyagon kívül a tabletta rendszerint töltelékanyagot, szétesést elősegítő anyagot, adszoi benst, kötőanyagot és tapadásgátlót tartalmaz. Tip kus töltelékanyag a laktóz, a finomra tört porcukor, a nátriumklorid, a keményítő és a mannit. A keményítő egyúttal szétesést elősegítő anyag is, akárcsak az algininsav. Felületaktív anyagokat is használnak, például nátrium-lauril-szulfátot és diokt 1-nátrium-szulfoszukcinátot. Gyakran használt köt áanyagok a zselatin, a mézgák, a keményítő, a dex'.rin és a különféle cellulózszármazékok. Az általánosan használt tapadásgátlók között emlithet7
192 162 jük a magnézium-sztearátot, a talkumot, a paraffin viaszt, a különféle fémszappanokat és a polietilénglikolt.
Az új eljárás megvalósítható az antibiotikumnak olyan nagy pilulákban történő bevitelével is, melyek a hatóanyagot lassan bocsátják ki a szervezetbe. Ezek a pilulák hasonló módon készíthetők, mint a tabletták, azzal a különbséggel, hogy adott módon biztosítani kell az antibiotikum oldódásának késleltetését, hogy az hosszú időtartamon keresztül szabaduljon fel. A lassú oldódás elősegíthető vízoldhatatlanabb antibiotikum-származék alkalmazásával. A pilula szilárdan a bendő alján tartható a fajtömegét növelő anyagokkal, például vasreszelékkel.
Az antibiotikum oldódása azáltal is késleltethető, hogy a hatóanyagot oldhatatlan alanyú állományba ágyazzuk. Ilyen szempontból felhasználható anyagok például a növényi viaszok, tisztított ásványi viaszok és a vízoldhatatlan polimerek.
Antibiotikumos gyógyszerfolyadék könnyen készíthető vízoldékony antibiotikum-származékok alkalmazásával. Ha valamilyen ok miatt oldhatatlan származék kívánatos, szuszpenzió készíthető. Alternatív megoldásként a gyógyszerfolyadék elkészíthető egy fiziológiásán alkalmazható oldószerben, például polietilén-glikolban történő oldással.
Az antibiotikum oldhatatlan származékának szuszpenziója oldószerként nem szolgáló közegben, például növényi - földimogyoró, kukorica vagy szezám-olajban, glikolban (propilén-gklikol, polietilén-glikol) vagy vízben készíthető el, attól függően, hogy milyen antibiotikum-származékot választunk.
Alkalmas, fiziológiailag alkalmazható tapadásgátlók azért szükségesek, hogy az antibiotikumot szuszpenzióban tartsák. Tapadásgátlókat választhatunk a sűrűségnövelő anyagok közül, például karboximetil-cellulóz, polivinil-pirrolidon, zselatin és az alginátok. A felületaktív anyagok több típusa szintén használható az antibiotikum szuszpenzióban tartásához. Az oldószerként nem szolgáló folyadékokban történő szuszpenziók készítéséhez alkalmas anyagok például a lecitin, az alkil-fenolpolietilénoxidok,. a naftalin-szulfátok, az alkilbenzolszulfonátok és a polioxietilén-szorbitészterek.
Ezeken kívül, egyedi esetekben sok olyan anyag elősegítheti a szuszpenzió elkészítését, melyek hatással vannak a folyékony közeg hidrofilitására, sűrűségére és felületi feszültségére. Jól alkalmazható szuszpendáló anyagok például a szilikon habzásgátlók, a glikolok, a szorbit és a cukrok.
A szuszpendálható antibiotikum használat előtt felhígítandó szuszpenzióként vagy az antibiotikum és a segédanyag száraz keverékeként állhat az állattenyésztők rendelkezésére.
A beszippantás útján történő bevitelhez használt por elkészítésekor az antibiotikumot rendszerint talkummal, diatomafölddel vagy valamilyen más semleges segédanyaggal keverik.
Az antibiotikum a kérődző állatok ivóvízében is beadható a vízoldékony vagy vízben szuszpendálható formában lévő antibiotikum megfelelő mennyiségének a vízhez való adásával. Az ivóvízhez adandó antibiotikum elkészítése ugyanazon elvek szerint történik, mint a gyógyszerfolyadéké.
Az állatok kezelésének leggyakorlatibb módja az antibiotikumnak a táplálékhoz történő adása. Bármilyen típusú táplálék, beleértve az általánosan használt száraz, folyékony vagy formázott takarmányt, tartalmazhatja az antibiotikumot.
Az állati táplálékban történő alkalmazásnál A 47 934 jelű antibiotikum forrásként használhatjuk a táptalajkomponenseket, és micéliumot is tartalmazó fermentlevet extrakció és elválasztás nélkül, de előnyös a víz előzetes eltávolítása. Az A 47 934 jelű antibiotikum képződését követően például az egész fermentlevet leszűrhetjük és az A 47 934-et tartalmazó kiszűrt anyagot még száríthatjuk. Ezenkívül extrahálhatjuk a kiszűrt száraz micéliumot vizes, pH 10,5 kémhatású, alkalikus oldattal, majd az extraktumot semlegesítjük és beszárítjuk, hozzájutva ezáltal az A 47 934 antibiotikumhoz.
Ugyancsak beszárítható a teljes fermentlé liofilizálással, szárítódobban való szárítással vagy azeotropos desztillációval és szárítással. A beszárított fermentlevet azután közvetlenül belekeverhetjük a takarmány adalékanyagába.
Az állati táplálékhoz adandó gyógyszerek elkészítésének módszerei jól ismertek. Nyersanyagként rendszerint egy, a gyógyszert koncentrált formában tartalmazó adalékkeveréket állítanak össze a gyógyszerezett takarmány elkészítéséhez. Például a tipikus gyógyszer-adalékkeverék 2-800 g hatóanyagot tartalmazhat kilogrammonként. Az adalékkeverék lehet folyékony vagy szilárd.
A hatékony kezeléshez kellő antibiotikum menynyiséget tartalmazó állati takarmány elkészítése elsősorban számtani probléma. Csak meg kell határozni az egyes állatokba beviendő hatóanyag mennyiségét, figyelembe kell venni az állat naponként elfogyasztott takarmányát, a használt adalékkeverék antibiotikum-koncentrációját és ezután kiszámítható már, hogy az antibiotikum milyen koncentrációban legyen a takarmányban.
A takarmány elkészítésének, keverésének, formázásának valamennyi ismert módszere tökéletesen alkalmas az antibiotikumot tartalmazó takarmány nagyüzemi előállításához.
A találmány szerinti eljárással előállított vegyület alkalmas a kérődző állatok takarmányhasznosításának fokozására az antibiotikum szájon át történő bevitelével.
Az A 47 934 jelű antibiotikum a csirkék növekedését is serkenti. Az ezzel kapcsolatos vizsgálatokat az alábbiakban ismertetjük.
Ezekhez a vizsgálatokhoz nyolcnapos Penobscot broiler csirkéket használtunk két párhuzamos vizsgálatban. összesen 560 csirkét hét-hét állatot tartalmazó csoportokra osztottunk. 35-35 csoport szolgált kontrollként, és öt-öt csoportot kezeltünk a csirkék induló táplálékába adott antibiotikummal, 20 g A 47 934 antibiotikumot keverve egy tonna takarmányba. A csirkék kezdő tápláléka a következő összetételű volt:
-8192 16?
alkotórész százalék
kukorica, sárga, őrölt 65,53
szójapor, oldószerrel extrahált, hántolt (49% fehérjetart.) 25,36
marhafaggyú 5,00
kálciumhidrogénfoszfát, takar- 2,15
mány minőségű
mészkő 0,83
nyomelemkeverék, TK-01 (1,02)’ 0,10
só 0,35
vitaminkeverék, TK-04 (1,00)2 0,50
metionin hidroxi analóg 0,18
100,00 1 A nyomelemkeverék 75 mg magnéziumot, 50 mg cinket, 25 mg vasat és 1 mg jódot juttat 1 kg takarmányba.
2 A vitaminkeverék 3000 NE A-vitamint, 900 NE D-vítamint, 40 mg E-vitamint, 0,7 mg K-vitamint, 1000 mg kolint, 70 mg niacint, 4 mg pantoténsavat, 4 mg riboflavint, 100 pg B12-vitamint és 100 pg biotint juttat I kg kész takarmányba. (NE = nemzetközi egység).
A takarmány számított analízise
protein % 18,00
metabolizálható energia
KJoule/kg 13 563,6
metabolizálható energia/
protein 753,5 (342,5)
zsír % 7,37
hamu % 5,14
kálcium % 0,85
foszfor % 0,73
felhasználható foszfor % 0,50
mangán, mg/kg 85
vas, mg/kg 72
réz, mg/kg 11
cink, mg/kg 72
szelén, mg/kg 74
magnézium, mg/kg 1693
kálium, mg/kg 7158
nátrium, mg/kg 1682
jód, mg/kg 1
A-vitamin, NE/kg 5162
D-vitamin, NE/kg 900
E-vitamin, mg/mg 56,2
K-vitamin, mg/kg 0,7
kolin, mg/kg 1450
niacin, mg/kg 85
pantoténsav, mg/kg 11,1
B6-vitamin, mg/kg 7,5
riboflavin, mg/kg 5,5
tiamin, mg/kg 2,8
folsav, mg/kg 1,1
B12-vitamín, mg/kg 100
biotin, mg/kg 233
arginin, % 1,305 (7,25)3
lizin, % 0,956 (5,31)
glicin, % 0,901 (5,01)
meticin, % 0,433 (2,41)
cisztin, % 0,273 (1,52)
összes kéntartalmú amino-
sav, % 0,706 (3,92)
triptofán 0,252 (1,40)
linolénsav, % 1,25
3 A zárójelben lévő értékek az aminosavak százalékos mennyiségét fejezik ki az emészthető proteinhez viszonyítva.
A táplálékból és vízből valamennyi csoport állatai tetszés szerinti mennyiséget fogyaszthattak 21 napon keresztül. Az aktivitás kritériuma 3 %-os súlygyarapodás és/vagy 2%-os tápanyaghasznositás növekedés volt. A vizsgálat eredményeit all. táblázatban mutatjuk be.
II. táblázat
kezelés koncent- ráció g/tonna súlygyarapodás tápanyaghasznosítás
gramm %-os javulás T/SN %-os javulás
kontroll - 484 - 1,791 -
A 47 934 20 519 7,23 1,707 4,69
T SN = elfogyasztott táplálék összsúlya osztva a súlynövekedéssel.
Alternatív megoldásként az A 47 934 nevű antibiotikumot farmakológiai szempontból alkalmazható sójaként a csirkék ivóvízébe juttatjuk be.
Ezek szerint az A 47 934 jelű antibiotikum csirkéknél növekedésserkentőként használható fel, amennyiben tonnánként 5-30 g A 47 934 jelű antibiotikumot vagy farmakológiai szempontból alkalmazható sóját tartalmazó takarmánnyal etetjük őket.
A választási malacoknak beadott A 79 934 jelű antibiotikum szintén növekedésserkentőként működik. Erre vonatkozó vizsgálatainkat ismertetjük az alábbiakban.
Az átlag 10,4 kg kezdeti súlyú malacok 10-50 ppm A 47 934 jelű antibiotikumot kaptak a táplálékukba, és összehasonlítottuk őket a táplálékukban 110 ppm Tylan®-t (tilozin, Elanco) kapó állatokkal. A kísérleteket kontrollált környezetű neveidéiben végeztük, dróthálós fenekű ketrecekben. Kezelésenként négy ismétlést indítottunk, négynégy állattal ismétlésenként a 28 napos kísérletekben. A kontroll csoportban, mely antibiotikumot nem tartalmazó táplálékot kapott, hat ismételt vizsgálatot végeztünk négy-négy állattal. A malacok korlátlanul ehettek a 18% proteint tartalmazó kukorica-szója eledelből, mely a következő összetételi! volt:
192 '62
A sertéstáp összetétele
alkotórész százalék
kukorica, sárga, őrölt 66,35
olajipari szójapor, extrahált, IQ IS
hántolt, 50% fehérjetart.
fölözött tej, szárított 10,00
kálciumhidrogénfoszfát, 1 90
takarmány minőségű
kalciumkarbonát 1,20
só 0,50
nyomelemkeverék, AN-031 0,10
sertés vitaminkeverék, SW-032 1,00
A-vitaminos keverék3 0,05
metionin hidroxi analóg, 93% 0,20
szelénes keverék4 0,05
100,00
' 1 kg keverék tartalmaz: 50 g magnéziumot magnéziumszulfátként, 100 g cinket cinkkarbonátként, 50 g vasat vasszulfátként, 5 g rezet rézoxidként, 1,5 g jódot káliumjodidként és maximum 150 g, minimum 130 g kálciumot kalciumkarbonátként.
2 1 kg keverék tartalmaz: 77 161 NE D2-vitamint, 2 205 NE E-vilamint, 411 mg K-vitamint, 19 180 kolint, 110 mg folsavat, 165 mg piridoxint, 110 mg tiamint és 22 mg biotint.
3 1 kg keverék 6 613 800 NE A-vilamint tartalmaz.
* I kg keverék 200 mg szelént tartalmaz nátriumszelenit formájában. A számított analízis adataiban csak a hozzáadott szelén mennyisége szerepel.
Számított analízis
nyers protein, % 19,10
éteres extraktum, % 2,83
nyers rost, % 1,89
hamu, % 5,60
kálcium, % 0,90
foszfor,.% 0,65
emészthető energia KJoule/kg 14 847
metabolizálható energia 1 3 693
KJoule/kg i J \J7J
riboflavin, mg/kg 7,88
niacin, mg/kg 27,38
pantoténsav, mg/kg 24,96
kolin, mg/kg 1 224,95
Bu-vitamin, mg/kg 50,54
folsav, mg/kg 1,99
piridoxin, mg/kg 8,37
tiamin, mg/kg 4,30
biotin, mg/kg 0,35
D-vitamin, NE/kg 811,61
A-vitamin, NE/kg 3 904,05
E-vitamin, NE/kg 23,61
K-vitamin, NE/kg 4,41
réz, mg/kg 15,43
vas, mg/kg 98,12
jód, mg/kg 1,50
magnézium, mg/kg 1 627,70
cink, mg/kg 119,61
magnézium, mg/kg 61,74
szelén, mg/kg 0,10*
lizin, % 1,02
metionin, % 0,53
cisztin, % 0,29
triptofán, % 0,23
izolencin, % 1,03
10
arginin, % U5
hisztidin, '% 0,44
lecin, % 1,72
fenilalanin, % 0,97
tirozin, % 0,52
treonin, % 0,77
valin, % 0,98
A kísérlet végére a malacok átlagsúlya 24 kilogrammra nőtt. A kísérlet eredményeit a 12. táblázatban mutatjuk be.
12. táblázat
kezelés ható- anyag- szint ppm átlagos napi tömegnövekedés átlagos napi takarmányfogyasztás kg % T/SN %-os javulás
kg %
kontroll 0 0,44 0,857 1,97
A 47 934 10 0,453 3,1 0,83 -3,2 1,82 7,6
A 47 934 50 0,48 10,3 0,898 4,7 1,85 6,1
TylanR 110 0,454 4,1 0,879 2,6 1,92 2,5
T/SN = a tápanyagfogyasztás és a súlynövekedés hányadosa.
A találmány szerinti eljárással előállított vegyület és sói tehát alkalmasak választási malacok növekedésserkentésére azáltal, hogy a malacok eledelébe 10-50 ppm A 47 934 jelű antibiotikumot vagy farmakológiai szempontból alkalmazható sóját adjuk be. Az A 47 934 jelű antibiotikum farmakológiai szempontból alkalmazható só formájában az ivóvízben is beadható a malacoknak.
A választási malacok növekedésserkentésében történő hasznosításán kívül várható, hogy az A 47 934 jelű antibiotikum felhasználható különböző méretű sertések, így a piacra szánt, azaz kb. 100 kg-os állatok növekedésserkentésére is.
A gazdasági állatoknál, így a kérődzőknél is általános, hogy életük folyamán különféle növekedés - serkentőkkel, betegségeket megelőző - és gyógyító gyógyszerekkel kezelik őket. Ezeket a kezeléseket gyakran kombinálva használják. Az ismertetett módszer ugyancsak elvégezhető más kezelésekkel kombinálva.
Amint az előzőekben ismertetett eredmények mutatják az A 47 934 jelű antibiotikum kedvező irányban változtatja meg az alkanoátok képződését a bendőben. Ugyanez a kezelés kedvező hatású az egyszerű gyomrú állatoknál is, melyek a rostos növényi anyagot a vakbélben emésztik. Az itt említett nem összetett gyomrú állatok rostos növényi táplálékot fogyasztanak, melynek legalábbis egy részét a vakbélben zajló mikrobiológiai fermentációval emésztenek meg. A vakbélben történő fermentáció a bendőben történőhöz hasonló kémiai utat követi.
A ló, a sertés és a nyúl jellemzően olyan állatok, melyek táplálékuk egy részét a vakbélben történő fermentációval emésztik meg. Ezeknek az állatoknak a teljes tápanyaghasznosítását javítja az olyan antibiotikumok szájon át történő adagolása, melyek kedvezően változtatják meg a propionátacetát arányát. A ló és a nyúl jellemzően olyan állatok, melyeknél a vakbélben történő erjesztés
-101
192 162 főszerepet játszik az összemésztési folyamatokban, és amelyek számára ezek az antibiotikumok különösen kedvező hatásúak.
Az A 47 934 jelű antibiotikumot a Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 vagy ennek A 47 934-et képző mutánsa vagy változata termeli, asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó süllyesztett kultúrában, aerob körülmények között tenyésztve a mikroorganizmust addig, amíg lényeges mértékű antibiotikum aktivitást nem jelenik meg.
Miként más mikroorganizmusok esetében is, az A 47 934 jelű antibiotikumot termelő kultúra, azaz az NRL 15 009 törzs tulajdonságai változnak. A találmány szerint felhasználhatók az NRRL 15 009 törzsnek A 47 934 jelű antibiotikumot termelő természetes variánsai és mutánsai (spontán vagy indukált).
Számos különféle táptalaj használható a Streptomyces toyocaensis-szel történő A 47 934 jelű antibiotikum termelésére. A termelés gazdaságossága, az optimális kitermelés és a könnyű termékizolálás szempontjából azonban bizonyos táptalajok előnyösebbek. Ezeknek a táptalajoknak asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat kell tartalmazniuk. Alkalmas szénforrás a glükóz, burgonya dextrin, tápióka dextrin, keményítő és melasz. Alkalmas nitrogénforrás a szójadara, savhidrolizált kazein, marhahúsextraktum és szójaliszt.
A növekedéshez és fejlődéshez szükséges eszenciális nyomelemeket a mikroorganizmus a kukoricalekvárból kaphatja meg és a növekedésnek és a bioszintetikus igényeknek megfelelő mennyiségben szennyezésként előfordulhatnak a táptalaj egyéb alkotórészeiben is. Kedvező hatású lehet azonban, ha a táptalajt nátrium, kálium, magnézium, kalcium, ammónium, klorid, karbonát, foszfát, szulfát, nitrát és más ionokat szolgáltató oldható tápsókkal egészítjük ki.
Az NRRL 15 009 törzzsel történő érdemleges mennyiségű A 47 934 jelű antibiotikum termeléséhez tartályokban végzett, süllyesztett aerob fermentációt használunk. Kis mennyiségű A 47 934 jelű antibiotikumhoz rázott lombiktenyészetben is hozzájuthatunk. A tartályban végzett fermentálásnál előnyös a vegetatív inokulum használata. A vegetatív inokulum elkészítéséhez kis térfogatú táptalajt oltunk be spórával, micélium fragmensekkel vagy liofilizált mikroorganizmussal, hogy friss, aktívan növekvő tenyészethez jussunk. A vegetatív inokulumot aztán a nagy tartályba visszük át, ahol megfelelő inkubációs idő után optimális mennyiségű A 47 934 jelű antibiotikum termelődik.
A be nem oltott táptalaj az összetételtől függően változó kémhatású, de valamennyi 6,4-7,0 pH tartományba esik.
Ez az A 47 934 jelű antibiotikumot termelő mikroorganizmus 20-40 ‘C közötti széles hőmérsékleti tartományban tenyészthető. Az NRRL 15 009 törzzsel történő A 47 934 jelű antibiotikum termelés optimális hőmérséklete 30 ’C körül van.
Amint az a süllyesztett aerob tenyészeteknél szokásos, steril levegőt diszpergálunk a tenyészeten keresztül. A mikroorganizmus eredményes növekedéséhez a tartályban történő fermentálásnál használt percenkénti levegőtérfogat a lenyészlé térfogatának 0,1-0,5 részével egyenlő. Egy 165 literes fermentornál a szokásos percenkénti 250 fordulatszámú keverés mellett az optimális percenkénti levegőtérfogat a tenyészlé térfogatának 0,25 részével egyenlő. Amennyiben a habzás gondot okozna, kis mennyiségű (azaz 0,2 ml/l) habzásgátló anyagot, például propilénglikolt adhatunk a nagytérfogatú fermentléhez.
Az A 47 934 jelű antibiotikum termelődésének fermentáció alatti nyomonkövetését agardiffúziós, azaz biometriás méréssel vagy turbidimetriás módszerrel végezhetjük. Az alkalmazott teszt-organizmus a Bacillus subtilis ATCC 6633. Mérés előtt a minta kémhatását pH 10,5-re állítjuk vizes nátriumhidroxid oldattal és lecentrifugáljuk.
Az antibiotikus aktivitás rendszerint a 36. óra után jelenik meg és legalább hét vagy több napig megmarad a fermentációs periódus alatt. Az antibiotikum-termelés maximuma a 4-5 napos fermentációnál jelenik meg.
Az A 47 934 jelű antibiotikumot az e területen alkalmazott módszerekkel nyerhetjük ki a fermentléből. Minthogy az A 47 934 jelű antibiotikum legnagyobb része a sejten vagy a sejtben adszorbeált, a sejtből való felszabadítás céljából a fermentlé kémhatását lúggal, például nátriumhidroxid vizes oldatával pH 10,5-re állítjuk. Szűrő-segédanyagként diatómaföldet (Hyflo Super-cel, Johns Manville Corp.) adunk a fermentléhez, összekeverjük és szűrjük, célszerűen szűrőprést alkalmazva. Az antibiotikumot tartalmazó szűrletet pH 7,0 kémhatásra állítva semlegesítjük és Diaion ΗΡ-20-szal (nagy porozitású sztirol-divinilbenzol gyöngy kopolimer, Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japán) kevertetjük kb. 60 percen keresztül. A vizes fázist leszívatással vagy szűréssel választjuk el a gyantától, mely adszorbeálta az antibiotikumot. Más adszorbensek is ismertek e téren, például a szén, a szilikagél, a poliamid, az alumíniumoxid, a makroretikuláris gyanták (XAD-2, XAD-4 stb.) és az ioncserélő, elsősorban anioncserélő gyanták.
Az A 47 934 aktivitás adszorbeált Diaion HP-20 gyantát vízzel, majd víz-metanol 4 : 1 arányú keverékével mossuk és szűrjük. Az antibiotikumot, eluensként víz-metanol 1 : 1 arányú keverékét használva oldjuk le a gyantáról. Az eluátumot bekoncentrálva és liofilizálva, halvány barna színű nyers A 47 934 port kapunk, amit tovább tisztíthatunk ismert kromatográfiás eljárásokkal.
A fermentlészűrletből is kinyerhetjük az antibiotikumot, savval kb. pH 3-ra állítva a szürlet kémhatását a teljes lecsapódáshoz, majd a csapadékot kiszűrjük. Az A 47 934 jelű antibiotikum pH 6,5nél kezd lecsapódni és pH 3-nál a lecsapódás teljes. A lesavanyításhoz szervetlen savak, például sósav, kénsav és foszforsav, valamint szerves savak is, például ecetsav és hangyasav alkalmasak. Az így kapott nyers A 47 934 jelű antibiotikumot tovább tisztíthatjuk ismert kromatográfiás eljárásokkal.
A találmány teljesebb illusztrálása céljából az alábbi példákat adjuk meg.
-111
192 162
1. példa
A Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 ferdeagar tenyészetére a következő táptalajt használjuk:
alkotórész mennyiség (g/1) paradicsompép 20,0 főtt zabliszt 20,0 agar 20,0 deinonizált vízzel 1 literre kiegészítve.
A fenti alkotórészek összekeverése után a táptalaj kémhatása pH 5,0, amit sterilizálás előtt 5n vizes nátriumhidroxid oldattal pH 6,7-re állítunk. Sterilizálás után a táptalaj kémhatása pH 6,5.
A Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 spórákat ráoltjuk a fenti összetételű ferde-agarra és a beoltott agart 10 napon keresztül inkubáljuk 30 ’C hőmérsékleten. A tenyészet liofilizátumát a ferdeagarról készítjük és ezt használjuk a következő összetételű inokulum táptalaj beoltásához:
alkotórész mennyiség (g/1)
glükóz 15,0
ourgonya dextrin 20,0
szójapor 15,0
élesztőkivonat 1,0
kukoricalekvár 10,0
CaCO3 2,0
Hideg csapvízzel 1 literre töltjük fel.
A fenti alkotórészek összekeverése után a táptalaj kémhatása pH 5,6, amit sterilizálás előtt 5n vizes nátriumhidroxid oldattal pH 6,5-re állítunk. Sterilizálás után a táptalaj kémhatása pH 6,5-45,7.
Az 50 ml inokulum tenyészeteket 250 ml-es, szélesszájú Erlenmeyer lombikokban inkubáljuk 30 ’C hőmérsékleten 48 órán keresztül, percenként 250-es fordulatszámú, 5 cm kitérésű forgómozgású rázógépen. Ezt az inkubált tenyészetet vagy kis térfogatú fermentorok beoltásához (az inokulum a fennentlé térfogatának 1 %-a) vagy a nagy térfogatú tenyészetek készítésénél alkalmazott két-lépéses inokulum táptalajának beoltására használjuk.
Az antibiotikumot termelő A 47 934.1 fermentációs tenyészetet az alábbiak szerint készítjük. 800 ml kitenyésztett kétlépéses inokulumot használunk 100 liter alábbi összetételű steril fermentációs táptalaj beoltásához:
alkotórész mennyiség (g/1)
habzásgátló (Down Corning An- n 7
tifoam „A”)
glükóz 25,0
burgonya dextrin 30,0
melasz 3,0
szójapor 15,0
savhidrolizált kazein 1,0
CaCO3 2,5
Hideg csapvízzel 100 liter térfogatra töltjük fel.
12
A fenti alkotórészek összekeverése után a táptalaj kémhatása pH 6,5, amit sterilizálás előtt pH
7,5-re állítunk be, 5n vizes nátriumhidroxid oldattal. Sterilizálás után a táptalaj kémhatása pH 6,9. 5 A beoltott fermentációs táptalajt 165 literes fermentorban inkubáljuk 30 ’C hőmérsékleten 4-4,75 napon keresztül. A fermentációs levet térfogatának egynegyedével azonos mennyiségű steril levegő percenkénti átvezetésével levegőztetjük és egy szokáso10 san használt keverővei kevertetjük 200-250 percenkénti fordulatszámmal.
2. példa
A 2. példában az A 47 934 jelű antibiotikum izolálását illusztráljuk.
141 liter fermentlé kémhatását pH 10,5-re állítjuk 5n vizes nátriumhidroxid oldattal, 3% szűrést 2θ elősegítő adalékanyagot (Hyflo Super-cel, diatómaföld, Johns-Manville Corp.) adunk hozzá, és egy órán keresztül kevertetjük. A keveréket présszűrőn szüljük, 106 liter antibiotikumot tartalmazó tiszta szűrletet nyerve. A szűrlet kémhatását pH 25 7,0-re állítjuk 5n vizes nátriumhidroxid oldattal, és
10,6 liter Diaion HP-20 gyantát (nagy porozitású sztirol-divinilbenzol gyöngy kopolimer, Mitsubishi Shemical Industries Ltd., Tokio, Japán) adunk hozzá. A keveréket 60 percen keresztül kevertetjük, 30 és a vizes fázist ieszivatással vagy szűréssel választjuk el a gyantától.
Az antibiotikumot adszorbeált gyantát 30 liter vízzel mossuk egymás utáni adagokban adva a vizet a gyantára, majd kétszer 30 liter víz-metanol 35 4 ; 1 arányú keverékével, minden egyes mosásnál 30 percen keresztül kevertetve, majd szűrve a gyantát. Az antibiotikumnak a gyantáról történő leoldásához a mosott gyantát 30 percen keresztül 30 liter metanol-víz 1 : 1 arányú keverékében kevertet4θ jük, szűrjük és ugyanezt az eljárást mégegyszer megismételjük. Az 1 : 1 arányú metanol-víz szűrletet egyesítjük, csökkentett nyomású térben 4-5 literes térfogatra koncentráljuk (6-12% szilárd anyagot tartalmaz) és liofilizáljuk. így 79,1 g halvány45 barna színű por formájában jutunk a nyers, kb. 30-40 %-os tisztaságú A 47 934 jelű antibiotikumhoz. Körülbelül 44-49%-os összkinyerést érünk el.
3. példa
A 3. példában a savas lecsapással történő nyers A 47 934 jelű antibiotikum kinyerést mutatjuk be.
Az A 47 934 jelű antibiotikum micélimból törté55 nő kiextrahálásához 450 ml fermentlé kémhatását pH 10,5-re állítjuk be és az oldatot szűrjük. A 47 934 jelű antibiotikumot tartalmazó szűrletet 200 milliliteres adagokra osztjuk és mindegyik kémhatását pH 2,5-re állítjuk 5n sósavval, hogy θθ maximális lecsapást éljünk el. A csapadékot centrifugálással elválasztjuk, vízzel mossuk és ismételten centrifugáljuk. Az egyik adag csapadékot vízben szuszpendáljuk és fagyasztva szárítva 186 mg vízben oldhatatlan, 20%-os hatóanyagtartalmú, nyers g5 A 47 934 jelű antibiotikumot nyerünk.
-1219? 162
A másik adagból származó csapadékot 50 ml vízben szuszpendáljuk, kémhatását pH 7,5-re állítjuk 5n vizes nátriumhidroxid oldattal és fagyasztva szárítjuk. 226 mg vízoldékony 20%-os hatóanyagtartalmú nyers A 47 934 jelű antibiotikumot nyerünk.
Ezek a nyers A 47 934 jelű antibiotikum preparátumok ismert módszerekkel, például Diaion PH-2Q gyanta vagy fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia alkalmazásával tisztíthatok.
4. példa
A 4. példában az A 47 934 jelű antibiotikum fordított fázisú kromatográfiával történő tisztítását mutatjuk be.
30-40 g nyers A 47 934 jelű antibiotikumot feloldunk 350 ml víz-acetonitril 12:8 arányú keverékében, pH 8 kémhatásnál és az oldatot rávisszük 4 liter fordított fázisú gyantát (Whatmann Silicagel LP-1/C,8) tartalmazó 100 egységes Chromatospacra (Instruments S.A., Inc., Metuchen, N.J.). A gyantát előzetesen, literenként 2 g ammóniumacetátot tartalmazó víz-acetonitril 86 : 14 arányú keverékével ekvilibráljuk. A minta felvitele után az oszlopot ugyanezzel az oldószer-rendszerrel fejlesztjük ki, 400 ml frakciókat gyűjtve és 254 nm-en nyomonkövetve az elúciót. Minden~frakciót analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon vizsgálunk, ehhez Zorbax ODS gyantával töltött 0,25 x 25 cm méretű oszlopot használunk. Eluáláshoz literenként 2 g ammóniumacetátot tartalmazó víz-acetonitril 82 : 18 rendszert alkalmazunk és az oszlopról lejövő anyagot 225 nm-en detektáljuk. A csak A 47 934 jelű antibiotikumot tartalmazó frakciókat (így például a különböző nyers A 47 934 jelű antibiotikum preparátumoknál a 32-60., 37-75. vagy 51-76. frakciókat) egyesítjük és a térfogatot kb. 1 literre bekoncentráljuk.
Nyolc hasonló futtatásból származó koncentrátumot egyesítünk és a kb. 8 litert kitevő oldatot 2 liter, vizágyban lévő Diaion HP-20 gyantát tartalmazó oszlopra visszük, hogy ezzel a kromatográfiás művelettel eltávolítsuk az ammóniumacetátot az egyesített koncentrátumból. Az oszlopot 6 liter vízzel mossuk és az antibiotikumot 4 liter víz-metanol 4 :1 arányú rendszerrel, majd 6 liter víz-metanol 1 :1 arányú rendszerrel eluáljuk. A 20%-os metanolos eluátumot 400 ml-re koncentrálva és liofilizálva, 14,82 g erősen tisztított A 47 934 jelű antibiotikumot nyerünk. Az 50%-os metanolos eluátumot 1 literre koncentrálva és liofilizálva 55,6 g erősen tisztított A 47 934 jelű antibiotikumot kapunk. Ennél a sótalanító lépésnél 81 %-os ősszkitermelést érünk el, melynek fizikai állandói megegyeznek a kiírás bevezető részében megadottal.
5. példa
Az 5. példában az A 47 934 jelű antibiotikum kristályosítását mutatjuk be.
Egy gramm erősen tisztított A 47 934 jelű antibiotikumot feldoldunk 50 ml acetonitril-víz 60 : 40 arányú keverékében és további acetonitrilt adunk hozzá zavarosodásig. Szobahőmérsékleten történő 16 órás állás után nyúlós, sötét anyag válik ki, amit eltávolítunk és az oldathoz további acetonitrilt adunk zavarosodásig.
A szobahőmérsékleten történő további állás közben kivált kristályokat szűréssel kinyerjük, acetonitrillel mossuk és szárítjuk. A kristályos anyag tömege 750 mg. Az anyagot 50 ml acetonitril-víz 60 40 arányú keverékében oldva és 300 ml acetonitrilt keverve az oldathoz, újra kristályosítjuk. A szárított kristályos anyag tömege 550 mg. További 100 ’C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson történő szárításnál 11% tömegveszteséget tapasztalunk, az illékony oldószerek eltávozása miatt.
6. példa
A 6. példában az A 47 934 antibiotikum mononátríumsójának elkészítését mutatjuk be.
130 mg A 47 934 jelű antibiotikumot tartalmazó 16 ml vizes oldathoz (0,1 mól, pH 4,8) 0,4 ml 10 mg/inl koncentrációjú nátriumhidroxid oldatot (0,1 mól) adunk. A kapott oldat pH 7,2 kémhatású. Az oldatot fagyasztva szárítjuk és 153 mg A 47 934 mononátriumsót kapunk (Na = 2,4%).
7. példa
A 7. példában az A 47 934 jelű antibiotikum dinátriumsójának előállítását írjuk le.
130 mg A 47 934 antibiotikumot tartalmazó 16 ml vizes oldathoz (0,1 mól, pH 4,8) keverés mellett 0,8 ml 10 mg/ml koncentrációjú vizes nátriumhidroxid oldatot (0,2 mól) adunk. Az oldat kémhatása pH 8T lesz. Az oldatot fagyasztva szárítjuk és az A 47 934 antibiotikumnak 156 mg nátríumsóját nyerjük. (Na = 3,6%).
8. példa
A 8. példában az A 47 934 antibiotikum monokáliumsójának előállítását írjuk le.
130 mg A 47 934 antibiotikumot tartalmazó 16 ml vizes oldathoz (0,1 mól, pH 4,8) keverés mellett 0,56 ml 10 mg/ml koncentrációjú káliumhidroxid oldatot (0,1 mól) adunk. A kapott oldat kémhatása pH 7,1. Az oldatot fagyasztva szárítjuk és az A 47 934 antibiotikumnak 154 mg monokálimsóját nyerjük (K = 2,14%).
9. példa
A 9. példában az A 47 934 antibiotikum dikáliumsójának előállítását írjuk le.
130 mg A 47 934 antibiotikumot tartalmazó 16 ml vizes oldathoz (0,1 mól, pH 4,8) keverés mellett 1,12 ml, 10 mg/ml koncentrációjú káliumhidroxid oldatot adunk. A kapott oldat kémhatása pH 7,95. Az oldatot fagyasztva szárítjuk és az A 47 934 antibiotikumnak 158 mg dikáliumsóját nyerjük (K = 3,94%).
-131
192 162 r
70. példa
A 10. példában az A 47 934 antibiotikum báriumsójának előállítását írjuk le.
100 mg A 47 934 jelű antibiotikumot tartalmazó, 4 ml vizes oldathoz 2 ml telített vizes báriumklorid oldatot adunk, lecsapva ezáltal az A 47 934 antibiotikumot báriumsó formájában. A csapadékot centrifugáljuk, kétszer 5-5 ml vízzel mossuk és a centrifugálást mindig megismételjük. A csapadékot végül 10 ml vízben szuszpendáljuk és fagyasztva szárítjuk 76 mg vízoldhatatlan báriumsót nyerve.
77. példa
All. példában az A 47 934 antibiotikum kálciumsójának előállítását írjuk le.
100 mg A 47 934 antibiotikumot tartalmazó 4 ml vizes oldathoz 2 ml telített, vizes kálciumklorid oldatot adunk, kicsapva ezáltal az A 47 934 antibiotikumot kálciumsó formájában. A csapadékot lecentrifugáljuk, kétszer 5-5 ml vízzel mossuk, minden alkalommal újra centrifugálva. A mosott csapadékot 10 ml vízben szuszpendáljuk, és fagyasztva szárítjuk. 87 mg A 47 934 kálciumsót nyerünk.
Szabadalmi igénypontok

Claims (3)

1. Eljárás az (I) képletű A 47 934 jelű antibioti10 kum és farmakológiai szempontból alkalmazható bázikus sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 mikroorganizmust vagy annak A 47 934 antibiotikumot termelő variánsát vagy mutánsát tenyésztjük asszi5 m iálható szén- és nitrogénforrásokat, és szervetlen sókat tartalmazó táptalajban, süllyesztett, aerobfermentációs körülmények között.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy az A 47934 antibiotikumot elválasztjuk a 20 fermentléből.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 mikroorganizmust tenyésztjük.
2 oldal rajz
Kiadja az Országos Találmányi Hivatal A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető Szedte a Nyomdaipari Fényszedő Üzem (878402/09)
88-2314 — Dabasi Nyomda, Budapest — Dabas Felelős vezető: Bálint Csaba igazgató
-14. 192 162
NSZ04: C 12 P 21/04 A 61 K 37/02 (I)
V CH-NHj, o nh li
H-OC-CH
CH-NH.
0 NH
1 I
H-OC-CH (ii)
HU832446A 1982-07-30 1983-07-07 Process for preparing antibiotica 47934 HU192162B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/403,842 US4462942A (en) 1982-07-30 1982-07-30 A47934 Antibiotic and process for production thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU192162B true HU192162B (en) 1987-05-28

Family

ID=23597185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU832446A HU192162B (en) 1982-07-30 1983-07-07 Process for preparing antibiotica 47934

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4462942A (hu)
EP (1) EP0100605B1 (hu)
JP (1) JPS5929621A (hu)
KR (1) KR860001231B1 (hu)
AR (1) AR231842A1 (hu)
AT (1) ATE22802T1 (hu)
AU (1) AU557782B2 (hu)
CA (1) CA1202261A (hu)
CS (1) CS235045B2 (hu)
DD (1) DD210072A5 (hu)
DE (1) DE3366836D1 (hu)
DK (1) DK310683A (hu)
ES (1) ES8504250A1 (hu)
FI (1) FI832429L (hu)
GB (1) GB2124620B (hu)
GR (1) GR77578B (hu)
HU (1) HU192162B (hu)
IL (1) IL69142A0 (hu)
NZ (1) NZ204800A (hu)
PL (1) PL242777A1 (hu)
PT (1) PT77007B (hu)
RO (1) RO86844B (hu)
ZA (1) ZA834938B (hu)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4537879A (en) * 1982-07-30 1985-08-27 Eli Lilly And Company A47934 Antibiotic and process for production thereof
AU579120B2 (en) * 1983-12-16 1988-11-17 Gruppo Lepetit S.P.A. Chemical process for preparing antibiotic L 17392 (deglucoteicoplanin) and its salts
GB8415092D0 (en) * 1984-06-13 1984-07-18 Lepetit Spa Ester derivatives
GB8415093D0 (en) * 1984-06-13 1984-07-18 Lepetit Spa Antibiotic l 17392
IL78597A0 (en) * 1985-04-25 1986-08-31 Lilly Co Eli Novel glycopeptide derivatives
GB8608798D0 (en) * 1986-04-11 1986-05-14 Lepetit Spa Recovery of glycopeptide antibiotics from aqueous solutions
US4742045A (en) * 1986-07-30 1988-05-03 Smithkline Beckman Corporation Glycopeptide antibiotics
US4880735A (en) * 1986-09-24 1989-11-14 Eli Lilly And Company Process for producing antibiotic A47934
GB8624806D0 (en) * 1986-10-16 1986-11-19 Pfizer Ltd Glycopeptide antibiotic
US4845194A (en) * 1987-02-27 1989-07-04 Eli Lilly And Company Glycopeptide recovery process
US5204361A (en) * 1988-03-30 1993-04-20 Rowe James B Method for treating laminitis in equine livestock
US7570028B2 (en) * 2007-04-26 2009-08-04 Advanced Energy Industries, Inc. Method and apparatus for modifying interactions between an electrical generator and a nonlinear load
US8716984B2 (en) 2009-06-29 2014-05-06 Advanced Energy Industries, Inc. Method and apparatus for modifying the sensitivity of an electrical generator to a nonlinear load
UA119642C2 (uk) * 2013-03-15 2019-07-25 Меріал, Інк. Протимікробні поліамідні композиції та лікування маститу
FR3013436B1 (fr) * 2013-11-18 2018-12-07 Valeo Systemes Thermiques Collecteur pour echangeur de chaleur
PL410247A1 (pl) * 2014-11-25 2016-06-06 Jamroży Marek Bio-Koncept Sposób sanityzacji otoczenia mikrobiologicznego

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB765886A (en) * 1953-08-11 1957-01-16 Abbott Lab A new antibiotic ristocetin and a method of producing same
US3067099A (en) * 1955-09-16 1962-12-04 Lilly Co Eli Vancomycin and method for its preparation
US3338786A (en) * 1966-07-29 1967-08-29 American Cyanamid Co Antibiotic av290 and production thereof
US3952095A (en) * 1972-06-02 1976-04-20 Eli Lilly And Company Novel antibiotic and a process for the production thereof
JPS5831196B2 (ja) * 1975-10-29 1983-07-04 明治製菓株式会社 Ｓｆ−１７７１ ブツシツノ セイゾウホウ
US4322406A (en) * 1980-12-18 1982-03-30 Eli Lilly And Company Antibiotic A-4696 factors B1, B2, B3, C1a, C3 and E1
US4322343A (en) * 1980-12-18 1982-03-30 Eli Lilly And Company Pseudo-aglycone of actaplanin

Also Published As

Publication number Publication date
ES523761A0 (es) 1985-04-16
DE3366836D1 (en) 1986-11-20
KR840005483A (ko) 1984-11-14
GB8318056D0 (en) 1983-08-03
IL69142A0 (en) 1983-11-30
GR77578B (hu) 1984-09-24
CS235045B2 (en) 1985-04-16
EP0100605B1 (en) 1986-10-15
AU1649383A (en) 1984-02-02
AU557782B2 (en) 1987-01-08
KR860001231B1 (ko) 1986-08-30
FI832429A0 (fi) 1983-07-01
GB2124620B (en) 1985-11-27
DK310683A (da) 1984-01-31
ATE22802T1 (de) 1986-11-15
RO86844B (ro) 1985-05-31
EP0100605A1 (en) 1984-02-15
GB2124620A (en) 1984-02-22
DD210072A5 (de) 1984-05-30
RO86844A (ro) 1985-05-20
PT77007B (en) 1986-04-11
NZ204800A (en) 1987-02-20
JPH0443079B2 (hu) 1992-07-15
FI832429L (fi) 1984-01-31
US4462942A (en) 1984-07-31
JPS5929621A (ja) 1984-02-16
ZA834938B (en) 1984-03-28
AR231842A1 (es) 1985-03-29
ES8504250A1 (es) 1985-04-16
PL242777A1 (en) 1984-08-13
CA1202261A (en) 1986-03-25
DK310683D0 (da) 1983-07-05
PT77007A (en) 1983-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4322406A (en) Antibiotic A-4696 factors B1, B2, B3, C1a, C3 and E1
HU192162B (en) Process for preparing antibiotica 47934
CA1238316A (en) Aglycone and pseudo-aglycones of the aad 216 antibiotics
JP2603047B2 (ja) 抗生物質ａａｄ２１６複合体を生産するキブデロスポランジウム・アリダム株
CA1297825C (en) Antibiotics called &#34;chloropolysporins b and c&#34; a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use
FI75190B (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett antibiotikum a41030-komplex eller dess faktorer a, b, c, d, e, f och g.
US4375513A (en) Biologically pure culture of Actinoplanes missouriensis
US4430328A (en) Ruminant lactation improvement
EP0287110A2 (en) Glycopeptide antibiotics pa-45052
US4537879A (en) A47934 Antibiotic and process for production thereof
US4604239A (en) Antibiotics
US4659660A (en) A47934 antibiotic and process for production thereof
US4537770A (en) A41030 antibiotics
US4713331A (en) Microbial production of A41030 antibiotics
EP0055071B1 (en) Antibiotic a-4696 factor g
EP0063491B1 (en) Ruminant lactation improvement
US4672036A (en) Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof
KR950013454B1 (ko) 동물 성장 촉진제
US5213797A (en) A80407 antibiotics
US4559323A (en) A41030 Antibiotics
US4996148A (en) A80407 antibiotics
US4797280A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323