PL180230B1 - Lipopeptydy z Actinoplanes sp. o dzialaniu farmakologicznym, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents
Lipopeptydy z Actinoplanes sp. o dzialaniu farmakologicznym, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna PL PL PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL180230B1 PL180230B1 PL94334634A PL33463494A PL180230B1 PL 180230 B1 PL180230 B1 PL 180230B1 PL 94334634 A PL94334634 A PL 94334634A PL 33463494 A PL33463494 A PL 33463494A PL 180230 B1 PL180230 B1 PL 180230B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- lipopeptides
- formula
- fatty acid
- carbon atoms
- chain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/60—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation occurring through the 4-amino group of 2,4-diamino-butanoic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/827—Actinoplanes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Lipopeptydy z Actinoplanes sp. o dzialaniu farmakologicznym o wzorze 1, w którym R1 oznacza jednokrotnie nienasyco- ny, nasycony, nierozgaleziony rodnik kwasu tluszczowego lub hydroksytluszczowego o dlugosci lancuchów o 6 do 22 wlacznie ato- mów wegla. P L 180230 B 1 PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku są lipopeptydy z Actinoplanes sp. o działaniu farmakologicznym, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna. Wynalazek dotyczy lipopeptydów o homologicznych sekwencjach aminokwasowych, jednak o różnych resztach kwasów tłuszczowych (część lipidowa), które syntetyzuje się z Actinoplanes sp. podczas fermentacji i które są oddawane do pożywki, sposobu wyodrębniania lipopeptydów z pożywki i oczyszczania ich, zastosowania lipopeptydów jako farmakologicznych substancji czynnych, zwłaszcza przeciwko bakteriom Gram-dodatnim.
Wtórne metabolity z mikroorganizmów stosuje się skutecznie do leczenia chorób zakaźnych. W przypadku wtórnych metabolitów chodzi o małocząsteczkowe związki, których tworzenie następuje na „biosyntetycznych drogach jednokierunkowych”, które odgałęziają się od pierwotnego metabolizmu, i których funkcja dla każdorazowych producentów jest niewyjaśniona. Do dzisiaj jest znanych około 8000 wtórnych metabolitów wyodrębnionych z hodowli różnych mikroorganizmów, przede wszystkim grzybów i bakterii gatunku Streptomyces.
Główną dziedziną zastosowania tych wtórnych metabolitów jest leczenie chorób zakaźnych. Jednak przez powszechne ich używanie dochodzi często do wytworzenia oporności tak, że istnieje ciągłe zapotrzebowanie na nowe antybiotyki i substancje czynne o nowych mechanizmach działania (Neu H.C., Science 257, 1992, strony 1064-1073).
Oprócz tego zakres wskazań mikrobiologicznych substancji czynnych rozszerzył się również na choroby, których nie zalicza się do chorób zakaźnych, np. leczenie nowotworów, immunomodulacja albo do regulowania przemiany tłuszczowej, oraz na ochronę roślin jak środki chwastobójcze i owadobójcze. Stosowane substancje czynne są oczywiście często jeszcze obciążone wadami charakteryzującymi się niezadowalającymi poziomami działania, zbyt wysoką toksycznością i/albo niepożądanymi działaniami ubocznymi.
W literaturze opisane są lipopeptydy, których część aminokwasowa odnośnie sekwencji jest identyczna z lipopeptydami według wynalazku albo odnośnie składu aminokwasów jest jednakowa lub bardzo podobna do lipopeptydów według wynalazku. Te lipopeptydy różnią się jednak zasadniczo od lipopeptydów według wynalazku w części lipidowej.
Przykłady tych lipopeptydów stanowią:
- amfomycyna (Amphomycin Antibiot.) /J. Antibiotics, 38, strona 517 (1965)/,
- glumamycyna (Glumamycin) /J. Antibiotics, 38, strona 517 (1965)/,
- zaomycyna (Zaomycin) /J. Antibiot., strona 194 (1960)/,
- aspartocyna (Aspartocin) /Antibiot. Ann., 194 (1960)/,
- tsuhimycyna (Tsuhimycin) /J. Antibiotics, 21, strona 439 (1968)/,
- laspartomycyna (Laspartomycin) /J. Antibiotics 21, strona 55 (1968)/.
Te lipopeptydy, które są określone jako lipopeptydy typu amfomycyna, syntetyzowane są przez mikroorganizmy gatunku Streptomyces. Swą antybiotyczną skuteczność rozwijają one przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, jak np. Strepto-, Staphylo- i Enterococcen. Szczególnie szczepy gatunków Staphylo- i Enterococcus okazały się w ostatnim czasie „zarazkami problemowymi”. Przez zarazki problemowe specjalista rozumie takie mikroorganizmy, których efektywne zwalczanie tymczasem na podstawie oporności nie jest możliwe powszechnie stosowanymi antybiotykami, np. β-laktamoantybiotykami albo glikopeptydoantybiotykami, jak na przykład wankomycyna (Vancomycin) albo teikoplanina (Teikoplanin).
Grupą szczepów mikroorganizmów, które wykształciły oporności, sąnp. oporne na metycylinę (Methicillin'ę) szczepy Staphylococcus aureus, nazywane krótko szczepy MRSA. Tymczasem
180 230 wiadomo, że te szczepy MRSA często wykształcały oporności nie tylko wobec metycyliny, lecz poza tym wobec dalszych antybiotyków, np. wankomycyny.
Pominąwszy już wymienione związki ze Streptomyceten, znany jest związek z Actimoplanes nipponensis ATCC 31 145, który na podstawie swego spektrum działania oraz opisanych właściwości fizyko-chemicznych wykazuje strukturalne podobieństwa z lipopepty darni według wynalazku i określonyjestjako związek41.012 (patentUS 4.000.397). Fermentacja Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 w różnych warunkach hodowli prowadzi ciągle do względnie niskich wydajności związku 41.012.
Zadaniem wynalazku jest wynalezienie mikrobiologicznych surowców naturalnych o poprawionych właściwościach.
Zadanie to rozwiązano według wynalazku przez fermentację Actioplanes sp. w pożywce płynnej ze źródłem węgla i azotu oraz zwykłymi solami nieorganicznymi, aż do nagromadzenia się z pożywce lipopeptydów, korzystnie lipopeptydów A 1437, następne wyodrębnienie lipopeptydów z pożywki i ewentualnie rozdzielenie mieszaniny na jej poszczególne składniki. Lipopepty dy wykazują farmakologiczną aktywność, a zatem terapeutyczną skuteczność i można je stosować jako antybiotyki o działaniu przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, zwłaszcza przeciwko szczepom opornym wobec glikopeptydów.
Przedmiotem wynalazku sązatem: Lipopeptydy o wzorze 1, w którym R1 oznacza jednokrotnie nienasycony, nasycony, nierozgałęziony łańcuch kwasu tłuszczowego lub hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów o 6 do 22 włącznie atomów węgla.
W lipopeptydach o wzorze 1, R1 oznacza łańcuch zawierający 6-22,korzystnie 10 do 20 włącznie atomów węgla, a zwłaszcza łańcuch zawierający 12-15 atomów węgla.
Korzystne są lipopeptydy o wzorze 1, w który R1 oznacza łańcuch
a) kwasu nC12-tłuszczowego,
b) kwasu nCj 3-tłuszczowego lub
c) kwasu nC14-tłuszczowego, a zwłaszcza lipopeptydy o wzorze 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze 2 lub 3, lub 4.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania lipopeptydów o wzorze 1, w którym R1 ma wyżej podane znaczenia, charakteryzujący się tym, że fermentuje się Actinoplanes sp. w pożywce aż do nagromadzenia się w tej pożywce jednego albo więcej lipopeptydów i oczyszcza się z pożywki jeden lub więcej lipopeptydów o wzorze 1 przez wytrącenie lipopeptydów z pożywki stosując kwasy, przy pH 0,5 do 4 włącznie, potem ewentualnie otrzymane z wytrącenia lipopeptydy oczyszcza się przez chromatografię na wymieniaczach anionowych albo chromatografię na hydrofobowej matrycy, przy czym obydwie chromatografie przeprowadza się alternatywnie albo jedną po drugiej w dowolnej kolejności.
W sposobie fermentuje się Actinoplanes sp. DSM7358. Przedmiotem wynalazku jest również substancja farmakologicznie skuteczna, przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, szczególnie korzystnie przeciwko bakteriom opornym wobec glikopeptydu, charakteryzująca się tym, że zawiera jeden lub więcej lipopeptydów o wzorze 1, w którym R1 ma wyżej podane znaczenie, korzystnie lipopeptyd o wzorze 1, wktórymR1 oznaczałańcucho 12,13,14albo 15 atomach węgla, lub łańcuch
a) kwasu nCi2-tłuszczowego,
b) kwasu nCj3-tłuszczowego lub
c) kwasu nC14-tłuszczowego lub grupę o wzorze 2, 3 i 4.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynnąi ewentualnie farmaceutyczne nośniki charakteryzująca się tym, że zawiera jako substancję czynną lipopeptydy o wzorze 1, w którym R1 oznacza jednokrotnie nienasycony, nasycony, nierozgałęziony rodnik kwasu tłuszczowego lub kwasu hydroksythrszczowego o długości łańcuchów o 6 do 22 włącznie atomów węgla.
Poniżej wynalazek opisany jest szczegółowo, zwłaszcza jego korzystne postacie wykonania. Poza tym wynalazek jest określony przez treść zastrzeżeń patentowych.
180 230
Określenie pojęć
- Dab oznacza kwas 2,3-diaminomasłowy,
- Pip oznacza kwas pipekolinowy (synonim - homoprolina),
- MeAsp oznacza β-metyloasparaginian,
- Gly oznacza glicynę,
- Asn oznacza asparaginę,
- Asp oznacza kwas asparginowy,
- Val oznacza walinę,
- Pro oznacza prołinę,
- n oznacza normalny/nierozgałęziony, a
- CID oznacza „rozpad wywołany zderzeniami”.
Skrót „i” oznacza „izo”, natomiast „ai” oznacza „ante-izo”. Te oznaczenia znane są specjaliście w związku z kwasami tłuszczowymi (Biochemistry, Zubay, wydawnictwo Addison Wesley w Londynie, Amsterdamie, 1983).
Wszystkie dane procentowe odnoszą się do ciężaru, jeżeli nie podano inaczej. Stosunki w mieszaninach w przypadku cieczy odnoszą się do objętości, o ile nie podano inaczej.
Sposób według wynalazku można stosować do fermentacji w skali laboratoryjnej (zakres mililitra do litra) i dla skali przemysłowej (skala w metrach sześciennych).
Actinoplanes sp. wyodrębnia się z próby ziemi. W celu oczyszczenia z ziemi przeprowadza się ją w zawiesinę przy wytworzeniu szeregu rozcieńczeń fizjologicznym roztworem NaCl (0,9%). Różne rozcieńczenia (10° -106) nanosi się następnie na pożywki Actinomyceten. Po wylęgnięciu kultur w temperaturze 30°C w okresie 2 do 14 dni powstają kolonie Actinomyceten, które można odosobnić i wyodrębnić przez szereg następujących po sobie etapów oczyszczania.
Oznaczanie gatunków przeprowadza się za pomocą morfologicznych i taksonomicznych kryteriów według metod znanych przez specjalistę. Dla gatunku Actinoplanes charakterystyczne są przede wszystkim ruchliwe zarodniki.
Na podstawie następujących po sobie etapów wyodrębniania i oczyszczania można wyodrębnić z Actinoplanes sp. kolonię, która bardzo skutecznie oddaje do pożywki jeden albo więcej związków lipopeptydowych, korzystnie lipopeptydy A 1437 A, B, C, D, E, F, G,H, K, L i/alboM, i jest określana jako główny producent.
Jako główny producent określa się izolat, który produkuje albo oddaje do pożywki jeden, albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku w 10-do 100-krotnie zwiększonej ilości w porównaniu do izolatów takiego samego rodzaju Actinoplanes.
Silnie produkującą kolonię Actinoplanes sp. rozmnaża się. Izolat zdeponowano w Niemieckim Zbiorze Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych GmbH, Mascheroder Veg IB, 3300 Braunschweig, Niemcy, według zasad Budapesztańskiej Umowy dnia 18 czerwca 1990 pod następującym numerem: Actinoplanes sp. DSM 7358.
Actinoplanes sp. DSM 7358 ma grzybnię o barwie pomarańczowej i charakteryzuje się kulistymi sporangiami.
W płynnej pożywce (określonej również jako pożywka), która zawiera źródło węgla i źródło azotu oraz zwykłe sole nieorganiczne, Actinoplanes sp., szczególnie DSM 7358, produkuje jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku.
Zamiast szczepu DSM 7358 można używać również jego mutanty i warianty, które syntetyzująjeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku. Takie mutanty można wytwarzać w zasadzie znanym sposobem za pomocą środków fizycznych, na przykład przez naświetlanie, jak promieniami ultrafioletowymi albo rentgenowskimi, albo chemicznymi mutagenami, takimi jak na przykład etylometanosulfonian (EMS), 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon (MOB) albo N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG).
Skrining według mutantów i wariantów syntetyzujących jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku następuje według poniższego schematu:
- oddzielenie grzybni po fermentacji,
- wytrącenie lipopeptydów przy pH 1 do 2 (w temperaturze 4°C),
180 230
- rozprowadzenie osadu w H2O/MeOH (1:1),
- analiza zapomocąHPLC, DC albo za pomocąbadania biologicznej aktywności (Hemmhoftest).
Opisane wyżej warunki fermentacji dotyczą Actinoplanes sp., zdeponowanego izolatu DSM 7358 oraz mutantów i wariantów ich.
W pożywce płynnej, która zawiera źródło węgla i źródło azotu oraz zwykłe nieorganiczne sole, Actinoplanes sp., korzystnie DSM 7358, produkuje jeden albo więcej związków lipopeptydowych, korzystnie lipopeptydy A 1437 A-H oraz K, L, M.
Jako korzystne źródła węgla dla aerobowej fermentacji nadają się dające się asymilować węglowodany i alkohole cukrowe jak glukoza, laktoza albo D-mannit oraz produkty naturalne zawierające węglowodany, jak np. ekstrakt słodowy. Jako substancje odżywcze zawierające azot wchodzą w rachubę aminokwasy, peptydy i proteiny jak również produkty ich rozkładu jak peptony albo tryptony, dalej ekstrakty mięsne, zmielone nasiona, na przykład kukurydzy, pszenicy, fasoli, soi albo roślin bawełny, pozostałości podestylacyjne z wytwarzania alkoholi, mączki mięsne albo ekstrakty drożdżowe, albo także sole amonowe i azotany. Odnośnie nieorganicznych soli pożywka płynna może zawierać na przykład chlorki, węglany, siarczany albo fosforany metali alkalicznych, albo metali ziem alkalicznych, żelaza, cynku, kobaltu i manganu.
Wytwarzanie lipopeptydów według wynalazku przeprowadza się szczególnie dobrze w pożywce płynnej, która zawiera około 0,1 do 5%, korzystnie 0,3 do 2% ekstraktu mięsnego i 0,2 do 5%, korzystnie 0,5 do 2% sacharozy i 0,05 do 5 g/1, korzystnie 0,1 do 0,5 g/1 ekstraktu drożdżowego i 0,05 do 2 g/1, korzystnie 0,1 do 1 g/1 siarczanu magnezu i 0,05 do 10 g/1, korzystnie 0,1 do 1 g/1 diwodorofosforanu potasu albo sodu i 0 do 100 μΜ, korzystnie 5 do 20 μΜ chlorku żelazowego. Dane procentowe odnoszą się każdorazowo do ciężaru całej pożywki płynnej.
W tej pożywce płynnej Actinoplanes sp., korzystnie Actinoplanes DSM 7358 tworzy mieszaninę złożoną z lipopeptydów według wynalazku. Mieszanina składa się szczególnie z 11 różnych, wykrywalnych lipopeptydów. Spośród tych lipopeptydów scharakteryzowano lipopeptydy o wzorze 1 według wynalazku jako A 1437 K; L i M i scharakteryzowano, je w poniższej tabeli. Obok lipopeptydów według wynalazku tworzy Actinoplanes sp., korzystnie Actinoplanes DSM 7358 lipopeptydy A, Β, E i G o wzorze 1 scharakteryzowane poniżej w tabeli.
Tabela
Nazwa lipopeptydu | R1 | Masa cząsteczkowa |
A 1437 A | wzór 5 | 1290 |
A 1437 B | wzór 6 | 1304 |
A 1437 E | wzór 7 | 1290 |
A 1437 G | wzór 8 | 1318 |
A 1437K | wzór 3 | 1318 |
A 1437 L | wzór 4 | 1318 |
A 1437 M | wzór 2 | 1318 |
Lipopeptyd A 1437 A, zawiera kwas izo-CI3-tłuszczowy. Sekwencja aminokwasowa w 1437 A odpowiada sekwencji aminokwasowej amfomycyny [Bodanszky et al. J. Am. Chem Soc. 95, 2352(1973)].
Lipopeptyd A 1437 B zawiera kwas tłuszczowy typu izo-C14, a zatem kwas tłuszczowy znany z tsuhimycyny [Shoji et al. The Journal of Antibiotics 21,439 (1968)] i posiada sekwencję aminokwasową amfomycyny [Bodanszky et al. J. Am. Chem. Soc. 95, 2352 (1973)].
Lipopeptyd A 1437 E jest identyczny z amfomycyną znaną ze Streptomyceten.
Dalej tworzy Actinoplanes sp., zwłaszcza Actinoplanes DSM 7358 poniżej scharakteryzowane lipopeptydy o wzorze 1A
180 230
Tabela
Nazwa lipopeptydu | R1 | Masa cząsteczkowa |
A 1437 C | wzór 5 | 1289 |
A 1437 D | wzór 6 | 1303 |
A 1437F | wzór 7 | 1289 |
A 1437 H | wzór 8 | 1317 |
Lipopeptyd A 1437 C, zawiera jeszcze nieznany dotychczas w lipopeptydach typu amfomycyny kwas izo-C13-tłuszczowy. Skład aminokwasów i sekwencja aminokwasowa w A 1437 C nie są znane z innych lipopeptydów.
Lipopeptyd A 1437 D zawiera kwas tłuszczowy typu izo-C14, a zatem kwas tłuszczowy znany z tsuhimycyny [Shoji et al. The Journal of Antibiotics 21, 439 (1968)].
A 1437 D różni się jednak w swym składzie aminokwasów i sekwencji od znanych dotychczas ze znanego stanu techniki.
Skład aminokwasów amfomycyny, glumamycyny, zaomycyny i tsuhimycyny jest według literatury identyczny. (Strong et al. Antimicrobal Agents and Chemotherapy 1970,42, Bodanszky et al. J. Am. Chem. Soc. 95, 2352 (1973) Inoue, Buli. Chem. Soc. Jap. 35, 1556 (1962)).
Lipopeptyd A 1437 F składa się z kwasu ante-izo-C13-tłuszczowego, a zatem zawiera taki sam typ kwasu tłuszczowego jak znany z amfomycyny. Jego sekwencja aminokwasowa i skład aminokwasowy nie są znane ze stanu techniki.
Lipopeptyd A 1437 H zawiera, równie jak aspartocyna, kwas ante-izo-C15-tłuszczowy. Sekwencja aminokwasowa w A 1437 H nie jest znana ze stanu techniki.
Lipopeptydy A 1437 K, L i M posiadają jako nierozgałęzione kwasy tłuszczowe kwasy tłuszczowe o długości łańcucha C12 - C14. Sekwencja aminokwasowa tych trzech wymienionych lipopeptydów odpowiada sekwencji aminokwasowej amfomycyny.
Lipopeptydy A 1437 A do H i K, L, M wszystkie mają połączenie funkcji karboksylowej C-końcowej proliny z β-aminofunkcją zlokalizowanego aminokońcowo Dab. To połączenie przedstawione jest przez we wzorze 1 względnie 1 A.
Zależnie od składu pożywki płynnej może zmieniać się ilościowy udział jednego albo więcej lipopeptydów według wynalazku. Poza tym przez skład pożywek można sterować syntezą poszczególnych lipopeptydów tak, że lipopeptyd nie jest w ogóle wytwarzany bądź jest wytwarzany w ilości poniżej granicy wykrywalności mikroorganizmu:
Pożywka Actinoplanes sp., zwłaszcza DSM 7358, zawiera lipopeptydy z jednokrotnie nienasyconym, nasyconym, nierozgałęzionym kwasem tłuszczowym albo kwasem hydroksytłuszczowym o długości łańcucha 6 do 22 włącznie atomach węgla, korzystnie o 10 do 20 włącznie atomach węgla, szczególnie korzystnie o 12, 13, 14 albo 15 atomach węgla.
Specjalista zna tego rodzaju kwasy tłuszczowe, tak np. z Rompp Chemie Lexikon, Prof. Falbe undProf, Regitz, 9. wydanie, wydawnictwo Georg Thieme Stuttgart, Nowy Jork albo z The Encyclopedia of Chemistry C.A. and G.G. Hawley, 3. wydanie, Van Nostrand Reinhold Company, Nowy Jork.
Następujące wyliczenie kwasów tłuszczowych jest przykładowe, nie wnosi żadnego zastrzeżenia do kompletności i nie stanowi żądanego ograniczenia.
Nasycone, nierozgałęzione kwasy tłuszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowią przykładowo kwas kapronowy, enantowy, kaprylowy, pelargonowy, kaprynowy, undekanowy, laurynowy, tridekanowy, mirystynowy, pentadekanowy, palmitynowy, margarynowy, stearynowy, nonadekanowy, arachidynowy, behenowy.
Jednokrotnie nienasycone, nierozgałęzione kwasy tłuszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowią przykładowo kwas akrylowy albo krotonowy.
180 230
Poza tym w pożywce mogąpojawiać się lipopeptydy z wielokrotnie rozgałęzionymi kwasami tłuszczowymi, jak np. z kwasem 2',4',6',8'-tetrametylodekanowym lub z wielokrotnie nienasyconymi, nierozgałęzionymi kwasami nie będące związkami według wynalazku. Są to dwukrotnie nienasycony, nierozgałęziony kwas tłuszczowy w lipopeptydach stanowiący przykładowo kwas sorbowy. Trzykrotnie nienasycony, nierozgałęziony kwas tłuszczowy stanowiący przykładowo kwas linolenowy albo kwas elaeostearynowy. Czterokrotnie nienasycony, nierozgałęziony kwas tłuszczowy stanowiący przykładowo kwas arachidonowy. Pięciokrotnie nienasycony, nierozgałęziony kwas tłuszczowy stanowiący przykładowo kwas klupanodenowy. Sześciokrotnie nienasycony, nierozgałęziony kwas tłuszczowy stanowiący przykładowo kwas dokozaheksanowy lub nasycone, rozgałęzione kwasy tłuszczowe w lipopeptydach stanowiące przykładowo kwas izomasłowy albo kwas izowalerianowy, albo odpowiednie kwasy w konfiguracji „ante-izo”.
Kwasy hydroksythiszczowe w lipopeptydach według wynalazku stanowią na przykład hydroksylowane w pozycji 2' i 3' i/albo na końcu łańcucha węglowego kwasy tłuszczowe w konfiguracji „izo” albo „ante-izo”.
Przy dodaniu 0,01 do 5%, korzystnie 0,02 do 0,1% L-waliny do opisanej wyżej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy A 1437 B i D. Przy dodaniu 0,01 do 5%, szczególnie 0,1 do 0,5% L-leucyny do wyżej opisanej pożywki płynnej szczep Actimoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy A 1437 A i C. Przy dodaniu 0,01 do 5%, szczególnie 0,05 do 0,5% L-izoleucyny do wyżej opisanej pożywki płynnej szczep Actiomoplames sp. tworzy przede wszystkim lipopeptydy A 1437 E, F, G i H. Przy dodaniu 0,01 do 5%, szczególnie 0,03 do 0,5% kwasu L-a-aminomasłowego do opisanej wyżej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy K. Przy dodaniu 0,01 do 5%, zwłaszcza 0,05 do 0,5% L-norwaliny do opisanej wyżej pożywki płynnej szczep Actinoplanes sp. tworzy korzystnie lipopeptydy L i/albo M. To samo dotyczy korzystnego szczepu DSM 7358.
Obok tych aminokwasów można stosować także odpowiednie a-ketonokwasy wymienionych aminokwasów (a-ketonoizowalerianian, α-ketonoizokapronian, a-ketono-3-metylowalerianian, a-ketonowalerianian) albo odpowiadające im kwasy (izomaślan, izowalerianian, α-metylomaślan, n-maślan, propionian, walerianian) w odpowiednich stężeniach albo dalsze substancje, które mogąingerować w biosyntezę kwasów tłuszczowych.
Hodowlę mikroorganizmu prowadzi się aerobowo, a więc na przykład wgłębnie przy wstrząsaniu albo mieszaniu w kolbach do wstrząsania albo fermentorach, ewentualnie przy wprowadzaniu powietrza albo tlenu. Można jąprzeprowadzać w zakresie temperatur około 18 do 35°C, korzystnie około 25 do 35°C, a szczególnie w temperaturze 28 do 32°C. Zakres wartości pH powinien znajdować się pomiędzy 6 i 8, korzystnie pomiędzy 6,5 i 7,5. Hodowlę mikroorganizmu w tych warunkach prowadzi się na ogół w ciągu 24 do 300 godzin, korzystnie 36 do 140 godzin.
Korzystnie hodowlę prowadzi się w kilku etapach, to znaczy najpierw wytwarza się w pożywce płynnej jedną albo więcej kultur wstępnych, które potem przeszczepia się do właściwej pożywki produkcyjnej, głównej hodowli, na przykład w stosunku objętościowym 1:10. Kulturę wstępną otrzymuje się na przykład w ten sposób, że grzybnię przeszczepia się do pożywki płynnej i pozostawia do rośnięcia przez około 3 6 do 120 godzin, korzystnie 48 do 72 godzin. Grzybnię można otrzymać przykładowo tak, że szczep pozostawia się do rośnięcia przez około 3 do 40 dni, korzystnie 4 do 10 dni, na stałej albo płynnej pożywce, na przykład drożdże-słód-agar albo odżywczy bulion-agar (standardowe pożywki dla mikroorganizmów z głównymi składnikami peptonem, solą kuchenną i agarem, np. firmy Difco).
Przebieg fermentacji można nadzorować za pomocą wartości pH kultur albo objętości grzybni oraz metodami chromatograficznymi, jak np. DC albo HPLC, albo przez badanie biologicznej aktywności. Związek według wynalazku zawarty jest zarówno w grzybni jak też w przesączu kultury, jednak największa część (>90%) znajduje się w przesączu kultury.
Niżej opisany sposób wyodrębniania służy do oczyszczania lipopęptydów według wynalazku.
Wyodrębnianie albo oczyszczanie lipopeptydu według wynalazku z pożywki prowadzi się znanymi metodami uwzględniając chemiczne, fizyczne i biologiczne właściwości naturalnych
180 230 surowców. W celu testowania stężenia antybiotyków w pożywce albo w poszczególnych etapach wyodrębniania można stosować chromatografię DC, na przykład na żelu krzemionkowym stosując jako eluent izopropanolowy 25% roztwór NH3 albo HPLC. Wywoływanie w przypadku rozdzielania za pomocą DC można prowadzić na przykład barwiącymi odczynnikami jak aldehydem anyżowym, przy czym ilość utworzonej substancji porównuje się celowo z roztworem wzorcowym.
W celu wyodrębnienia lipopeptydów według wynalazku najpierw zwykłymi sposobami oddziela się grzybnię od brzeczki hodowlanej i następnie przesącz hodowlany ustawia się, korzystnie w temperaturze 4°C, na wartość pH 0,5 do 4 włącznie, korzystnie na pH 1,5 do 2,5 włącznie. Do ustawienia wartości pH, a zatem do wytrącenia lipopeptydów A1437 można stosować wszystkie znajdujące się w handlu kwasy. Roztwór inkubuje się do 16 godzin, korzystnie do 4 godzin i następnie odwirowuje powstały osad.
Osad zawierający całość lipopeptydów ponownie przeprowadza się w stan zawiesiny w 1/20 pierwotnej objętości wody dwukrotnie destylowanej i zapomocąNaOH doprowadza do pH 6 do 7. Przy tym osad przechodzi całkowicie do roztworu, który oziębia się do temperatury -20°C i poddaje liofilizacji. Liofilizat, określany dalej jako surowy produkt, zawiera 5 do 30% lipopeptydów i stosuje się go do dalszego wyodrębniania.
Dalsze oczyszczanie jednego albo więcej lipopeptydów według wynalazku przeprowadza się drogą chromatografii na odpowiednich materiałach, korzystnie na przykład na żelu krzemionkowym, tlenku glinu, wymieniaczach jonowych albo żywicach adsorpcyjnych, a całkiem szczególnie korzystnie ma mocno albo słabo zasadowych wymieniaczach anionowych. Za pomocą tej chromatografii oddziela się lipopeptydy, które zawierają Asp albo Asn jako aminokońcowo zlokalizowany aminokwas. Chromatografię lipopeptydów prowadzi się zbuforowanymi roztworami wodnymi albo mieszaninami wodnych i alkoholowych roztworów.
Przez zbuforowane roztwory wodne rozumie się np. wodę, bufor fosforanowy, octan amonu, bufor cytrynianowy, bufor boranowy w stężeniu 0 do 1M, korzystnie 1 do 100 mM, szczególnie korzystnie stosuje się zbuforowane fosforanem roztwory w stężeniu 1 do 100 mM.
Przez mieszaniny wodnych albo alkoholowych roztworów rozumie się wszystkie mieszające się z wodą organiczne rozpuszczalniki, korzystnie metanol, acetonitryl, w stężeniu 10 do 80% rozpuszczalnika, korzystnie 40 do 60% rozpuszczalnika albo również wszystkie zbuforowane roztwory wodne, które sąmieszalne z organicznymi rozpuszczalnikami. Odpowiednimi tu buforami są takie same bufory jak podano wyżej.
Oddzielanie lipopeptydów na podstawie ich różnych kwasów tłuszczowych prowadzi się za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami, na przykład MCI® (żywica adsorpcyjna firmy Mitsubishi, laponia). Szczególnie korzystna jest chromatografia z odwróconymi fazami na hydrofobowych materiałach, korzystnie chromatografia na fazach RP-8 albo RP-18. Poza tym oddzielenie może następować za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym.
Chromatografię lipopeptydów przeprowadza się zbuforowanymi albo zakwaszonymi wodnymi roztworami, albo mieszaninami wodnych roztworów z alkoholami, albo innymi rozpuszczalnikami organicznymi mieszającymi się z wodą. Jako organiczny rozpuszczalnik stosuje się korzystnie acetonitryl.
Przez zbuforowane albo zakwaszone roztwory wodne rozumie się np. wodę, bufor fosforanowy, octan amonu, bufor cytrynianowy, bufor boranowy w stężeniu 0 do 0,5 M oraz kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas trifluorooctowy albo wszystkie znajdujące się w handlu, znane specjaliście kwasy, korzystnie w stężeniu 0 do 1%, szczególnie korzystnie 0,1%.
Chromatografię prowadzi się z gradientem, który rozpoczyna się ze 100% wody i kończy ze 100% rozpuszczalnika, korzystny jest liniowy gradient 40 do 60% acetonitrylu.
Kolejność obydwu uprzednio wymienionych chromatografii (chromatografia w celu oddzielenia lipopeptydów według aminokwasów Asp albo Asn i według typu kwasu tłuszczowego) jest odwracalna. Korzystne jest oddzielenie lipopeptydów według różnych aminokwasów w pierwszym etapie i następnie dopiero oddzielenie ich według typu kwasu tłuszczowego.
180 230
Jeżeli wymieniony wyżej surowy produkt zawiera lipopeptydy o jednorodnym kwasie tłuszczowym, opisaną wyżej chromatografię (oddzielenie lipopeptydów na podstawie różnych kwasów tłuszczowych) stosuje się do odsalania i dalszego oczyszczania lipopeptydów.
Alternatywnie można prowadzić również chromatografię żelowąna hydrofobowych fazach.
Chromatografię żelową przeprowadza się na żelach poliakryloamidowych albo żelach z mieszanych polimerów, jak na przykład Biogel-P 2® (firmy Biorad) albo Fractogel TSK HW 40® (firmy Merck, Niemcy albo Toso Haas, USA).
Lipopeptydy według wynalazku są trwałe w stanie stałym i w roztworach w zakresie pH pomiędzy 4 i 8, szczególnie 5 i 7, a zatem można j e wprowadzać w zwykłe preparaty galenowe.
Jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku, na podstawie ich cennych właściwości farmakologicznych, można stosować jako środki lecznicze.
Substancje według wynalazku wykazują farmakologiczną skuteczność szczególnie jako antybiotyk przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, szczególnie korzystnie przeciwko szczepom opornym wobec glikopeptydu.
W przypadku szczepów opornych wobec penicyliny bądź netycyliny (szczepy MRSA), które wykształciły dalsze oporności wobec antybiotyków, często tylko glikopeptydy jak wankomycyna albo teikoplanina wykazują terapeutycznie wystarczające działanie. W sposób powiększający się występująjednak szczepy oporne wobec tych antybiotyków. (FEMS Microbiol. Lett. 98) 1992) 109 do 116). Jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku wykazuje doskonałe działanie również wobec tych „zarazków problemowych”.
Wynalazek dotyczy również farmaceutycznych preparatów jednego albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku.
Jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku, można stosować zasadniczo jako takie w substancji. Korzystne jest zastosowanie w mieszaninie z odpowiednimi substancjami pomocniczymi albo nośnikami. Jako nośniki w przypadku środków leczniczych dla zwierząt można stosować zwykłe mieszanki paszowe, a w przypadku środków leczniczych dla ludzi można stosować wszystkie farmakologicznie tolerowane nośniki i/albo substancje pomocnicze.
Zgodnie z wynalazkiem środki lecznicze stosuje się na ogół doustnie albo pozajelitowo, ale zasadniczo możliwe jest także stosowanie doodbytnicze. Odpowiednie stałe albo ciekłe galenowe postacie preparatów stanowią na przykład granulaty, proszki, tabletki, drażetki (mikro-)kapsułki, czopki, syropy, emulsje, zawiesiny, aerozole, krople albo odpowiednie do wstrzykiwania roztwory w postaci ampułek oraz preparaty o przedłużonym uwalnianiu substancji czynnej. Przy wytwarzaniu wymienionych postaci preparatów znajdują zastosowanie zazwyczaj nośniki i dodatki i/albo środki pomocnicze jak środki rozkruszające, wiążące, otoczkowe, spęczniające, poślizgowe albo smarujące, substancje smakowe, środki słodzące albo środki solubilizujące. Jako często stosowane nośniki albo substancje pomocnicze można wymienić na przykład węglan magnezu, ditlenek tytanu, laktozę, mannit oraz inne cukry, talk, białko mleka, żelatynę, skrobię, witaminy, celulozę i jej pochodne, oleje zwierzęce albo roślinne, glikole polietylenowe i rozpuszczalniki jak na przykład sterylną wodę, alkohole, glicerynę alboalkohole wielowodorotlenowe.
Jednostki dawkowe dla stosowania doustnego mogą być ewentualnie mikrokapsułkowane, aby opóźniać albo rozciągać na dłuższy czas oddawanie substancji czynnej. To mikrokapsułkowanie odbywa się przykładowo przez powleczenie albo ułożenie substancji czynnej w postaci cząstek w odpowiednie polimery, woski albo podobne.
Farmaceutyczne preparaty korzystnie wytwarza się i stosuje w jednostkach dawkowych, przy czym każda jednostka jako czynny składnik zawiera określoną dawkę jednego albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku. W przypadku jednostek dawkowych jak tabletek, kapsułek i czopków dawka ta może wynosić do około 200 mg, korzystnie jednak około 0,1 do 100 mg, a w przypadku roztworów do wstrzykiwania w postaci ampułek do około 200 mg, korzystnie jednak około 0,5 do 100 mg, na dzień.
Przeznaczona do zastosowania dawka dzienna zależy od ciężaru ciała, wieku, rodzaju i stanu ssaka. Ewentualnie można jednak stosować wyższe albo niższe dawki dzienne. Dzienną dawkę można stosować zarówno przez jednorazowe podanie w postaci pojedynczej jednostki
180 230 dawkowej albo w kilku mniejszych jednostkach dawkowych, jak również przez wielokrotne podawanie podzielonych dawek w określonych odstępach.
Środki lecznicze według wynalazku wytwarza się w ten sposób, że jeden albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku razem ze zwykłymi nośnikami oraz ewentualnie substancjami dodatkowymi i/albo pomocniczymi przeprowadza się w odpowiednie albo odpowiednią postać podawania.
Poniższe przykłady objaśniają dalej wynalazek, przy czym dane procentowe odnoszą się do ciężaru. Stosunki w mieszaninach w przypadku cieczy odnoszą się do objętości, o ile nic innego nie zaznaczono.
Przykłady la) Wytwarzanie kultury glicerynowej Actinoplanes sp. DSM 7358
100 ml-pożywki płynnej (4 g/1 ekstraktu drożdżowego, 15 g/1 rozpuszczalnej skrobi, 1 g/1 K2HPO4,0,5 g/1 MgSO4 x 7 H2O, uzupełnione wodą do 1000 ml, wartość pH przed sterylizacją7,0) zaszczepia się w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 300 ml szczepem Actinoplanes sp. DSM 7358 i inkubuje przez 7 dni w temperaturze 30°C i przy 150 obrotach/min na obrotowej wstrząsarce. Następnie 1,5 ml tej kultury rozcieńcza się przy użyciu 2,5 ml 80% gliceryny i składuje w temperaturze -20°C.
Ib) Wytwarzanie w kolbie Erlenmeyera kultury albo kultury wstępnej Actinoplanes sp. DSM 7358
100 ml płynnej pożywki o następującym składzie: 30 g/1 sacharozy, 2 g/1 KN03, 1 g/1 K2HPO4,0,5 g/1 MgSO4 x 7 H20,0,5 g/1 HC1,0,01 g/1 FeSO4 x 7 H20,2 g/1 ekstraktu drożdżowego, 5 g/1 peptonu zaszczepia się w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 300 ml kulturą wyrośniętą na skośnych rurkach (taka sama pożywka płynna, jednak z 2% agaru) albo za pomocą 1 ml kultury glicerynowej (patrz przykład la) i inkubuje na wstrząsarce przy 180 obrotach/min i w temperaturze 30°C. Maksymalną produkcję jednego albo więcej związków lipopeptydów według wynalazku osiąga się po około 120 godzinach. Do zaszczepienia fermentorów o pojemności 10 i 200 1 wystarcza uzyskana po 48 do 96 godzinach wgłębna kultura (ilość szczepiąca około 10%) z takiej samej pożywki płynnej.
II. Porównawcza charakterystyka Actinoplanes sp. DSM 7358
W celu scharakteryzowania szczepu Actinoplanes sp. DSM 7358 przeprowadza się porównanie z blisko spokrewnionymi szczepami metodą ISP według Shirling'a i Gott!ieb'a (Int. J. of Sys. Bacterioł. 16. 3 (1966) 313 do 349). Wyniki przedstawione sąw tabeli I i pokazująone, że szczep Actinoplanes sp. DSM 7358 różni się od innych szczepów morfologicznie i pod względem swej fizjologii.
Tabela 1
Actinoplanes sp. DSM 7358 | A.utahensis NRRL 12052 | A.brasiliensis ATCC 25844 | A.nipponensis ATCC 311455 | |
1 | 2 | 3 | 4 | |
Grzybnia powietrzna Sporangia | + | + | + (ISP 3) + | + |
Pożywka | ||||
ISP 2 | pomarańczowa | pomarańczowa | żółtopomarańczowa | pomarańczowa |
ISP 3 | pomarańczowa | pomarańczowa | żółtopomarańczowa | pomarańczowa |
ISP 4 | pomarańczowa | pomarańczowa | żółtopomarańczowa | pomarańczowa |
ISP 5 | pomarańczowa | pomarańczowa | żółtopomarańczowa | pomarańczowa |
ISP 6 | pomarańczowa czerwony egzopigment | pomarańczowa bmnatnoczerwony egzopigment | żółtopomarańczowa czerwony ezgopigment | pomarańczowa czerwony egzopigment |
180 230 cd. tabeli 1
1 | 2 | 3 | 4 | |
Melanina | - | - | (+) | (+) |
Glukoza | + | + | + | + |
Arabinoza | + | + | + | + |
Sacharoza | + | + | + | + |
Ksyloza | + | + | (+) | - |
Inozytol | + | + | (+) | (+) |
Mannit | + | + | + | - |
Fruktoza | 4- | + | + | - |
Ramnoza | + | + | + | + |
Rafinoza | + | + | (+) | - |
Celuloza | + | + | (+) | - |
Melibioza | - | - | - | - |
Amigdalina | - | + | + | + |
Żelatyna (hydroliza) | + | + | + | + |
Cytrynian (hydroliza) | - | - | + | - |
Mocznik (hydroliza) | + | - | - | - |
Argininohydrolaza | + | - | - | - |
β-galaktozydaza | - | - | - | - |
Tryptofanaza | - | - | - | - |
Lizynodekarboksylaza | + | - | - | - |
Acetoina (tworzenie się) | + | + | + | + |
Indol (tworzenie się) | - | - | - | - |
H2S (tworzenie się) | - | - | - | - |
Tolerancja NaCl | 0 - 2,5% | 0 - 2,5% | 0 - 2,5% | 0 - 2,5% |
Ilia) Wytwarzanie lipopeptydu A 1437 K
Wytwarzanie prowadzi się w następujący sposób:
Fermentor o pojemności 10 1 pracuje w następujących warunkach:
Pożywka: 11 g/1 sacharozy g/1 ekstraktu mięsnego
0,3 g/1 ekstraktu drożdżowego
0,6 g/1 MgSO4
0,1 g/1 KH2PO4 μΜ FeCl3 x 6 H2O
500 mg/1 kwasu L-a-aminomasłowego (albo 1 g/1 racematu) pH 7,3 (przed sterylizacją)
Czas inkubacji: 120 godzin
Temperatura inkubacji: 30°C
Szybkość mieszania: 50 obrotów/min.
N apowietrzanie: 1501 min'1
Przez kilkakrotne dodanie etanolowego roztworu poliolu można powstrzymać tworzenie się piany. Maksimum produkcji osiąga się po około 96 do 120 godzinach.
180 230
Po zakończeniu fermentacji Actinoplanes sp. DSM 7358 sączy się brzeczkę kultury przy dodaniu około 2% środka pomocniczego do sączenia (np. Celite®), przesącz kultury oziębia się do temperatury 4°C i doprowadza do pH 1,5. Po 4 godzinach odwirowuje się przy 10000 g i osad powtórnie przeprowadza w stan zawiesiny w wodzie destylowanej. Przez zobojętnienie zawiesiny wymieniona substancja przechodzi do roztworu. Roztwór zamraża się i liofilizuje. Wydajność surowego peptydu wynosi 1,1 g/1 (= 10 g).
ΙΠ b) Wyodrębnianie lipopeptydu A 1437 K g surowego produktu rozpuszcza się w 100 ml destylowanej wody i przerabia odpowiednio do niżej podanego schematu.
Schemat przerobu (A 1437 K)
- 10 g surowego peptydu w 100 ml destylowanej wody
- adsorpcja na Q-Sepharose fast flow (kolumna 3,5 x 17 cm)
- elucja z następującym gradientem bufor A: NaH2PO4 1 mM w 50% metanolu, pH 5,9 bufor B: NaH2PO4 100 mM w 50% metanolu, pH 5,3 minut: bufor A —> w 45 minut na 25% buforu B, dalsze 45 minut przy 25% buforu B
- liofilizacja frakcji A 1437 K
- odsalanie na Biogefu P2 (wymiar sita 100 - 200) (kolumna 7 x 20 cm) 700 mg A 1437 K (60%)
- chromatografia RP na Nucleosifu C18 7 pm (kolumna 20 x 250 mm) naniesienie: 50 mg wstępnie oczyszczonego produktu elucja z następującym gradientem bufor A: woda dwukrotnie destylowana, 0,1% TFA bufor B: acetonitryl minut: bufor A/5% bufor B —> w 60 minut na 70% buforu B przy przepływie ml/min
- liofilizacja frakcji A 1437 K
5,6 mg A 1437 (> 95%)
IVa) Wytwarzanie lipopeptydów A 1437 L i M
Wytwarzanie prowadzi się w sposób opisany pod Ilia, tylko kwas L-a-aminomasłowy w mieszaninie produkcyjnej zastępuje się przez 500 mg/1 L-norwałiny (albo 1 g/1 racematu) i fermentację przeprowadza się w fermentorze o pojemności 101. Wydajność surowego peptydu wynosi 1,2 g/1 (=12 g).
IVb) Wyodrębnianie lipopeptydów A 1437 L i M g surowego produktu rozpuszcza się w 100 ml destylowanej wody i przerabia odpowiednio do poniższego schematu
Schemat przerobu
- 10 g surowego peptydu w 100 ml destylowanej wody
- adsorpcja na Q-Sepharose fast flow (kolumna 3,5 x 17 cm)
- elucja z następującym gradientem bufor A: NaH2PO4 1 mM w 50% metanolu, pH 5,9 bufor B: NaH2PO4 100 mM w 50% metanolu, pH 5,3 minut: bufor A - w 45 minut na 25% buforu B, dalsze 45 minut przy 25% buforu B
- liofilizacja frakcji A 1437 L i M
- odsalanie na Biogefu P2 (wymiar sita 100 - 200) (kolumna 7 x 20 cm) 900 mg A 1437 L i M (około 60%)
- chromatografia RP na Nucleosifu C18 7 pm (kolumna 20 x 250 mm) naniesienie:50 mg wstępnie oczyszczonego produktu elucja z następującym gradientem
180 230 bufor A: woda dwukrotnie destylowana, 0,1% TFA bufor B: acetonitryl minut: bufor A/5% bufor B-> w 60 minut na 70% buforu B przy przepływie ml/min
- liofilizacja frakcji A 1437 L i M
5,8 mg A 1437 L (> 95%) 6,7 mg A 1437 M (> 95%)
V) Układ HPLC do wykrywania lipopeptydów A 1437
Opisany niżej układ pozwala na oddzielenie i oznaczenie ilościowe lipopeptydów w surowej mieszaninie albo w przesączu kultury; czasy retencji wynoszą pomiędzy 11,5 minut i około 15,9 minut.
Eluent: A fosforan potasu-bufor pH 7,0, 10 mM
B acetonitryl
Gradient: | t (min) | przepływ (ml/min) | A(%) | B (%) |
0 | 1,5 | 80 | 20 | |
15 | 1,5 | 50 | 50 | |
15,5 | 2 | 00 | 100 | |
16,5 | 2 | 00 | 100 | |
17 | 1,5 | 80 | 20 | |
22 | 1,5 | 80 | 20 |
Kolumna: Shandon ODS Hypersil RP 18 (120 x 4,6 mm z kolumną wstępną 20 x 4,6 mm) albo
Nucleosil 120 RP 18 (120 x 4,6 mm z kolumną wstępną 20 x 4,6 mm)
Przepływ: 1,5 ml/min
Wywoływanie: 210 mm
Iniekcja: 10 pi
VI) Porównanie pomiędzy Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 i Actinoplanes spec. DSM 7358
Z obydwu szczepów hoduje się najpierw, jak opisano w przykładzie Ib, kulturę wstępną którą stosuje się do zaszczepienia następujących pożywek produkcyjnych.
Pożywka 1: | 11 g/1 sacharozy 6 g/1 ekstraktu mięsnego 0,3 g/1 ekstraktu drożdżowego 0,6 g/1 MgSO4 0,1 g/1 KH2PO4 10 μΜ FeCl3 x 6H2O 0,6 g/1 L-waliny pH 7,3 (przed sterylizacją) |
Pożywka 2: | jak pożywka 1 jednak bez L-waliny |
Pożywka 3: | glukoza 30 g/1, mączka sojowa 20 g/1, Fe2(SO4)3 0,3 g/1, MnCl2 x 4H2O 0,3 g/1 i CoCl2 x 6H2O pH 7,3 |
każdorazowo 100 ml pożywki w kolbach Erlenmeyera o pojemności 300 ml.
Inkubację prowadzi się w temperaturze 30°C na obrotowej wstrząsarce. Po upływie 48,96 i 144 godzin oznacza się stężenie lipopeptydów A 1437 w przesączu kultury za pomocą HPLC (patrz przykład HI). W pożywce 2 i pożywce 3 w przypadku szczepu Actinoplanes nipponensis 31145
180 230 żaden lipopeptyd nie jest wykrywalny. W pożywce 1 po 144 godzinach wykrywane są niektóre peptydy w bardzo małych ilościach. Jeżeli weźmie się za podstawę identyczną właściwą absorbancję tych związków w porównaniu do peptydów A 1437, to utworzona ilość znajduje się o co najmniej czynnik 100 (< 1 mg/1) poniżej stężenia A 1437 B, jaki syntetyzowany jest przez szczep Actinoplanes spec. DSM 7358 w pożywce 1 po takim samym czasie.
VII) Działanie lipopeptydów A 1437
Czułość istotnych zarazków wobec lipopeptydów A 1437 oznacza się za pomocątestu rozcieńczania agaru. Jako agar stosuje się agar Miiller-Hinton'a, do którego w przypadku S. pyogenes i Enterococcen dodaje się 10% krwi konia. Płytki zawierające antybiotyk zaszczepia się wielokanałowym przyrządem do szczepienia (5 χ 104 cfu/miejsce szczepienia, stacjonarnej kultury każdorazowego szczepu). Wartości NHK (minimalne stężenie hamujące) odczytuje się przy temperaturze 37°C. Jako wartość MHK określa się stężenie antybiotyku, przy którym po 24 godzinach inkubacji nie jest wykrywalny żaden dostrzegalny wzrost zarazków.
Wyniki przedstawione są w tabeli 2. Stosowanąjako kontrola Amfomycynę otrzymano od firmy Boehringer Mannheim (Niemcy). Amfomycyna jest tam do nabycia jako odczynnik wysokowartościowy.
Tabela 2
Substancja A 1437: Aktywność in vitro (widmo AB); stężenie w pg/ml
A 1437 A | 0,391 | 0,781 | 0,391 | 1,56 | 0,391 | 3,13 |
A 1437 B | 0,098 | 0,195 | 0,098 | 0,195 | 0,049 | 0,391 |
A 1437C | 0,195 | 0,781 | 0,391 | 3,13 | 0,781 | 3,13 |
A 1437 D | 0,049 | 0,195 | 0,049 | 0,781 | 0,391 | 0,781 |
A 1437E | 0,098 | 0,195 | 0,094 | 0,098 | 0,025 | 0,195 |
A 1437 F | 0,098 | 0,391 | 0,195 | 1,56 | 0,781 | 1,56 |
A 1437 G | 0,098 | 0,195 | 0,049 | 0,088 | 0,025 | 0,195 |
A 1437H | 0,049 | 0,098 | 0,049 | 0,195 | 0,049 | 0,195 |
Amfomycyna | 0,195 | 0,781 | 0,391 | 1,56 | 0,391 | 1,56 |
Substancja A 1437: Aktywność in vitro (szczepy oporne wobec wankomycyny); stężenie w pg/ml
Enterococcus faecium VR1 | Enterococcus faecium VR2 | Streptococcus pyogenes | |
A 1437 A | nie oznaczone | ||
A 1437 B | 1 | 1 | 0,5 |
A 1437 C | 4 | 4 | 4 |
A 1437 D | 2 | 2 | 1 |
A 1437 E | 4 | 4 | 1 |
A 1437 F | 4 | 4 | 1 |
A 1437 G | 0,25 | 0,25 | 0,125 |
A 1437 H | 1 | 1 | 0,5 |
Amfomycyna | 4 | 4 | 2 |
Związki K, L, M wykazują aktywność in vitro porównywalną ze związkami A-H.
180 230
Przykład VIa. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 D
Lipopeptyd A 1437 D wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
Wartość skręcalności: | +35°C (c = 0,1; metanol) |
HPLC: | czas retencji: 15,1 minut |
Aminokwasy: | 2 kwasy asparaginowe 1 asparagina 1 β-metyloasparginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 1 walina |
FAB-MS: | m/e = 1303, 6952 /(M+H)+/ |
masa cząsteczkowa: | 1302 6884 (C59H94N14O19) |
CID-MS: | m/z = 356, 491, 517, 520, 741, 761, 938, 982 |
IR (Kbr): | v = 3420 (br) cm'1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. |
Przykład VIb. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 B
Lipopeptyd A 1437 B wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
Wartość skręcalności: | +27° (c = 0,1; metanol) |
HPLC: | czas retencji: 12,8 minut |
Aminokwasy: | 3 kwasy asparginowe 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 1 walina |
FAB-MS: | m/e = /(M+H)+/ |
masa cząsteczkowa: | 1303 (C59H93N13O20) |
CID-MS: | m/z = 356, 407, 518, 521, 741, 762, 938, 982 |
IR (Kbr): | δ= 3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. |
Przykład VIc. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 C
Lipopeptyd A 1437 C wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
Wartość skręcalności: | +30° (c = 0,1; metanol) |
HPLC: | czas retencji: 14,1 minut |
Aminokwasy: | 2 kwasy asparaginowe 1 asparagina 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 1 walina |
Masa cząsteczkowa: | 1288 (C5gH92N14O19) |
CID-MS O: IR (Kbr): | m/z = 356, 392, 503, 741, 747, 938, 981 v = 3420 (br) cm’1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. |
Przykład VId. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 A
Lipopeptyd A 1437 wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
Wartość skręcalności: +30° (c = 0,1; metanol)
HPLC: czas retencji: 11,8 minut
Aminokwasy: 3 kwasy asparaginowe β-metyloasparaginian
180 230
2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 1 walina | |
masa cząsteczkowa: | 1289 (C58H91NI3O20) |
CID-MS: | m/z = 356, 478, 504, 507, 741, 748, 938, 981 |
IR (Kbr): | v = 3420 (br) cm’1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. |
Przykład VIe. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 F
Lipopeptyd A 1437 F wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
Wartość skręcalności: | +31° (c = 0,1; metanol) |
HPLC: czas retencji: | 13,8 minut |
Aminokwasy: | 2 kwasy asparaginowe 1 asparagina 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 1 walina |
masa cząsteczkowa: | 1288 (C58H92N14O19) |
CID-MS IR (Kbr): | = m/z = 356, 392, 503, 506, 741, 747, 938, 981 v = 3420 (br) cm'1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. |
Przykład VIf. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 E
Lipopeptyd A 1437 E wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą.
HPLC: czas retencji: | 11,5 minut |
Aminokwasy: | 3 kwasy asparaginowe 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 2 walina |
masa cząsteczkowa: | 1289 (C58H91N13O20) |
CID-MS: | m/z = 356, 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981 |
IR (Kbr): | v = 3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. |
Przykład VIg. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 H
Lipopeptyd A 1437 H wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
Wartość skręcalności: | +32° (c = 0,1; metanol) |
HPLC: czas retencji: Aminokwasy: | 15,9 minut 2 kwasy asparaginowe 1 asparagina 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 1 walina |
masa cząsteczkowa: | 1316 (C60H96N14O19) |
CID-MS: | m/z = 356, 420, 531, 534, 741, 775, 938, 981 |
IR (Kbr): | v = 3420 (br) cm’1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400. |
180 230
Przykład VIh. Charakterystykalipopeptydu A 1437 G
Lipopeptyd A 1437 G wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
Wartość skręcalności: +34° (c = 0,1; metanol)
HPLC: czas retencji: Aminokwasy: | 13,6 minut 3 kwasy asparaginowe 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 kwas pipekolinowy 2 waliny |
masa cząsteczkowa: | 1317 (C^N^) |
CID-MS: IR (Kbr): | m/z = 356, 421, 532, 535, 741, 776, 938, 981 v = 3420 (br) cm’1, 2925,1650, 1535, 1450, 1400. |
Przykład VIi. Charakterystyka lipopeptydu A 1437K
Lipopeptyd A 1437 K wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
HPLC: czas retencji: | 12,5 minut |
Aminokwasy: | 3 kwasy asparaginowe 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 pipekolina 1 walina |
FAB-MS: masa cząsteczkowa: | m/e = /(M+H)+/ 1299 (C58H9łN13O20) |
CID-MS: | m/z = 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981 |
IR (Kbr): | v = 3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. |
Przykład VIj. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 L
Lipopeptyd A 1437 L wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
HPLC: czas retencji: | 13,0 minut |
Aminokwasy: | 3 kwasy asparaginowe 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 pipekolina 1 walina |
FAB-MS: | m/e = /(M+H)+/ |
masa cząsteczkowa: | 1289 (C59H93N13O20) |
CID-MS: | m/z = 407, 518, 741, 761, 938, 981 |
IR (Kbr): | v = 3420 (br) cm'1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. |
Przykład VIk. Charakterystyka lipopeptydu A 1437 M
Lipopeptyd A 1437 M wyodrębnia się jako bezpostaciową substancję stałą
HPLC: | czas retencji: 9,8 minut |
Aminokwasy: | 3 kwasy asparaginowe 1 β-metyloasparaginian 2 glicyny 2 kwasy 2,3-diaminomasłowe 1 prolina 1 pipekolina 1 walina |
180 230
FAB-MS: m/e = /(M+H)+/ masa cząsteczkowa: 1275 (C57H89N13O20)
CID-MS: m/z = 379, 490,493, 724, 741, 938, 981
IR (Kbr): v = 3420 (br) cm’1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.
Przykład VII. C13-chemiczne przesunięcia
W poniższej tabeli pokazane sąC13-chemiczne przesunięcia sygnałów CH lipopeptydu A 1437B
Aby umożliwić porównanie z danymi *H, podano NH-chemiczne związki sygnałów NH albo dla Pip i Pro CoH-przesunięcia odpowiednich układów spinowych.
Tabela
Zaszeregowanie | Dab | Cly | MeAsp | Gly | Asp | Asp | Asp | Dab | Val | Pro | Pip |
NH/Ca | 8,30 | 8,43 | 8,19 | 8,12 | 8,09 | 7,96 | 8,15 | 7,87 | 7,30 | 4,13 | 4,62 |
a | 56,00 | 44,60 | 41,20 | 44,70 | 52,00 | 53,10 | 53,00 | 55,60 | 59,20 | 62,40 | 56,80 |
β | 50,10 | 14,40 | 36,10 | 35,60 | 36,30 | 47,80 | 31,30 | 30,80 | 27,20 | ||
z | 16,00 | 20,10 | 18,9 19,7 | 26,00 | 20,60 | ||||||
δ | 49,40 | 24,90 | |||||||||
β | 45,00 |
180 230
180 230
WZÓR 2
WZÓR 4
180 230
WZÓR 5
WZÓR 6
WZÓR 7
WZÓR 8
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Lipopeptydy z Actinoplanes sp. o działaniu farmakologicznym o wzorze l, w którym R1 oznacza jednokrotnie nienasycony, nasycony, nierozgałęziony rodnik kwasu tłuszczowego lub hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów o 6 do 22 włącznie atomów węgla.
- 2. Lipopeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że R1 oznacza korzystnie łańcuch o 12, 13, 14 albo 15 atomach węgla.
- 3. Lipopeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że R1 oznacza łańcuch o 6 do 22 włącznie atomach węgla taki jak łańcucha) kwasu nCi2-tłuszczowego,b) kwasu nC13-tłuszczowego lubc) kwasu nC14-tłuszczowego.
- 4. Lipopeptydy według zastrz. 3, znamienne tym, że R1 oznacza łańcuch o 6 do 22 włącznie atomach węgla taki jak grupa o wzorze 2..
- 5. Lipopeptydy według zastrz. 3, znamienne tym, że R1 oznacza łańcuch o 6 do 22 włącznie atomach węgla taki jak grupa o wzorze 3.
- 6. Lipopeptydy według zastrz. 3, znamienne tym, że R1 oznacza łańcuch o 6 do 22 włącznie atomach węgla taki jak grupa o wzorze 4.
- 7. Sposób wytwarzania lipopeptydów o wzorze 1, w którym R1 oznacza jednokrotnie nienasycony, nasycony, nierozgałęziony rodnik kwasu tłuszczowego albo kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów o 6 do 22 włącznie atomów węgla, znamienny tym, że fermentuje się Actinoplanes sp., w pożywce aż do nagromadzenia się w tej pożywce jednego albo więcej lipopeptydów i oczyszcza się z pożywki lipopeptydy o wzorze 1 przez wytrącenie lipopeptydów z pożywki stosując kwasy, przy pH 0, 5 do 4 włącznie, potem ewentualnie otrzymane z wytrącenia lipopeptydy oczyszcza się przez chromatografię na wymieniaczach anionowych albo chromatografię na hydrofobowej matrycy, przy czym obydwie chromatografie przeprowadza się alternatywnie albo jedną po drugiej w dowolnej kolejności.
- 8. Sposób wytwarzania lipopeptydów o wzorze 1, według zastrzeżenia 7, w którym R1 oznacza korzystnie łańcuch o 12,13,14 albo 15 atomach węgla lub R1 oznacza łańcuch o 6 do 22 włącznie atomach węgla taki jak łańcucha) kwasu nC12-thiszczowego,b) kwasu nC13-thiszczowego łubc) kwasu nC14-tłuszczowego, lub taki jak grupa o wzorze 2, 3 lub 4, znamienny tym, że fermentuje się Actinoplanes sp. w pożywce aż do nagromadzenia się w tej pożywce jednego lub więcej lipopeptydów i oczyszcza się z pożywki lipopeptydy o wzorze 1, przez wytrącenie lipopeptydów z pożywki stosując kwasy, przy pH 0,5 do 4 włącznie, potem ewentualnie otrzymane z wytrącenia lipopeptydy oczyszcza się przez chromatografię na wymieniaczach anionowych albo chromatografię na hydrofobowej matrycy, przy czym obydwie chromatografie przeprowadza się alternatywnie albo jedną po drugiej w dowolnej kolejności.
- 9. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną i ewentualnie farmaceutyczne nośniki, znamienna tym, że zawiera jako substancję czynną lipopeptydy o wzorze 1, w którym R1 oznacza jednokrotnie nienasycony, nasycony, nierozgałęziony rodnik kwasu tłuszczowego lub kwasu hydroksytłuszczowego o długości łańcuchów o 6 do 22 włącznie atomów węgla.
- 10. Substancja farmakologicznie czynna, przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej lipopeptydów o wzorze 1, w którym R1 oznacza jednokrotnie nienasycony, nasycony, nierozgałęziony rodnik kwasu tłuszczowego lub hydroksytłuszczowego o180 230 długości łańcuchów o 6 do 22 włącznie atomów węgla, korzystnie lipopeptyd o wzorze 1, w którym R1 oznacza łańcuch o 12-15 atomach węgla lub łańcucha) kwasu nC12-thiszczowego,b) kwasu nC13-tłuszczowego lubc) kwasu nC]4-tłuszczowego, lub grupę o wzorze 2, 3 lub 4.* * *
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4319007 | 1993-06-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL180230B1 true PL180230B1 (pl) | 2001-01-31 |
Family
ID=6489896
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL94334634A PL180230B1 (pl) | 1993-06-08 | 1994-06-06 | Lipopeptydy z Actinoplanes sp. o dzialaniu farmakologicznym, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna PL PL PL PL PL PL PL PL |
PL94303716A PL179581B1 (pl) | 1993-06-08 | 1994-06-06 | kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna PL PL PL PL PL PL PL PL |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL94303716A PL179581B1 (pl) | 1993-06-08 | 1994-06-06 | kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna PL PL PL PL PL PL PL PL |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6194383B1 (pl) |
EP (2) | EP0864584B1 (pl) |
JP (1) | JP2660161B2 (pl) |
KR (2) | KR0174264B1 (pl) |
AT (2) | ATE174604T1 (pl) |
AU (1) | AU672691B2 (pl) |
CA (1) | CA2125376C (pl) |
CY (1) | CY2190B1 (pl) |
CZ (1) | CZ285322B6 (pl) |
DE (2) | DE59407475D1 (pl) |
DK (2) | DK0629636T3 (pl) |
ES (2) | ES2153224T3 (pl) |
FI (1) | FI942660A (pl) |
GR (2) | GR3029591T3 (pl) |
HK (1) | HK1012009A1 (pl) |
HU (1) | HU217177B (pl) |
IL (2) | IL109917A (pl) |
MA (1) | MA23216A1 (pl) |
NO (1) | NO942110L (pl) |
NZ (1) | NZ260682A (pl) |
OA (1) | OA10066A (pl) |
PL (2) | PL180230B1 (pl) |
PT (1) | PT864584E (pl) |
RU (1) | RU2117672C1 (pl) |
SK (1) | SK281830B6 (pl) |
TW (1) | TW455591B (pl) |
UY (1) | UY23762A1 (pl) |
ZA (1) | ZA943983B (pl) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4411025A1 (de) * | 1994-03-30 | 1995-10-05 | Hoechst Ag | Lipopeptid-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
DE19807972A1 (de) | 1998-02-25 | 1999-08-26 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Lipopeptidantibiotika-Calciumsalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung |
KR100291406B1 (ko) * | 1999-05-13 | 2001-05-15 | 이길정 | 직거 염색기용 기어박스 |
KR100423751B1 (ko) * | 1999-05-18 | 2004-03-22 | 심선희 | 지그염색기의 직물이송속도 유지장치 |
KR100331966B1 (ko) * | 1999-10-23 | 2002-04-10 | 윤기룡 | 염색된 직물의 직물권취장치 |
US6696412B1 (en) * | 2000-01-20 | 2004-02-24 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | High purity lipopeptides, Lipopeptide micelles and processes for preparing same |
US6737403B2 (en) | 2000-07-17 | 2004-05-18 | Micrologix Biotech Inc. | Derivatives of laspartomycin and preparation and use thereof |
US6511962B1 (en) * | 2000-07-17 | 2003-01-28 | Micrologix Biotech Inc. | Derivatives of laspartomycin and preparation and use thereof |
US6750199B2 (en) | 2000-07-17 | 2004-06-15 | Micrologix Biotech Inc. | Antimicrobial sulfonamide derivatives of lipopeptide antibiotics |
US20060014674A1 (en) | 2000-12-18 | 2006-01-19 | Dennis Keith | Methods for preparing purified lipopeptides |
JP4402463B2 (ja) | 2002-01-03 | 2010-01-20 | マイジェニックス インコーポレイテッド | リポペプチド抗生物質のDab9誘導体およびそれを製造および使用する方法 |
US6887900B2 (en) * | 2002-03-04 | 2005-05-03 | Divergence, Inc. | Nematicidal compositions and methods |
US20040157803A1 (en) * | 2002-03-04 | 2004-08-12 | Williams Deryck J. | Nematicidal fatty acid and fatty acid ester related compounds |
CA2530063A1 (en) | 2003-06-26 | 2005-01-06 | Migenix Inc. | Compositions of lipopeptide antibiotic derivatives and methods of use thereof |
US7368629B2 (en) * | 2004-02-04 | 2008-05-06 | Divergence, Inc. | Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom |
DE102004060750A1 (de) | 2004-12-15 | 2006-07-13 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Deacylierung von Lipopeptiden |
GB0821540D0 (en) | 2008-11-25 | 2008-12-31 | Merlion Pharmaceuticals Pte Ltd | Lipopeptide compounds and their use |
HUE039967T2 (hu) | 2009-11-23 | 2019-02-28 | Cubist Pharmaceuticals Llc | Lipopeptid kompozíció és ezzel kapcsolatos eljárások |
KR101151878B1 (ko) | 2010-06-08 | 2012-05-31 | 미원상사주식회사 | 지방산 트리펩타이드염 및 이를 함유하는 항균 조성물 |
WO2013012101A1 (ko) * | 2011-07-15 | 2013-01-24 | 미원상사주식회사 | 지방산 트리펩타이드염 및 이를 함유하는 항균 조성물 |
FR2980802B1 (fr) * | 2011-10-03 | 2014-12-26 | Univ Lille 1 Sciences Et Technologies Ustl | Procede de production de biosurfactants et dispositif de mise en œuvre |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4000397A (en) | 1975-03-21 | 1976-12-28 | Spectra-Physics, Inc. | Signal processor method and apparatus |
US4001397A (en) * | 1975-08-11 | 1977-01-04 | Pfizer Inc. | Antibiotic compound 41,012 |
DE4411025A1 (de) * | 1994-03-30 | 1995-10-05 | Hoechst Ag | Lipopeptid-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
-
1993
- 1993-12-17 TW TW082110700A patent/TW455591B/zh not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-04-25 UY UY23762A patent/UY23762A1/es not_active IP Right Cessation
- 1994-05-06 HU HU9401465A patent/HU217177B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-06-01 DE DE59407475T patent/DE59407475D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-01 EP EP98110484A patent/EP0864584B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-01 ES ES98110484T patent/ES2153224T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-01 PT PT98110484T patent/PT864584E/pt unknown
- 1994-06-01 AT AT94108443T patent/ATE174604T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-01 AT AT98110484T patent/ATE198209T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-01 ES ES94108443T patent/ES2127312T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-01 DE DE59409616T patent/DE59409616D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-01 EP EP94108443A patent/EP0629636B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-01 DK DK94108443T patent/DK0629636T3/da active
- 1994-06-01 DK DK98110484T patent/DK0864584T3/da active
- 1994-06-03 NZ NZ260682A patent/NZ260682A/en unknown
- 1994-06-06 PL PL94334634A patent/PL180230B1/pl unknown
- 1994-06-06 PL PL94303716A patent/PL179581B1/pl unknown
- 1994-06-06 CZ CZ941381A patent/CZ285322B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-06 SK SK685-94A patent/SK281830B6/sk unknown
- 1994-06-06 MA MA23529A patent/MA23216A1/fr unknown
- 1994-06-06 AU AU64620/94A patent/AU672691B2/en not_active Ceased
- 1994-06-06 FI FI942660A patent/FI942660A/fi unknown
- 1994-06-07 CA CA002125376A patent/CA2125376C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-07 RU RU94022485/04A patent/RU2117672C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-07 IL IL10991794A patent/IL109917A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-06-07 JP JP6125062A patent/JP2660161B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-07 ZA ZA943983A patent/ZA943983B/xx unknown
- 1994-06-07 NO NO942110A patent/NO942110L/no not_active Application Discontinuation
- 1994-06-08 KR KR1019940012795A patent/KR0174264B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-06-08 OA OA60522A patent/OA10066A/fr unknown
-
1997
- 1997-03-05 US US08/811,843 patent/US6194383B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-07-11 KR KR1019980028496A patent/KR100319563B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-07-21 IL IL12545098A patent/IL125450A0/xx unknown
- 1998-12-10 HK HK98113032A patent/HK1012009A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-05 GR GR990400678T patent/GR3029591T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-16 CY CY0000024A patent/CY2190B1/xx unknown
-
2001
- 2001-01-10 GR GR20010400022T patent/GR3035204T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL180230B1 (pl) | Lipopeptydy z Actinoplanes sp. o dzialaniu farmakologicznym, sposób ich wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz substancja farmakologicznie czynna PL PL PL PL PL PL PL PL | |
EP0055070B1 (en) | Antibiotic a-4696 factors b1,b2,b3,c1a,c3 and e1 | |
US4918054A (en) | Antibiotics called `chloropolysporins B and C`, a process for their preparation, and their therapeutic and veterinary use | |
CA1340338C (en) | Glycopeptide antibiotic pa-45052 and the production thereof | |
CA1198695A (en) | Antibiotic compound | |
IE57727B1 (en) | Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum shearer gen.nov.,sp.nov.atcc 39323 | |
DE68925540T2 (de) | Peptid-Antibiotika | |
US4672036A (en) | Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof | |
AU648816B2 (en) | Antibiotic GE1655 complex and its factors A, B and C | |
AU738970B2 (en) | Novel antibiotic, feglymycin, processes for its preparation and its use | |
EP0818464A1 (en) | Methylsulfomycin l, a process for its production and its use | |
JPH02149593A (ja) | 抗生物質ge2270 | |
JPH01240196A (ja) | 新規グリコペプチド系抗生物質pa−45052 | |
IE913058A1 (en) | Antibiotic ge1655 complex and its factors a, b, and c | |
US4797280A (en) | Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 | |
CS228936B2 (cs) | Předběžné, respektive doplňkové krmivo pra vytvoření krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavco |