PT864584E - Lopopeptidos de actinoplanes sp. com accao farmacologica processo para a sua preparacao e respectiva utilizacao - Google Patents

Description

Γ ^ ^ \ί ' DESCRIÇÃO "LIPOPÉPTIDOS DE Actinoplanes sp. COM ACÇÃO FARMACOLÓGICA, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E RESPECTIVA UTILIZAÇÃO" A invenção refere-se a lipopéptidos com sequências de aminoácidos muito homólogas, mas com resíduos de ácidos gordos diferentes (parte lipídica), que são sintetizados por Actinoplanes sp. durante a fermentação sendo expelidos para o meio de cultura, a um processo para o isolamento dos lipopéptidos a partir do meio de cultura e respectiva purificação, à utilização dos lipopéptidos ·como ingredientes activos farmacológicos, em especial contra bactérias gram-positivas, bem como a Actinoplanes sp. DSM 7358 para a preparação dos lipopéptidos acima referidos.

Os metabolitos secundários de microorganismos utilizam-se com sucesso para o tratamento de doenças infecciosas. Os metabolitos secundários tratam-se de compostos de baixo peso molecular, cuja formação se processa em "vias sintéticas de sentido único", derivadas do metabolismo primário, e cuja função em cada caso não está esclarecida. Até hoje conhecem-se cerca de 8000 metabolitos secundários, isolados a partir de culturas de vários microorganismos (principalmente fungos e bactérias da espécie Streptomyces). O domínio de aplicação principal destes metabolitos secundários é a terapia de doenças infecciosas. Devido à larga aplicação ocorre frequentemente formação de resistências, havendo por isso uma necessidade constante de novos antibióticos e ingredientes activos com novos mecanismos de acção (Neu H.C., Science 257, 1992, pag. 1064-1073). 1 t p Lc,

Além disso, alargou-se também a área de indicações de ingredientes activos microbianos a doenças que não pertencem ao grupo das doenças infecciosas (por exemplo terapia de tumores, imunomodulação ou regulação do metabolismo de sólidos) e à protecção de plantas (herbicidas e insecticidas). Os ingredientes activos utilizados estão aliás muitas vezes relacionados também com deficiências, caracterizadas por eficácias insuficientes, toxicidade demasiado elevada e/ou efeitos secundários indesejáveis.

Na literatura encontram-se descritos lipopéptidos, cuja parte de aminoácidos em relação à sequência é idêntica ou em relação à composição em aminoácidos é igual ou muito semelhante aos lipopéptidos de acordo com a invenção. Estes lipopéptidos distinguem-se contudo fundamentalmente dos lipopéptidos de acordo com a invenção na parte lipidica.

Exemplos de lipopéptidos como os acima mencionados, são: - Anfomicina Antibiot. [J. Antibiotics, 38, pag. 517 (1965)]; - Glutamicina [J. Antibiotics, 38, pag. 517 (1965)]; - Zaomicina [J. Antibiot. Ann., pag. 194 (1960)]; - Aspartocina [J. Antibiot. Ann., pag. 194 (1960)]; - Tsuimicina [J. Antibiotics, 21, pag. 439 (1968)]; - Laspartomicina [J. Antibiotics, 21, pag. 55 (1968)].

Estes lipopéptidos, que se designam como lipopéptidos do tipo anfomicina, são sintetizados por microorganismos da espécie Streptomyces. Desenvolvem a sua actividade antibiótica contra bactérias gram-positivas, como por exemplo estreptococcus, estafilococcus e enterococcus. Em particular, estirpes das espécies estafilococcus e enterococcus têm-se revelado nos últimos tempos gérmens problemáticos. Gérmens problemáticos são para o especialista os microorganismos cujo combate eficaz não é entretanto possível devido a resistências contra os antibióticos 2 | ^ ^^ \i ’ correntes (por exemplo antibióticos de β-lactama ou antibióticos de glicopéptidos, como por exemplo vancomicina ou teicoplamina).

Um grupo de estirpes de microorganismos que criaram resistência, são por exemplo a estirpe de estafilococcus aureus, designada abreviadamente por estirpe MRSA, resistente à meticiclina. Sabc-se entretanto que esta estirpe MRSA criou frequentemente resistências não só contra a meticiclina, mas também contra outros antibióticos (por exemplo vancomicina).

Abstraindo os compostos já mencionados de estreptomycetes, conhece-se um composto de Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 que, devido ao seu espectro de acção e às propriedades físico-químicas descritas, apresenta semelhanças estruturais com os lipopéptidos de acordo com a invenção, e que se designa por composto 41.012 (patente US 4,001,397). A fermentação de

Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 em várias condições de cultura leva sempre a rendimentos relativamente baixos do composto 41.012. O objectivo da invenção é disponibilizar agentes naturais microbianos com propriedades melhoradas.

Este objectivo atinge-se, de acordo com a invenção, com a fermentação de Actinoplanes sp. numa solução nutriente com fontes de carbono e de azoto bem como com os sais inorgânicos usuais, até se formarem lipopéptidos no meio de cultura, de preferência os lipopéptidos a seguir descritos detalhadamente, seguindo-se o isolamento dos lipopéptidos a partir do meio de cultura e a separação da mistura nos seus componentes. Os lipopéptidos isolados possuem actividade farmacológica e por isso efeito terapêutico e podem utilizar-se como antibióticos com efeito contra bactérias gram-positivas, de preferência contra estirpes resistentes ao glicopéptidos. A invenção refere-se assim a: 3

Lipopéptidos de fórmula I, R^Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro em que R1 significa ácido gordo ou ácido gordo hidroxilado mono- ou poli-insaturado, saturado, ou independentemente disso linear ou ramificado, com um comprimento de cadeia de 6 a 22 átomos de carbono inclusive, com excepção dos lipopéptidos de fórmula I, em que R1 significa: o

ou

Preferem-se em especial os lipopéptidos de fórmula I, caracterizados por R1 significar 4 t a) ácido gordo iC13, b) ácido gordo ÍCi4, c) ácido gordo aiCi5, d) ácido gordo nCi2, e) ácido gordo nC13 ou f) ácido gordo nC14, preferindo-se muito em especial os lipopéptidos de fórmula I, em que

0 R1 = ou 0

A presente invenção refere-se ainda a um processo para a preparação de um ou mais lipopéptidos de fórmula I, contudo sem excepção no que respeita aos substituintes R1 de ácido gordo, caracterizado por se efectuar a fermentação de Actinoplanes sp. num meio de cultura, até se formarem um ou mais lipopéptidos no meio de cultura e se purificarem um ou mais lipopéptidos de fórmula I a partir do meio de cultura. A presente invenção refere-se também a uma utilização de um lipopéptido de fórmula I para a preparação de um antibiótico contra bactérias gram-positivas, muito em especial contra bactérias resistentes a glicopéptidos. 5

I I # t A seguir descreve-se detalhadamente a invenção, em especial nas suas formas de concretização preferenciais. A invenção é ainda definida pelo conteúdo das reivindicações da patente.

Definição das abreviaturas: - Dab significa ácido 2,3-diaminobutírico; - Pip significa ácido pipecolinico (sinónimo = homoprolina); - MeAsp significa β-metilaspartato; - Gly significa glicina; - Asn significa asparagina; - Asp significa ácido aspártico; - Vai significa valina; - Pro significa prolina; - n significa normal / não ramificado e - CID significa "colisional induced decay". A abreviatura "i" representa "iso", enquanto que "ai" tem o significado de "ante-iso". Estas designações são conhecidas do especialista no que respeita a ácidos gordos (Biochemistry, Zubay, Verlag Addison Wesley in London, Amsterdam, 1983).

Todos os dados percentuais se referem, salvo indicação em contrário, ao peso. As proporções de mistura em líquidos referem-se ao volume, salvo indicação em contrário. O processo de acordo com a invenção pode utilizar-se para a fermentação em escala laboratorial (gama de mililitros a litros) e em escala industrial (gama de metros cúbicos). 0 Actinoplanes sp. isola-se a partir de uma amostra de terra. Para a purificação a partir da terra suspende-se esta numa solução fisiológica de Naci (0,9%), preparando-se uma série de diluições. As várias diluições (10o—106) colocam-se em seguida sobre superfícies nutrientes de actinomicetes. Após um crescimento das culturas a 30°C durante um período de 2 a 14 6

dias formam-se colónias de actinomicetes, que se separam e se podem isolar após vários passos de purificação sucessivos. A determinação das estirpes efectua-se com base em critérios morfológicos e taxonómicos, de acordo com métodos conhecidos do especialista. A característica da estirpe Actinoplanes é principalmente a existência de esporos móveis.

Com base nos sucessivos passos de isolamento e purificação pode, a partir de Actinoplanes sp., isolar-se uma colónia que segregue de modo muito eficiente para o meio de cultura um ou mais compostos dos lipopéptidos, de preferência os lipopéptidos A 1437 A, B, C, D, E, F, G, Η, K, L e/ou M, designando-se por produtor principal.

Como produtor principal designa-se um isolado que produz ou segrega para o meio de cultura um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção numa quantidade 10 a 100 vezes maior em comparação com isolados do mesmo tipo de Actinoplanes.

Procede-se à amplificação de uma colónia de Actinoplanes fortemente produtora. Registou-se um isolado na Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1B, 3300 Braunschweig, Alemanha, segundo as regras do Acordo de Budapeste de 18 de Junho de 1990, sob o seguinte número: Actinoplanes sp. DSM 7358. O Actinoplanes sp. DSM 7358 possui um micélio cor de laranja e caracteriza-se por esporos globulosos.

Numa solução nutriente (designada também por meio de cultura), que contém uma fonte de carbono e uma fonte de azoto bem como os sais inorgânicos usuais, o Actinoplanes sp., de preferência o 7 ) .. U-o

t DSM 7358, produz um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção.

Em vez da estirpe DSM 7358 podem também utilizar-se respectivos mutantes e variantes, que sintetizem um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção. Tais mutantes podem produzir-se, de modo em si conhecido, por meios físicos, por exemplo por irradiação, como raios ultravioleta ou raios X, ou por mutagénicos químicos, como por exemplo metanossulfonato de etilo (EMS), 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona (MOB) ou N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). 0 "screening" de mutantes e variantes que sintetizam um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção, efectua-se segundo o seguinte esquema: - separação do micélio depois da fermentação; - precipitação dos lipopéptidos a pH 1 a 2 (4°C); - recolha do precipitado em H20/Me0H (1:1); - análise por meio de HPLC, DC (CCF) ou teste de Hemmhof.

As condições de fermentação a seguir descritas são válidas para Actinoplanes sp., para o isolado registado como DSM 7358, bem como mutantes e variantes destes.

Numa solução nutriente, que contém uma fonte de carbono e uma fonte de azoto bem como os sais inorgânicos usuais, o Actinoplanes sp., de preferência o DSM 7358, produz os lipopéptidos A 1437 A-H, bem como K, L, M.

Como fontes de carbono preferenciais para a fermentação aeróbia são adequados hidratos de carbono assimiláveis e álcoois de açúcar, como glucose, lactose ou D-manite, bem como produtos naturais contendo hidratos de carbono, como por exemplo extracto de malte. Como nutrientes contendo azoto referem-se: aminoácidos, péptidos e proteínas, bem como os respectivos 8

produtos de degradação, como peptona ou triptona, e ainda extractos de carne, sementes moídas, por exemplo de milho, centeio, feijão, soja ou da planta do algodão, resíduos de destilação da preparação de álcool, farinha de carne ou extracto de levedura, e ainda sais de amónio e nitratos. Como sais inorgânicos a solução nutriente pode conter por exemplo cloretos, carbonatos, sulfatos ou fosfatos de metais alcalinos ou alcalinoterrosos, ferro,, zinco, cobalto e manganês. A formação dos lipopéptidos de acordo com a invenção decorre particularmente bem numa solução nutriente que contém cerca de 0,1 a 5%, de preferência 0,3 a 2% de extracto de carne e 0,2 a 5%, de preferência 0,5 a 2% de sacarose e 0,05 a 5 g/1, de preferência 0,1 a 0,5 g/1 de extracto de levedura e 0,05 a 2 g/1, de preferência 0,1 a 1 g/1 de sulfato de magnésio e 0,05 a 10 g/1, de preferência 0,1 a 1 g/1 de di-hidrogenofosfato de potássio ou de sódio e 0 a 100 μΜ, de preferência 5 a 20 μΜ de cloreto de ferro III. Os dados percentuais referem-se sempre ao peso da solução nutriente total.

Nesta solução nutriente, o Actinoplanes sp., de preferência o Actinoplanes DSM 7358, dá origem a uma mistura de lipopéptidos. A mistura é constituída preferencialmente por 11 lipopéptidos diferentes identificáveis. De entre eles caracterizam-se lipopéptidos de acordo com a presente invenção, por exemplo os seguintes lipopéptidos de fórmula I, que se designam por A 1437 K, L e M.

Nome

A 1437 KD □ 9

A 1437 LD

A 1437 MD !

1318D □ Ri

1318D 0 □

Para além dos lipopéptidos de acordo com a invenção, o Actinoplanes sp., de preferência o Actinoplanes DSM 7358, dá origem aos seguintes lipopéptidos caracterizados A, B, E e G, de fórmula I:

Peso molecular 1290D

1304D

1290D D

1318D

Nome

A 1437 AD

A 1437 BD

A 1437 ED

A 1437 GD

D

O lipopéptido A 1437 A possui um ácido gordo iso-C13. A 10 i r ^ ^ \ί sequência de aminoácidos de A 1437 A corresponde à da anfomicina (Bodanszky et al., J. Am. Chem. Soc. 95, 2352 (1973)). A 1437 B possui um ácido gordo do tipo iso-C14 e por isso o ácido gordo conhecido da tsuimicina (Shoji et al., The Journal of Antibiotics 21, 439 (1968)) e possui a sequência de aminoácidos da anfomicina (Bodanszky et al., J. Am. Chem. Soc. 95, 2352 (1973)). A 1437 E é idêntico à anfomicina conhecida de estreptomycetes.

Além disso, o Actinoplanes sp., de preferência o Actinoplanes DSM 7358, dá origem aos seguintes lipopéptidos caracterizados de fórmula II R1-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro n 11 t

Nome A 1437 CD

Peso molecular 1289D

A 1437 DD D Ri

1303D

D

Ri

1289D

1317D D

A 1437 FD A 1437 HD 0 lipopéptido A 1437 A possui um ácido gordo iso-C^ até agora ainda não conhecido em lipopéptidos do tipo anfomicina. A composição e a sequência de aminoácidos do A 1437 C não é conhecida de outros lipopéptidos. 0 A 1437 B tem um ácido gordo do tipo iso-C13 e por essa razão o ácido gordo conhecido da tsushimicina (Shoji et al., J. of Antibiotics 21, 439 (1968)). 0 A 1437 D distingue-se contudo pelas suas composição e sequência de aminoácidos dos lipopéptidos até agora conhecidos do estado da técnica. A composição em aminoácidos da anfomicina, glutamicina, zaomicina e tsushimicina é, de acordo com a literatura, idêntica (Strong et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1970, 42; Bodanszky et al., J. Am. Chem. Soc. 95, 2352 (1973); Inoue, Buli. Chem. Soc. jap. 35, 1556 (1962)). 12 y 0 A 1437 F é constituído por um ácido gordo ante-iso-C^, possuindo por isso o mesmo tipo de ácido gordo já conhecido da anfomicina. As suas sequência e composição de aminoácidos são desconhecidas do estado da técnica. 0 lipopéptido A 1437 H tem, tal como a aspartocina, um ácido gordo ante-iso-C15. A sequência e composição de aminoácidos do A 1437 H são desconhecidas do estado da técnica.

Os lipopéptidos A 1437 A a H e K, L, M possuem todos eles uma ligação da função carboxilo da prolina C-terminal com a função β -amino de Dab localizada em posição N-terminal. Esta ligação é representada nas fórmulas I ou II por

Conforme a composição da solução nutriente pode variar a parte quantitativa de um ou mais dos lipopéptidos de acordo com a invenção. Além disso, através da composição do meio, pode controlar-se a síntese de cada um dos lipopéptidos, de modo que um lipopéptido não seja produzido ou seja produzido numa quantidade abaixo do limite de detecção do microorganismo. 0 meio de cultura de Actinoplanes sp., de preferência DSM 7358, contém lipopéptidos com um ácido gordo ou um ácido gordo hidroxilado mono- ou poli-insaturado, saturado ou, independentemente disso, ramificado ou linear, com um comprimento de cadeia de 6 a 22 átomos de carbono, de preferência de 10 a 20 átomos de carbono inclusive, muito preferencialmente de 13, 14 ou 15 átomos de carbono.

Tais ácidos gordos são conhecidos do especialista, como por exemplo de Rõmpp Chemie Lexikon, Prof. Falbe e Prof. Regitz, 9.a Ed-, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York ou de The 13

U

Encyclopedia of Chemistry, C.A. Hampel e G.G. Hawley, 3a Ed., Van Nostrand Reinhold Company, New York. A enumeração de ácidos gordos seguinte é exemplificativa, não pretende ser completa e não representa qualquer limitação. Ácidos gordos saturados, não ramificados, nos lipopéptidos de acordo com a invenção são por exemplo os ácidos capróico, onântico, caprilico, pelargónico, caprínico, undecanóico, láurico, tridecanóico, miristico, pentadecanóico, palmitico, margarinico, esteárico, nonadecanóico, araquídico, ácido de Behen. Ácidos gordos saturados, ramificados, nos lipopéptidos de acordo com a invenção são por exemplo os ácidos isobutirico ou isovalérico, ou os ácidos correspondentes em configuração "ante-iso". Ácidos gordos mono-insaturados, não ramificados, nos lipopéptidos de acordo com a invenção são por exemplo os ácidos acrílico ou crotónico.

Um ácido gordo di-insaturado, não ramificado, nos lipopéptidos de acordo com a invenção é por exemplo o ácido sorbínico. Ácidos gordos tri-insaturados, não ramificados, nos lipopéptidos de acordo com a invenção são por exemplo os ácidos linolénico e elaosteárico.

Um ácido gordo tetra-insaturado, não ramificado, nos lipopéptidos de acordo com a invenção é por exemplo o ácido araquidónico.

Um ácido gordo penta-insaturado, não ramificado, nos lipopéptidos de acordo com a invenção é por exemplo o ácido clupanodénico. 14

Um ácido gordo hexa-insaturado, não ramificado, nos lipopéptidos de acordo com a invenção é por exemplo o ácido docosa-hexaenóico.

Além disso, podem ocorrer no meio de cultura lipopéptidos com ácidos gordos poli-ramifiçados, como por exemplo o ácido 2',4', 6', 8'-tetrametildecanóico.

Os ácidos gordos hidroxilados nos lipopéptidos de acordo com a invenção são por exemplo os ácidos gordos hidroxilados na posição 2' e 3' e/ou no extremo da cadeia de carbono, na configuração "iso" ou "ante-iso".

Por adição de 0,01 a 5%, de preferência de 0,02 a 0,1% de L-valina à solução nutriente acima descrita, a estirpe Actinoplanes sp. forma preferencialmente os lipopéptidos A 1437 B e D. Por adição de 0,01 a 5%, de preferência de 0,1 a 0,5% de L-leucina à solução nutriente acima descrita, a estirpe Actinoplanes sp. forma preferencialmente os lipopéptidos A 1437 A e C.

Por adição de 0,01 a 5%, de preferência de 0,05 a 0,5% de L-isoleucina à solução nutriente acima descrita, a estirpe Actinoplanes sp. forma principalmente os lipopéptidos A 1437 E, F, G e H. Por adição de 0,01 a 5%, de preferência de 0,05 a 0,5% de ácido L-a-aminobutírico à solução nutriente acima descrita, a estirpe Actinoplanes sp. forma preferencialmente o lipopéptido K. Por adição de 0,01 a 5%, de preferência de 0,05 a 0,5% de L-norvalina à solução nutriente acima descrita, a estirpe Actinoplanes sp. forma preferencialmente os lipopéptidos L e/ou Μ. O mesmo se aplica à estirpe preferencial DSM 7358.

Para além destes aminoácidos podem também empregar-se os a-cetoácidos correspondentes dos aminoácidos mencionados (a-cetoisovalerato, α-cetoisocaproato, a-ceto-p-metilvalerato, a-cetovalerato) ou os ácidos correspondentes (isobutirato, isovalerato, α-metilbutirato, n-butirato, propionato, valerato) nas concentrações adequadas, ou outras substâncias que possam ter actividade na biossíntese de ácidos gordos. A cultura dos microorganismos efectua-se de modo aeróbio, assim por exemplo em forma submersa sob agitação, em balões agitados ou fermentadores, eventualmente com fornecimento de ar ou oxigénio. Pode efectuar-se numa gama de temperaturas de cerca de 18 a 35°C, de preferência a cerca de 25 a 35°C, em especial de 28 a 32 °C. A gama de pH deve situar-se entre 6 e 8, de preferência entre 6,5 e 7,5. Cultiva-se o microorganismo nestas condições em geral durante um periodo de tempo de 24 a 300 horas, de preferência de 36 a 140 horas. É vantajoso efectuar-se a cultura em vários passos , isto é prepara-se primeiro uma ou mais pré-culturas num meio nutriente liquido, que se inocula depois no meio de produção propriamente dito, a cultura principal, por exemplo numa proporção volumétrica de 1:10. A pré-cultura prepara-se por exemplo inoculando um micélio numa solução nutriente e deixando-o crescer durante cerca de 36 a 120 horas, de preferência durante 48 a 72 horas. O micélio pode preparar-se por exemplo deixando crescer a estirpe durante cerca de 3 a 40 dias, de preferência durante 4 a 10 dias, sobre uma superfície nutriente sólida ou líquida, por exemplo levedura-malte-agar ou pão de agar nutriente (meio padrão para microorganismos com os componentes principais peptona, cloreto de sódio e agar, por exemplo da firma Difco). O decurso da fermentação pode controlar-se com base no valor de pH das culturas ou no volume do micélio, bem como por métodos cromatográficos, como por exemplo cromatografia em camada fina ou cromatografia líquida de alta pressão, ou por teste da actividade biológica. Um composto de acordo com a invenção obtém-se tanto no micélio como no filtrado de cultura, a maior parte (>90%) encontra-se contudo no filtrado de cultura. 16 t 0 processo de isolamento descrito a seguir destina-se à purificação dos lipopéptidos de acordo com a invenção. 0 isolamento ou purificação de um lipopéptido de acordo com a invenção a partir do meio de cultura efectua-se de acordo com métodos conhecidos, atendendo às propriedades químicas, físicas e biológicas dos materiais naturais. Para testar a concentração de antibióticos no meio de cultura ou em cada um dos passos de isolamento pode utilizar-se a cromatografia em camada fina, por exemplo em sílica gel com isopropanol/25% de NH3 como eluente, ou HPLC. A detecção na separação por cromatografia em camada fina pode efectuar-se por exemplo por meio de reagentes corantes como anisaldeído, comparando-se convenientemente a quantidade da substância formada com uma solução de calibração.

Para isolar um lipopéptido de acordo com a invenção separa-se primeiro o micélio do caldo de cultura segundo os processos usuais e ajusta-se em seguida o pH do filtrado de cultura, de preferência a 4°C, a um valor de 0,5 a 4 inclusive, de preferência de pH 1,5 até pH 2,5 inclusive. O ajuste do valor de pH e com ele a precipitação dos lipopéptidos A 1437 pode efectuar-se com todos os ácidos comerciais. Á solução incuba-se até durante 16 horas, de preferência até 4 horas, e centrifuga-se em seguida o precipitado formado. 0 precipitado, que contém a totalidade dos lipopéptidos, ressuspende-se em 1/20 do volume original de água bidestilada e ajusta-se valor de pH com NaOH a 6 a 7. 0 precipitado dissolve-se completamente, arrefece-se a solução a -20°C e liofiliza-se. 0 liofilizado, a seguir designado como produto bruto, contém 5 a 30% de lipopéptidos e utiliza-se para o isolamento seguinte. A purificação seguinte de um ou mais lipopéptidos de acordo com a invenção efectua-se por cromatografia em materiais apropriados, de preferência por exemplo em sílica gel, óxido de alumínio, permutadores iónicos ou resinas adsorventes e, muito 17 i-‘ U K ii ' t em especial, em permutadores aniónicos forte ou fracamente básicos. Por meio desta cromatografia separam-se os lipopéptidos que possuem Asp ou Asn como aminoácido localizado na posição N-terminal. A cromatografia dos lipopéptidos efectua-se com soluções aquosas tamponizadas ou com misturas de soluções aquosas e alcoólicas.

Por soluções aquosas tamponizadas entendem-se por exemplo água, tampão de fosfato, acetato de amónio, tampão de citrato, tampão de borato, numa concentração de 0 a 1 M, de preferência de 1 a 100 mM, muito em especial empregam-se soluções tamponizadas com fosfato numa concentração de 1 a 100 mM.

Por misturas de soluções aquosas ou alcoólicas entendem-se todos os solventes orgânicos misciveis com água, de preferência metanol, acetonitrilo, numa concentração de 10 a 80% de solvente, de preferência de 40 a 60% de solvente, ou ainda todas as solução aquosas tamponizadas que sejam misciveis com solventes orgânicos. Os tampões a utilizar são os mesmos que os referidos acima. A separação dos lipopéptidos com base nos seus diferentes ácidos gordos efectua-se por meio de cromatografia em fase reversa, por exemplo em MCI® (resina adsorvente da Mitsubishi, Japão). Muito preferencial é a cromatografia em fase reversa em materiais hidrofóbicos, de preferência cromatografia em fases RP-8 ou RP-18. Além disso, a separação pode efectuar-se por meio de cromatografia em sílica gel. A cromatografia dos lipopéptidos efectua-se com soluções aquosas tamponizadas ou acidificadas ou com misturas de soluções aquosas com álcoois ou outros solventes orgânicos misciveis com água. Como solvente orgânico emprega-se de preferência acetonitrilo.

Por soluções aquosas tamponizadas ou acidificadas entendem-se por exemplo água, tampão de fosfato, acetato de amónio, tampão 18 de citrato, tampão de borato, numa concentração de 0 a 0,5 M, bem como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético ou todos os ácidos conhecidos do especialista e disponíveis no mercado, de preferência numa concentração de 0 a 1%. Prefere-se em especial 0,1%.

Efectua-se a cromatografia com um gradiante, que começa com 100% de água e termina com 100% de solvente, de preferência um gradiante linear de 40 a 60% de acetonitrilo. A sequência das duas cromatografias acima mencionadas (cromatografia para a separação dos lipopéptidos segundo o tipo de aminoácidos Asp ou Asn e segundo o tipo de ácido gordo) é permutável. Prefere-se a separação dos lipopéptidos segundo os vários aminoácidos no primeiro passo e só em seguida a sua separação por tipo de ácido gordo.

Quando o produto bruto acima referido contém lipopéptidos com um único ácido gordo, a cromatografia acima descrita (separação dos lipopéptidos com base em ácidos gordos diferentes) emprega-se para dessalinizar e posterior purificação dos lipopéptidos.

Em alternativa, pode também seguir-se uma cromatografia de gel ou a cromatografia em fases hidrófobas. A cromatografia de gel efectua-se em geis de poliacrilamida ou mistos, como por exemplo Biogel-P 2® (firma Biorad) ou Fractogel TSK HW 40® (firmas Merck, Alemanha, ou Toso Haas, USA).

Os lipopéptidos de acordo com a invenção são estáveis no estado sólido e em soluções, na gama de pH entre 4 e 8, em especial entre 5 e 7, e podem por isso incorporar-se em composições galénicas habituais. 19

Um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção são apropriados, devido às suas valiosas propriedades farmacológicas, para utilização como medicamentos.

As substâncias de acordo com a invenção apresentam eficácia farmacológica em especial como antibióticos contra bactérias gram-positivas, muito preferencialmente contra estirpes resistentes aos glicopéptidos.

No caso de estirpes resistentes à penicilina ou à meticiclina (estirpes MRSA), que criaram novas resistências contra os antibióticos, muitas vezes só glicopéptidos como vancomicina ou teicoplamina possuem um efeito terapêutico suficiente. É contudo crescente o número de estirpes que são também resistentes a estes antibióticos (FEMS Microbiol. Lett. 98 (1992) 109 a 116). Um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção apresentam um efeito extraordinário mesmo contra estes gérmens problemáticos. A invenção refere-se também a composições farmacêuticas de um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção.

Um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção podem basicamente trabalhar-se como tal em substância. Prefere-se contudo a utilização em mistura com aditivos ou veículos adequados. Como veículos podem utilizar-se em medicamentos para animais as misturas de ração usuais ou, no caso de seres humanos, todos os veículos e/ou aditivos farmacologicamente toleráveis.

Os medicamentos de acordo com a invenção administram-se em geral por via oral ou parenteral, sendo também em principio possível uma aplicação rectal. Formas de composições galénica sólidas ou líquidas adequadas são por exemplo granulados, pós, comprimidos, drageias, (micro)cápsulas, supositórios, xaropes, emulsões, suspensões, aerossois, gotas ou soluções injectáveis em forma de 20 t r-'. u κ li ampola, bem como preparados com libertação retardada de ingrediente activo, em cuja preparação se utilizam normalmente veículos e aditivos e/ou adjuvantes como agentes desintegrantes, ligantes, de revestimento, humectantes, de polimento ou lubrificantes, reforçadores de sabor, adoçantes ou solubilizantes. Como veículos ou aditivos frequcntemonte usados referem-se por exemplo carbonato de magnésio, dióxido de titânio, lactose, manite e outros açúcares, talco, albumina, gelatina, amido, vitaminas, celulose e seus derivados, óleos animais ou vegetais, polietilenoglicois e solventes, como água esterilizada, álcoois, glicerina e álcoois polivalentes.

Conforme os casos, as unidades de dosagem para a administração oral podem ser colocadas em microcápsulas, para retardar a libertação ou para a estender por um período mais longo, como por exemplo por revestimento ou por inclusão do ingrediente activo na forma de partículas em polímeros adequados, ceras ou semelhantes.

De preferência, preparam-se e administram-se as composições farmacêuticas em unidades de dosagem, em que cada unidade contém como componente activo uma determinada dose de um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção. Em unidades de dosagem sólidas como comprimidos, cápsulas e supositórios esta dose pode ser de até cerca de 200 mg, de preferência contudo de cerca de 0,1 a 100 mg, e em soluções injectáveis em forma de ampola até cerca de 200 mg, de preferência contudo de cerca de 0,5 a 100 mg, por dia. A dose diária a administrar de pende do peso corporal, da idade, do sexo e do estado do mamífero. Em condições especiais podem contudo empregar-se doses diárias mais altas ou mais baixas. A administração da dose diária pode efectuar-se tanto numa única toma na forma de uma unidade de dosagem unitária ou também em várias unidades de dosagem mais pequenas e ainda por toma múltipla de doses parciais a intervalos determinados. 21

Os medicamentos de acordo com a invenção preparam-se incorporando um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção com veículos ou aditivos e/ou adjuvantes, de modo a obter-se uma forma de administração adequada.

Nos exemplos que se seguem ilustra-se detalhadamente a invenção. Os dados percentuais referem-se ao peso. As proporções de mistura em líquidos referem-se ao volume, salvo indicação em contrário.

Exemplos la) Preparação de uma cultura em glicerina de Actinoplanes sp. DSM 7358

Inoculam-se 100 ml de solução nutriente (4 g/1 de extracto de levedura, 15 g/1 de amido solúvel, 1 g/1 de K2HPO4, 0,5 g/1 de MgS04 x 7 H20, preenchido com água até ao volume de 1000 ml, valor de pH antes da esterilização 7,0) num balão de Erlenmeyer de 300 ml esterilizado, com a estirpe Actinoplanes sp. DSM 7358, durante 7 dias a 30 °C e 150 UpM numa máquina de agitação rotativa. Dilui-se depois 1,5 ml desta cultura com 2,5 ml de glicerina a 80% e armazena-se a -20°C. lb) Preparação de uma cultura ou de uma pré-cultura de Actinoplanes sp. DSM 7358 em balão de Erlenmeyer

Inocula-se um balão de Erlenmeyer de 300 ml esterilizado, contendo 100 ml da seguinte solução nutriente: 30 g/1 de sacarose, 2 g/1 de KN03, 1 g/1 de K2HPO4, 0,5 g/1 de MgS04 x 7 H20, 0,5 g/1 de KC1, 0,01 g/1 de FeS04 x 7 H20, 2 g/1 de extracto de levedura, 5 g/1 de peptona, com uma cultura crescida num tubo inclinado (mesma solução nutriente, mas com 2% de agar) ou com 1 ml de uma cultura em glicerina (ver exemplo la)) e incuba-se numa máquina de agitação a 180 UpM e 30°C. A produção 22

I

máxima de um ou mais compostos dos lipopéptidos de acordo com a invenção atinge-se após cerca de 20 horas. Para inoculação de fermentadores de 10 e 200 1 basta uma cultura submersa de 48 a 96 horas (quantidade de inoculação: cerca de 10%) da mesma solução nutriente. 2) Caracterização comparativa de Actinoplanes sp. DSM 7358

Para a caracterização da estirpe Actinoplanes sp. DSM 7358 efectua-se uma comparação com estirpes com ela relacionadas de perto, segundo o método ISP de Shirling e Gottlieb (Int. J. of Sys. Bacteriol. 16, 3 (1966), 313 a 340). Os resultados (ver Tabela 1) mostram que a estirpe Actinoplanes sp. DSM 7358 se distingue das outras estirpes morfologicamente e pela sua fisiologia.

Actinoplanes sp. DSM 7358 A.utahensis NRRL 12052 A.brasiliensis ATCC 25844 A.nipponensis ATCC 311455 micélio aéreoDesporos □ + (ISP 3)□+□ -□+□ meioDISP 2DISP 30ISP 40ISP 5DISP 6D0 laranja laranja laranja laranja laranja exopigmento vermelho laranja laranja laranja laranja laranja exopigmento cast.-averm. lar.-amarelo lar.-amarelo lar.-amarelo lar.-amarelo lar.-amarelo exopigmento vermelho laranja laranja laranja laranja laranja exopigmento vermelho melaninaD -□ -□ (+)□ ( + )□ qlucoseD +□ +□ +□ +□ arabinoseD +□ +□ +□ +□ sacaroseG +□ +□ +□ +□ xiloseO +□ +□ (+)□ -□ inositeD +0 +□ (+)□ ( + )D manitcO +□ +□ +□ -□ 23

u

t

frutoseD +□ +□ +□ -□ ramnoseD +□ +□ +□ +□ rafinoseD +□ +□ ( + )□ □ celulose + + ( + ) melibioseD -□ -□ -□ -□ amiqdalinaD -□ +□ +□ +□ gelatinaO(hid rólise)□ +□ +□ +o +□ citratoD(hidr ólise)□ -□ -□ +0 -□ ureiad(hidról ise)0 +□ -□ -□ -□ argininaD(hid rólise)□ +□ -□ -□ -□ P- galactosidase □ triptofanaseD -□ -□ -□ -□ lisina-des- carboxilaseD +□ -□ -□ -□ acetoinaD(for inação) □ +□ +□ +□ +□ indoleD(forma ção) □ -□ -□ -□ -□ H2S0(formação )□ -□ -□ -□ -□ tolerância a NaClD 0-2,5%D 0-2,5%D 0-2,5%D 0-2,5%D

3a) Preparação dos lipopéptidos A 1437 B e D Põe-se a funcionar um fermentador de 500 1 nas seguintes condições:

Meio nutriente: 11 g/1 de sacarose 6 g/1 de extracto de carne 24

t 0,3 g/1 de extracto de levedura 0,6 g/1 de MgS04 0,1 g/1 de KH2P04 10 μΜ de FeCl3 x 6H20 0,6 g/1 de L-valina pH 7,3 (antes da esterilização)

Tempo de incubação: 120 horas Temperatura de incubação: 30°C Velocidade de agitação: 50 UpM

Arejamento: 150 1 min-1.

Por adição repetida de uma solução etanólica de poliol pode eliminar-se a formação de espumas. O máximo de produção atinge-se após cerca de 96 a 120 horas.

Após terminada a fermentação de Actinoplanes sp. DSM 7358 filtra-se o caldo de cultura sob adição de cerca de 2% de adjuvante de filtração (por exemplo Celite®) e arrefece-se o filtrado de cultura a 4°C e ajusta-se o pH a 1,5. Após 4 horas centrifuga-se a lOOOOg e ressuspende-se o precipitado em água destilada. Por neutralização da suspensão a substância referida dissolve-se. Esta, congela-se e liofiliza-se. O rendimento é de cerca de 1,5 g/1 de produto bruto (= 750 g). 3b) Separação por cromatografia iónica do produto bruto (contém B + D)

Enche-se uma coluna de cromatografia de 3,2 1 (10 cm Dl x 40 cm H) com DEAE-®Sepharose Fast Flow e equilibra-se com 10 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0, em 40% de metanol (tampão A). Colocam-se então sobre a coluna 25 g de produto bruto A 1437 B (obtido de acordo com o exemplo 3a)), dissolvidos em 3,5 1 de água, e elui-se com 1 1 de água e em seguida com 6 1 de tampão A. No eluido e na água encontram-se as impurezas do produto bruto. Em seguida aplica-se um gradiante de fosfato de potássio de 10 a 100 mM, a pH 7,0, em 40% de metanol. A 25 a 35 mM 25

r II u

t fosfato de potássio elui-se o péptido A 1437 D e a 40 a 55 mM fosfato de potássio obtém-se o antibiótico Δ 1437 B. Remove-se o metanol de cada uma das fracção sob vácuo. Para dessalinizar utiliza-se uma coluna contendo 1 1 de ®Dianion HP-20 (Mitsubishi, Japão) . Aplicam-se então à coluna os 9 1 de fracção contendo o péptido B puro e clui-se em seguida com 3 1 de água dessalinizada. Elui-se depois com um gradiante de água-isopropanol (0 a 50% de componente alcoólica) . A 15 a 25% de isopropanol separa-se do suporte o A 1437 B puro. Recolhe-se cuidadosamente este eluido da coluna, concentra-se em vácuo e liofiliza-se. Obtêm-se 4,8 g de A 1437 B com uma pureza de 97%. A dessalinização da fracção contendo o A 1437 D deu origem a 3,1 g de antibiótico. Pureza: 98%.

4a) Preparação dos lipopéptidos A 1437 A e C A preparação efectua-se como descrito em 3a), substituindo simplesmente a L-valina no meio de produção por 4 g/1 de L-leucina e efectuando a fermentação num bio-reactor de 50 1. O rendimento é de 1,3 g/1 de péptido bruto (= 65 g).

4b) Isolamento dos lipopéptidos A 1437 A e C

Dissolveram-se 10 g de produto bruto em 100 ml de água destilada e precedeu-se de acordo com o esquema abaixo indicado.

Esquema de trabalho: 10 g de produto bruto em água destilada 4, adsorpção em Q-Sepharose Fast tlow (firma Pharmacia) (coluna de 5 x 20 cm) 4 eluição com o gradiante seguinte: tampão A: Naí^PC^ 1 mM em 50% de metanol, pH 5,9 26 Γ~ tampão Β: NaHaPO^ 100mM em 50 % de metanol, pH 5,3 20 min: tampão A em 60 min. a 25% tampão B, mais 30 min. a 25% tampão B; i liofilização das fracções A 1437 A ou C e dissolução no eluente i dessalinização em Biogel P2 (100-200 mesh) da firma Biorad (coluna de 7 x 20 cm) i i

1,6 g de lipopéptido A 1437 A (a 80%) 1,2 g de lipopéptido A •1437 C (a 80%) i i cromatografia RP em Nucleosil®C18 (7 μιτι) (coluna de 20 x 250 mm, 200 mg de aplicação) eluição com o gradiante seguinte: tampão A: água bidestilada, 0,1% de TFA tampão B: acetonitrilo 10 min. : tampão B -> em 60 min. a 90% tampão B a 10 ml/min, de caudal i i

liofilizações das fracções A 1437 A ou C 150 mg de A 1437 A (pureza > 95%) 154 mg de A 1437 C (pureza > # 95%).

5a) Preparação dos lipopéptidos A 1437 E, F, G e H A preparação efectua-se como descrito no exemplo 3a), simplesmente substitui-se a L-valina no meio de produção por 1,5 g/1 de L-isoleucina e efectua-se a fermentação num bio-reactor de 50 1. O rendimento é de 1,4 g/1 de péptido bruto (70 g). 5b) Separação por cromatografia iónica do péptido bruto 27

Na coluna, como descrito no exemplo 3a) , separam-se 25 g de produto bruto lipopeptídico, preparado de acordo com o exemplo 5a), nas condições do exemplo 3a), com: 14 a 19 mM de tampão elui-se o A 1437 F (rendimento: 1,8 g) , 18 a 25 mM de tampão elui-se o A 1437 E (rendimento: 1,3 g), 35 a 50 mM de tampão elui-se o A 1437 H (rendimento: 2,7 g) θ 64 a 82 mM de tampão elui-se o A 1437 G (rendimento: 1,9 g) .

Recolhem-se as respectivas fracções e remove-se o metanol em vácuo. 5c) Purificação dos componentes do exemplo 5b) sobre fase reversa RP-18

Enche-se uma coluna de HPLC preparativa de 500 ml (5,1 cm (Dl) x 25 cm (H) ) com ®LiChrosorbG RP-18, 10 μτη, e aplica-se a solução salina contendo o A 1437 G, com 1,9 g de antibiótico. Elui-se num processo de gradiantes, com 5% de acetonitrilo em 10 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0 até 36% de acetonitrilo em 10 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0. Com 24 a 26% de acetonitrilo obtém-se o lipopéptido A 1437 G. Após concentração em vácuo, dessalinização em 100 ml de resina de adsorpção ® Dianion HP-20 num sistema de água/50% de isopropanol e liofilização obtêm-se 1,1 g de lipopéptido A 1437 G com uma pureza de 99%. A respectiva pós-purificação do A 1437 H obtido de acordo com o exemplo 5b) efectua-se com o gradiante de solventes 10 a 50% de acetonitrilo em 10 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0. A eluição do antibiótico ocorre a 37 a 39% da composição do solvente. A concentração das fracções respectivas e a dessalinização sobre ®Dianion HP-20, seguidas de liofilização, dá origem a 2,2 g de lipopéptido A 1437 H com uma pureza superior a 98%. 28 t jp L:

5d) Purificação dos lipopéptidos-antibióticos A 1437 E e F do exemplo 5b) sobre Gel-MCI A solução salina de A 1437 F obtida de acordo com o exemplo 5b), com 1,8 g de antibiótico, aplica-se sobre 1 1 de gel MCL CHP 20P (Mitsubishi Kasei Corp.) . As medidas da coluna são 6 cm Dl x 35 cm H. Após carga do suporte com o material a separar lava-se com tampão A (5 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0, com 20% de acetonitrilo) e elui-se num processo de gradiantes com tampão B (5 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,0, com 70% de acetonitrilo). 34 a 35% de partes do solvente levam à eluição do antibiótico puro. Após concentração em vácuo e dessalinização sobre ®Dianion HP-20, obtiveram-se 1,4 g de lipopéptido A 1437 F com uma pureza superior a 98%.

Procedimento análogo com o produto bruto de A 1437 E do exemplo 5a) dá origem a 1 g de lipopéptido A 1437 E com uma pureza superior a 98%.

6a) Preparação do lipopéptido A 1437 K

Dissolveram-se 10 g de produto bruto em 100 ml de água destilada e procedeu-se de acordo com o esquema abaixo apresentado.

Esquema de trabalho (A 1437 K) : - 10 g de péptido bruto em 100 ml de água destilada - adsorpção em Q-Sepharose Fast Flow (coluna de 3,5 x 16 cm) - eluição com o gradiante seguinte: tampão A: NaH2P04 1 mM em 50% de metanol, pH 5,9 tampão B: NaH2P04 100 mM em 50% de metanol, pH 5,3 20 min. : tampão A -> em 45 min. a 25% de tampão B, mais 45

min. a 25% de tampão B - liofilização das fracções contendo A 1437 K dessalinização em Biogel P2 (100-200 mesh) 29

L-Cj (coluna de 7 x 20 cm) 700 mg de A 1437 K (a 60%) - cromatografia RP em Nucleosil C18 7 μπι (coluna de 20 x 250 mm) aplicação: 50 mg do produto pré-purifiçado eluição com o gradiente seguinte: tampão A: água bidestilada, 0,1% de TFA tampão B: acetonitrilo 10 min.: tampão A/5% de tampão B - em 60 min. a 70% de tampão B a 10 ml/min. de caudal - liofilização das fracções contendo A 1437 K 5,6 mg de A 1437 K (> 95%).

7a) Preparação dos lipopéptidos A 1437 L e M A preparação efectua-se como descrito em 4a), substituindo simplesmente a L-valina na mistura de produção por 500 mg/1 de L-norvalina (ou 1 g/1 do racemato) e efectuando a fermentação num bio-reactor de 10 1. O rendimento é de 1,2 g/1 de péptido bruto (= 12 g).

7b) Isolamento dos lipopéptidos A 1437 L e M

Dissolvem-se 10 g do produto bruto em 100 ml de água destilada e procede-se de acordo com o esquema seguinte:

Esquema de trabalho: - 10 g de péptido bruto em 100 ml de água destilada - adsorpção em Q-Sepharose Fast Flow (coluna de 3,5 x 17 cm) - eluição com o gradiante seguinte:

tampão A: NaH2P04 1 mM em 50% de metanol, pH 5,9 tampão B: NaH2P04 100 mM em 50% de metanol, pH 5,3 20 min.: tampão A —> em 45 min. a 25% de tampão B, mais 45 min. a 25% de tampão B 30 ff~

- liofilização das fracções contendo A 1437 L e M dessalinização em Biogel P2 (100-200 mesh) (coluna de 7 x 20 cm) 900 mg de A 1437 L e M (a cerca de 60%) - cromatografia RP em Nucleosil Cl8 7 μπι (coluna de 20 x 250 mm) aplicação: 50 mg do produto pré-purifiçado eluição com o gradiante seguinte: tampão A: água bidestilada, 0,1% de TFA tampão B: acetonitrilo 10 min. : tampão A/5% de tampão B - em 60 min. a 70% de tampão B a 10 ml/min. de caudal

- liofilização das fracções contendo A 1437 L e M 5,6 mg de A 1437 L (> 95%); 6,7 mg de A 1437 M (> 95%). 8) Sistema de HPLC para a identificação dos lipopéptidos A 1437 O sistema a seguir descrito permite a separação e a quantificação dos lipopéptidos em mistura bruta ou em filtrado de cultura; os tempos de retenção situam-se entre 11,5 minutos (A 1437 E) e cerca de 15,9 minutos (A 1437 H).

Eluente: A B tampão de fosfato de potássio, pH 7,0, 10 mM acetonitrilo t [mim.] Fluxo [ml/min] A [%] B [% ] 0 1,5 80 20 15 1,5 50 50 15, 5 2 00 100 16,5 2 00 100 17 1,5 80 20 22 1,5 80 20

Coluna: Shandon ODS Hypersil RP 18 (120 x 4,6 mm com 20 x 4,6 mm de pré-coluna) ou Nucleosil 120 RP 18 (120 x 4,6 mm 31 com 20 x 4,6 mm de pré-coluna)

Caudal: 1,5 ml/min.

Detecção: 210 nm Injecção: 10 μΐ. 9) Comparação entre Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 e Actinoplanes spec. DSM 7358

Faz-se crescer primeiro uma pré-cultura de ambas as estirpes, como descrito no exemplo lb), e utiliza-se esta para inocular os seguintes meios de produção.

Meio 1: como descrito no exemplo 3a)

Meio 2: como o meio 2 mas sem L-valina meio 3: glucose 30 g/1; farinha de soja 20 g/1; Fe2(S04)3 0,3 g/1; MnCl2 x 4H20 0,3 g/1 e CoCl2 x 6 H20, pH 7,3, sempre em 100 ml de meio num balão de Erlenmeyer de 300 ml. A incubação efectua-se a 30°C numa máquina de agitação rotativa. Após 48, 96 e 144 horas determina-se a concentração dos lipopéptidos A 1437 no filtrado de cultura por meio de HPLC (ver exemplo 8) . No meio 2 e no meio 3, no caso da estirpe Actinoplanes nipponensis ATCC 31145 não se detecta qualquer lipopéptido. No meio 1 conseguem detectar-se após 144 horas alguns lipopéptidos em quantidades muito pequenas. Considerando uma extinção especifica destes compostos idêntica à dos péptidos A 1437, a quantidade formada é pelo menos um factor de 100 (< 1 mg/1) inferior à concentração de A 1437 B, tal como é sintetizado pela estirpe Actinoplanes spec. DSM 7358 no meio 1 ao fim do mesmo período de tempo. 10) Acção dos lipopéptidos A 1437 í t A sensibilidade de determinados gérmens em relação aos lipopéptidos A 1437 determina-se por meio de um teste de diluição em agar. Como agar utiliza-se agar de Miiller-Hinton, ao qual se adiciona 10% de sangue de cavalo no caso de S. pyogenes e dos enterococcus. As placas contendo antibiótico inoculam-se com um aparelho de inoculação dc canais múltiplos (5xl04 cfu/posição de inoculação, de uma cultura estacionária da estirpe em causa). Os valores de MHK (concentração de inibição mínima) registam-se a 37°C. Como valor de MHK define-se a concentração do antibiótico, à qual após 24 horas de incubação não se detecta qualquer crescimento visível dos gérmens. Os resultados apresentam-se na Tabela 2. A anfomicina utilizada como controle é da firma Boehringer Mannheim (Alemanha). A anfomicina é fornecida por esta firma como composto químico fino. 33

Tabela 2

Substâncias A 1437: actividade in vitro (espectro de absorção); concentração em μς/ιηΐ

A 1437 A 0,391 0, 781 0,391 1,56 0,391 3, 13 A 1437 BO 0,098D 0,195D 0,098D 0,195D 0,0 4 9D 0,391D A 1437 CD 0,195 0,781 0,391 3,13 0,781 3,13 A 1437 DD 0,049D 0,195D 0,049D 0,781D 0,391D 0,781D A 1437 ED 0,098D 0,195D 0,094D 0,098D 0,025D 0,195D A 1437 FD 0,098D 0,391D 0,195D 1,56D 0,781D 1,56D A 1437 GD 0,098D 0,195D 0,04 9D 0,088D 0,025D 0,195D A 1437 H 0,049 0,098 0,049 0,195 0,049 0,195 Anfomicina D 0,195D 0,781D 0,391D 1, 56D 0,391D 1, 56D

Substâncias A 1437: actividade in vitro (estirpes resistentes à vancomicina) ; concentração em μ9/ιη1

EnterococcusDfaec ium VR1 Enterococcus faecium VR2 Estreptococcus pyoqenes A 1437 AD não determinadoD A 1437 BD 1D 1D 0, 5D A 1437 CD 4D 4D 4D A 1437 DD 2D 2D 1D A 1437 ED 4D 4D 1D A 1437 FD 4D 4D 1D A 1437 GD 0, 25D 0,25D 0,125D A 1437 HD 1D 1D 0, 5D Anfomicina 4 4 2

Os compostos K, L e M possuem uma actividade in vitro comparável à dos compostos A a H.

Exemplo 11a: Caracterização de A 1437 D r

U 0 lipopéptido A 1437 D isola-se como um sólido amorfo. Poder rotatório: +35° (c = 0,1; metanol) HPLC: tempo de retenção: 15,1 minutos.

Aminoácidos: 2 ácidos aspárticos 1 asparagina 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina FAB-MS: m/e = 1303, 6952 [(M+H)+]

Massa molar: 1302, 6884 (C5gHg4N140ig) CID-MS: m/z = 356, 491, 517, 520, 741, 761, 938, 982 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm”1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1440.

Exemplo 11b: Caracterização de A 1437 B 0 lipopéptido A 1437 B isola-se como um sólido amorfo.

Poder rotatório: +27° (c = 0,1; metanol) HPLC: tempo de retenção: 12,8 minutos.

Aminoácidos: 3 ácidos aspárticos 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina FAB-MS: m/e = [(M+H)+]

Massa molar: 1303 (C5gHg3N1302o) 35

-------- CID-MS: m/z = 356, 407, 518, 521, 741, 762, 938, 982 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm"1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Exemplo 11c: Caracterização de A 1437 C O lipopéptido A 1437 C isola-se como um sólido amorfo.

Poder rotatório: +30° (c = 0,1; metanol) HPLC: tempo de retenção: 14,1 minutos.

Aminoácidos: 2 ácidos aspárticos 1 asparagina 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutiricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina

Massa molar: 1288 (¢53^2^4()19) CID-MS: m/z = 356, 392, 503, 503, 741, 747, 938, 981 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm-1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

Exemplo lld: Caracterização de A 1437 A O lipopéptido A 1437 A isola-se como um sólido amorfo.

Poder rotatório: +30° (c = 0,1; metanol) HPLC: tempo de retenção: 11,8 minutos.

Aminoácidos: 3 ácidos aspárticos 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 36 1 valina

Massa molar: 1289 (CsgH^Nj^C^o) CID-MS: m/z = 356, 478, 504, 507, 741, 748, 938, 981 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm"1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Exemplo lie: Caracterização de A 1437 F O lipopéptido A 1437 F isola-se como um sólido amorfo.

Poder rotatório: +31° (c = 0,1; metanol) HPLC: tempo de retenção: 13,8 minutos.

Aminoácidos: 2 ácidos aspárticos 1 asparagina 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina

Massa molar: 1288 (C58H92N14019) CID-MS: m/z = 356, 392, 503, 506, 741, 747, 938, 981 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm”1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

Exemplo llf: Caracterização de A 1437 E O lipopéptido A 1437 E isola-se como um sólido amorfo.

Poder rotatório: +27° (c = 0,1; metanol) HPLC: tempo de retenção: 11,5 minutos.

Aminoácidos: 3 ácidos aspárticos 1 β-metilaspartato 2 glicinas 37 ί t 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina

Massa molar: 1289 (CggHg^N^C^o) CID-MS: m/z = 356, 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm"1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Exemplo llg: Caracterização de A 1437 H O lipopéptido A 1437 H isola-se como um sólido amorfo. HPLC: tempo de retenção: 15,9 minutos.

Aminoácidos: 2 ácidos aspárticos 1 asparagina 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina

Massa molar: 1316 (CgoHgeNi^Oig) CID-MS: m/z = 356, 420, 531, 534, 741, 775, 938, 981 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm-1, 2930, 1660, 1530, 1450, 1400.

Exemplo llh: Caracterização de A 1437 G O lipopéptido A 1437 G isola-se como um sólido amorfo.

Poder rotatório: +34° (c = 0,1; metanol) HPLC: tempo de retenção: 13,6 minutos.

Aminoácidos: 3 ácidos aspárticos 38 1 3-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina

Massa molar: 1317 CID-MS: m/z = 356, 421, 532, 535, 741, 776, 938, 981 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm"1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Exemplo lli: Caracterização de A 1437 K O lipopéptido A 1437 K isola-se como um sólido amorfo. HPLC: tempo de retenção: 12,5 minutos.

Aminoácidos: 3 ácidos aspárticos 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina FAB-MS: m/e = [(M+H)+]

Massa molar: 1299 (CsgHg-iN^C^o) CID-MS: m/z = 393, 504, 507, 741, 748, 938, 981 IV (KBr): v = 3420 (largo) cm-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400.

Exemplo llj: Caracterização de A 1437 L O lipopéptido A 1437 L isola-se como um sólido amorfo. HPLC: tempo de retenção: 13,0 minutos. 39

Aminoácidos: 3 ácidos aspárticos 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2, 3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina FAB-MS: m/e = [(M+H)+]

Massa molar: 1298 (C59H93N1302o) CID-MS: m/z = 407, 518, 741, 761, 938, 981

IV (KBr): v = 3420 (largo) cm-1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. Exemplo llk: Caracterização de A 1437 M 0 lipopéptido A 1437 M isola-se como um sólido amorfo. HPLC: tempo de retenção: 9,8 minutos.

Aminoácidos: 3 ácidos aspárticos 1 β-metilaspartato 2 glicinas 2 ácidos 2,3-diaminobutíricos 1 prolina 1 ácido pipecolinico 1 valina FAB-MS: m/e = [(M+H)+]

Massa molar: 1275 ^57Η89Ν1302ο) CID-MS: m/z = 379, 490, 493, 724, 741, 938, 981 IV (KBr): v= 3420 (largo) cm"1, 2925, 1650, 1535, 1450, 1400. 40

Exemplo 12:

Desvios químicos de Cl3

A Tabela mostra os desvios químicos de C13 dos sinais de CH de A 1437 B atrib Dab Giy MeAsp Gly Asp Asp Asp Dab val Pro Plp NH/Ca 8,30D 8,43D 8,19D 8,12D 8,090 7,960 8,15 7,87 7,30 4,13 4,62 0 aD 56,00 44, 60 41,20 44,70 52,00 53,10 53,00 55,60 59,20 62,40 56,80 □ □ □ □ □ O O O O O 0 PD 50,10 □ 14,40 □ 36,10 35, 60 36,30 47,80 31,30 30,80 27,20 □ □ o · 0 0 0 0 D O ΖΏ 16,00 □ □ □ 0 0 0 20,10 18,9 26,00 20, 60 □ 19,7 δα α □ □ □ □ 0 O O O 49,40 24,90 □ O 6D □ □ □ □ 0 0 □ O □ 0 45,00 □

Para permitir uma comparação com os dados de 1H, incluíram-se os desvios químicos de NH dos sinais de NH ou de CHa para Pip e Pro dos sistemas de spin correspondentes.

Lisboa, 28 de Fevereiro de 2001

0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL 41

Claims (5)

1. Γtl U t REIVINDICAÇÕES 1. Lipopéptidos de fórmula I, F^-Asn-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro em que R1 significa ácido gordo ou.ácido gordo hidroxilado mono- ou poli-insaturado, saturado, ou independentemente disso linear ou ramificado, com um comprimento de cadeia de 6 a 22 átomos de carbono inclusive, com excepção dos lipopéptidos de fórmula I, em que R1 significa:

   1

   o Lipopéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1 apresentar um comprimento de cadeia de 10 a 20 átomos de carbono inclusive. Lipopéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1 apresentar um comprimento de cadeia de 12, 13, 14 ou 15 átomos de carbono. Lipopéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1 significar a) ácido gordo iC13, b) ácido gordo iC14, c) ácido gordo aiC15, d) ácido gordo nC^, e) ácido gordo nCi3 ou f) ácido gordo nC14. Lipopéptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por R1 = Lipopéptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por R1 = Lipopéptido de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por

   o 2
2. 8. Processo para a preparação de lipopéptidos de fórmula I, R1-Asp-Dab-Pip-MeAsp-Asp-Gly-Asp-Gly-Dab-Val-Pro R1 significa ácido gordo ou ácido gordo hidroxilado mono- ou poli-insaturado, saturado, ou independentemente disso linear ou ramificado, com um comprimento de cadeia de 6 a 22 átomos de carbono inclusive, caracterizado por se efectuar a fermentação de Actinoplanes sp. num meio de cultura, até se formarem um ou mais lipopéptidos no meio de cultura e se purificar o lipopéptido de fórmula I a partir do meio de cultura.
3. 9. Processo para a preparação de um lipopéptido de fórmula I, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se efectuar a fermentação de Actinoplanes sp. num meio de cultura, até se formarem um ou mais lipopéptidos no meio de cultura e se purificar o lipopéptido de fórmula I a partir do meio de cultura.
4. 10. Processo de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado por se efectuar a purificação precipitando os lipopéptidos a partir do meio de cultura utilizando ácidos a pH de 0,5 até 4 inclusive, purificando conforme o caso os lipopéptidos obtidos na precipitação por cromatografia em permutadores iónicos ou por cromatografia numa matriz hidrófoba, podendo as duas cromatografias ser efectuadas em alternativa ou sucessivamente por qualquer ordem desejada.
5. 11. Processo de acordo cóm uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por se efectuar a fermentação de Actinoplanes sp. DSM 7358. 3 12. Medicamento, caracterizado por conter um ou mais lipopéptidos de fórmula I, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7, e, conforme o caso, veículos farmacêuticos. 13. Utilização de um lipopéptido de fórmula I, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, para a preparação de um antibiótico contra bactérias gram-positivas. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por as bactérias serem bactérias resistentes a glicopéptidos. Lisboa, 28 de Fevereiro de 2001 0 AGENTE OPICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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