JPH06166656A - 新規生理活性物質ベナスタチンｃ、ｄ、その製造法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明により、免疫調節作用を有する新規な
生理活性物質ベナスタチンＣ及びＤ、その製造法及びそ
の用途が提供される。 【構成】 下記一般式（１） 【化１】 〔式Ｒは−ＣＨ＝ＣＨ−（ベナスタチンＣ）または−Ｃ
Ｈ₂ −ＣＨ₂ −（ベナスタチンＤ）を示す。〕で表され
る新規生理活性物質ベナスタチンＣ、Ｄは免疫調節作用
を有し免疫調節剤として極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫調節作用（ｉｍｍｕ
ｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する新
規な生理活性物質ベナスタチンＣ、Ｄ（Ｂｅｎａｓｔａ
ｔｉｎ Ｃ、Ｄ）、その製造法およびその用途に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】免疫調節作用には、免疫賦活作用および
免疫抑制作用がある。免疫賦活作用を有する物質は、
癌、感染症等の治療薬として有効である。免疫抑制作用
を有する物質は、臓器移植等で有効となり得る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】過去に報告されている
免疫調節剤は、その作用が弱く、より強い免疫調節剤が
望まれている。本発明の目的は、そのような強い免疫調
節活性を有する生理活性物質、その製造法及びその用途
を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は新規生理活性物質ベナスタチンＣ、
Ｄに関する発明であって、下記一般式（１）：

【化２】 〔式中Ｒは−ＣＨ＝ＣＨ−（ベナスタチンＣ）または−
ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −（ベナスタチンＤ）を示す。〕で表さ
れる化合物であることを特徴とする生理活性物質ベナス
タチンＣ、Ｄを提供するものである。

【０００５】ベナスタチンＣの理化学的性質は下記の通
りである。 ベナスタチンＣの理化学的性状 （１） 色及び形状：黄色粉末 （２） 分子式：Ｃ₂₉Ｈ₂₈Ｏ₅ （３） 分子量：４５６ ＦＡＢ−ＭＳ（Ｐｏｓｉｔｉ
ｖｅ）ｍ／ｚ４５７（Ｍ＋Ｈ）⁺ （４） 融点：２１４〜２１６℃（ｄｅｃ．） （５） 紫外線吸収スペクトル：添付図面の図１に示
す。 （６） 赤外線吸収スペクトル：添付図面の図２に示
す。 （７） 水素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図３
に示す。 （８） 炭素核核磁気共鳴スペクトル：添付図面の図４
に示す。 （９） 溶解性：ジメチルスルホキシド、メタノール、
アセトン、酢酸エチルに可溶であり、水に不溶である。 （１０）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：０．８０ シリカゲル（メルク社製Ａｒｔ． ５７１５）薄層を用
い、展開溶媒としてクロロホルム−メタノール（４：
１）を用いた。

【０００６】本発明の第２の発明は、新規生理活性物質
ベナスタチンＣ、Ｄの製造法に関する発明であって、ス
トレプトミセス属に属するベナスタチンＣ、Ｄ生産菌を
栄養培地中で培養し、その培養物から上記一般式（１）
で表される生理活性物質ベナスタチンＣ、Ｄを分離採取
することを特徴とする。

【０００７】本発明に使用されるベナスタチンＣ、Ｄ生
産菌の１例としては、本発明者らにより東京都杉並区の
土壌より分離された放線菌であって、ＭＩ３８４−ＤＦ
１２の菌株番号が付された菌株がある。ＭＩ３８４−Ｄ
Ｆ１２株の菌学的性状は次の通りである。

【０００８】１．形態 ＭＩ３８４−ＤＦ１２株は、顕微鏡下で分枝した基中菌
糸より気菌糸を伸長する。気菌糸は通常まっすぐである
が、らせん状の胞子鎖を有し、胞子の連鎖は２０個以上
を数える。特徴的な形態として直径１．５〜６ミクロン
の偽似胞子のう（Ｐｓｅｕｄｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）
を形成する。輪生枝および胞子のうは認められない。胞
子の大きさは約０．５〜０．６×０．７〜０．８ミクロ
ンであり、その表面は平滑である。

【０００９】２．各種培地における生育状態 色の記載について以下の〔 〕内に示す標準は、コンテ
ィナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・
ハーモニー・マニュアル（ＣｏｎｔａｉｎｅｒＣｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａのｃｏｌｏｒ
ｈａｒｍｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）を用いた。

【００１０】（１） シュクロース・硝酸塩寒天培地
（２７℃培養） 発育は明るい茶〔４ｎｇ，Ｌｔ Ｂｒｏｗｎ〕〜暗い茶
〔３ｐｎ，Ｄｋ Ｂｒｏｗｎ〕、気菌糸の着生は、認め
られない。溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。

【００１１】（２） グルコース・アスパラギン寒天培
地（２７℃培養） 発育はうす茶〔３ｉｅ，Ｃａｍｅｌ〕〜赤茶〔５ｕｉ，
Ｒｏｓｅｗｏｏｄ Ｂｒｏｗｎ〕、気菌糸の着生は認め
られない。溶解性色素はわずかにピンク色を帯びる。

【００１２】（３） グリセリン・アスパラギン寒天培
地（ＩＳＰ−培地５，２７℃培養） 茶灰〔４ｎｉ，Ｓｐｉｃｅ Ｂｒｏｗｎ〕〜暗いオリー
ブ灰〔１ｐｏ，Ｅｂｏｎｙ〕の発育上に、まばらに白い
気菌糸を着生する。溶解性色素はわずかにピンク色を帯
びる。発育の色調および溶解性色素は０．０５Ｎ−Ｎａ
ＯＨの添加により緑色を帯びるが、０．０５Ｎ−ＨＣｌ
の添加によっては変化しなかった。

【００１３】（４） スターチ・無機塩寒天培地 ＩＳ
Ｐ−培地４，２７℃培養） 茶灰〔４ｎｉ，Ｓｐｉｃｅ Ｂｒｏｗｎ〕〜暗い茶〔４
ｐｎ，Ｄｋ Ｂｒｏｗｎ〕の発育上に、綿状の白い気菌
糸を着生する。溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。
発育の色調および溶解性色素は０．０５Ｎ−ＮａＯＨの
添加により緑色を帯びるが、０．０５Ｎ−ＨＣｌの添加
によっては変化しなかった。

【００１４】（５） チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地
７，２７℃培養） 発育は灰味茶〔３ｎｉ，Ｃｌｏｖｅ Ｂｒｏｗｎ〕〜暗
い茶〔４ｐｌ，ＤｋＢｒｏｗｎ〕、気菌糸の着生は認め
られない。溶解性色素は茶色味を帯びる。

【００１５】（６） 栄養寒天培地（２７℃培養） 発育はうす茶〔３ｎｇ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｈａｐｌｅ〕〜
灰味茶〔３ｎｉ，Ｃｌｏｖｅ Ｂｒｏｗｎ〕、気菌糸の
着生は認められない。溶解性色素は茶色味を帯びる。

【００１６】（７） イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ
−培地２，２７℃培養） うす黄茶〔２ｐｇ． Ｍｕｓｔａｒｄ Ｇｏｌｄ〕〜う
す茶〔２ｎｉ，Ｍｕｓｔａｒｄ Ｂｒｏｗｎ〕の発育上
に、白い綿状の気菌糸を着生する。溶解性色素は認めら
れない。

【００１７】（８） オートミール寒天培地（ＩＳＰ−
培地３，２７℃培養） うすピンク〔５ｂａ，Ｓｈｅｌｌ Ｐｉｎｋ〕〜うす黄
茶〔２ｌｇ，Ｍｕｓｔａｒｄ Ｔａｎ〕の発育上に、明
るい灰色〔１３ｃｂ，Ｐｅａｒｌ Ｇｒａｙ〕の気菌糸
をうっすらとまばらに着生する。溶解性色素はうすピン
クを帯びる。

【００１８】（９） グリセリン・硝酸塩寒天培地（２
７℃培養） 発育はピンク〔６ｉｅ，Ｒｅｄｗｏｏｄ〕〜灰味赤〔６
ｌｇ，Ｄｋ Ｒｅｄｗｏｏｄ〕、気菌糸の着生は認めら
れない。溶解性色素はわずかにうすピンクを帯びる。

【００１９】（１０） スターチ寒天培地（２７℃培
養） 発育はうす茶〔３ｎｇ，Ｙｅｌｌｏｗ Ｍａｐｌｅ〕〜
暗い茶〔４Ｐｎ，ＤｋＢｒｏｗｎ〕、気菌糸の着生は認
められない。溶解性色素はわずかにうすピンクを帯び
る。

【００２０】（１１） リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃
培養） 発育はうすオリーブ〔１ｌｅ，Ｏｌｉｖｅ Ｙｅｌｌｏ
ｗ〕、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められない。

【００２１】（１２） セルロース（濾紙片添加合成
液、２７℃培養） 培養後３週間観察したが、生育を認めなかった。

【００２２】（１３） ゼラチン穿刺培養（１５％単純
ゼラチン培地、２０℃培養；グルコース・ペプトン・セ
ラチン培地、２４℃培養） 単純ゼラチン培地の場合は、発育はうす茶、気菌糸は着
生せず、溶解性色素は茶色味を帯びる。グルコース・ペ
プトン・ゼラチン培地では、発育はうす黄茶、気菌糸は
着生せず、溶解性色素は茶色味を帯びる。

【００２３】（１３） 脱脂牛乳（３７℃培養） 発育はうす茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は褐色を
呈する。

【００２４】３．生理的性質 （１） 生育温度範囲 イースト・スターチ寒天培地（可溶性デンプン１．０
％、イースト・エキス０．２％、ひも寒天３．０％、ｐ
Ｈ７．０）を用い、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、
３７℃、５０℃の各温度で試験した結果、２０℃、２４
℃、２７℃、３０℃、３７℃で生育したが、２０℃での
生育は極めて悪く、５０℃では生育しない。生育至適温
度は２７℃〜３０℃付近と思われる。

【００２５】（２） ゼラチンの液化（１５％単純ゼラ
チン培地、２０℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチ
ン培地、２７℃培養） １５％単純ゼラチン培地においては、液化を示さず、グ
ルコース・ペプトン・ゼラチン培地では培養後２１日目
に弱い液化を示した。その作用は弱い方である。

【００２６】（３） スターチの加水分解（スターチ・
無機塩寒天培地及びスターチ寒天培地、うずれも２７℃
培養） いずれの培地でも、培養後３日目には水解性を認めその
作用は中等度である。

【００２７】（４） 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱
脂牛乳、３７℃培養） 培養後６日目頃よりペプトン化が始まる１３日目頃には
完了する。その作用は中等度〜強い方である。凝固は、
認められない。

【００２８】（５） メラニン様色素の生成（トリプト
ン・イースト・ブロス、ＩＳＰ−培地１；ペプトン・イ
ースト・鉄寒天培地、ＩＳＰ−培地６；チロシン寒天培
地、ＩＳＰ−培地７；いずれも２７℃培養） トリプトン・イースト・ブロス（ＩＳＰ−培地１）、ペ
プトン・イースト・鉄寒天培地（ＩＳＰ−培地６）は陽
性、チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７）はわずかにメ
ラニン様色素を生成する。

【００２９】（６） 炭素源の利用性（プリドハム・ゴ
トリーブ寒天培地、ＩＳＰ−培地９、２７℃培養） Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトー
ス、シュクロース、イノシトール、Ｄ−マンニトールを
利用して発育する。Ｄ−キシロースもおそらく利用す
る。ラムノース、ラフィノース、ラクトースは利用しな
い。

【００３０】（７） リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石
灰寒天培地、２７℃培養） 陰性である。 （８） 硝酸塩の還元反応（０．１％硝酸カリウム含有
ペプトン水、ＩＳＰ−培地８、２７℃培養） 陽性である。 （９） セルロースの分解（濾紙片添加合成液、２７℃
培養） 生育しない。

【００３１】以上の性状を要約すると、ＭＩ３８４−Ｄ
Ｆ１２株はその形態上、らせん形成および特徴的な偽似
胞子のうを有する気菌糸を伸長する。胞子の連鎖は２０
個以上を数え、その表面は平滑である。種々の培地で、
発育はうす茶〜暗い茶、特定な培地ではピンク色を呈す
る。気菌糸の着生は認めないことが多いが、ＩＳＰ−培
地２、３、４、５では白い気菌糸を着生する。溶解性色
素は、培地によりピンク色を帯びる場合と褐色を帯びる
場合がある。メラニン様色素の生成は陽性、蛋白分解力
は中等度、スターチの水解性も中等度である。なお、細
胞壁に含まれる２，６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型
であった。

【００３２】これらの性状より、ＭＩ３８４−ＤＦ１２
株はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に
属すると考えられる。近縁の既知菌種を検索すると、Ｍ
Ｉ３８４−ＤＦ１２株の特徴である偽似胞子のうを有す
るものとして次の２種があげられた。すなわち、ストレ
プトミセス・パラドクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐ
ａｒａｄｏｃｕｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ，３６巻、５７３〜５７６頁、１９８６
年；Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８巻、６１〜６４頁、１９
８６年およびストレプトミセス・ヴィタミノフィルス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｔａｍｉｎｏｐｈｉ
ｌｌｕｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ，３６巻、５７３〜５７６頁、１９８６年；Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ，８巻、６１〜６４頁、１９８６年；Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，３３
巻、５５７〜５６４頁、１９８３年）である。このう
ち、ストレプトミセス・ヴィタミノフィルスとは、ビタ
ミン要求性において区別された。ＭＩ３８４−ＤＦ１２
株をストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｓｐ．）ＭＩ３８４−ＤＦ１２と同定した。

【００３３】ＭＩ３８４−ＤＦ１２株を工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託申請し、平成２年２月８日に微
工研菌寄第１１２７０号として受託された。平成３年１
月１８日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れ、微工研条寄第３２２８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２２
８）の受託番号が付与されている。

【００３４】ＭＩ３８４−ＤＦ１２株は他の放射菌の場
合に見られるように、その性状が変化しやすい。たとえ
ば、ＭＩ３８４−ＤＦ１２株に由来する突然変異株（自
然発生または誘発性）、形質融合体または遺伝子組み換
え体であっても、ベナスタチンＣ、Ｄの生産能を有する
ストレプトミセス属の菌はすべて本発明の方法に使用す
ることができる。

【００３５】本発明の方法では、前記の菌を通常の微生
物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。炭素
源としては、グルコース、水飴、デキストリン、シュク
ロース、でんぷん、糖蜜、動・植物油等を使用できる。
また、窒素源としては、大豆粉、小麦、小麦胚芽、コー
ンスティープ・リカー、綿実かす、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素
等を利用できる。その他、必要に応じ、ナトリウム、コ
バルト、塩素、硫酸、燐酸、及びその他のイオンを生成
することのできる無機塩類を添加することは有効であ
る。また、菌の生育を助け、生理活性物質ベナスタチン
Ｃ、Ｄの生産を促進するような有機及び無機物を適当に
添加することができる。

【００３６】培養法としては、好気的条件での培養法、
特に深部培養法が適している。培養に適当な温度は１５
〜３７℃であるが、多くの場合、２６〜３０℃付近で培
養する。生理活性物質ベナスタチンＣ、Ｄの生産は培地
や培養条件により異なるが、振盪培養、タンク培養とも
通常１〜１０日の間でその蓄積が最高に達する。培養物
中の生理活性物質ベナスタチンＣ、Ｄの蓄積量が最高に
なった時に、培養を停止し、培養液から目的物質を単離
精製する。

【００３７】本発明によって得られるベナスタチンＣ、
Ｄの培養液からの採取にあたっては、その形状を利用し
た通常の分離手段を適宜組み合わせて抽出して精製する
ことができる。ベナスタチンＣ、Ｄは培養濾液及び菌体
の両方に存在する。培養濾液よりは、酢酸エチル等の水
不混和性の有機溶媒で抽出できる。菌体よりは、メタノ
ール、アセトン等の有機溶剤で抽出後、抽出液を減圧濃
縮し、培養濾液と同様の方法で更に溶媒抽出することが
できる。上述の方法に加え、脂溶性物質の採取に用いら
れる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーより
のかき取り、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み
合わせ、あるいは繰り返すことによってベナスタチン
Ｃ、Ｄを純粋に単離することができる。

【００３８】本発明の第３の発明は、ベナスタチンＣ、
Ｄを有効成分とする免疫調節剤である。ベナスタチンＣ
は以下の試験例に示すようにリンパ球幼若化反応におい
て低濃度（例えば約７μｇ／ｍｌ以下）では免疫賦活作
用を示し、高濃度（例えば約１２μｇ／ｍｌ以上）では
免疫抑制作用を示す。しかもこの化合物は毒性を示さな
い。したがって、ベナスタチンＣ、Ｄは免疫調節剤とし
て極めて有用である。特にベナスタチンＣの低濃度での
免疫賦活作用は強く、免疫賦活剤として期待される。ベ
ナスタチンＣ、Ｄは、通常、経口投与あるいは静脈、皮
内、筋肉内投与などの非経口投与によって投与すること
ができる。投与量は投与する対象、投与ルートなどによ
って変動するが０．０５〜１５０ｍｇ／ｋｇ／日程度、
通常０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１〜５
０ｍｇ／ｋｇ／日である。

【００３９】投与する際の製剤としては慣用的に用いら
れている剤形が挙げられる。経口投与の場合には、デン
プンなどの通常の賦形剤などともに成型された錠剤、顆
粒剤、カプセル剤などが用いられる。非経口投与の場合
には生理食塩水、溶解剤などを用いて成型された通常の
注射剤などが用いられる。

【００４０】

【発明の効果】以上に詳細に説明したように、本発明で
は新規な生理活性物質ベナスタチンＣ、Ｄが提供され、
この化合物は免疫調節作用を有する。したがって、免疫
調節剤として極めて有用である。またベナスタチンＤは
主としてグラム陽性細菌に対して抗菌活性をも有し、抗
菌剤としても有用である。

【００４１】

【実施例】次に実施例によって本発明のベナスタチンＣ
の製造例および製剤例を示す。なおベナスタチンＤはベ
ナスタチンＣに準じて製造される。実施例１ 種培地として、ガラクトース２．０％、デキストリン
２．０％、バクトーソイトン（登録商標）（ディフコ社
製）１．０％、コーンスティープ・リカー（イワキ社
製）０．５％、硫酸アンモニウム０．２％、炭酸カルシ
ウム０．２％、消泡剤としてシリコンＫＭ−７０（信越
化学社製）：大豆油（局法）（１：１）の混液０．０５
％を含む培地を用いた。なお、殺菌前の培地はｐＨ７．
４に調整して使用した。

【００４２】５００ｍｌ容三角フラスコに１１０ｍｌを
分注した前記種培地を１２０℃で２０分間滅菌し、これ
にストレプトミセス・エスピーＭＩ３８４−ＤＦ１２株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３２２８）の斜面培養の１〜２白金
耳を接種し、３０℃、１８０回転／分の回転式振盪機に
て３日間培養し種培養とした。ついで生産培地としてグ
リセリン２．０％、エスサンミート（味の素社製）１．
５％、燐酸水素二カリウム０．１％、塩化コバルト六水
塩０．０００５％を含む培地（ｐＨ６．２、１Ｍ燐酸−
カリウムで調整）を５００ｍｌ容三角フラスコに１１０
ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間滅菌し、前記種培
養液２ｍｌずつを移植し、２７℃で４日間振盪培養し
た。培養終了後、培養液を濾過し培養濾液と菌体に分別
した。

【００４３】培養濾液３０リットルに酢酸エチル３０リ
ットルを加え、よく攪拌して有効成分を抽出し、これを
濃縮して赤色の粗物質１３．３２ｇを得た。この粗物質
をメタノール４０ｍｌに溶解し、シラナイズドシリカゲ
ル（メルク社製、Ａｒｔ．７７１９）４０ｇを加えて減
圧下に濃縮乾固した。次に、これを４０％メタノールで
懸濁後、あらかじめ４０％メタノールで充填したシラナ
イズドシリカゲル５００ｍｌのカラムにかけ、有効成分
を４０％メタノール〜１００％メタノールの直線的濃度
勾配溶出法により溶出し、濃縮乾固して赤色の粗物質
６．３６ｇを得た。

【００４４】この粗物質をメタノール２０ｍｌに溶解
し、ＹＭＣ−ＧＥＬ（ＯＤＳ−Ａ６０−２００／６０、
山村化学研究所社製）２０ｇを加えて濃縮乾固した。次
に、これを４０％メタノールで懸濁後、あらかじめ４０
％メタノールで充填したＹＭＧ−ＧＥＬ ５００ｍｌの
カラムにかけ、有効成分を４０％メタノール〜１００％
メタノールの直線的濃度勾配溶出法により溶出し、濃縮
乾固して褐色の粉末３．２９ｇを得た。この粉末をメタ
ノール２０ｍｌに溶解し、シリカゲル６０（メルク社
製、Ａｒｔ．７７３４）２０ｇを加えて濃縮乾固した。
次に、これをクロロホルムで懸濁後、あらかじめ同溶液
で充填したシリカゲル６０ ４００ｍｌのカラムにか
け、同溶媒で洗浄した。続いて、有効成分をクロロホル
ム：メタノール（９５：５）で溶出し、濃縮乾固して黄
色の粉末１．３５ｇを得た。次に、この粉末をあらかじ
め酢酸を１％含有する７８％アセトニトリルで平衡化し
た高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用カラム
（資生堂社製、カプセルパツクＣ₁₈、２０Φ×２５０ｍ
ｍ、流速８ｍｌ／ｍｉｎ）へ通し、前記平衡液で溶出
し、得られた活性画分を濃縮乾固することにより、純粋
なベナスタチンＣの黄色粉末を２．８６ｍｇ得た。

【００４５】純粋なベナスタチンＣを用いて、紫外線吸
収スペクトル、赤外線吸収スペクトル、水素核核磁気共
鳴スペクトル及び炭素核核磁気共鳴スペクトルを測定し
た。これらのスペクトルは図１、図２、図３及び図４に
示した通りである。ベナスタチンＣの培養工程ならびに
精製工程中での追跡は、免疫調節活性の測定に基づいて
行った。その方法は、後述する試験例で示す免疫調節活
性の測定法と同様の方法を用いた。

【００４６】実施例２ ベナスタチンＣ、３０重量部、結晶乳糖１２０部、結晶
セルロース１４７部及びステアリン酸マグネシウム３部
をＶ型混合機で打錠し、１錠３００ｍｇの錠剤を得た。

【００４７】

【試験例】以下に、ベナスタチンＣが免疫調節活性を有
し、且つ毒性を示さないことを試験例により示す。試験例１ ベナスタチンＣのリンパ球幼若化反応における免疫調節
活性 リンバ球幼若化反応に対するベナスタチンＣの調節効果
の試験法は次の通りである。培養には２０％牛胎児血
清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ、１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシン及び１００単位／ｍｌのペ
ニシリンＧを添加したＲＰＭＩ １６４０培地を用い
た。培養は９６穴の平底マイクロプレート（ＣＯＳＴＡ
Ｒ）で行った。マイトジェンは、リポポリサッカライド
（ＬＰＳ）とコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）をそれぞ
れ最終濃度１００、５μｇ／ｍｌで用いた。

【００４８】脾臓細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性、
＞２０周齢）から脾臓を取り出し単細胞浮遊液を作り、
ハイパーショック（ｈｙｐｅｒ ｓｈｏｃｋ）で赤血球
を除去し、ＬＰＳ用にはこれをそのまま用いて調整し、
Ｃｏｎ Ａ用にはＴ細胞分離用ＮＹｌｏｎ Ｆｉｂｅｒ
（和光純薬）を通して調整した。各ウエルに２×１０ ⁵
個の脾細胞と、それぞれの希釈濃度の被験化合物を加え
総量０．２ｍｌとし、これを７２時間培養した。培養終
了の８時間前にウエル当たり３７ＫＢｑの〔³Ｈ〕−チ
ミジンを添加し、その細胞内への取り込み量を測定し
た。効果の判定は、それぞれの被験化合物添加群の対照
に対する〔³ Ｈ〕−チミジンの取り込み量の比率によっ
た（日本免疫学会編、免疫実験操作法、第２２６７〜２
２７６頁）。ベナスタチンＣのマウスのリンパ球幼若化
反応に対する作用を第１表に示した。ベナスタチンＣは
ＬＰＳ，Ｃｏｎ Ａによるリンパ球幼若化反応を低濃度
において非常に強く促進した。また、１２．５μｇ／ｍ
ｌ以上では強く抑制した。

【００４９】

【表１】 第 １ 表 ＬＰＳ及びＣｏｎ Ａによるマウスリンパ球幼若化反応 におけるベナスタチンＣの作用 濃 度 作用指数（％） サンプル （μｇ／ｍｌ） ＬＰＳ Ｃｏｎ Ａ コントロール １００ １００ ベナスタチンＣ ３．１３ ５６９．１ ９４２．２ ６．２５ ３１４．５ ２５７．６ １２．５ １２．６ ６．５ ２５ ０．６ ０．３ ＃Ｐ＜０．０５ｖｓコントロール

【図面の簡単な説明】

【図１】ベナスタチンＣの１０μｍ／ｍｌエタノール溶
液の紫外線吸収スペクトル。

【図２】ベナスタチンＣの臭化カリウム錠内での赤外線
吸収スペクトル。

【図３】ベナスタチンＣの重メタノール中で測定した４
００ＭＨｚ水素核磁気共鳴スペクトル。

【図４】ベナスタチンＣの重メタノール中で測定した１
００ＭＨｚ炭素核磁気共鳴スペクトル。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 浜田 雅 東京都新宿区内藤町１−26 (72)発明者 村岡 靖彦 東京都板橋区高島平３−11−２−1107 (72)発明者 青山 貴之 東京都北区志茂３丁目17番２−302号 (72)発明者 山崎 忠雄 埼玉県浦和市上大久保843−７ (72)発明者 冨田 勝久 東京都北区志茂３−５−７ (72)発明者 小川 裕 埼玉県南埼玉郡白岡町西７−１−49 (72)発明者 安部 史紀 東京都北区志茂３−29−15 (72)発明者 嶋田 信義 東京都北区志茂２−９−10

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（１）： 【化１】 〔式中Ｒは−ＣＨ＝ＣＨ−（ベナスタチンＣ）または−
   ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −（ベナスタチンＤ）を示す。〕で表さ
   れる化合物であることを特徴とする生理活性物質ベナス
   タチンＣ、Ｄ。
2. 【請求項２】 ストレプトミセス属に属するベナスタチ
   ンＣ、Ｄ生産菌を栄養培地中で培養し、その培養物から
   ベナスタチンＣ、Ｄを採取することを特徴とする、生産
   活性物質ベナスタチンＣ、Ｄの製造法。
3. 【請求項３】 ベナスタチンＣ、Ｄを有効成分とする免
   疫調節剤。