KR0137675B1 - 무레이도마이신 그룹의 새로운 항생제, 그의 미생물학적 제조방법, 및 그의 치료적 용도(new antibiotics of the mureidomycin group, the microbiological preparation, and their therapeutic use) - Google Patents

무레이도마이신 그룹의 새로운 항생제, 그의 미생물학적 제조방법, 및 그의 치료적 용도(new antibiotics of the mureidomycin group, the microbiological preparation, and their therapeutic use)

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KR0137675B1
KR0137675B1 KR1019970056329A KR19970056329A KR0137675B1 KR 0137675 B1 KR0137675 B1 KR 0137675B1 KR 1019970056329 A KR1019970056329 A KR 1019970056329A KR 19970056329 A KR19970056329 A KR 19970056329A KR 0137675 B1 KR0137675 B1 KR 0137675B1
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다쯔오 하네이시
마사또시 이누까이
게이꼬 시미쯔
후지오 이소노
요시하루 사까이다
다께시 기노시따
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가와무라 요시부미
상꾜 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens) SANK 60486(BIKOKEN JOHKI 1347: FERM BP-1347)로부터 발효하여 수득된, 무레이도마이신 E 또는 F로 명명된 화합물 및 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 및 에스테르; 그의 미생물학적 제조 방법 및 그의 치료학적 용도에 관한 것이다.

Description

무레이도마이신 그룹의 새로운 항생제, 그의 미생물학적 제조방법, 및 그의 치료적 용도
제 1 도는 무레이도마이신 E의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 2 도는 무레이도마이신 E의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 3 도는 무레이도마이신 E의 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 4 도는 무레이도마이신 F의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 5 도는 무레이도마이신 F의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 6 도는 무레이도마이신 F의 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 7a및 7b 도는 무레이도마이신 A의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 8 도는 무레이도마이신 A의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 9 도는 무레이도마이신 A의 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 10 도는 메틸무레이도마이신 E의 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 도이다.
제 11 도는 메틸무레이도마이신 F의 핵자기 공명 스펙트럼을 나타낸 도이다.
본 발명은 무레이도마이신 그룹의 신규 항생제에 관한 것이며 또한 그의 제조방법 및 활성성분으로 그중 하나 이상을 함유하는 항생제 조성물을 제공한다.
종래 항생제의 내성은 일반적인 병원균에 있어서 점차적으로 확립되어가므로 그러한 군에 대해 대항할 보다 광범위한 항생제의 필요성은 더욱 중요해지고 있다. 이러한 필요성은 기존 항생제류의 화학적 변형으로 충족될 수 있고, 가끔 충족되기도 하지만 전혀 새로운 항생제균의 발견이야말로 병원균에 의해 야기되는 질병치료의 가능성을 고양하는 것이다.
˝무레이도마이신˝이라 명명된 새로운 항생제 부류는 본출원인의 1987. 5. 18자의 선행 미합중국 특허출원 제 51,665호에 개시된 바 있다. 상기에서, 우리는 상기 부류의 처음 네가지 무레이도마이신 A, B, C 및 D를 새롭게 발견된 미생물, 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens) SANK 60486(BIKOKEN JOHKI 1347 ; FERM BP-1347)로 제조된 발효액으로부터의 분리를 개시하였다.
지금, 본 발명자들은 특히 그람-음성균, 더 특별히는 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 종에 대해 효과적인 것으로, 그들의 염, 에스테르 및 어떤 다른 유도체들과 함께 ˝무레이도마이신 E 및 F˝로 명명될, 상기 항생제의 신규 두가지를 발견하였다. 무레이도마이신 E 및 F는 스트렙토마이세스종 SANK 60486의 발효액에서 분리될 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 두가지 신규 무레이도마이신 뿐 아니라 그들의 유도체는 무레이도마이신 A를 화학 반응시켜 제조될 수 있다.
본 발명자들은 또한 무레이도마이신 A 내지 F 각각의 유도체이며, 그들로부터 제조될 수 있는 ˝무레이도마이신 AP 내지 FP˝로 명명될 또는 다른 화합물의 그룹도 발견하였다. 상기 화합물 및 그들의 염 및 에스테르는 다른 무레이도마이신의 제조시 합성중간체로도 사용된다.
그러므로, 새로운 조성물로 유용한 항균성 활성을 지닌 새로운 화합물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
또한 본 발명의 목적은 활성성분으로 하나 이상의 상기 화합물을 함유하는 약제학적 조성물 및 활성성분으로 하나 이상의 상기 화합물을 이용하여 균의 감염치료 및 예방법을 제공하는 것이다.
여기서 언급될 무레이도마이신 A 내지 F는 다음 평면구조식으로 나타낼 수 있다.
Figure kpo00001
상기 식 중:
무레이도마이신 A에서는, R1은 2,4-디옥소피리미딘-1-일, R2는 α-아미노-3-히드록시페네틸을 나타낸다 ;
무레이도마이신 B에서는, R1은 2,4-디옥소디히드로피리미딘-1-일, R2는 α-아미노-3-히드록시페네틸을 나타낸다 ;
무레이도마이신 C에서는, R1은 2,4-디옥소피리미딘-1-일, R2는 α-글리실아미노-3-히드록시페네틸을 나타낸다 ;
무레이도마이신 D에서는, R1은 2,4-디옥소디히드로피리미딘-1-일, R2는 α-글리실아미노-3-히드록시페네틸을 나타낸다 ;
무레이도마이신 E에서는, R1은 2,4-디옥소피리미딘-1-일, R2는 8-히드록시-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-일을 나타낸다 ; 및
무레이도마이신 F에서는, R1은 2,4-디옥소피리미딘-1-일, R2는 6-히드록시-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-일을 나타낸다.
그러므로, 본 발명은 새로운 화합물로서 다음 평면 구조식으로 나타낼 수 있는 상기의 무레이도마이신 E 및 F와 그의 유도체를 제공한다 :
Figure kpo00002
상기 식 중 X는 다음기를 나타낸다.
Figure kpo00003
그리고 상기 식 중 R은 수소, 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴 또는 아르알킬을 나타낸다. 무레이도마이신 E는 X가 다음기(즉, 8-히드록시-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-일기)인 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
Figure kpo00004
그리고 무레이도마이신 F는 X가 다음기(즉, 6-히드록시-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-일기)을 나타내는 상기 일반식(Ⅰ)의 화합물이다.
Figure kpo00005
본 발명은 또한, 새로운 화합물로 다음 평면구조식으로 나타낼 수 있는 무레이도마이신 AP부터 FP을 제공한다 :
Figure kpo00006
상기 식 중 R1및 R2는 앞과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용 가능한 일반식(Ⅰ)의 상기 화합물의 염 및 에스테르와 일반식(Ⅱ)의 염을 제공한다.
또한 본 발명은 스트렙토마이세스속의 무레이도마이신 E 또는 F를 만드는 미생물을 배양액속에서 배양하여 배양액으로부터 무레이도마이신 E 또는 F 또는 그의 염을 분리하고 그렇게 분리된 화합물을 임의로 염화, 탈염화 또는 에스테르화하여 무레이도마이신 E 또는 F 또는 그들의 염 및 에스테르를 제조하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물로, 상기의 무레이도마이신 E 또는 F 또는 그들의 염 또는 에스테르를 함유하는, 약제학적 조성물도 제공한다.
또한, 상기의 무레이도마이신 E 또는 F 또는 그들의 염 또는 에스테르를, 사람 또는 사람 이외의 동물에 투여하는 균감염의 치료 및 예방법을 제공한다.
상기 일반식(Ⅰ)에서 R이 알킬일 경우 직쇄 또는 측쇄 C1∼C10, 바람직하게는 C1∼C5, 최적으로는 C1∼C3알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, t-펜틸, 헥실, 1,1-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 헵틸, 옥틸, 2-에틸헥실, 노닐, 또는 데실이 적합하다.
R이 알케닐일 경우, 직쇄 또는 측쇄 C1∼C7, 더 바람직하게는 C2∼C4, 알케닐, 예컨대, 비닐, 알릴, 메탈릴, 2-부텐일, 3-부텐일, 3-펜틸, 4-헥센일 또는 5-헵텐일이 적합하다.
R이 알킨일일 경우, 직쇄 또는 측쇄 C3∼C7, 더 바람직하게는 C3∼C4, 알킨일, 예컨대, 에틴일, 1-프로핀일, 2-프로핀일, 2-부틴일, 3-펜틸일, 3-헥신일 또는 4-헵틴일이 적합하다.
R이 아릴일 경우에는 C6∼C10아릴, 예컨대 페닐 또는 나프틸, 더 바람직하게는 페닐이 적합하다.
R이 아르알킬일 경우에는 C7∼C10, 더 바람직하게는 C7∼C8아르알킬, 예컨대, 벤질, 페네틸, α-메틸벤질, 3-페닐프로필 또는 4-페닐부틸이 적합하다.
R이 아릴 또는 아르알킬일 경우에는, 아릴핵이 비치환될 수 있고 또는 직쇄 또는 측쇄 C1∼C5알킬(즉, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 펜틸) 또는 할로겐(즉, 염소, 불소 또는 브롬)과 같은 하나 이상의 치환기를 임의로 가질 수 있다.
바람직한 R은 수소, C1∼C10알킬, 페닐, (C1∼C5알킬) 페닐 또는 할로페닐이고, 가장 적합한 R은, 수소, C1∼C5알킬 또는 페닐이다.
일반식(Ⅰ)의 화합물은 양쪽성이기 때문에 염 및 에스테르를 형성할 수 있고, 이 염 및 에스테르도 본 발명의 일부를 형성하고 있다. 그러한 염 및 에스테르의 성질은 그것이 의약적 또는 수의약적 목적으로 사용되어야 하는 것, 즉 그것은 의약적으로 허용할 만한, 즉 그것은 염화되지 않거나, 에스테르화 지 않은 화합물과 비교하여, 그 독성이 증가되지도 그 활성이 감소되지도 말아야 고 또는 그 정가 심각하지 말아야 한다는 것외에는 그 성질에 있어 결정적인 것은 없다.
상기 염 형성을 위한 적합한 산의 예는 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산; 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 말론산, 말레이산, 말산, 푸마르산, 이타콘산, 시트라콘산 또는 숙신산과 같은 유기산 ; 및 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 나프탈렌술폰산 또는 p-톨루엔술폰산과 같은 유기술폰산을 포함한다.
언급된 화합물에 존재하는 카르복시기는 또한 적절한 염기와 염을 형성할 수도 있다. 상기 염의 예는 금속, 특히 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘염과 같은 알카리 및 알카리토금속의 염, 암모늄염, 시클로헥실아민, 디이소프로필아민 또는 트리에틸아민과 같은 유기아민과의 염, 리신 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산의 염을 포함한다.
언급된 일반식(Ⅰ)의 화합물의 적합한 에스테르의 예는 ; C1∼C6, 더 바람직하게는 C1∼C4알킬에스테르, 예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 펜틸 및 헥실에스테르 ; 벤질 p-니트로벤질 및 벤즈히드릴 에스테르와 같은 디아릴알킬에스테르를 포함하는 아르알킬 ; 알콕시 및 알킬부분이 1 내지 4 탄소를 적절히 갖으며, 특히 에톡시카르보닐메틸 및 3급-부톡시카르보닐메틸 에스테르와 같은 알콕시카르보닐메틸인 알콕시카르보닐알킬 에스테르 ; 알콕시 및 알킬부분이 1 내지 4 탄소를 적절히 갖으며, 특히 2-메톡시카르보닐옥시에틸, 2-에톡시카르보닐옥시메틸 및 2-t-부톡시카르보닐옥시에틸에스테르와 같은 알콕시카르보닐옥시알킬 에스테르 ; 프탈리딜, 치환된 프탈리딜, 펜아실, 치환된 펜아실 (즉, p-니트로펜아실) 및 (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸에스테르와 같은 다른 특별한 에스테르를 포함한다.
무레이도마이신 E 및 F와 그의 염은 스트렙토마이세스 sp, SANK 60486으로 확인되고 다음의 진균학적 성질을 갖는 스트렙토마이세스 균주를 배양하여 제조된다. 그 특성은 ISP(International Streptomyces Project)에서 지시된 다양한 배지, 또는 S. A. Waksman에 의한 ˝The Actinomycetes˝ (문헌)의 제 2 권에서 추천된 배지에서, 서술된 다른 경우의 예는 모든 경우외에는 28℃에서 배양함으로서 결정된다.
1. 형태학적 특성
일반적으로, 한천배지에서 미생물의 기저 균사는 잘 분지되고 뻗어나가고 미생물의 기균사는 간단하게 분지된다. 포자사슬은 직선에서 곡선으로 형성된다. 포자 사슬에 형성된 포자수는 대개는 10 에서 50 이고 더 많을 수도 있다. 포자들은 타원형으로 그 크기는 0.5 ∼ 0.8 ㎛ × 0.7 × 1.1 ㎛이고 부드러운 표면을 갖는다. 기균사의 윤축, 균핵, 포자낭 등의 특별한 기관은 관찰되지 않는다.
2. 여러가지 배지의 배양 특성
여러종류의 배양배지에서 14 일간 28 ℃ 에서 배양후, 성질을 표 1 에 나타내었다. 색조의 표시는 니뽄시끼사이껜뀨쇼에서 출판한 ˝ Guide to Color Standard˝(문헌)에 나타낸 색채팁 번호를 사용하여 나타내었다.
이 표에서 다음의 약자를 사용하였다 :
G : 성장 ; AM : 기균사제 ; R : 뒷면 ; SP : 가용성 염료.
[표 1a]
Figure kpo00007
[표 1b]
Figure kpo00008
[표 1c]
Figure kpo00009
3. 생리학적 성질
균주 SANK 60486 의 생리학적 성질을 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure kpo00010
＊ 배양배지1 : 효모 밀배아 한천 (ISP 2) ;
배양배지 2 : 트립톤 효모 추출액 (ISP 1) ;
배양배지 3 : 펩톤 효모 추출물 철 한천 (ISP 6) ;
배양배지 4 : 티로신 한천 (ISP 72).
프리담 고트리브(Pridham Gottlieb) 한천배지에서 28 ℃ 에서 14 일간 배양한 후 균주 SANK 60486 에 의한 탄소원의 동화성을 표 3 에 나타내었다.
[표 3]
Figure kpo00011
상기 표에서 :
+ 동화됨 ; - 동화되지 않음.
4. 세포벽 구성
균주 SANK 60486 의 세포벽을 B. Becker 등 [문헌, Applied Microbiology, 12, 421 ∼ 423 (1964)] 의 방법에 따라 조사하였다. L,L - 디아미노피멜산 및 글리신이 그 균주에서 검출되었다.
균주 SANK 60486 의 동정은 ISP (International Streptomyces Project) ; 문헌, Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology 제 8 판 ; S. A. Waksman이 출판한 ˝The Actinomycetes˝ 및 스트렙토마이세테스에 관한 다른 최근 문헌에 따라 수행하였다.
상기 자료를 근거로, 균주를 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens)의 균주로 확인하였고 여기에서는 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 SANK 60486(BIOKOKEN JOHKI 1347 : FERM BP-1347) 로 언급하였다.
균주 SANK 60486 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 1986. 2. 4 자로 수탁번호 FERM P-8636 으로 기탁하였고 부다페스트 조약에 따라 1987. 4. 17 자로 수탁번호 FERM BP-1347 로 상기 FRI 에 재-기탁하였다.
균주 SANK 60486 은 무레이도마이신 E 및 F을 제조한다고 확인되었다. 그러나, 잘 알려진 바와 같이 악티노마이세테스의 일반적 범주에 속하는 미생물의 성질은 상당히 다양할 수 있고 이러한 미생물은 자연적 원인이나 인위적 조작에 의해서 쉽게 돌연변이될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 스트렙토마이세스 속으로 분류될 수 있고, 균주 SANK 60486 과 함께 무레이도 마이신 E 및 F 을 생성하는 특징적 능력을 갖는다면 어떠한 미생물이라도 사용하였다.
본 발명의 방법에서 사용된 미생물은 바람직하게는 스트렙토마이세스 플라비도비렌스종의 균주, 더 바람직하게는 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 SANK 60486(FERM BP-1347) 이다.
본 발명에 따라 무레이도 마이신 E 및 F 를 생성하는 스트렙토마이세스 속의 미생물의 배양은 악티노마이세테스 종의 배양에 통상적으로 사용되는 조건, 바람직하게는 액체 배양에서, 원하면 진탕 및 교반의 통기와 함께 수행한다. 배양을 위해 이용된 영양 배지는 완전히 통상적인 것으로 악티노마이세테스의 배양에 보통 사용되는 성분을 함유한다.
특히, 배지는 적절한 예로는 글루코오즈, 말토오즈, 슈크로오즈, 만니톨, 몰라세스, 글리세롤, 덱스트린, 전분, 대두유 및 면실유 중의 하나 이상의 동화될 수 있는 탄소원 ; 적절한 예로 대두 가루, 땅콩가루, 면실가루, 팜아민, 생선가루, 옥수수침지액, 펩톤, 육즙, 생효모, 압축효모, 효모추출물, 질산나트륨, 질산암모늄 또는 황산암모늄 중의 하나 이상의 동화될 수 있는 질소원 ; 염화나트륨, 인산염, 탄산칼슘 및 미량 금속염과 같은 하나 이상의 무기염을 함유해야 한다. 배양이 액체 배지에서 효과적일때는 거품억제제(예컨대, 실리콘유, 식물유 또는 적절한 계면활성제)을 배지에 더 가하는 것이 일반적으로 바람직하다.
배양은 실질적으로 중성 pH 값에서 20 에서 37 ℃의 온도, 더 바람직하게는 약 22 ℃에서 적절히 수행한다.
배양이 진행됨에 따른, 무레이도마이신의 생성은 항생제의 생성(그것이 미생물 배양에 의해 생성될 경우)을 감지하기 위한 복잡하지 않는 다양한 종래의 미생물학적 분석 기술로 감지될 수 있다. 적절한 기술로, 예를 들면, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeroginosa) 균주 SANK 70579 를 시험균으로 사용한 종이 디스크 - 한천 확산분석(paper disc-agar diffusion assay) (예를 들면, 도요가가꾸 산교사에서 제조된 약 8㎜ 직경의 종이 디스크를 이용함)을 들 수 있다.
보통 생성된 무레이도마이신의 양은 배양이 72 ∼ 96 시간동안 진행후 최고에 이르면, 최고조의 시간이 지나기전에 배양배지로부터 무레이도마이신을 분리하는 것이 확실히 바람직하다. 그러나 이 기간은 배양조건 및 기술에 따라 다양하지만 더 짧거나 더 긴 기간이 상황에 따라서는 적합할 수 있다. 올바른 배양시간은 적절한 감지기술 즉, 상기 언급한 바와 같은 보통의 실험에 의한 경우라면 쉽게 설정될 수 있다.
무레이도마이신 E 및 F 는 주로 배양액의 액체 부분으로부터 방출되므로 균사체를 포함한 고체물질을 예컨대 여과(바람직하게는 규조토와 같은 여과 보조물을 사용하여) 및 원심분리로 제거하여 회수할 수 있다. 그런 다음 분리된 액체부분으로부터 종래의 기술에 의해 회수될 수 있고 원하면 각각의 정제 및/또는 분리할 수 있다.
항생제, 무레이도마이신 E 및 F 는 그들의 물리-화학적 성질을 이용하여 분리, 수집 및 정제될 수 있다. 예컨대, 그 적절한 방법에는 용매로 추출 : 도웩스 (Dowex) SBR-P (Dow Chemical Co.) 등의 음이온 교환수지 또는 도웩스 50 W (Dow Chemical Co.) IRC-50, CG-50 (Rohm Haas 사) 등의 양이온 교환수지 등의 수지를 통한 이온 - 교환 ; 흡수제로 활성탄, 암벌리트(Amberlite)XAD-2, XAD-4 또는 XAD-7 (Rohm Haas 사) 또는 디아이온 HP 10, HP 20, CHP 20P 또는 HP 50 (미쓰비시 화학 산업주식회사) 등의 비-이온성 흡수 수지를 통과시키는 크로마토그래피 ; 및 실리카겔 또는 알루미나를 통과시키는 크로마토그래피를 들 수 있다. 또한, 준항생제의 분리, 수집 및 정제는 원한다면 어떤 순서로든 조합할 수도 있고, 반복할 수 있는 다음의 조작을 하나 이상 사용함으로서 수행할 수 있다 : 아비셀(Avicel) (아사히 화학산업주식회사) 또는 세파덱스 (Sephadex) LH-20 (Pharmacia 사) 등의 셀룰로오즈상의 분배 컬럼 크로마토그래피 ; 세파덱스 G-10, G-25, G-50 또는 G-100 (Pharmacia 사) 또는 토요페알 (Toyopearl) HW040 (도요소다공업주식회사) ; 결정화 ; 및 재결정 (˝Dowex˝, ˝Amberlite˝, ˝Diaion˝, ˝Avicel˝, ˝Sephadex˝ 및 ˝Toyopearl˝은 모두 상품명이다).
배양 조건에 따라 무레이도마이신 E 및 F는 배양으로부터 균사체로 존재할 수 있으므로 종래의 기술에 의해 그 형태로 추출될 수 있다. 예를 들면, 친수성 유기용매 (알콜 또는 아세톤과 같은)으로 추출한 다음 용매를 추출물로부터 제거하여 수성매질에 용해되는 잔여물로 남길 수 있다. 무레이도마이신은 생성된 용액으로부터 추출하고 상기에서 언급한 바와 같이 정제될 수 있다.
무레이도마이신은 크로마토그래피에 의해 바람직하게 각각 분리된다.
무레이도마이신 E 또는 F 를 염의 형태로 분리될 때, 그것은 이온-교환수지 또는 역상 크로마토그래피를 위한 흡착제를 이용하는 종래의 수단으로 탈염화된 화합물로 전환될 수 있다. 마찬가지로, 탈염화된 화합물은 상기 기록된 것과 같은 적절한 산 또는 적절한 염기 (즉, 수산화나트륨 또는 칼륨, 탄산나트륨 또는 칼슘과 같은 금속수산화물 또는 금속 탄산염)로 처리하는 종래의 수단에 의해 조염화 될 수 있다. 에스테르는 산촉매하에 적절한 알콜과 반응시키는 종래의 에스테르화 방법으로 제조될 수 있다.
그렇게 수득된 무레이도마이신 E 및 F는 아래 기술된 물리적 화학적 성질을 갖는다.
무레이도 마이신 E는 다음의 물리-화학적 성질을 갖는다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 백색 분말 ;
2) 고유 광회전도 :
[α]25 D= 34.2
Figure kpo00012
(c 1.17, 50% v/v 수성 메탄올) ;
3) 원소분석 : C, 48.57% ; H, 5.35% ; N, 11.34% ;
S, 3.00% (수화물로 측정함) ;
4) 분자량 ; 852 [고해상도 질량 스펙트럼 FAB MS : 853.3213 (QM+)].
(FAB MS는 고속원자 충격 질량 분광법이다.)
5) 분자식 : C39H48N8O12S ;
6) 산가수분해하여 생성되는 산물 : 우라실 ; m - 티로신 ; 2-아미노-3-N-메틸아미노부틸산 ; 8-히드록시-1,2,3,4-테트라히드로-3-이소퀴놀린 카르복실산 ;
7) 자외선 흡수 스펙트럼, λmaxnm(E1% 1cm) :
중성수에서 258nm (252) ; 0.01 N 염산수용액에서
258nm (247) ; 0.01 N 수산화나트륨 수용액에서
240nm (432) ; 265nm (235, 쇼울더) 및 295nm (80, 쇼울더) ;
스펙트럼은 제 1 도에 나타내었다.
8) 적외선 흡수 스펙트럼(KBr) νmaxcm-1:
KBr 디스크에서 측정된 스펙트럼은 제 2 도에 나타내었다.
9) 핵자기 공명 스펙트럼, δppm :
스텍트럼(270MHz)은 중수에서, 외부표준 물질로 테트라메틸실란을 사용하여 측정하여 제 3 도에 나타내었다(형태이성질체를 포함하여) ;
10) 용해도 : 물과 메탄올에 용해되고 아세톤에는 다소용해되고 에틸아세테이트, 클로로포름 및 벤젠에는 불용성이다 ;
11) 색반응 : 닌히드린, 황산, 요오드, 염화철(Ⅲ) 및 배이어(Baeyer) 반응에는 양성 ;
12) 박층크로마토그래피 : Rf 치 : 0.39 : 흡착제 ; 실리카겔 판(Merck, Kieselgel 60 F254); 전개용매 : 부탄올, 프로판올, 물의 4 : 2 : 1 용적비의 혼합물 ;
13) 고성능 액체 크로마토그래피 :
컬럼 : 아쿠아실(Aquasil) SS 372-N (Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 클로로포름, 이소프로판올, 메탄올, 물의 200 : 100 : 100 : 40 용적비의 혼합물; 유속 : 1.0ml/분 ;
유보시간 : 4.7 분.
무레이도 마이신 F는 다음의 물리 - 화학적 성질을 갖는다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 백색분말 ;
2) 고유 광회전도 : [α]25 D-40.3
Figure kpo00013
(c 1.05, 50% v/v 수성 메탄올) ;
3) 원소분석 : C, 50.40% ; H, 5.53% ; N, 11.20% ; S, 2.92% (수화물로 측정함) ;
4) 분자량 ; 852 [고해상도 질량 스펙트럼 FAB MS : 853.3180 (QM+)].
5) 분자식 : C36H48N8O12S :
6) 산가수분해하여 생성되는 산물 : 우라실 ; m - 티로신 ; 2-아미노-3-N-메틸아미노부틸산 ; 6-히드록시-1,2,3,4-테트라히드로-3-이소퀴놀린 카르복실산 ;
7) 자외선 흡수 스펙트럼, λmaxnm(E1% 1cm) :
중성수에서 258nm (232) ; 0.01 N 염산수용액에서
258nm (232) ; 0.01 N 수산화나트륨 수용액에서 240nm (352) ; 265nm (200, 쇼울더) 및 295nm (64, 쇼울더) ; 스펙트럼은 제 4 도에 나타내었다 ;
8) 적외선 흡수 스펙트럼(KBr) νmaxcm-1
KBr 디스크에서 측정된 스펙트럼은 제 5 도에 나타내었다 ;
9) 핵자기 공명 스펙트럼, δppm :
스텍트럼(270MHz)은 중수에서, 외부표준 물질로 테트라메틸실란을 사용하여 측정하여 제 6 도에 나타내었다(형태 이성질체를 포함하여) ;
10) 용해도 : 물과 메탄올에 용해되고, 아세톤에는 다소 용해되고, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 벤젠에는 불용성이다 ;
11) 색반응 : 닌히드린, 황산, 요오드, 염화철(Ⅲ) 및 배이어(Baeyer) 반응에 양성이다 ;
12) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.34 ; 흡착제 : 실리카겔 판(Merck, Kieselgel 60 F254); 전개용매 : 부탄올, 프로판올, 물이 4 : 2 : 1의 용적비인 혼합물 ;
13) 고성능 액체 크로마토그래피 :
컬럼 : 아쿠아실(Aquasil) SS 372-N (Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 클로로포름, 이소프로판올, 메탄올, 물이 200 : 100 : 100 : 40의 용적비인 혼합물 유속 : 1.0ml/분 ; 유보시간 : 5.3분.
상기 일반식(Ⅰ)로 나타낸 무레이도마이신 E 및 F와 그의 유도체 뿐 아니라 그들의 염 및 에스테르는 다음 일반식의 무레이도마이신 A ; 또는 그들의 염 및 에스테르와
Figure kpo00014
다음 식의 알데히드와 반응시키고
R-CHO(Ⅳ)
(상기 식 중 R은 상기에 정의된 바와 같다)
그렇게 수득된 화합물을 임의로 염화, 탈염화 또는 에스테르화하여 양자택일로 수득될 수 있다.
이 방법은 1 몰의 무레이도마이신 A 또는 그의 염이나 에스테를 상기 일반식(Ⅳ)의 알데히드의 약 3 내지 6몰과 반응시켜 수행될 수 있다. 반응은 불활성용매 중에서 유리하게 수행된다. 용매가 반응 과정을 간섭하지 않는 한 용매선택에 있어 특별한 제한은 없으며 적합한 예로는 물, 테트라히드로푸란 및 디옥산과 같은 에테르 및 물과 그러한 유기용매의 혼합물이다. 반응온도는 보통 5 ∼ 100℃ 범위내로, 바람직하게는 실온에서 80℃ 사이가 된다. 반응시간은 반응물 및 선택된 온도에 따르지만 대개는 1 내지 24시간의 범위내이다.
반응 완료시, 원하는 생성물은, 이미 앞서 언급된 바와 동일한 미생물 발효 과정에 의해 생성된 산물을 위한 기술로 분리 및 정제될 수 있다. 원하면, 생성물을 이미 언급한 바와 같이 염화, 탈염화 또는 에스테르화할 수도 있다.
상기 반응에서 출발물질로 사용된, 무레이도마이신 A는, 무레이도마이신 E 및 F의 제조를 위해 본 발명에서 사용된 것과 동일한 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 SANK 60486을 배양하여 수득될 수 있고 그의 제조, 분리 및 정제는 우리의 앞선 1987. 5. 18자, 미합중국 특허출원 제 51,665 호에 보다 상세히 기술되었다.
무레이도 마이신 A는 다음과 같은 물리-화학적 성질을 갖는다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 백색분말 :
2) 고유 광회전도 : [α]25 D-40.9
Figure kpo00015
(c 69, 50% v/v 수성 메탄올) ;
3) 원소분석 : C, 49.73% ; H, 5.65% ; N, 12.08% ; S, 3.40% (수화물로 측정함) ;
4) 분자량 ; 840 [고해상도 질량 스펙트럼 FAB MS : 841.31798 (QM+)] (FAB MS는 고속원자 충격 질량 분광법이다.)
5) 분자식 : C36H48N8O12S :
6) 산가수분해하여 생성되는 산물 : 우라실 ; m - 티로신 ; 2-아미노-3-N-메틸아미노부틸산 ;
7) 자외선 흡수 스펙트럼, λmaxnm(E1% 1cm) :
중성수에서 260nm (348) ; 0.01 N 염산 수용액에서 258nm (358) ; 0.01 N 수산화나트륨 수용액에서 265nm (330, 쇼울더) 및 295nm (78, 쇼울더); 스펙트럼은 제 7a 및 7b도에 나타내었다.
8) 적외선 흡수 스펙트럼(KBr) νmaxcm-1:
KBr 디스크에서 측정된 스펙트럼을 제 8 도에 나타내었다 ;
9) 핵자기 공명 스펙트럼, δppm :
스텍트럼(400MHz)은 디메틸술폭사이드 중에서 테트라메틸실란을 외부표준 물질로 하여 측정하여 제 9도에 나타내었다 (형태 이성질체를 포함하여) ;
10) 용해도 : 물과 메탄올에 용해되고, 아세톤에 다소 용해되고, 에틸아세테이트, 클로로포름, 벤젠에서는 불용성이다.
11) 색반응 : 닌히드린, 황산, 요오드, 염화철(Ⅲ) 및 배이어(Baeyer) 반응에는 양성이다 ;
12) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.36 ; 흡착제 : 실리카겔 판(Merck, Kieselgel 60 F254); 전개용매 : 부탄올, 프로판올, 물이 4 : 2 : 1의 용적비인 혼합물 ;
13) 고성능 액체 크로마토그래피 :
컬럼 : 아쿠아실 SS 372-N (Senshu Kagaku Co.) ; 전개용매 : 클로로포름, 이소프로판올, 메탄올 및 물의 200 : 100 : 100 : 40의 용적비인 혼합물; 유보시간 : 3.92분.
여러가지 그람-양성 및 그람-음성균에 대한 무레이도 마이신 E 및 F의 최소 억제 농도(MIC)는 물러-힌톤(Mueller-Hintion) 한천배지(디프코사)를 사용하여 한천 희석법에 의해 정량하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure kpo00016
또한 시험은 메틸무레이도마이신 E 및 F와 페닐무레이도마이신 E 및 F가 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) SANK 70579의 성장을 억제함을 나타내고 있다.
상기의 치료에서, 무레이도 마이신 E, F 및 그들의 유도체는 그람-음성균, 특히 슈도모나스 속의 균에 대해 활성을 보인다.
무레이도 마이신 E 또는 F 또는 그의 유도체 한가지를 400㎎/㎏으로 정맥내 주사된 생쥐에서 독성은 관찰되지 않았다.
상기 결과들로부터 무레이도 마이신 E 및 F와 그의 유도체들은 균의 감염으로 야기되는 여러가지 질병에 대한 항생제로 사용될 수 있음을 보인다. 투여경로는 광범위하게 다양하게 비경구(즉, 직장, 정맥 또는 근육내 주사 또는 좌제로) 또는 경구(정제, 캅슐, 분말 또는 과립의 형태로 투여될 수 있을 경우)일 수 있다. 용량은 물론 치료될 질병의 성질, 연령, 환자의 상태 및 체중, 투여경로 및 시간에 따라 다양할 수 있으나, 성인 환자의 경우 1.0 내지 10g의 1일 용량이 바람직하고 일회용 혹은 분할하여 투여될 수 있다.
상기 일반식(Ⅱ)의 무레이도 마이신 AP, BP, CP, DP, EP 및 FP와 그들의 염은 이어 상응하는 무레이도 마이신 A, B, C, D, E 또는 F 및 그들의 염을 가수분해하고, 이에 그렇게 수득된 생성물을 사용시 임의로 염화 혹은 탈염화하여 수득될 수 있다. 가수분해는 출발물질을 임의적으로 용해 존재하에 적합한 산, 염기 혹은 프로테아제로 처리하여 이를 수 있다.
이미 알려진 유사한 가수분해 반응에서 사용되는 통상적인 산, 염기 및 프로테아제를 특별한 제한없이 상기 제조에서 사용될 수 있다. 그 예로, 염산, 황산, 브롬산과 같은 무기산 : 또는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화바륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨 또는 탄산칼슘과 같은 알칼리 또는 알칼리토금속의 수산화물 또는 탄산화물이 사용될 수 있고 : 프로테아제로는 펩신, 카텝신, 프로나제 또는 키노트립신을 사용하는 것이 바람직하고, 특히 펩신이 바람직하다. 가수분해를 용매 존재하에 수행하여 보다 온화하게 진행하는 것이 바람직하다. 용매가 반응에 역작용을 하지 않는한 용매 선택에 있어 특별한 제한은 없고 그 적합한 예는 물, 수성 메탄올 및 메탄올 또는 에탄올과 같은 알콜과 테트라히드로푸란 또는 디옥산과 같은 에테르 또는 디메틸술폭사이드와 같은 술폭사이드의 혼합물이 포함된다. 만일, 가수분해가 산 또는 염기로 이루어질때, 반응온도는 특히 결정적이지 않다. 그 예로 반응은 실온 또는 용매(한가지일 경우)의 환류온도에서 수행될 수 있다. 한편, 가수분해가 프로테아제로 이루어질때는 종래의 효소반응 조건에서 이루어져야 한다 ; 그 예로는 펩신의 경우 반응은 묽은 염산으로 pH 2.5로 조정된 반응용매 중에서 10 내지 60℃의 온도, 더 바람직하게는 약 37℃로 10 시간 내지 3일간 반응을 수행할 수 있다.
반응 완료후, 원하는 화합물은 그것의 물리-화학적 성질을 이용한 종래의 기술로 분리, 정제할 수 있다(무레이도마이신 AP, BP, CP, DP, EP 및 FP의 물리-화학적 성질은 각각 아래 실시예 9에서 14까지에서 설명하였다). 예를 들어, 적합한 방법예는 : 용매 추출 : 도웩스 SBR-P(Dow Chemical Co.)와 같은 음이온 교환수지 또는 도웩스 50W (Dow Chemical Co.) 또는 IRC-50, CG-50 (Rohm Haas Co.)와 같은 양이온 교환수지 등의 수지를 통한 이온 - 교환 : 흡수제로 활성탄 또는 암벌리트 XAD-2, XAD-4 또는 XAD-7 (Rohm Haas Co.) 또는 디아이온 HP 10, HP 20, CHP 20P 또는 HP 50 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.)와 같은 비-이온성 흡수 수지를 통한 크로마토그래피 ; 및 실리카겔 또는 알루미나를 통한 크로마토그래피를 포함한다. 더욱이, 대사물의 분리, 수집 및 정제는, 원한다면 다음의 조작의 하나 이상을 어떤 순서로든 조합하거나 반복하여 수행될 수 있다. : 아비셀(Asahi Chemical Industries, Ltd.) 또는 세파덱스 LH-20 (Pharmacia Co.)와 같은 셀룰로오즈상의 분배 컬럼크로마토그래피 : 세파덱스 G-10, G-25, G-50 또는 G-100 (Pharmacia Co.) 또는 토요페알 HW-40 (Toyo Soda 공업주식회사) 등을 이용한 겔 여과; 결정화 ; 및 재결정 (˝Dowex˝, ˝Amberlite˝, ˝Diaion˝, ˝Avicel˝, ˝Sephadex˝ 및 ˝Toyopearl˝은 모두 상품명이다).
무레이도마이신 AP, BP, CP, DP, EP 또는 FP가 염의 형태로 분리되면 그것은 이온 교환수지의 사용 또는 역상 크로마토그래피를 위한 흡착제를 사용한 종래의 방법에 의해 탈염화된 화합물로 전환될 수 있다. 마찬가지로, 탈염화된 화합물은 종래의 방법, 예컨대, 상기에 기록된 것과 같은 적절한 산이나 적절한 염기(즉, 수산화나트륨 또는 칼륨 혹은 탄산나트륨 또는 칼슘과 같은 수산화금속염)으로 처리하여 염화될 수 있다.
상기의 반응에서 무레이도마이신 AP에서 DP까지 제조를 위해 출발물질로 사용된 무레이도마이신 A에서 D의 생성, 분리, 정제 및 특성에 관해서는 본 발명자들이 앞서 언급한 1987. 5. 18자 미합중국 특허출원 제 51,665호에서 기술되어 있다.
무레이도마이신 AP에서 FP까지는, 그 자체로 종래 반응 과정을 이용하여 다른 무레이도마이신을 화학합성하기 위한 출발물질로 사용될 수 있다. 그 예로 아래에 기술되고 반응도식 1에 체계적으로 나타난 과정을 무레이도마이신 AP로부터 무레이도마이신 C를 합성하는데 이용될 수 있다.
디시클로헥실카르보디이미드(DCC)는 교반하, 얼음-냉각하에 N-카르보벤족시-글리시(CBZ-glycine) 용액에 가하고, 무레이도마이신 AP의 용액은 생성된 혼합물에 적가한다. 반응을 얼음 - 냉각하여 약 3 내지 4시간 동안 진행하게 한다. 여과후, 용매를 증류 제거하고 잔여물을 종래의 방법, 즉 액체 크로마토그래피 또는 TCL로 정제하여 반응도식 1의 일반식(Ⅴ)을 갖는 글리신 유도체를 수득한다. 일반식(Ⅵ)의 우레이도 유도체는 종래의 방법에 의해 메치오닌 및 m-티로신으로부터 제조하여, 적합한 유기용매에 용해시켰다. DCC를 교반, 얼음 냉각하여 이 용액에 가한 다음 글리신 유도체(Ⅴ)의 용액을 생성된 혼합물에 가한다. 반응을 얼음 냉각하에 약 3 내지 4시간 진행하게 한다. 여과후, 용매를 증류 제거한다(모든 진행과정중, 에틸 아세테이트 또는 아세토니트릴과 같은 적당한 유기 용매가 용액을 보충하기 위해 사용될 수 있다).
생성된 잔여물을 적합한 유기 용매(즉, 80% 수성메탄올)에 용해시키고 적합한 촉매(즉, 10% 탄소중 팔라디움)로 약 2 내지 3시간 동안 촉매 환원시킨다. 환원 완결후 촉매를 여과하여 제거하고 유기 용매를 증류 제거한다. 수층을 동결 건조하여 분말 형태의 무레이도마이신 C를 수득한다.
반응도 식에서 ˝CBZ˝은 N-카르보벤족시를 나타낸다.
[반응도 식 Ⅰ]
Figure kpo00017
발명은 다음 실시예로서 더 설명될 것이다.
[실시예 1]
발효에 의한 무레이도마이신 E, F 및 A
스트렙토마이세스 플라비도비렌스 SANK 60486을 한번의 플라티늄 루프만큼을, 다음 조성물의 배지 A를 80ml 함유한 500ml 삼각 플라스크에 접종한다(백분율은 중량백분율이다).
배지 A
글루코오즈 3 %
압축 효모 1 %
대두분3 %
탄산칼슘0.4 %
황상마그네슘 7 수화물 0.2 %
거품억제제
(Nissan Disfoam CB-442) 0.01 %
물나머지
(멸균전 pH 7.2)
미생물은 22℃에서 84시간동안 회전 진탕기를 사용하여 220 r .p .m에서 배양한다.
생성된 종배양 25ml을 조성이 위와 같은 배지 A가 500ml 씩 함유된 네개의 2 - 리터 삼각플라스크에 각각 접종한다. 그런 다음, 미생물을 22℃에서 24시간 동안, 회전 진탕기를 이용하여 220 r .p .m에서 배양한다. 생성된 배양액을 합한다. 이 배양액 750ml을 배지 A가 15리터씩 함유된 두개의 30리터 자 발효기에 각각 접종한 다음 분당 15리터의 속도로 통기하고 150 r .p .m으로 교반하면서 미생물을 22℃에서 96시간동안 배양한다.
시간이 끝날 무렵, 배양액의 두 배취를 합한다. 셀리트(Celite) 545(Johns-Manville 사, New Jersey, U.S.A의 제품의 상품명으로 등록된) 여과 보조기를 가하여 혼합물을 여과하여 여액 30리터를 수득한다. 이 여액을 크로마토그래피칼럼내의 3리터의 암벌리트 XAD-2에 흡착시킨다. 칼럼을 15리터의 탈이온수 그 다음, 12리터의 15% v/v으로 메탄올을 함유한 물의 순으로 세척한 다음, 40% v/v으로 메탄올을 함유한 물 15리터로 용출시킨다. 그런 다음 활성 성분을 함유한 분획으로부터 감압 증류하여 메탄올을 제거한 후 잔여 용액을 동결건조하여 17.4g의 조 생성물을 수득한다.
상기의 조 생성물 17g을 3리터의 탈이온수에 용해시키고, 용액을, 800ml 암벌리트 CG-50 (H+)를 함유한 칼럼을 통과시켜 활성 성분을 흡착시킨다. 활성 성분을 0.5M 암모늄 수용액으로 칼럼으로부터 용출시킨다. 용출된 활성 분획(4 리터)를 모으고 감압하에서 증발시켜 1.0 리터 용적으로 농축시킨다. 농축액(1.0 리터)를 0.1M의 중탄산 암모늄 수용액으로 미리 - 평형된 DE-52 이온 교환제(Whatman Ltd.) 500ml을 통과시키면 활성성분이 칼럼에 흡착된다. 칼럼을 0.2M 중탄산 암모늄 수용액으로 용출시킨다. 활성 성분을 함유한 분획(1 리터)을 모으고 200ml의 디아이온 HP 20(Mitsubishi 화학 산업주식회사)을 함유한 칼럼에 흡착시킨 후 칼럼을 50% v/v 수용성 아세톤 500ml로 용출시켜 활성성분을 수득한다. 활성성분을 함유하는 분획을 감압하에서 증발시켜 농축시키고 동결 건조하여 무레이도마이신 E, F 및 A를 함유하는 조 분말 생성물 15g을 수득한다.
상기 조 분말 14g을 500ml의 탈이온수에 녹이고 활성 성분을, 0.05M 중탄산 암모늄 수용액으로 미리-평형된 DE-52 500ml을 함유하는 칼럼에 흡착시킨다. 칼럼을 0.05M의 중탄산암모늄 수용액으로 씻고, 0.1M의 중탄산나트륨 수용액으로 용출시켜 각각 20ml씩의 용출액을 함유하는 분획을 얻는다. 활성 성분을 함유하는 분획 80부터 130까지를 모으고, 그것을 탈이온하기 위해 HP 20이 함유된 칼럼에 흡착시킨다. 탈이온된 용출액을 감압에서 증발시켜 농축하고 잔사를 동결 건조하여 3.1g의 부분적 정제된 분말을 수득한다.
상기의 부분 정제된 분말 3.0g을 실리카겔 100g이 함유된 칼럼을 통과시키고, 부탄올, 프로판올 및 물(8 : 4 : 1)의 혼합물로 용출시켜 각각 용출액 20ml을 함유하는 분획을 얻는 칼럼 크로마토그래피를 한다. 분획 13에서 70까지를 모아 물과 섞고 감압하에 농축하고 동결 건조하여 항생제 무레이도마이신 E, F 및 A를 함유하는 조 분말 생성물 320㎎을 수득한다.
그렇게 생성된 조 분말 300㎎을 30% v/v 수성 메탄올에 용해시킨 용액을 토요페알 HW-40 1000ml을 함유하는 칼럼에 흡착시키고 칼럼을 30% v/v 수성 메탄올로 용출시켜 각각 10ml의 용출액을 함유하는 분획들을 수득한다. 분획 95에서 105까지를 활성 분획으로 모으고 이를 10ml의 암벌리트 CG-50 (H+형)을 함유한 칼럼에 흡착시키고 그런 다음 0.5M 암모늄 수용액으로 용출시킨다. 활성 성분을 함유하는 분획을 모아 감압하에 증발하여 농축하고, 동결 건조하여 상기 설명된 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 E 15㎎을 수득한다.
용출 분획 80에서 90까지 그리고 50에서 70까지를 각각 유사한 처리를 하여 각각 상기 설명된 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 F 32㎎과 24㎎의 무레이도마이신 A를 수득한다.
[실시예 2]
무레이도마이신 A로부터 무레이도마이신 E 및 F
270㎎의 무레이도마이신 A를 60ml의 탈이온수에 용해시키고 300㎕의 30% 수성 포름알데히드를 용액에 가하여 생성된 혼합물을 반응을 완결시키기 위하여 하룻밤 방치한다.
반응 혼합물을 1500ml의 토요페알 칼럼에 흡착시키고 30% 수성 메탄올로 용출하여 각각 15ml씩의 용출액을 함유한 분획을 수득한다. 활성성분을 함유한 분획 81부터 88까지를 모으고 감압하에 증류하여 농축하고 동결 건조하여 상기에서 설명한 바와 같은 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 F를 65㎎ 수득한다.
분획 92부터 100까지를 유사하게 처리하여 상기에서 설명한 바와 같은 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 E를 64㎎ 수득한다.
[실시예 3]
무레이도마이신 A로부터 무레이도마이신 E 및 F
200㎎의 무레이도마이신 A를 50ml의 탈이온수에 용해시키고 500㎕의 아세트알데히드를 용액에 가하여 생성된 혼합물을 반응을 완결시키기 위하여 70℃에서 3시간 동안 교반한다.
반응 혼합물을 1500ml의 토요페알 칼럼에 흡착시키고 30% 수성 메탄올로 용출하여 각각 15ml씩의 용출액을 함유한 분획을 수득한다. 활성성분을 함유한 분획 85부터 90까지를 모으고 감압하에 증류하여 농축하고 동결 건조하여 상기에서 설명한 바와 같은 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 F를 30㎎ 수득한다.
분획 93부터 98까지를 유사하게 처리하여 상기에서 설명한 바와 같은 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 E를 27㎎ 수득한다.
메틸무레이도마이신 E
Figure kpo00018
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성 ;
2) 분자량 : 866 ;
3) 분자식 : C40H50N8O12S ;
4) 핵자기공명 스펙트럼, δppm : 스펙트럼(270MHz)은 테트라메틸실란을 외부표준 물질로 하여 중수중에서 측정하여 제 10 도에 나타내었다(형태 이성질체도 포함하여) ;
5) 박층 크로마트그래피 : Rf 치 : 0.27 ;
흡착제 : 실리카겔 판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : 부탄올, 프로판올 및 물의 4 : 2 : 1 : 용적비의 혼합물 ;
6) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : 아쿠아실 SS 372-N (Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 클로로포롬, 이소프로판올, 메탄올 및 물이 200 : 100 : 100 : 40 용적비의 혼합물 ; 유속 : 1.0ml/분 ; 유보시간 : 4.5분.
메틸무레이도마이신 F
Figure kpo00019
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성 ;
2) 분자량 : 866 ;
3) 분자식 : C40H50N8O12S ;
4) 핵자기공명 스펙트럼, δppm : 스펙트럼(270MHz)은 테트라메틸실란을 외부표준 물질로 하여 중수중에서 측정하여 제 11 도에 나타내었다(형태 이성질체도 포함하여) ;
5) 박층 크로마트그래피 : Rf 치 : 0.27 ;
흡착제 : 실리카겔 판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : 부탄올, 프로판올 및 물의 4 : 2 : 1 : 용적비의 혼합물 ;
6) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : 아쿠아실 SS 372-N (Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 클로로포롬, 이소프로판올, 메탄올 및 물이 200 : 100 : 100 : 40 용적비의 혼합물 ; 유속 : 1.0ml/분 ; 유보시간 : 5.2분.
[실시예 4]
무레이도마이신 A로부터 무레이도마이신 E 및 F
200㎎의 무레이도마이신 A를 50ml의 탈이온수에 용해시키고 500㎕의 벤즈알데히드를 용액에 가하여 생성된 혼합물을 반응을 완결시키기 위하여 70℃에서 3시간 동안 교반한다.
반응 혼합물을 1500ml의 토요페알 칼럼에 흡착시키고 30% 수성 메탄올로 용출하여 각각 15ml씩의 용출액을 함유한 분획을 수득한다. 활성성분을 함유한 분획 91부터 98까지를 모으고 감압하에 증류하여 농축하고 동결 건조하여 상기에서 설명한 바와 같은 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 F를 15㎎ 수득한다.
분획 101부터 106까지를 유사하게 처리하여 상기에서 설명한 바와 같은 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 E을 8㎎ 수득한다.
페닐무레이도마이신 E
Figure kpo00020
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성 ;
2) 분자량 : 928 ;
3) 분자식 : C45H52N8O12S ;
페닐무레이도마이신 F
Figure kpo00021
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성 ;
2) 분자량 : 928 ;
3) 분자식 : C45H52N8O12S ;
[실시예 5]
경구투여를 위한 무레이도마이신 E 캅슐
다음 분말을 혼합한다 :
무레이도마이신 E100 ㎎
락토오즈 100 ㎎
옥수수 전분148.5 ㎎
마그네슘 스테아레이트 1.5 ㎎
총350 ㎎
그리고, 30 - 메쉬 체(Tyler 기준)을 통과시킨다. 혼합물(350 ㎎)을 젤라틴 캅슐 제 2 호에 채워 봉하여 소정의 캅슐을 수득한다.
[실시예 6]
경구투여를 위한 무레이도마이신 F 캅슐
다음 분말을 혼합한다 :
무레이도마이신 F100 ㎎
락토오즈 100 ㎎
옥수수 전분148.5 ㎎
마그네슘 스테아레이트 1.5 ㎎
총350 ㎎
그리고, 30 - 메쉬 체(Tyler 기준)을 통과시킨다. 혼합물(350 ㎎)을 젤라틴 캅슐 제 2 호에 채워 봉하여 소정의 캅슐을 수득한다.
[실시예 7]
무레이도마이신 E 주사
1.0 g의 무레이도마이신 E를 5.0 ml의 1/15M 인산 완충액(pH 6.9)에 용해시키고 용액을 5 ml의 앰플에 채워 넣는다. 앰플을 종래 방법으로 멸균하여 소정의 주사액을 수득한다.
[실시예 8]
무레이도마이신 F 주사
1.0 g의 무레이도마이신 F를 5.0 ml의 1/15M 인산 완충액에 용해시키고 용액을 5 ml의 앰플에 채워 넣는다. 앰플을 종래 방법으로 멸균하여 소정의 주사액을 수득한다.
[실시예 9]
무레이도마이신 A로부터 무레이도마이신 AP
1.00 ㎎의 무레이도마이신 A를 1N의 염산용액으로 pH 2.5로 조정된 탈이온수 50 ml 및 200 ㎎의 펩신(Boehringer Mannheim Co.)을 용액에 가하여 생성된 혼합물을 반응을 완결시키기 위하여 37℃에서 하룻밤 교반한다.
반응 혼합물을 1N 수산화나트륨으로 pH 5.0이 되게 조정한 다음 70 ml의 디아이온 CHP 20P 수지(Mitsubish 화학산업 주식회사)의 칼럼에 흡착시키고 칼럼을 350 ml의 탈이온수 및 210 ml의 0.1 % 트리플루오로아세트산으로 연이어 용출시킨다. 용출액을 농축시키고 동결 건조하여 다음의 물리 - 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 AP 34 ㎎을 수득한다 ;
1) 특성 및 형태 : 양폭성, 수용성, 무색 분말 ;
2) 분자량 : 502 ;
3) 분자식 : C23H30N6O7;
4) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.13 ;
흡착제 : 실리카겔판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : n - 부탄올, 아세트산 및 물의 4 : 2 : 1 : 용적비의 혼합물;
5) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : ODS H2151(Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 5% 아세토니트릴 - 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 ;
유속 : 1.0 ml/분 ; 유보시간 : 8.3 분.
[실시예 10]
무레이도마이신 B로부터 무레이도마이신 BP
실시예 9에 기술된 과정을 반복하나 100 ㎎의 무레이도마이신 B와 펩신 200 ㎎을 24시간 동안 반응하여 다음의 물리 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 BP을 15 ㎎ 수득한다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 무색분말 ;
2) 분자량 : 504 ;
3) 분자식 : C23H32N6O7;
4) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.13 ;
흡착제 : 실리카겔판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : n - 부탄올, 아세트산 및 물의 4 : 1 : 2 : 용적비의 혼합물 ;
5) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : ODS H2151(Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 5% 아세토니트릴 - 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 ;
유속 : 1.0 ml/분 ; 유보시간 : 8.1 분.
[실시예 11]
무레이도마이신 C로부터 무레이도마이신 CP
실시예 9에 기술된 과정을 반복하나 100 ㎎의 무레이도마이신 C와 펩신 200 ㎎을 48시간 동안 반응하여 다음의 물리 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 CP을 28 ㎎ 수득한다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 무색 분말 ;
2) 분자량 : 559 ;
3) 분자식 : C25H33N7O8;
4) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.13 ;
흡착제 : 실리카겔판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : n - 부탄올, 아세트산 및 물의 4 : 1 : 2 : 용적비의 혼합물 ;
5) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : ODS H2151(Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 5% 아세토니트릴 - 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 ;
유속 : 1.0 ml/분 ; 유보시간 : 13.6 분.
[실시예 12]
무레이도마이신 D로부터 무레이도마이신 DP
실시예 9에 기술된 과정을 반복하나 100 ㎎의 무레이도마이신 D와 펩신 200 ㎎을 48시간 동안 반응하여 다음의 물리 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 DP을 11 ㎎ 수득한다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 무색 분말 ;
2) 분자량 : 561 ;
3) 분자식 : C25H35N7O8;
4) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.13 ;
흡착제 : 실리카겔판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : n - 부탄올, 아세트산 및 물의 4 : 1 : 2 : 용적비의 혼합물 ;
5) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : ODS H2151(Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 5% 아세토니트릴 - 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 :
유속 : 1.0 ml/분 ; 유보시간 : 9.2 분.
[실시예 13]
무레이도마이신 E로부터 무레이도마이신 EP
실시예 9에 기술된 과정을 반복하나 100 ㎎의 무레이도마이신 E와 펩신 200 ㎎을 24시간 동안 반응하여 다음의 물리화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 EP을 38 ㎎ 수득한다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 무색분말 ;
2) 분자량 : 514 ;
3) 분자식 : C24H30N6O7;
4) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.13 ;
흡착제 : 실리카겔판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : n - 부탄올, 아세트산 및 물의 4 : 1 : 2 : 용적비의 혼합물 ;
5) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : ODS H2151(Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 5% 아세토니트릴 - 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 ;
유속 : 1.0 ml/분 ; 유보시간 : 10.1 분.
[실시예 14]
무레이도마이신 F로부터 무레이도마이신 FP
실시예 9에 기술된 과정을 반복하나 100 ㎎의 무레이도마이신 F와 펩신 200 ㎎을 24시간 동안 반응하여 다음의 물리 화학적 성질을 갖는 무레이도마이신 FP을 29 ㎎ 수득한다.
1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 무색분말 ;
2) 분자량 : 514 ;
3) 분자식 : C24H30N6O7;
4) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.12 ;
흡착제 : 실리카겔판(Merck, Kieselgel 60 F254) ;
전개용매 : n - 부탄올, 아세트산 및 물의 4 : 1 : 2 : 용적비의 혼합물 ;
5) 고성능 액체 크로마토그래피 :
칼럼 : ODS H2151(Senshu Kagaku Co.) ;
전개용매 : 5% 아세토니트릴 - 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 ;
유속 : 1.0 ml/분 ; 유보시간 : 5.3 분.

Claims (8)

  1. 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens) SANK 60486(BIKOKEN JOHKI 1347: FERM BP-1347)로부터 발효하여 수득되고, 다음의 물리-화학적 성질로 특징 지워지는 무레이도마이신 E로 명명된 화합물; 및 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 및 에스테르.
    1) 특징 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 백색분말;
    2) 고유 광회전도 : [α]25 D-34.2
    Figure kpo00022
    (c 1.17, 50% v/v 수성 메탄올) ;
    3) 원소분석 : C, 48.57% ; H, 5.35% ; N, 11.34% ; S, 3.00% (수화물로서 측정) ;
    4) 분자량 ; 852 [고해상도 질량 스펙트럼 FAB MS : 853.3212 (QM+)]
    (FAB MS는 고속 원자충격 질량분석법이다) ;
    5) 분자식 : C39H48N8O12S :
    6) 산 가수분해로 생성된 산물 : 우라실 ; m - 티로신 ; 2-아미노-3-N-메틸아미노부티르산 ; 8-히드로시-1,2,3,4-테트라히드로-3-미소퀴놀린 카르복실산;
    7) 자외선 흡수 스펙트럼, λmax nm(E1cm 1%) :
    중성수에서 258nm (252) ; 0.01 N 염산수용액에서 258nm (247) ; 0.01 N 수산화나트륨 수용액에서 240nm (432) , 265nm (235, 쇼울더) 및 295nm (80, 쇼울더) ; 그 스펙트럼을 제 1 도에 나타내었다.
    8) 적외선 흡수 스펙트럼(KBr) νmax cm-1:
    KBr 디스크에서 측정된 스펙트럼을 제 2 도에 나타내었다.
    9) 핵자기 공명 스펙트럼, δppm :
    스텍트럼(270MHz)은 중수에서, 외부표준물질로 테트라메틸실란을 사용하여 측정하여 제 3 도에 나타내었다 (형태 이성질체를 포함) ;
    10) 용해도 : 물과 메탄올에 용해되고, 아세톤에는 다소 용해되고 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 벤젠에는 불용성이다;
    11) 색반응 : 닌히드린, 황산, 요오드, 염화철(Ⅲ) 및 배이어(Baeyer) 반응에는 양성;
    12) 박층 크로마토그래피 : Rf 치 : 0.39 ; 흡착제 : 실리카겔 판(Merck, Kieselgel 60 F254); 전개용매 : 부탄올, 프로판올, 물의 4 : 2 : 1 용적비의 혼합물 ;
    13) 고성능 액체 크로마토그래피 :
  2. 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens) SANK 60486(BIKOKEN JOHKI 1347: FERM BP-1347)로부터 발효하여 수득되고, 다음의 물리-화학적 성질로 특징 지워지는 무레이도마이신 F로 명명된 화합물; 및 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 및 에스테르.
    1) 특성 및 형태 : 양쪽성, 수용성, 백색분말;
    2) 고유광회전도 : [α]25 D-40.3
    Figure kpo00023
    (c 1.05, 50% v/v 수성 메탄올) ;
    3) 원소분석 : C, 50.40% ; H, 5.53% ; N, 11.20% ; S, 2.92% (수화물로서 측정) ;
    4) 분자량 ; 852 [고해상도 질량 스펙트럼 FAB MS : 853.3180 (QM+)]
    (FAB MS는 고속 원자충격 질량분석법이다) ;
    5) 분자식 : C39H48N8O12S :
    6) 산 가수분해로 생성된 산물 : 우라실 ; m - 티로신 ; 2-아미노-3-N-메틸아미노부티르산 ; 6-히드록시-1,2,3,4-테트라히드로-3-이소퀴놀린 카르복실산;
    7) 자외선 흡수 스펙트럼, λmax nm(E1cm 1%) :
    중성수에서 258nm (252) ; 0.01 N 염산수용액에서 258nm (232) ; 0.01 N 수산화나트륨 수용액에서 240nm (432) , 265nm (200, 쇼울더) 및 295nm (64, 쇼울더) ; 그 스펙트럼을 제 4 도에 나타내었다.
    8) 적외선 흡수 스펙트럼(KBr) νmax cm-1:
    KBr 디스크에서 측정된 스펙트럼을 제 5 도에 나타내었다.
    9) 핵자기 공명 스펙트럼, δppm :
    스펙트럼(270MHz)은 중수에서, 외부표준물질로 테트라메틸실란을 사용하여 측정하여 제 6 도에 나타내었다 (형태 이성질체를 포함) ;
    10) 용해도 : 물과 메탄올에 용해되고, 아세톤에는 다소 용해되고 에틸 아세테이트, 클로로포름 및 벤젠에는 불용성이다;
    11) 색반응 : 닌히드린, 황산, 요오드, 염화철(Ⅲ) 및 배이어(Baeyer) 반응에는 양성;
    12) 박층크로마토그래피 : Rf 치 : 0.34 ; 흡착제 : 실리카겔 판(Merck, Kieselgel 60 F254); 전기용매 : 부탄올, 프로판올, 물의 4 : 2 : 1 용적비의 혼합물 ;
    13) 고성능 액체 크로마토그래피 :
    컬럼 : 아쿠아실 SS 372-N (Senshu Kagaku Co.); 전기용매 : 클로로포름, 이소프로판올, 메탄올, 물의 200 : 100 : 100 : 40 용적비의 혼합물; 유속 : 1.0 ml/분; 유보시간 : 5.3 분.
  3. 스텝토마이세스(Streptomyces) 속으로 무레이도마이신 E 또는 F를 생성하는 미생물을 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 무레이도마이신 E 또는 F를 분리하고, 필요하면, 그렇게 분리된 화합물을 염화, 탈염 또는 에스테르화하여 항생제 무레이도마이신 E 또는 F, 또는 그의 염 또는 에스테를 제조하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 언급된 균주가 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 (Streptomyces flavidovirens) SANK 60486(BIKOKEN JOHKI 1347: FERM BP-1347)인 방법.
  5. 제 1 항에서 정의된 무레이도마이신 E 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 에스테르를 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물로서 함유하는 약제학적 항균 조성물.
  6. 제 2 항에서 정의된 무레이도마이신 F 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 에스테르를 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물로서 함유하는 약제학적 항균 조성물.
  7. 제 1 항에서 정의된 항생제 무레이도마이신 E 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 에스테르를 사람외 동물에게 투여하여 언급한 동물의 군의 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  8. 제 2 항에서 정의된 항생제 무레이도마이신 F 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염 또는 에스테르를 사람외 동물에게 투여하여 언급한 동물의 군의 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
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