DE3880092T2

DE3880092T2 - Antibiotika der Mureidomycin-Gruppe, deren Herstellung und deren Verwendung.

Info

Publication number: DE3880092T2
Application number: DE88310822T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo C O Sankyo Com Haneishi; Masatoshi C O Sankyo Co Inukai; Fujio C O Sankyo Company Isono; Takeshi C O Sankyo C Kinoshita; Yoshiharu C O Sankyo C Sakaida; Keiko C O Sankyo Compa Shimizu
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1987-11-20
Filing date: 1988-11-16
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2008-11-17
Also published as: DE3854205D1; ES2077345T3; EP0317292A3; HK1003573A1; EP0517345A1; ES2054829T3; DE3854205T2; ATE125256T1; KR890008130A; HK1005736A1; KR0137675B1; CA1339595C; EP0317292B1; US5041423A; EP0517345B1; KR0137779B1; DE3880092D1; EP0317292A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte neue Antibiotika der Mureidomycin-Gruppe sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und eine antibakterielle Zusammensetzung, die mindestens eines von ihnen als Wirkstoff enthält.
Da sich die Resistenz gewöhnlicher pathogener Bakterien gegenüber herkömmlichen Antibiotika zunehmend etabliert, wird die Notwendigkeit von Breitbandantibiotika für die Verwendung bei der Bekämpfung solcher Bakterien ständig bedeutender. Wenn auch dieses Erfordernis, wie es auch manchmal der Fall ist, durch chemische Modifikation von existierenden Klassen von Antibiotika erfüllt wird, so führt doch die Entdeckung einer völlig neuen Klasse von Antibiotika zu aufregenden Möglichkeiten bei der Behandlung von durch pathogene Bakterien verursachten Erkrankungen.
Eine solche neue Klasse von Antibiotika mit der Bezeichnung "Mureidomycin" ist in der EP-Patentanmeldung 0 253 413 der Anmelderin, eingereicht am 18. Mai 1987, die lediglich gemäß Art. 54(3) EPÜ Stand der Technik ist, beschrieben. Dort wurde die Isolierung der ersten vier Glieder dieser Klasse, nämlich der Mureidomycine A, B, D und D, aus der Kulturbrühe beschrieben, die durch einen seinerzeit neu entdeckten Mikroorganismus, nämlich Streptomyces flavidovirens SANK 60486 (BIKOKEN JOHKI 1347; FERM BP-1347), produziert werden.
Es wurden nun zwei neue Glieder dieser Klasse von Antibiotika gefunden, die hier "Mureidomycine E und F" genannt werden, zusammen mit ihren Salzen und Estern und bestimmten anderen Derivaten, die insbesondere gegen gramnegative Bakterien, ganz besonders gegen Stämme des Genus Pseudomononas, wirksam sind. Die Mureidomycine E und F können auch aus der Kulturbrühe des Streptomyces-Stammes SANK 60486 isoliert werden. Alternativ können diese neuen Mureidomycine ebenso wie bestimmte Derivate von diesen hergestellt werden, indem man Mureidomycin A einer chemischen Umsetzung unterzieht.
Die hier genannten Mureidomycine A bis F können durch die folgende planare Strukturformel
dargestellt werden, in welcher
für Mureidomycin A R¹ 2,4-Dioxopyrimidin-1-yl und R² α-Amino- 3-hydroxyphenethyl bedeutet;
für Mureidomycin B R¹ 2,4-Dioxodihydropyrimidin-1-yl und R² α- Amino-3-hydroxyphenethyl bedeutet;
für Mureidomycin C R¹ 2,4-Dioxopyrimidin-1-yl und R² α-Glycylamino-3-hydroxyphenethyl bedeutet;
für Mureidomycin D R¹ 2,4-Dioxodihydropyrimidin-1-yl und R² α- Glycylamino-3-hydroxyphenethyl bedeutet;
für Mureidomycin E R¹ 2,4-Dioxopyrimidin-1-yl und R² 8- Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-yl bedeutet; und
für Mureidomycin F R¹ 2,4-Dioxopyrimidin-1-yl und R² 6- Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-yl bedeutet.
Somit sind erfindungsgemäß als neue Verbindungen die Mureidomycine E und F und ihre Derivate vorgesehen, die durch die folgende planare Strukturformel
dargestellt werden können, in der X die Gruppe
darstellt und worin R ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe ist. Mureidomycin E ist eine Verbindung der obigen Formel (I), in der X die Gruppe (d. h. die 8-Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-yl-Gruppe) darstellt, und Mureidomycin F ist die Verbindung der obigen Formel (I), in der X die Gruppe
(d. h. die 6-Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-yl-Gruppe) darstellt.
Erfindungsgemäß sind auch pharmazeutisch geeignete Salze und Ester der obigen Verbindungen der Formel (I) vorgesehen.
Die Erfindung schafft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Mureidomycin E oder F oder ihrer Salze oder Ester durch Züchten eines Mureidomycin E oder F produzierenden Mikroorganismus des Genus Streptomyces in einem Kulturmedium für diesen und Isolieren von Mureidomycin E oder F oder eines Salzes davon aus der Kulturbrühe und erforderlichenfalls Salzbildung, Überführen des Salzes in die Verbindung oder Veresterung der so isolierten Verbindung.
Die Erfindung umfaßt noch weiter eine Arzneimittelzusammensetzung, die sich für die Behandlung oder die Prophylaxe von bakteriellen Infektionen eignet und die eine Verbindung der obigen Formel (I) oder ein Salz oder einen Ester davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel enthält.
In der beigefügten Zeichnung zeigt:
Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Mureidomycin E;
Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Mureidomycin E;
Fig. 3 das kernmagnetische Resonanzspektrum von Mureidomycin E;
Fig. 4 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Mureidomycin F;
Fig. 5 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Mureidomycin F;
Fig. 6 das kernmagnetische Resonanzspektrum von Mureidomycin F;
Fig. 7A und 7B das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Mureidomycin A;
Fig. 8 das Infrarot-Absorptionsspektrum von Mureidomycin A;
Fig. 9 das kernmagnetische Resonanzspektrum von Mureidomycin A;
Fig. 10 das kernmagnetische Resonanzspektrum von Methylmureidomycin E; und
Fig. 11 das kernmagnetische Resonanzspektrum von Methylmureidomycin F.
Wenn in der obigen Formel (I) R Alkyl ist, ist dieses geradekettiges oder verzweigtes C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl, vorzugsweise c&sub1;-C&sub5;- Alkyl, am besten C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. -Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, tert. -Pentyl, Hexyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, Heptyl, Octyl, 2-Ethylhexyl, Nonyl oder Decyl.
Wenn R Alkenyl ist, ist dieses geradekettiges oder verzweigtes C&sub2;-C&sub7;-Alkenyl, noch bevorzugter C&sub2;-C&sub4;-Alkenyl, beispielsweise Vinyl, Allyl, Methallyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 3-Pentenyl, 4- Hexenyl oder 5-Heptenyl.
Wenn R Alkinyl ist, ist dieses geradekettiges oder verzweigtes C&sub3;-C&sub7;-Alkinyl, noch bevorzugter C&sub3;-C&sub4;-Alkinyl, beispielsweise Ethinyl, 1-Propinyl, 2-Propinyl, 2-Butinyl, 3-Pentinyl, 3-Hexinyl oder 4-Heptinyl.
Wenn R Aryl ist, ist dieses C&sub6;-C&sub1;&sub0;-Aryl beispielsweise Phenyl oder Naphthyl, noch bevorzugter Phenyl.
Wenn R Aralkyl ist, ist dieses C&sub7;-C&sub1;&sub0;-Aralkyl, noch bevorzugter C&sub7;-C&sub8;-Aralkyl, beispielsweise Benzyl, Phenethyl, α-Methylbenzyl, 3-Phenylpropyl oder 4-Phenylbutyl.
Wenn R Aryl oder Aralkyl ist, kann der Arylkern unsubstituiert sein oder wahlweise einen oder mehrere Substituenten aufweisen, wie geradekettiges oder verzweigtes C&sub1;-C&sub5;-Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl oder Pentyl) oder Halogen (z. B. Chlor, Fluor oder Brom).
R ist vorzugsweise Wasserstoff, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl, Phenyl, (C&sub1;-C&sub5;- Alkyl)phenyl oder Halogenphenyl, und am besten ist R Wasserstoff, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl oder Phenyl.
Da die Verbindungen der Formel (I) einen amphoteren Charakter haben, sind sie zur Bildung von Salzen und Estern befähigt, wobei diese Salze und Ester ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen. Die Art solcher Salze und Ester ist nicht kritisch, mit der Ausnahme, daß sie medizinisch verträglich sein müssen, wenn sie für medizinische oder veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt werden sollen, d. h. sie dürfen nicht, jedenfalls nicht in signifikantem Ausmaß, eine gesteigerte Toxizität aufweisen oder eine verminderte Aktivität besitzen, verglichen mit der freien, nicht in das Salz umgewandelten Verbindung und der unveresterten Verbindung.
Beispiele für geeignete Säuren für die Bildung solcher Salze umfassen anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefel- oder Phosphorsäure; organische Carbonsäuren, wie Essig-, Citronen-, Wein-, Malon-, Malein-, Äpfel-, Fumar-, Itacon-, Citracon- oder Bernsteinsäure; und organische Sulfonsäuren, wie Methansulfon-, Benzolsulfon-, Naphthalinsulfon- oder p-Toluolsulfonsäure.
Die in diesen Verbindungen vorhandene Carboxylgruppe kann auch mit geeigneten Basen Salze bilden. Beispiele für solche Salze umfassen die Salze mit Metallen, insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallen, wie die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze, die Ammoniumsalze, Salze mit organischen Aminen, wie Cyclohexylamin, Diisopropylamin oder Triethylamin, und Salze mit basischen Aminosäuren, wie Lysin oder Arginin.
Beispiele für geeignete Ester der Verbindungen der Formel (I) umfassen: C&sub1;-C&sub6;-, noch bevorzugter C&sub1;-C&sub4;-Alkylester, beispielsweise die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, sec.-Butyl-, tert. -Butyl-, Pentyl- und Hexylester; Aralkylester, einschließlich Diarylalkylester, wie die Benzyl-, p-Nitrobenzyl- und Benzhydrylester; Alkoxycarbonylalkylester, bei denen die Alkoxy- und Alkylgruppen in geeigneter Weise jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, insbesondere Alkoxycarbonylmethylester, wie die Ethoxycarbonylmethyl- und tert.-Butoxycarbonylmethylester; Alkoxycarbonyloxyalkylester, bei denen die Alkoxy- und Alkylgruppen in geeigneter Weise jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, insbesondere 2-Alkoxycarbonyloxyethylester, wie die 2-Methoxycarbonyloxyethyl-, 2-Ethoxycarbonyloxyethyl- und 2-tert.-Butoxycarbonyloxyethylester; und andere spezifische Ester, wie die Phthalidylester, die substituierten Phthalidylester, die Phenacylester, die substituierten Phenacylester (z. B. die p-Nitrophenacylester) und die (5-Methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4- yl)methylester.
Die Mureidomycine E und F und ihre Salze werden durch Züchten eines Streptomyces-Stammes produziert, der hier als Streptomyces sp. SANK 60486 bezeichnet ist und der die folgenden mykologischen Eigenschaften hat. Diese Merkmale wurden durch Züchten auf verschiedenen, durch die ISP (International Streptomyces Project) vorgeschriebenen Medien oder mit Medien ermittelt, die von S.A. Waksman in Band 2 von "The Actinomycetes" empfohlen werden, wobei in allen Fällen bei einer Temperatur von 28ºC gearbeitet wurde, wenn es nicht anders angegeben ist.

1. Morphologische Merkmale

Im allgemeinen verzweigen sich die Substrathyphen des Mikroorganismus auf einem Agar-Medium gut und breiten sich gut aus, während sich die Lufthyphen des Mikroorganismus einfach verzweigen. Die Sporenkette bildet gerade bis gekrümmte Linien. Es wird beobachtet, daß die Anzahl der auf einer Sporenkette gebildeten Sporen meistens von 10 bis 50 beträgt, aber es können auch mehr sein. Die Sporen sind ellipsoid, haben eine Größe in dem Bereich von 0,5 bis 0,8 um·0,7 bis 1,1 um und eine glatte Oberfläche. Es wurden keine speziellen Organe, wie Radachsenverzweigungen der Lufthyphen, Sklerotien, Sporangien u. dgl., beobachtet.

2. Kulturmerkmale auf verschiedenen Medien

Die Eigenschaften nach dem Züchten auf verschiedenen Arten von Kulturmedien bei 28ºC für 14 Tage sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Angabe der Farbtöne beruht auf den Farbspitzenzahlen, wie sie in "Guide to Color Standard", herausgegeben von Nippon Shikisai Kenkyusho, angeführt sind.
In dieser Tabelle werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
G: Wachstum; AM: Luftmyzelium; R: Rückseite; SP: Lösliches Pigment. Tabelle 1 Kulturmedium Prüfgröße Eigenschaften von SANK 60486 Saccharose-Agar Begrenzt, flach, gelblich-grau Gut ausgebildet, pulverig, Blaßgelblich-orange Nicht produziert Glucose-Asparagin-Agar Gut, flach, hellbraun Gut ausgebildet, pulverig, blaßgelblich-orange Gelblich-braun Nicht produziert Glycerin-Asparagin-Agar (ISP 5) Gut, erhaben, blaßgelblich-orange kReichlich, pulverig, Gelblich-braun Nicht produziert Stärke-Anorganisches Salz-Agar (ISP 4) Sehr gut, flach Tyrosin-Agar (ISP 2) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6) Nährboden-Agar (Difco) Hefe-Weizenkeim-Agar (ISP 2) Hafermehl-Agar (ISP 3)Wasser-Agar Kartoffelextrakt-Karottenextrakt-Agar

3. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes SANK 60486 sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Stärkehydrolyse Positiv Gelatine-Verflüssigung Reduktion von Nitratsalz Gerinnung von Milch Peptonisation von Milch Temperaturbereich des Wachstums (Kulturmedium 1)* Natriumchlorid-Resistenz Wachstum (Kulturmedium 1)* Kein Wachstum Zersetzung von Casein Tyrosin Xanthin Negativ Produktivität von melaninartigem Pigment (Kulturmedium 2)*
* Kulturmedium 1: Hefe-Weizenkeim-Agar (ISP 2);
Kulturmedium 2: Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP 1);
Kulturmedium 3: Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6);
Kulturmedium 4: Tyrosin-Agar (ISP 7).
Die Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen durch den Stamm SANK 60486 nach dem Züchten auf Pridham-Gottlieb-Agar-Medium (ISP 9) bei 28ºC für 14 Tage wird in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

D-Glucose +
L-Arabinose +
D-Xylose +
Inositol -
D-Mannitol +
D-Fruktose +
L-Rhamnose +
Saccharose -
Raffinose -
Kontrolle -
In der obigen Tabelle bedeutet: + Assimilierbar; - Nicht assimilierbar

4. Zellwandbeschaffenheit

Die Zellwand des Stammes SANK 60486 wurde nach der Methode von B. Becker et al. Applied Microbiology, 12, 421-423 (1964) untersucht. Es wurden L,L-Diaminopimelinsäure und Glycin in ihr nachgewiesen.
Die Identifizierung des Stammes SANK 60486 wurde in Übereinstimmung mit The International Streptomyces Project; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe; "The Actinomycetes", herausgegeben von S.A. Waksman, und anderen neueren Literaturstellen, die sich auf Streptomycetes beziehen, durchgeführt.
Auf der Basis der obigen Werte wurde der Stamm als ein Stamm von Streptomyces flavidovirens identifiziert. Er wird hier als Streptomyces flavidovirens SANK 60486 (BIKOKEN JOHKI 1347; FERM BP-1347) bezeichnet.
Der Stamm SANK 60486 wurde am 4. Februar 1986 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-8636 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, hinterlegt und die Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag bei dem Fermentation Research Institute am 17. April 1987 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1347 bestätigt.
Es ist gesichert, daß der Stamm SANK 60486 die Mureidomycine E und F produziert. Wie jedoch gut bekannt ist, können die Eigenschaften von Mikroorganismen, die zu der allgemeinen Kategorie von Actinomycetes gehören, erheblich variieren, und solche Mikroorganismen neigen dazu, sowohl durch natürliche Ursachen als auch als das Ergebnis der Induzierung durch künstliche Maß nahmen Mutationen durchzumachen. Folglich umfaßt das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung die Verwendung aller Mikroorganismen, die als zu dem Genus Streptomyces gehörig klassifiziert werden können und die mit dem Stamm SANK 60486 die charakteristische Fähigkeit zum Produzieren der Mureidomycine E und F gemeinsam haben.
Der bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus ist vorzugsweise ein Stamm der Spezies Streptomyces flavidovirens, noch bevorzugter Streptomyces flavidovirens SANK 60486 (FERM BP-1347).
Das Züchten von Mikroorganismen des Genus Streptomyces nach der vorliegenden Erfindung zum Produzieren der Mureidomycine E und F kann unter den allgemein beim Züchten von Actinomycetes-Spezies üblichen Bedingungen durchgeführt werden, vorzugsweise in einer flüssigen Kultur, und wenn es erwünscht ist, unter Schütteln oder Rühren und Belüften. Das für die Züchtung verwendete Nährbodenmedium ist vollkommen gebräuchlich und enthält solche Bestandteile, wie sie üblicherweise beim Züchten von Actinomycetes verwendet werden. Insbesondere sollte das Medium enthalten eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen, wofür geeignete Beispiele Glucose, Maltose, Saccharose, Mannitol, Melasse, Glycerin, Dextrin, Stärke, Sojabohnenöl und Baumwollsaatöl umfassen; eine oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen, wofür geeignete Beispiele Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsaatmehl, Pharmamine, Fischmehl, Maiseinweichflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, lebende Hefe, Preßhefe, Hefeextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumsulfat umfassen; und ein oder mehrere anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat und Spuren von Metallsalzen. Wenn die Züchtung in einem flüssigen Medium vorgenommen wird, ist es im allgemeinen wünschenswert, ein Antischaummittel (beispielsweise Siliconöl, pflanzliches Öl oder ein geeignetes oberflächenaktives Mittel) in das Medium einzuarbeiten.
Das-Züchten wird in geeigneter Weise bei einem im wesentlichen neutralen pH-Wert und bei einer Temperatur von 20 bis 37ºC, noch bevorzugter bei etwa 22ºC, durchgeführt.
Die Produktion von Mureidomycinen kann mit fortschreitender Züchtung durch eine Vielzahl von herkömmlichen mikrobiologischen Untersuchungsmethoden zum Überwachen der Produktion von Antibiotika überwacht werden (wenn sie durch mikrobielle Kultur produziert werden), die hier nicht näher erläutert werden müssen. Eine geeignete Methode kann die Papierscheiben-Agardiffusionsprobe (unter Verwendung beispielsweise einer Papierscheibe mit einem Durchmesser von etwa 8 mm, hergestellt von Toyo Kagaku Sangyo Co., Ltd.) und die Verwendung von beispielsweise Pseudomonas aeruginosa Stamm SANK 70579 als Testorganismus sein.
Die Menge an produzierten Mureidomycinen erreicht normalerweise nach 72- bis 96-stündigem Züchten ein Maximum, wobei es natürlich wünschenswert ist, die Mureidomycine erst dann von dem Kulturmedium abzutrennen, wenn dieses Maximum erreicht ist. Dieser Zeitraum kann jedoch in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen und -methoden schwanken, so daß in Abhängigkeit von den Umständen ein kürzerer oder längerer Zeitraum geeignet sein kann. Die korrekte Züchtungszeit kann für jeden Fall durch Routineversuche unter Verwendung geeigneter Überwachungsmethoden, z. B. den vorstehend beschriebenen, leicht ermittelt werden.
Die Mureidomycine E und F werden hauptsächlich in den flüssigen Anteil der Kulturbrühe abgegeben und können somit durch Entfernen der Feststoffe, einschließlich des Myzels, beispielsweise durch Filtration (vorzugsweise unter Verwendung einer Filterhilfe, wie Diatomeenerde) oder durch Zentrifugieren gewonnen werden. Sie können dann aus dem abgetrennten flüssigen Anteil durch herkömmliche Methoden gewonnen und danach gewünschtenfalls gereinigt und/oder voneinander getrennt werden.
Die Antibiotika Mureidomycin E und F können unter Ausnutzung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften getrennt, aufgefangen und gereinigt werden. Beispielsweise umfassen geeignete Verfahren: Extraktion mit Lösungsmitteln; Ionenaustausch durch Harze, beispielsweise Anionaustauschharze, wie Dowex SBR-P (Dow Chemical Co.) oder Kationaustauschharze, wie Dowex 50 W (Dow Chemical Co.) oder IRC-50, CG-50 (Rohm & Haas Co.); Chromatographie durch Aktivkohle als Absorptionsmittel oder durch nichtionische Absorptionsharze, wie Amberlite XAD-2, XAD-4 oder XAD-7 (Rohm & Haas Co.) oder Diaion HP 10, HP 20, CHP 20P oder HP 50 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.); und Chromatographie durch Silicagel oder Tonerde. Weiterhin kann unter Anwendung eines oder mehrerer der folgenden Vorgänge, die gewünschtenfalls in beliebiger Reihenfolge kombiniert oder wiederholt werden können, die Trennung, das Auffangen und die Reinigung der Metaboliten durchgeführt werden: Verteilungschromatographie über Cellulose, wie Avicel (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) oder Sephadex LH-20 (Pharmacia Co.); Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-10, G-25, G-50 oder G-100 (Pharmacia Co.) oder Toyopearl HW-40 (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.); Kristallisation; und Umkristallisation. ("Dowex", "Amberlite", Diaion", "Avicel", "Sephadex" und "Toyopearl" sind sämtlich Warenzeichen).
In Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen können die Mureidomycine E und F in dem Myzel der Kultur existieren und aus diesem durch herkömmliche Methoden extrahiert werden. Beispielsweise können sie mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel (wie einem Alkohol oder Aceton) extrahiert werden, wonach das Lösungsmittel aus dem Extrakt unter Zurücklassung eines Rückstandes entfernt wird, der in einem wäßrigen Medium gelöst wird. Die Mureidomycine können, wie vorstehend beschrieben, aus der erhaltenen Lösung extrahiert und gereinigt werden.
Die Mureidomycine E und F werden vorzugsweise durch Chromatographie voneinander getrennt.
Wenn die Mureidomycine E oder F in Form eines Salzes isoliert werden, können sie durch herkömmliche Maßnahmen in die freie Verbindung überführt werden, wie die Verwendung von Ionenaustauschharzen oder von Adsorptionsmitteln für die Phasenumkehrchromatographie. In gleicher Weise kann die freie Verbindung durch herkömmliche Maßnahmen in das Salz umgewandelt werden, beispielsweise durch Behandlung mit einer geeigneten Säure, wie einer der vorstehend aufgelisteten, oder mit einer geeigneten Base (z. B. einem Metallhydroxid oder -carbonat, wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Natrium- oder Calciumcarbonat). Ester können durch gebräuchliche Veresterungsverfahren, wie durch Umsetzung mit einem geeigneten Alkohol unter Säurekatalyse, hergestellt werden.
Die so erhaltenen Mureidomycine E und F haben die nachstehend beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften.
Mureidomycin E hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich, weißes Pulver;
2) Spezifische Drehung: aD 34,2 (c 1,17, 50% v/v wäßriges Methanol);
3) Elementaranalyse: C 48,57 %; H 5,35 %; N 11,34 %; S 3,00 % - bestimmt als Hydrat;
4) Molekulargewicht: 852 Massenspektrum hoher Auflösung FAB MS: 853.3212 (QM> ); (FAB MS bedeutet Massenspektroskopie mit schnellem Atombeschuß)
5) Molekularformel: C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub8;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;
6) durch Säurehydrolyse resultierende Produkte: Uracil; m-Tyrosin; 2-Amino-3-N-methylaminobuttersäure; 8-Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolin-carbonsäure;
7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, λmaxnm (E1%1cm): 258 nm (252) in neutralem Wasser; 258 nm (247) in 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure; 240 nm (432), 265 nm (235, Schulter) und 295 nm (80, Schulter) in 0,01 n wäßrigem Natriumhydroxid; die Spektren sind in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung gezeigt;
8) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) max cm&supmin;¹: das in einer KBr-Scheibe gemessene Spektrum ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnung gezeigt;
9) Kernmagnetisches Resonanzspektrum, 6 ppm: das Spektrum (270 MHz) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard gemessen und ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnung (einschließlich des Konformationsisomeren) dargestellt;
10) Löslichkeit: löslich in Wasser und Methanol, geringfügig löslich in Aceton und unlöslich in Ethylacetat, Chloroform und Benzol;
11) Farbreaktionen: positiv in der Ninhydrin-, Schwefelsäure-, Iod-, Eisen-III-chlorid- und Baeyer-Reaktion;
12) Dünnschichtchromatographie: Rf-Wert: 0, 39; Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Butanol, Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 2:1;
13) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Kolonne: Aquasil SS 372-N (Senshu Kagaku Co.,); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Chloroform, Isopropanol, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 200 : 100 : 100 : 40;
Fließrate: 1,0 ml/min;
Retentionszeit: 4,7 min.
Mureidomycin F hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich, weißes Pulver;
2) Spezifische Drehung: aD 40,3 (c 1,05, 50% v/v wäßriges Methanol);
3) Elementaranalyse: C 50,40 %; H 5,53 %; N 11,20 % S 2,92 % - bestimmt als Hydrat;
4) Molekulargewicht: 852 Massenspektrum hoher Auflösung FAB MS: 853.3180 (QM> );
5) Molekularformel: C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub8;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;
6) durch Säurehydrolyse resultierende Produkte: Uracil; m-Tyrosin; 2-Amino-3-N-methylaminobuttersäure; 6-Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolin-carbonsäure;
7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, λmax nm (E1%1cm): 258 nm (232) in neutralem Wasser; 258 nm (232) in 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure; 240 nm (352), 265 nm (200, Schulter) und 295 nm (64, Schulter) in 0,01 n wäßrigem Natriumhydroxid; die Spektren sind in Fig. 4 der beigefügten Zeichnung gezeigt;
8) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) ¥max cm&supmin;¹: das in einer KBr-Scheibe gemessene Spektrum ist in Fig. 5 der beigefügten Zeichnung gezeigt;
9) Kernmagnetisches Resonanzspektrum, 6 ppm: das Spektrum (270 MHz) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard gemessen und ist in Fig. 6 der beigefügten Zeichnung (einschließlich des Konformationsisomeren) dargestellt;
10) Löslichkeit: löslich in Wasser und Methanol, geringfügig löslich in Aceton und unlöslich in Ethylacetat, Chloroform und Benzol;
11) Farbreaktionen: positiv in der Ninhydrin-, Schwefelsäure-, Iod-, Eisen-III-chlorid- und Baeyer-Reaktionen;
12) Dünnschichtchromatographie: Rf-Wert: 0, 34; Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Butanol, Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 2:1;
13) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Kolonne: Aquasil SS 372-N (Senshu Kagaku Co.,): Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Chloroform, Isopropanol, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 200 : 100 : 100 : 40;
Fließrate: 1,0 ml/min;
Retentionszeit: 5,3 min.
Die Mureidomycine E und F und ihre Derivate ebenso wie ihre Salze und Ester, die durch die obige allgemeine Formel (I) dargestellt werden, können alternativ durch Umsetzen von Mureidomycin A der Formel
oder eines Salzes oder Esters davon mit einem Aldehyd der Formel
R-CHO (IV)
(worin R wie vorstehend definiert ist) und wahlweise Salzbildung, überführung des Salzes in die Verbindung oder Veresterung der so erhaltenen Verbindung erhalten werden.
Dieses Herstellungsverfahren kann durch Umsetzen von etwa einem Mol Mureidomycin A oder eines Salzes oder Esters davon mit etwa 3 bis 6 Mol eines Aldehyds der obigen Formel (IV) durchgeführt werden. Die Umsetzung wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel ausgeführt. Die Wahl des Lösungsmittels unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, vorausgesetzt, daß es nicht in die Reaktion eingreift, wobei geeignete Beispiele Wasser, Ether, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, und Gemische von Wasser mit solchen organischen Lösungsmitteln umfassen. Die Reaktionstemperatur liegt gewöhnlich in dem Bereich von 5 bis 100ºC, vorzugsweise zwischen Raumtemperatur und 80ºC. Die Reaktionszeit hängt von der Art der Reaktionsteilnehmer und der angewandten Temperatur ab, jedoch liegt sie gewöhnlich in dem Bereich von 1 bis 24 Stunden.
Nach Beendigung der Umsetzung kann das gewünschte Produkt nach denselben Verfahren, wie sie bereits vorstehend für das durch mikrobielle Fermentation erhaltene Produkt erwähnt wurden, isoliert und gereinigt werden. Falls erwünscht, kann das Produkt auch in das Salz übergeführt, das Salz in die Verbindung übergeführt oder die Verbindung verestert werden, wie es vorstehend beschrieben ist.
Das bei der obigen Umsetzung als Ausgangsmaterial verwendete Mureidomycin A kann durch Züchten desselben Streptomyces flavidovirens SANK 60486 erhalten werden, das bei der vorliegenden Erfindung für die Produktion der Mureidomycine E und F verwendet wird.
Mureidomycin A kann aus dem flüssigen Anteil der Kulturbrühe von Streptomyces flavidovirens SANK 60486 unter Ausnutzung seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften abgetrennt, gewonnen und gereinigt werden. Der Mikroorganismus wird, vorzugsweise in einer flüssigen Kultur, in einem eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganisches Salz enthaltenden herkömmlichen Medium für die Züchtung von Actinomycetes gezüchtet. Die Züchtung wird bei weitgehend neutralem pH-Wert und bei einer Temperatur von 20 bis 37ºC durchgeführt, wobei die Produktion von Mureidomycin A unter Anwendung von standardverfahren überwacht werden kann. Die Verfahren sind eingehender in der anhängigen europäischen Patentanmeldung 0 253 413 erläutert.
Mureidomycin A hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich, weißes Pulver;
2) Spezifische Drehung: a+40,90 (c 0,69, 50% v/v wäßriges Methanol);
3) Elementaranalyse: C 49,73 %; H 5,65 %; N 12,08 %; S 3,40 % - bestimmt als Hydrat;
4) Molekulargewicht: 840 Massenspektrum hoher Auflösung FAB MS: 841.31798 (QM) (FAB MS bedeutet Massenspektroskopie mit schnellem Atombeschuß);
5) Molekularformel: C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub8;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;
6) durch Säurehydrolyse resultierende Produkte: Uracil; m-Tyrosin; 2-Amino-3-N-methylaminobuttersäure;
7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, λmax nm 260 nm (348) in neutralem Wasser; 258 nm (358) in 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure; 240 nm (499), 265 nm (330, Schulter) und 295 (78, Schulter) in 0,01 n wäßrigem Natriumhydroxid; die Spektren sind in Fig. 7A und 7B der beigefügten Zeichnung gezeigt;
8) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) max cm&supmin;¹: das in einer KBr-Scheibe gemessene Spektrum ist in Fig. 8 der beigefügten Zeichnung gezeigt;
9) Kernmagnetisches Resonanzspektrum, 6 ppm: das Spektrum (400 MHz) wurde in Dimethylsulfoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard gemessen und ist in Fig. 9 der beigefügten Zeichnung (einschließlich des Konformationsisomeren) dargestellt;
10) Löslichkeit: löslich in Wasser und Methanol, geringfügig löslich in Aceton und unlöslich in Ethylacetat, Chloroform und Benzol;
11) Farbreaktionen: positiv in der Ninhydrin-, Schwefelsäure-, Iod-, Eisen-III-chlorid- und Baeyer-Reaktion;
12) Dünnschichtchromatographie: Rf-Wert: 0, 36; Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Butanol, Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 2:1;
13) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Kolonne: Aquasil SS 372-N (Senshu Kagaku Co.); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Chloroform, Isopropanol, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 200 : 100 : 100 : 40;
Fließrate: 1,0 ml/min;
Retentionszeit: 3,92 min.
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) der Mureidomycine E und F gegen verschiedene grampositive und gramnegative Bakterien wurden durch das Agar-Verdünnungsverfahren unter Verwendung eines Mueller-Hinton-Agar-Mediums (hergestellt von Difco) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 MIC Mureidomycin E F Staphylococcus aureus Escherichia coli Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens
Tests zeigten auch, daß die Methylmureidomycine E und F und die Phenylmureidomycine E und F das Wachstum von Pseudomonas aeruginosa SANK 70579 hemmen.
Aus den vorstehenden Werten wird ersichtlich, daß die Mureidomycine E und F und ihre Derivate gegenüber gramnegativen Bakterien, insbesondere gegenüber Bakterien des Genus Pseudomonas, wirksam sind.
Es wurde keine Toxizität bei Mäusen beobachtet, denen man intravenös 400 mg/kg Mureidomycin E oder F oder eines ihrer Derivate verabreichte.
Aus den obigen Erkenntnissen kann ersehen werden, daß die Mureidomycine E und F und ihre Derivate als Antibiotika gegen verschiedene durch bakterielle Infektionen hervorgerufene Erkrankungen eingesetzt werden können. Der Verabreichungsweg kann ganz unterschiedlich sein, d. h. es kann parenteral (z. B. durch subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektion oder durch Suppositorien) oder peroral (durch Verabreichung in Form von Tabletten, Kapseln, Pulver oder Granulat) verabreicht werden. Die Dosis schwankt in Abhängigkeit von der Art der zu behandelnden Erkrankung, dem Alter, dem Zustand und dem Körpergewicht des Patienten und dem Weg und dem Zeitpunkt der Verabreichung; jedoch ist bei einem Erwachsenen eine Tagesdosis von 0,1 bis 10 g zu bevorzugen, wobei diese als einzige Dosis oder aufgeteilt auf mehrere Gaben verabreicht werden kann.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.

BEISPIEL 1

Mureidomycine E, F und A durch Fermentation

80 ml Medium A, das die nachfolgende Zusammensetzung hat (Prozentsätze in Gewichtsprozenten), wurden in einem 500-ml- Erlenmeyerkolben mit einer Platinöse einer Kultur von Streptomyces flavidovirens SANK 60486 beimpft:

MEDIUM A

Glucose 3%
Preßhefe 1%
Sojabohnenmehl 3%
Calciumcarbonat 0,4 %
Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,2 %
Antischaummittel (Nissan Disfoam CB-442) 0,01 %
Wasser Rest zu 100 %
(pH 7,2 vor der Sterilisation)
Der Mikroorganismus wurde dann unter Verwendung eines Drehschüttlers bei 200 Umdrehungen/min. 84 Stunden bei 22ºC gezüchtet.
Mit je 25 ml der erhaltenen Impfkultur wurden dann vier 2-l- Erlenmeyerkolben beimpft, die jeweils 500 ml Medium A enthielten, das die obenbeschriebene Zusammensetzung hat. Der Mikroorganismus wurde dann unter Verwendung eines Drehschüttlers bei 220 Umdrehungen/min 24 Stunden bei 22ºC gezüchtet. Die erhaltenen Kulturbrühen wurden vereinigt. Mit 750 ml dieser Brühe wurden dann je zwei 30-l-Schüttelfermenter beimpft, die jeweils 15 l Medium A enthielten, wonach der Mikroorganismus dann 96 Stunden bei 22ºC gezüchtet wurde, wobei mit einer Rate von 15 l pro Minute und Rühren bei 150 Umdrehungen/min belüftet wurde.
Danach wurden die beiden Ansätze der Kulturbrühe vereinigt, Celite 545 (eingetragenes Warenzeichen für ein Produkt von Johns-Manville Products Corp., New Jersey, USA) wurde als Filterhilfe zugesetzt und das Gemisch filtriert, was 30 l Filtrat ergab. Dieses Filtrat wurde an 3 l Amberlite XAD-2 in einer chromatographischen Säule adsorbiert. Die Säule wurde zunächst mit 15 l entionisiertem Wasser und dann mit 12 l Wasser gewaschen, das 15 % v/v Methanol enthielt, wonach mit 15 l Wasser, das 40 % v/v Methanol enthielt, eluiert wurde. Das Methanol wurde dann aus den die aktiven Bestandteile enthaltenden Fraktionen durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt und die Rückstandlösung lyophilisiert, wodurch 17,4 g Rohprodukt als Pulver erhalten wurden.
17 g dieses Rohpulvers wurden in 3 l entionisiertem Wasser gelöst und die Lösung durch eine 800 ml Amberlite CG-50 (H&spplus;) enthaltende Säule geschickt, um die aktiven Bestandteile zu adsorbieren. Die Wirkbestandteile wurden mit 0,5 m wäßrigem Ammoniak aus der Säule eluiert. Die eluierten aktiven Fraktionen (4 l) wurden aufgefangen und durch Eindampfen unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 1,0 l eingeengt. Das Konzentrat (1,0 l) wurde durch 500 ml eines DE-52- Ionenaustauschers (Whatman Ltd.) geschickt, der zuvor mit einer 0,1 m wäßrigen Lösung von Ammoniumbicarbonat ins Gleichgewicht gebracht worden war, wobei die aktiven Bestandteile an der Säule adsorbiert wurden. Die Säule wurde mit 0,2 m wäßrigem Ammoniumbicarbonat eluiert. Die die Wirkbestandteile enthaltenden Fraktionen (1 l) wurden aufgefangen und an einer 200 ml Diaion HP 20 (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.) enthaltenden Säule adsorbiert, wonach die Säule zum Gewinnen der aktiven Bestandteile mit 500 ml 50 % V/v wäßrigem Aceton eluiert wurde, was die aktive Komponente ergab. Die die aktiven Bestandteile enthaltenden Fraktionen wurden durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, was 15 g eines die Mureidomycine E, F und A enthaltenden rohen, pulverförmigen Produktes ergab.
14 g dieses Rohpulvers wurden in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst und die aktiven Bestandteile an einer 500 ml DE-52 enthaltenden Säule adsorbiert, die zuvor mit 0,05 m wäßrigem Ammoniumbicarbonat ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Säule wurde mit 0,05 m wäßrigem Ammoniumbicarbonat gewaschen und dann mit 0,1 m wäßrigem Ammoniumbicarbonat eluiert, was Fraktionen ergab, die jeweils 20 ml Eluat enthielten. Die die aktiven Bestandteile enthaltenden Fraktionen 80 bis 130 wurden aufgefangen und an einer HP 20 enthaltenden Säule adsorbiert, um sie zu entionisieren. Das entionisierte Eluat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand lyophilisiert, was 3,1 g eines teilweise gereinigten Pulvers ergab.
3,0 g dieses teilweise gereinigten Pulvers wurden der Säulenchromatographie durch eine 100 g Silicagel enthaltende Säule unterzogen, die mit einem Gemisch von Butanol, Propanol und Wasser (8 : 4:1) eluiert wurde, was Fraktionen ergab, die jeweils 20 ml Eluat enthielten. Die Fraktionen 13 bis 70 wurden aufgefangen, mit Wasser vermischt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, was 320 mg eines rohen pulverförmigen Produkts ergab, das die antibiotischen Mureidomycine E, F und A enthielt.
Eine Lösung von 300 mg des so erhaltenen, in 30 % v/v wäßrigem Methanol gelösten Rohpulvers wurde an einer 1000 ml Toyopearl HW-40 enthaltenden Säule adsorbiert und die Säule mit 30 % v/v wäßrigem Methanol eluiert, was Fraktionen ergab, die jeweils 10 ml Eluat enthielten. Die Fraktionen 95 bis 105 wurden als aktive Fraktionen aufgefangen und an einer 10 ml Amberlite CG- 50 (H&spplus;-Typ) enthaltenden Säule adsorbiert, wonach mit 0,5 m wäßrigem Ammoniak eluiert wurde. Die die aktiven Bestandteile enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen, durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, was 15 mg Mureidomycin E mit den vorstehend angegebenen physikalischchemischen Eigenschaften ergab.
Die Eluatfraktionen 80 bis 90 bzw. 50 bis 70 wurden in gleicher Weise behandelt, was 32 mg Mureidomycin F und 24 mg Mureidomycin A ergab, die jeweils die vorstehend angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften hatten.

BEISPIEL 2

Mureidomycine E und F aus Mureidomycin A

270 mg Mureidomycin A wurden in 60 ml entionisiertem Wasser gelöst und 300 ul 30 %iges wäßriges Formaldehyd zu der Lösung zugesetzt, wonach zur Vervollständigung der Reaktion das erhaltene Gemisch über Nacht stehengelassen wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde dann an einer 1500-ml-Toyopearl- Säule adsorbiert, die mit 30 %igem wäßrigem Methanol eluiert wurde, was Fraktionen ergab, die jeweils 15 ml Eluat enthielten. Die die aktiven Bestandteile (nachstehend auch "Wirkbestandteile") enthaltenden Fraktionen 81 bis 88 wurden aufgefangen, durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, was 65 mg Mureidomycin F mit den vorstehend angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ergab.
Die in gleicher Weise behandelten Fraktionen 92 bis 100 ergaben 64 mg Mureidomycin E mit den vorstehend angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften.

BEISPIEL 3

Methylmureidomycine E und F aus Mureidomycin A

200 mg Mureidomycin A wurden in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst und 500 ul Acetaldehyd zu der Lösung zugesetzt, wonach das erhaltene Gemisch zur Vervollständigung der Reaktion 3 Stunden bei 70ºC gerührt wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde dann an einer 1500-ml-Toyopearl- Säule adsorbiert, die mit 30 %igem wäßrigem Methanol eluiert wurde, was Fraktionen ergab, die jeweils 15 ml Eluat enthielten. Die die Wirkbestandteile enthaltenden Fraktionen 85 bis 90 wurden aufgefangen, durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, was 30 mg Methylmureidomycin F mit den nachstehend angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ergab.
Die Fraktionen 93 bis 98 wurden in gleicher Weise behandelt, was 27 mg Methylmureidomycin E mit den nachstehend angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ergab. Methylmureidomycin E
1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich;
2) Molekulargewicht: 866;
3) Molekularformel: C&sub4;&sub0;H&sub5;&sub0;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;
4) Kernmagnetisches Resonanzspektrum, δ ppm: das Spektrum (270 MHz) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard gemessen und ist in Fig. 10 der beigefügten Zeichnung (einschließlich des Konformationsisomeren) dargestellt;
5) Dünnschichtchromatographie: Rf-Wert: 0,27; Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Butanol, Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 2:1;
6) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Kolonne: Aquasil SS 372-N (Senshu Kagaku Co.,); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Chloroform, Isopropanol, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 200 : 100 : 100 : 40;
Fließrate: 1,0 ml/min;
Retentionszeit: 4,5 min. Methylmureidomycin F
1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich;
2) Molekulargewicht: 866;
3) Molekularformel: C&sub4;&sub0;H&sub5;&sub0;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;
4) Kernmagnetisches Resonanzspektrum, 6 ppm: das Spektrum (270 MHz) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard gemessen und ist in Fig. 11 der beigefügten Zeichnung (einschließlich des Konformationsisomeren) dargestellt;
5) Dünnschichtchromatographie: Rf-Wert: 0,27; Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Butanol, Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 2:1;
6) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Kolonne: Aquasil SS 372-N (Senshu Kagaku Co.); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Chloroform, Isopropanol, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 200 : 100 : 100 : 40;
Fließrate: 1,0 ml/min;
Retentionszeit: 5,2 min.

BEISPIEL 4

Phenylmureidomycine E und F aus Mureidomycin A

200 mg Mureidomycin A wurden in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst und 500 ul Benzaldehyd zu der Lösung zugesetzt, wonach das erhaltene Gemisch zur Vervollständigung der Reaktion 3 Stunden bei 70ºC gerührt wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde dann an einer 1500-ml-Toyopearl- Säule adsorbiert, die mit 30 %igem wäßrigem Methanol eluiert wurde, wodurch Fraktionen erhalten wurden, die jeweils 15 ml Eluat enthielten. Die die Wirkbestandteile enthaltenden Fraktionen 91 bis 98 wurden aufgefangen, durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch 15 mg Phenylmureidomycin F mit den nachstehend angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften erhalten wurden.
Die Fraktionen 101 bis 106 wurden in gleicher Weise behandelt, wodurch 8 mg Phenylmureidomycin E mit den nachstehend angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften erhalten wurden. Phenylmureidomycin E
1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich;
2) Molekulargewicht: 928;
3) Molekularformel: C&sub4;&sub5;H&sub5;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub2;S. Phenylmureidomycin F
1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich;
2) Molekulargewicht: 928;
3) Molekularformel: C&sub4;&sub5;H&sub5;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;

BEISPIEL 5

Mureidomycin E-Kapseln für die perorale Verabreichung

Es wurden die folgenden Pulver gemischt:
Mureidomycin E 100 mg
Milchzucker 100 mg
Maisstärke 148,5 mg
Magnesiumstearat 1,5 mg
Insgesamt/ 350 mg
und durch ein 30-Maschen-Sieb (Tyler-Standardsieb) gegeben. Das Gemisch (350 mg) wurde in eine Gelatinekapsel No. 2 eingesiegelt, wodurch die gewünschte Kapsel erhalten wurde.

BEISPIEL 6

Mureidomycin F-Kapseln für die perorale Verabreichung

Es wurden die folgenden Pulver gemischt:
Mureidomycin F 100 mg
Milchzucker 100 mg
Maisstärke 148,5 mg
Magnesiumstearat 1,5 mg
350 mg
und durch ein 30-Maschen-Sieb (Tyler-Standardsieb) gegeben. Das Gemisch (350 mg) wurde in eine Gelatinekapsel No. 2 eingesiegelt, wodurch die gewünschte Kapsel erhalten wurde.

BEISPIEL 7

Mureidomycin-E-Injektion

1,0 g Mureidomycin E wurden in 5,0 ml einer 1/15 m Phosphatpufferlösung (pH 6,9) gelöst und die Lösung in eine 5-ml-Ampulle eingesiegelt. Die Ampulle wurde auf herkömmliche Weise sterilisiert, wodurch die gewünschte injizierbare Flüssigkeit erhalten wurde.

BEISPIEL 8

Mureidomycin-F-Injektion

1,0 g Mureidomycin F wurden in 5,0 ml einer 1/15 m Phosphatpufferlösung gelöst und die Lösung in eine 5-ml-Ampulle eingesiegelt. Die Ampulle wurde auf herkömmliche Weise sterilisiert, wodurch die gewünschte injizierbare Flüssigkeit erhalten wurde.

Claims

1. Verbindungen der Formel

in der X die Gruppe

darstellt und worin R ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine dieser Aryl- oder Aralkylgruppen, die mit mindestens einem Halogenatom und/oder mindestens einer Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist, bedeutet, und deren pharmazeutisch geeignete Salze und Ester.

2. Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Alkinylgruppe mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine dieser Aryl- oder Aralkylgruppen bedeutet, die mit mindestens einem Halogenatom und/oder mindestens einer Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist.

3. Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Phenylgruppe, eine Halogenphenylgruppe oder eine Alkylphenylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in dem Alkylteil bedeutet.

4. Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe bedeutet.

5. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X die 8-Hydroxy- 1,2,3,4-tetrahydro-isochinolin-3-yl-Gruppe bedeutet und deren pharmazeutisch geeignete Salze und Ester.

6. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin X die 6-Hydroxy- 1,2,3,4-tetrahydro-isochinolin-3-yl-Gruppe bedeutet und deren pharmazeutisch geeignete Salze und Ester.

7. Verbindung der Bezeichnung Mureidomycin E, die erhältlich ist durch Fermentation von Streptomyces flavidovirens SANK 60486 (BIKOKEN JOHKI 1347; FERM BP-1347) und- Isolierung aus der Kulturbrühe, und die durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften gekennzeichnet ist:

1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich, weißes Pulver;

2) spezifische Drehung aD 34,2 (c 1,17, 50% v/v wäßriges Methanol);

3) Elementaranalyse: C 48,57 %; H 5,35 %; N 11,34 %; S 3,00 % - bestimmt als Hydrat;

4) Molekulargewicht: 852 Massenspektrum hoher Auflösung FAB MS: 853.3212 (QM> ) (FAB MS bedeutet Massenspektroskopie unter Beschuß mit schnellen Atomen);

5) Molekularformel: C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub8;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;

6) durch Säurehydrolyse resultierende Produkte: Uracil; m-Tyrosin; 2-Amino-3-N-methylaminobuttersäure; 8-Hydroxy-1,2,3,4-htetrahydro-3-isochinolin-carbonsäure;

7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, λmax nm (E1%1cm): 258 nm (252) in neutralem Wasser; 258 nm (247) in 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure; 240 nm (432), 265 nm (235, Schulter) und 295 nm (80, Schulter) in 0,01 n wäßrigem Natriumhydroxid; die Spektren sind in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen gezeigt;

8) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) ¥max cm&supmin;¹: das in einer KBr-Scheibe gemessene Spektrum ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen gezeigt;

9) Kernmagnetisches Resonanzspektrum, 8 ppm: das Spektrum (270 MHz) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard gemessen und ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen (einschließlich des Konformationsisomeren) dargestellt;

10) Löslichkeit: löslich in Wasser und Methanol, geringfügig löslich in Aceton und unlöslich in Ethylacetat, Chloroform und Benzol;

11) Farbreaktionen: positiv in der Ninhydrin-, Schwefelsäure-, Iod-, Eisen-III-chlorid- und Baeyer-Reaktion;

12) Dünnschichtchromatographie: Rf-Wert: 0,39; Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Butanol, Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 2:1;

13) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Kolonne: Aquasil SS 372-N (Senshu Kagaku Co.); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Chloroform, Isopropanol, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 200 : 100 : 100 : 40;

Fließrate: 1,0 ml/min;

Retentionszeit: 4,7 min;

und deren pharmazeutisch geeignete Salze und Ester.

8. Verbindung der Bezeichnung Mureidomycin F, die erhältlich ist durch Fermentation von Streptomyces flavidovirens SANK 60486 (BIKOKEN JOHKI 1347; FERM BP-1347) und Isolierung aus der Kulturbrühe, und die durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften gekennzeichnet ist:

1) Merkmale und Aussehen: amphoter, wasserlöslich, weißes Pulver;

2) Spezifische Drehung: a25D 40,3 (c 1,05, 50% v/v wäßriges Methanol);

3) Elementaranalyse: C 50,40 %; H 5,53 %; N 11,20 %; S 2,92 % - bestimmt als Hydrat;

4) Molekulargewicht: 852 Massenspektrum hoher Auflösung FAB MS: 853.3180 (QM> );

5) Molekularformel: C&sub3;&sub9;H&sub4;&sub8;N&sub8;O&sub1;&sub2;S;

6) durch Säurehydrolyse resultierende Produkte: Uracil; m-Tyrosin; 2-Amino-3-N-methylaminobuttersäure; 8-Hydroxy-1, 2,3, 4-tetrahydro-3-isochinolin-carbonsäure;

7) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, λmax nm (E1%1cm): 258 nm (232) in neutralem Wasser; 258 nm (232) in 0,01 n wäßriger Chlorwasserstoffsäure; 240 nm (352), 265 nm (200, Schulter) und 295 nm (64, Schulter) in 0,01 n wäßrigem Natriumhydroxid; die Spektren sind in Fig. 4 der beigefügten Zeichnungen gezeigt;

8) Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr) max cm&supmin;¹: das in einer KBr-Scheibe gemessene Spektrum ist in Fig. 5 der beigefügten Zeichnungen gezeigt;

9) Kernmagnetisches Resonanzspektrum, 8 ppm: das Spektrum (270 MHz) wurde in Deuteriumoxid unter Verwendung von Tetramethylsilan als äußerem Standard gemessen und ist in Fig. 6 der beigefügten Zeichnungen (einschließlich des Konformationsisomeren) dargestellt;

12) Dünnschichtchromatographie: Rf-Wert: 0,34; Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Merck, Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;); Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Butanol, Propanol und Wasser im Volumenverhältnis 4 : 2:1;

Fließrate: 1,0 ml/min;

Retentionszeit: 5,3 min;

und deren pharmazeutisch geeignete Salze und Ester.

9. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Mureidomycin E oder F der in Anspruch 1 definierten Struktur oder eines Salzes oder Esters davon, welches das Züchten eines Mureidomycin E oder F produzierenden Mikroorganismus des Genus Streptomyces in einem Kulturmedium für diesen und Isolieren von Mureidomycin E oder F oder eines Salzes davon aus der Kulturbrühe und erforderlichenfalls Salzbildung, Überführen des Salzes in die Verbindung oder Veresterung der so isolierten Verbindung umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Streptomyces flavidovirens SANK 60486 (BIKOKEN JOHKI 1347; FERM BP 1347) ist.

11. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, welches die Umsetzung von Mureidomycin A der folgenden Formel

oder eines Salzes oder Esters dieser Verbindung mit einem

Aldehyd der Formel

R - CHO

worin R wie in Anspruch 1 definiert ist, und gegebenenfalls Salzbildung, Überführen eines Salzes in die Verbindung oder Veresterung der so erhaltenen Verbindung umfaßt.

12. Arzneimittelzusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz oder einen pharmazeutisch geeigneten Ester dieser Verbindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel enthält.

13. Arzneimittelzusammensetzung, die Mureidomycin E gemäß der Definition in Anspruch 7 oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz oder einen pharmazeutisch geeigneten Ester dieser Verbindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel enthält.

14. Arzneimittelzusammensetzung, die Mureidomycin F gemäß der Definition in Anspruch 8 oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz oder einen pharmazeutisch geeigneten Ester dieser Verbindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel enthält.