Nouveau complexe antib iotique .
La présente invention concerne un nouveau complexe
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par culture d'une nouvelle espèce de Pseudomonas appelée Pseudomonas sp. souche D946-B83, A.T.C.C. n[deg.] 31086, en submersion aérobie dans un milieu aqueux nutritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote jusqu'à production d'une quantité sensible du complexe Bu-2183 par l'organisme dans le milieu de culture, puis éventuellement isolement du complexe Bu-2183 de ce milieu de culture. L'invention a de plus pour objet un procédé pour produire, sous forme de substances distinctes, les différents constituants du complexe Bu-2183 et en particulier les constituants antibiotiques Bu-2183 A, Bu-2183 A2 et Bu-2183 B, de même que l'utile inter-
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Bu-2183 comme décrit ci-dessus, on sépare le complexe antibiotique du mycellium du milieu de culture, on adsorbe le complexe Bu-2183 sur une résine échangeuse de cations, on élue
par fractions les constituants du complexe Bu-2183 de la résine et on recueille les fractions contenant les constituants voulus.
La Fig.l portant en ordonnées la transmission .en pourcent est le spectre d'absorption infrarouge du constituant Bu-2183 A à l'état de base libre dans une pastille de bromure de potassium.
La Fig. 2 est le spectre de résonance magnétique des protons du constituant Bu-2183 A à l'état de chlorhydrate en solution dans le D20 en présence de 2,2-diméthyl-2-silapentane5-sulfonate comme étalon interne, relevé à l'aide d'un spectro- <EMI ID=3.1>
La Fig. 3 portant en ordonnées la transmission en pour-cent est le spectre d'absorption infrarouge du constituant
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potassium.
La Fig. 4 est le spectre de résonance magnétique des protons du constituant Bu-2183 A2 à l'état de chlorhydrate en
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5-sulfonate comme étalon interne, relevé à l'aide d'un spectromètre TNM-C-60HL JEOL à 60 MHz.
La Fig. 5 portant en ordonnées la transmission en pour-cent est le spectre d'absorption infrarouge du constituant Bu-2183 B à l'état de base libre dans une pastille de bromure de potassium.
La Fig. 6 est le spectre de résonance magnétique des protons du constituant Bu-2183 B à l'état de chlorhydrate en solution dans le D20 en présence de 2,2-diméthyl-2-silapentane5-sulfonate comme étalon interne, relevé à l'aide d'un spectromètre TNM-C-60HL JEOL à 60 MHz.
La Fig. 7 portant en ordonnées la transmission, en pour-cent est le spectre d'absorption infrarouge du constituant Bu-2183 D à l'état de base libre dans une pastille de bromure
de potassium.
La Fig. 8 est le spectre de résonance magnétique des protons du constituant Bu-2183 D à l'état de chlorhydrate en solution dans le D20 en présence de 2,2-diméthyl-2-silapentane5-sulfonate comme étalon interne, relevé à l'aide d'un spectromètre TNM-C-60HL JEOL à 60MHz.
On connaft déjà divers antibiotiques au nombre desquels on compte différents aminoglucosides tels que la kanamyeine, la gentamycine, la streptomycine, la néomycine, la tobramycine et la paromomycine. Il serait cependant intéressant de disposer d'autres nouveaux antibiotiques à large spectre exerçant
en particulier un effet contre les organismes qui résistent
aux aminoglucosides tels que Pseudomonas.
La nouvelle espèce de Pseudomonas, appelée Pseudomonas sp. souche D946-B83 de la collection de culture Bristol-Banyu, est une bactérie psychrophile du sol qui a été isolée d'un échantillon de terre des Indes. Une culture de l'organisme
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lection, Washington, D.C.
Le nouveau complexe d'aminoglucosides faisant l'objet de l'invention comprend au moins cinq aminoglucosides constitutif s, dont trois,qui sont les constituants Bu-2183 A, Bu-2l83 A2 et Bu-2183 B,ont un effet biologique et dont deux, qui sont les constituants Bu-2183 C et Bu-2183 D sont biologiquement inertes.
Le complexe antibiotique Bu-2183 et chacun de ses constituants antibiotiques précités ont un spectre d'activité antibactérienne étendu et inhibent la plupart des organis-
<EMI ID=7.1>
Les antibiotiques Bu-2183, Bu-2183 A, Bu-2183 A2 et Bu-2183 B sont utiles comme agents antibactériens, comme suppléments
pour la nourriture des animaux et comme agents thérapeutiques pour l'homme, les animaux et la volaille. Ils sont intéressants pour le traitement des infections provoquées par les bactéries Gram-positives et Gram-négatives et en particulier des infections provoquées par les organismes qui résistent aux aminoglucosides .L'un des nouveaux constituants biologiquement inertes du complexe que donne la fermentation, à savoir le constituant Bu-2183 D,est utile comme intermédiaire pour la préparation semi-synthétique (par N-acylation) des constituants actifs Bu-2183 A, Bu-2183 A2 et Bu-2183 B.
Le micro-organisme
L'organisme produisant l'antibiotique Bu-2183 est
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une bactérie Gram-négative non sporulante strictement aérobie. Les cellules en forme de bâtonnet produisent des touffes de flagelles unipolaires. La souche D946-B83 est un organisme
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un pigment fluorescent dans un milieu au glutamate et dans
le lait écrémé, mais non dans le milieu B de King (H. Iizuka, & K. Komagata: An Attempt At Grouping Of The Genus Pseudomonas. j. Gen. Appl. Microbiol. 9: 73-82, 1963). Cette souche ne produit pas de cytochrome oxidases. On trouvera ci-après des détails relatifs à la morphologie, à la culture et à la physiologie de la souche D946-B83.
Morphologie
La souche D946-B83 se présente en bâtonnets Gram-négatifs mobiles non sporulents. Les cellules sont droites, parfois fléchies suivant leur grand axe et produisent des touffes
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stitue pas une réserve cellulaire (R.Y. Stanier, N. J. Palleroni & M. Doudoroff: The Aérobic Pseudomonas: A Taxonomic Study.
J. Gen Microbiol. 43: 159-271, 1966). On n'observe pas de production de gaine, de tige, ni de mucus.
Caractéristiques de croissance
Culture sur gélose nutritive et sur gélose à l'extrait de levure: Croissance abondante. Diamètre de 0,5 à 1,5 mm après 1 jour. Forme diffuse, circulaire quelque peu en relief. Lisse et souple. Opaque, blanc crémeux, ultérieurement jaune orangé clair. Aspect légèrement visqueux. Pas de pigment diffusible .
Culture en bouillon nutritif et bouillon à l'extrait de levure: Croissance abondante. Bouillon trouble, ultérieurement avec sédiment et occasionnellement pellicule.
Culture en piqûre sur gélose à l'extrait de levure:
Croissance uniquement en surface et pas de croissance en anaérobiose.
Culture en milieu contenant des sels inorganiques chimiquement définis: Croissance modérée en présence de glucose ou de lactate comme unique source de carbone.
Facteur de croissance nécessaire: Aucun.
Température de croissance: Croissance restreinte à
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à 11,0.
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au-dessous .
Ces propriétés de morphologie et de culture sont semblables à celles de la famille des Pseudomonadaceae. Propriétés physiologiques
La souche D946-B83 produit un pigment fluorescent diffusible dans certains milieux, mais non dans d'autres, alors qu'une espèce connue de Pseudomonas, à savoir Pseudomonas fluorescens est à l'origine d'une abondante fluorescence (voir tableau I).
Les propriétés physiologiques et biochimiques de la souche D946-B83 sont détaillées au tableau II. L'utilisation des hydrates de carbone et autres sources de carbone par l'organisme est précisée au tableau III, la comparaison étant établie avec deux autres espèces connues de Pseudomonas, à savoir Ps. fluorescens et Ps. aeruginosa.
Taxonomie
La souche D946-B83 se révèle appartenir au groupe des Pseudomonas d'après les propriétés de morphologie de culture et de physiologie ci-dessus. Suivant le système taxonomique
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Palleroni et M. Doudoroff: The Aérobic Pseudomonas: A Taxonomic Study..J. Gen. Microbiol. 43: 159-271, 1966) pour les pseudomonadaceae aérobies, la souche D946-B83 est assez étroitement apparentée à Pseudomonas fluorescens, sauf sa réaction négative au jaune d'oeuf l'absence de l'utilisation de l'inositol
et l'absence de production d'oxydase. Parmi les treize espèces de Pseudomonadaceae aérobies examinées par Stanier, seul
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l'absence de production d'arginine dihydrolase et par des différences dans l'utilisation dihydrolase et par des diffé-
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est donc à considérer comme appartenant à une nouvelle espèce du genre Pseudomonas.
Préparation de l'antibiotique
Le complexe antibiotique Bu-2183 est produit par mise en culture de la nouvelle espèce de Pseudomonas dite Pseudomonas
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dans un milieu aqueux nutritif. L'organisme est mis en culture dans un milieu nutritif contenant une source de carbone assimilable, par exemple un hydrate de carbone assimilable. Des exemples de sources de carbone préférées sont le glucose, le fructose, la mannose, le glycérol etc. Le milieu nutritif doit contenir aussi une source d'azote assimilable, comme de la farine de poisson, de la farine de soya, de la peptone etc. Des sels inorganiques nutritifs peuvent être ajoutés aussi au milieu de culture et sont notamment les divers sels habituels apportant des ions sodium, potassium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chlorure, bromure, nitrate, carbonate etc.
La production du complexe Bu-2183 peut être exécutée
à toute température permettant une croissance satisfaisante
<EMI ID=18.1>
tageusement d'environ 28 à 30[deg.]C. D'ordinaire, la croissance optimale est assurée en 3 à 5 jours. L'intervalle le plus favorable pour le pH du milieu est d'environ 5,5 à 9,5 et le plus favorablement le milieu est ajusté à un pH d'environ 7.
Pour la culture en fermenteur, il est désirable de produire un inoculum végétatif en bouillon nutritif en inoculant ce bouillon de culture au moyen d'une culture sur gélose inclinée ou sur terre ou au moyen d'une culture lyophilisée de l'organisme.
Après la préparation d'un inoculum actif, celui-ci est transféré aseptiquement dans le fermenteur.
On trouvera ci-après la description d'un procédé préféré pour la préparation du complexe-antibiotique Bu-2183.
On utilise une culture en bon état sur gélose inclinée de Pseudomonas sp., souche D94�6-B83 pour inoculer un mi-
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carbonate de calcium, le pH ayant été a justé à 7, 0 avant la stérilisation. On met la culture d'ensemencement en incubation
<EMI ID=20.1>
une fiole conique de 500 ml contenant 100 ml du milieu de fermentation qui contient 2% de glycérol, 2% de farine de lin, 1%
<EMI ID=21.1>
mentation est appréciée par diffusion sur gélose au moyen d'un disque de papier avec vérification au moyen de Bacillus subtilis PCI 219. La souche D946-B83 lors de la fermentation en fiole
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par ml de bouillon.
Après que le bouillon a atteint le pouvoir antibiotique maximal, comme il est possible de l'apprécier, par exemple, de la façon indiquée ci-dessus, le pH du bouillon est ajusté à environ 2 de manière que le complexe antibiotique hydrosoluble basique se sépare du mycellium et se dissolve dans le bouillon de fermentation aqueux. Le bouillon est alors filtré, de préférence en présence d'un auxiliaire de filtration,et le filtrat contenant l'antibiotique est neutralisé à peu près jusqu'à pH 7. Le filtrat neutralisé est passé sur une résine échangeuse de cations,qui est de préférence la résine Amberlite IRC-50 sous forme ammonique. La résine est ensuite lavée à l'eau et à l'hydroxyde d'ammonium dilué (N�50), après quoi le complexe antibiotique est élué à l'aide d'un solvant approprié,par exemple l'hydroxyde d'ammonium N/2.
Les fractions éluées actives sont combinées, concentrées sous vide et évaporées ou lyophilisées pour donner comme résidu le complexe Bu-2183 brut.
Le solide brut ainsi obtenu se révèle à la chromatographie en couche mince comprendre au moins trois constituants actifs, appelés Bu-2183 A, Bu-2183 A2 et Bu-2183 B, et au moins deux constituants inertes,appelés Bu-2183 C et Bu-2183 D. Le complexe Bu-2183 peut être fractionné en ses constituants Bu-2183 A, A2' B, C et D au moyen d'une résine échangeuse de cations qui est de préférence du type de la résine Amberlite CG-50 sous forme ammonique. Après dissolution dans l'eau, le complexe est mis au contact de la résine et celle-ci est la-
<EMI ID=23.1>
tion étant faite à l'aide d'un éluant convenable. L'hydroxyde d'ammonium N/20 s'est révélé propre à séparer les constituants Bu-2183 A et Bu-2183 B. La poursuite de l'élution de la colonne avec de l'hydroxyde d'ammonium plus concentré, par exemple N/10, permet de collecter les constituants Bu-2183 C et Bu-2183 D qui sont biologiquement Inertes, mais donnent urie réaction positive
<EMI ID=24.1>
est habituellement nécessaire d'effectuer une chromatographie sur colonne supplémentaire de la fraction Bu-2183 A qui permet de séparer le constituant Bu-2183 A proprement dit et le constituant Bu-2183 A2. Une séparation complète avec purification
de chacun de ces constituants est réalisable par chrcmatographie répétée de la manière décrite ci-dessus. Comme il ressort du tableau IV, deux systèmes de chromatographie en couche mince, appelés ci-après S-117 et S-122,se sont révélés propres à l'identification des quatre constituants Bu-2183 A, Bu-2183 B, Bu-2183 C et Bu-2183 D. Pendant la purification chromatogra- phique du constituant Bu-2183 A de la manière décrite plus en détail dans les exemples, un autre aminoglucoside biologiquement actif appelé constituant Bu-2183 A2 apparaît. Celui-ci
peut être discerné du constituant Bu-2183 A au moyen des sys- tèmes de chromatographie en couche mince S-117 et S-122 comme il ressort du tableau V. Caractérisation des constituants du complexe antibiotique
<EMI ID=25.1>
L'antibiotique Bu-2183 A est une base amorphe blanche hydrosoluble,faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol et pratiquement insolubles dans le n-butanol, l'acétone et les autres solvants organiques courants.
L'antibiotique Bu-2183 A peut former des sels avec les acides de sorte que les sels d'addition d'acides pharmaceutiquement acceptables de cet antibiotique font aussi l'objet de l'invention. Des exemples de sels d'addition d'acides pharmaceutiquement acceptables qui conviennent sont les sels non toxiques formés avec les acides organiques ou inorganiques, comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide acétique, l'acide stéarique, l'acide propionique, l'acide tartrique, l'acide maléique, l'acide benzoïque, l'acide succinique etc.
L'antibiotique Bu-2183 A donne des réactions positives à la ninhydrine et à l'anthrone, mais négatives avec les réactifs de Pollens, de Fehling et de Sakaguchi.
Le pouvoir rotatoire spécifique de l'antibiotique
<EMI ID=26.1>
(c = 1,0, eau).
L'analyse d'un échantillon de l'antibiotique Bu-2183 A précipité à partir d'une solution éthanolique donne les résultats suivants:
<EMI ID=27.1>
Trouvé : C, 44,25; H, 8,08; N, 9,11: 0, 38.56 % (par
différence)
<EMI ID=28.1>
sente en aiguilles incolores fondant à 149-150[deg.]C. Son poids moléculaire déterminé par osmométrie est de 481 et l'analyse donne les résultats suivants:
<EMI ID=29.1>
Trouvé : C, 45,73; H, 7,49; N, 8,19; 0, 38,59 %(par
différence) L'antibiotique Bu-2183 A est faiblement basique et
<EMI ID=30.1>
9,40 dans l'eau. Le poids moléculaire approximatif de l'antibiotique déduit du titrage est de 398.
L'antibiotique Bu-2183 A n'absorbe qu'à l'extrémité du spectre ultraviolet. A l'état de pastille dans le bromure de potassium, il présenteun spectre infrarouge sensiblement tel qu'à la Fig. l,avec des bandes d'absorption caractéristi-
<EMI ID=31.1>
à une concentration d'environ 8%, le chlorhydrate de l'antibiotique Bu-2183 A présente un spectre de résonance magnétique nucléaire sensiblement tel qu'à la Fig. 2. Ce spectre comprend
<EMI ID=32.1>
2,29 (2H, q, J = 7,5 Hz) ppm.
La structure de l'antibiotique Bu-2183 A est la suivante:
<EMI ID=33.1>
Bu-2183 A2
<EMI ID=34.1>
ci-dessus,est une base amorphe blanche hydrosluble, faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol et pratiquement insoluble dans le n-butanol, l'acétone et les autres solvants organiques courants.
Cet antibiotique peut former des sels avec les acides de sorte que les sels d'addition d'acides pharmaceutiquement acceptables de la base Bu-2183 A2 font aussi l'objet de l'invention.
L'antibiotique Bu-2183 A2 donne des réactions positives à la ninhydrine et à l'anthrone et négatives avec les réactifs de Tollens, de Fehling et de Sakaguchi.
<EMI ID=35.1>
A l'analyse, un échantillon de l'antibiotique Bu-2183 A2 isolé sous la forme du carbonate donne les résultats suivants:
<EMI ID=36.1>
Trouvé : C, 44,35; H, 7,83; N, 9,21; 0, 38,61 % (par . différence) L'antibiotique Bu-2183 A2 n'absorbe qu'à l'extrémité du spectre ultraviolet. A l'état de pastille dans le bromure de potassium, il donne un spectre infrarouge qui est sensiblement tel qu'à la Fig. 3. Après dissolution dans l'oxyde de deuterium à environ 6%, le spectre de résonance magnétique nu- cléaire du chlorhydrate de l'antibiotique Bu-2183 A2 est sen-
<EMI ID=37.1>
être distingué de l'antibiotique Bu-2183 A et de l'antibiotique Bu-2183 B par le signal du radical n-butyryle dans le spectre de résonance magnétique nucléaire pour ô = 0,92 (3H, t), 1,63
(2H, sextet) et 2,30 (2H, t) ppm, alors que les antibiotiques
A et B comprennent les signaux des radicaux propionyle et acétyle.
La structure de l'antibiotique Bu-2183 A2 est la suivante:
<EMI ID=38.1>
Bu-2183 B
L'antibiotique Bu-2183 B est fort semblable,par son
<EMI ID=39.1>
du fait qu'il est une base amorphe blanche hydrosoluble, faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol et pratiquement insoluble dans le n-butanol, l'acétone et les autres solvants organiques courants.
L'antibiotique Bu-2183 B peut former des sels avec des acides,de sorte que les sels d'addition d'acides pharmaeeutiquenent acceptables de cet antibiotique font aussi l'objet de l'invention.
L'antibiotique Bu-2183 B donne des réactions positives à la ninhydrine et à l'anthrone, nais négatives avec les réac-tifs de Tollens, de Fehling et de Sak aguchi.
La pouvoir rotatoire spécifique de l'antibiotique
<EMI ID=40.1>
eau).
Un échantillon de l'antibiotique Bu-2183 B précipité à partir d'une solution éthanolique donne à l'analyse les résultats suivants:
<EMI ID=41.1>
différence) Le di-N-acétate de l'antibiotique Bu-2183 B se pré-
<EMI ID=42.1>
différence) L'antibiotique Bu-2183 B est faiblement basique et comprend des radicaux décelables par titrage dont les pKa sont de 7,15 et 9,35 dans l'eau. Le poids moléculaire approximatif de l'antibiotique d'après le titrage est de 409.
L'antibiotique Bu-2183 B n'absorbe qu'à l'extrémité
du spectre ultraviolet. A l'état de pastille dans le bromure
de potassium, il présente un spectre d'absorption dans l'infrarouge sensiblement tel qu'à la Fig. 5 avec des bandes d'ab-
<EMI ID=43.1>
chlorhydrate de l'antibiotique Bu-2183 B présente un spectre de résonance magnétique nucléaire sensiblement tel qu'à la Fig. 6. Ce spectre montre que l'antibiotique Bu-2183 B peut être distingué des antibiotiques Bu-2183 A et Bu-2183 A2 par
<EMI ID=44.1>
que les spectres des antibiotiques A et A2 comprennent les signaux des radicaux propionyle et n-b utyryle respectivement.
L'antibiotique Bu-2183 B répond à la formule:
<EMI ID=45.1>
Caractérisation du composé intermédiaire Bu-2183 D
Le constituant inerte Bu-2183 D est une base amorphe blanche hydrosoluble, faiblement soluble dans le méthanol et l'éthanol et pratiquement insoluble dans le n-butanol, l'acétone et les autres solvants organiques courants.
Le constituant Bu-2183 D peut former des sels avec les acides,de sorte que les sels d'addition d'acides de cette base font aussi l'objet de l'invention.
Le constituant Bu-2183 D donne des réactions positives à la ninhydrine et à l'antbrone, mais négatives avec les réac-
<EMI ID=46.1>
Un échantillon du constituant Bu-2183 D isolé à l'état de carbonate donne les résultats suivants à l'analyse:
<EMI ID=47.1>
différence) Le constituant Bu-2183 D est faiblement basique et
<EMI ID=48.1>
ron 6,95 (2 équivalents) et 9,68 dans l'eau.
Le tri-N-acétate du constituant Bu-2183 D se présen-
<EMI ID=49.1>
le identique au di-N-acétate du constituant Bu-2183 B.
Le constituant Bu-2183 D n'absorbe qu'à l'extrémité du spectre ultraviolet. A l'état de pastille dans le bromure de potassium, il présente un spectre d'absorption infrarouge sensiblement tel qu'à la Fig. 7. Ce spectre ne comprend pas les bandes d'absorption dues aux radicaux carbonyle d'amide existant dans les antibiotiques Bu-2183 A, Bu-2183 A2 et
<EMI ID=50.1>
le chlorhydrate du constituant Bu-2183 D présente un spectre
de résonance magnétique nucléaire sensiblement tel qu'à la Fig. 8. La structure du constituant Bu-2183 D est la suivante:
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
L'hydrolyse acide ménagée des constituants Bu-2183 A et Bu-2183 B dans l'acide chlorhydrique IN méthanolique à 80[deg.]C pendant <3> heures donne le même composé désacylé de formule glo-
<EMI ID=53.1>
lé par séparation chromatographique du complexe Bu-2183 brut. La N-acétylation totale du constituant Bu-2183 D donne le tri-
<EMI ID=54.1> Bu-2183 B.
L'hydrolyse acide du constituant Bu-2183 B dans le chlorure d'hydrogène méthanollque à la saturation pendant 24 heures à la température de reflux donne une aglucone et un amino-sucre, outre le constituant Bu-2183 D. L'aglucone est
<EMI ID=55.1>
tats suivants:
Analyse pour ClOH20N206
<EMI ID=56.1>
désosy-D-sorbitol à partir du 4-amino-4-désoxy-D-glucose a permis d'observer que le produit se révèle être cette aglucone à la chromatographie en couche mince et à l'analyse par résonance magnétique nucléaire.
L'amino-sucre obtenu après la méthanolyse acide cidessus du constituant B,purifié par chromatographie sur résine
<EMI ID=57.1> dant à 185-186[deg.]C dont l'analyse donne les résultats suivants:
<EMI ID=58.1>
side et le méthyl-4-amino-li--désoxy-p-D-glucopyrano s ide respectivement,à l'examen du spectre infrarouge et du spectre de résonance magnétique nucléaire de leurs dérivés tétra-N,O-acétylés. Les spectres infrarouges d'échantillons authentiques de ces sucres isolés à partir de la 4-tréhalosamine (J. Antibiotics,
<EMI ID=59.1>
échantillons expérimentaux.
L'hydrolyse acide du constituant Bu-2183 D dans l'acide chlorhydrique 6N au reflux pendant 3 heures donne la même aglucone et le même amino-sucre que ceux isolés par hydrolyse du constituant Bu-2183 B.
Le constituant Bu-2183 C isolé par chromatographie du complexe Bu-2183 brut et hydrolyse dans le chlorure d'hydrogène
<EMI ID=60.1>
D'après les résultats ci-dessus, les structures des différents constituants du complexe Bu-2183 sont les suivantes:
<EMI ID=61.1>
Activité antimicrobienne
Les essais in vitro montrent que le complexe Bu-2183
<EMI ID=62.1>
et Bu-2183 B ont un spectre antibactérien large. Le complexe antibiotique et ses constituants actifs sont spécialement utiles pour inhiber la plupart des organismes qui sont résistants
<EMI ID=63.1>
plus actif que l'antibiotique Bu-2183 B, mais moins actif que l'antibiotique Bu-2183 A.
Les concentrations inhibitrices minimales des antibiotiques Bu-2183 A et Bu-2183 B peuvent être déterminées à l'égard de nombreuses bactéries par dilution dans le rapport de 1:2 sur gélose nutritive. L'expérience est effectuée avec le dispositif d'inoculation en double de Steers et Collaborateurs. Le volume d'inoculum est ajusté pour que la dilution soit de
104 d'une culture âgée de une nuit des organismes à examiner dans du bouillon d'infusion de coeur (Société Difco). Les résultats sont rassemblés au tàbleau VI avec ceux que donne la <EMI ID=64.1>
Les concentrations inhibitrices minimales indiquent que les activités intrinsèques des anti biotique Bu-2183 A et Bu-2183 B sont modérées à assez faibles, le premier anti-
<EMI ID=65.1>
le spectre d'activité antibactérienne est large contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives, notamment de nombreux
<EMI ID=66.1>
glucosides.
Le tableau VII mentionne les concentrations inhibitrices minimales des antibiotiques Bu-2183 A et Bu-2183 A2 contre divers organismes pathogènes.
Un échantillon du complexe Bu-2183 d'une pureté d'environ 30 à 40% s'est révélé propre à inhiber E. coli A20365 à une concentration de 12,5 ug/ml, K. pneumoniae D-ll à une
<EMI ID=67.1>
Effet du pH du milieu sur la concentration inhibitrice minimale
L'effet du pH du milieu sur la concentration inhibitrice minimale de l'antibiotique Bu-2183 A est observable
par dilution dans le rapport de 1:2 sur gélose nutritive à
<EMI ID=68.1>
VIII montrent que l'activité de l'antibiotique Bu-2183 A augmente à mesure que le pH s'élève et diminue à mesure qu'il baisse.
Effet de la composition du milieu
L'effet de la composition du milieu sur l'activité de l'antibiotique Bu-2183 A et de l'antibiotique Bu-2183 B a pu être observé sur 8 organismes d'essai. Les milieux examinés sont la gélose nutritive, la gélose à l'infusion de coeur et la gélose de Mueller-Hinton. Le pH du milieu est toujours ajus-
<EMI ID=69.1> est maximale sur gélose nutritive.
Activité in vivo et toxicité
L'activité et la toxicité des antibiotiques Bu-2183 A
<EMI ID=70.1>
gène à l'état de suspension à 5% dans de la mucine gastrique de porc. L'antibiotique est administré par voie sous-cutanée en dose simple immédiatement après l'infection bactérienne
(heure 0), de même qu'en dose double à l'heure 0 et à l'heure 3 après l'infection. Les souris sont utilisées par groupe de 5 pour chaque dose et les animaux sont observés pendant 5 jours
<EMI ID=71.1>
Les résultats sont rassemblés au tableau X. Les antibiotiques Bu-2183 A et Bu-2183 B sont actifs in vivo contre les trois infections.
La toxicité aiguë des antibiotiques Bu-2183 A et Bu-2183 B est observable chez la souris en administration souscutanée et intraveineuse. Les souris sont observées pendant 15 jours au terme desquels il ressort que les DL50 intraveineuses et sous-cutanées de l'antibiotique Bu-2183 A sont de 2.500 mg/kg
<EMI ID=72.1>
beaucoup moins toxique que l'antibiotique Bu-2183 A et n'entraîne aucune mortalité à des doses atteignant 2.000 mg/kg en administration tant intraveineuse que sous-cutanée au cours des 15 jours d'observation.
Utilisation du constituant Bu-218� D
Le constituant Bu-2183 D,bien qu'inerte du point de vue biologique)est un utile intermédiaire pour la préparation semi-synthétique des antibiotiques Bu-2183 A, Bu-2183 A2 et Bu-2183 B. Ainsi, le radical amino libre du composé interné-diaire Bu-2183 D (après protection appropriée des autres radicaux fonctionnels réactifs) peut être N-acylé de manière classique pour conduire (après élimination des radicaux protecteurs éventuels) l'antibiotique Bu-2183 A ou dérivé N-butyrylé, l'antibiotique Bu-2183 B ou dérivé N-acétylé ou l'antibiotique Bu-2183 A2 ou dérivé N-propionylé .
<EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
TABLEAU II
<EMI ID=75.1>
TABLEAU II (suite)
<EMI ID=76.1>
1) R. Y. Stanier, N. J. Palleroni & M. Doudoroff: The Aérobic <EMI ID=77.1>
Spécial Référence To Their Modes Of Metabolism Of Carbon Compounds, J. Gen. Appl. Microbiol. 9: 83-95, 1963
5) V. B. D. Skerman: Abstracts Of Microbiological Methods.
<EMI ID=78.1>
page 364, 1969.
TABLEAU III
<EMI ID=79.1>
TABLEAU III (suite)
<EMI ID=80.1>
TABLEAU III (suite)
<EMI ID=81.1>
<EMI ID=82.1>
sels minéraux exempts de vitamine de Hutner.
TABLEAU IV
<EMI ID=86.1>
TABLEAU VII
<EMI ID=83.1>
TABLEAU V
Chromatographie en couche mince des constituants
<EMI ID=84.1>
TABLEAU VI
<EMI ID=85.1>
TABLEAU VI (suite)
Spectre antibactérien des antibiotiques Bu-2183 A et Bu-2183 A2
<EMI ID=87.1>
TABLEAU VII (suite)
<EMI ID=88.1>
TABLEAU VIII
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
TABLEAU IX
Effet du milieu sur l'activité des antibiotiques <EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
TABLEAU X
Activité in vivo des antibiotiques Bu-218� A et Bu-218� B
<EMI ID=93.1>
TABLEAU X (suite)
<EMI ID=94.1>
Les exemples suivants illustrent L'invention sans la limiter.
Les résines Amberlite IRC-50 et CG-50 sont des résines échangeuses de cations faiblement acides de type polyméthacrylate à radicaux carboxyle.
EXEMPLE 1 - (Fermentation en cuve)
On utilise une culture de Pseudomonas sp., souche D946-B83 sur gélose inclinée pour inoculer 100 ml de milieu d'ensemencement n[deg.] 83B (3% de glucose, 2% de farine de poisson,
<EMI ID=95.1>
en incubation à 28[deg.]C pendant 3 jours sur une secoueuse rotative à 250 tours par minute, puis on utilise 1 litre de la culture d'ensemencement pour inoculer 300 litres de bouillon de fer-
<EMI ID=96.1>
pouvoir antibiotique du bouillon au moyen de disques de papier sur gélose contre B. subtilis PCI 219 en prenant l'antibiotique Bu-2183 A comme étalon. Les résultats sont les suivants:
<EMI ID=97.1>
EXEMPLE 2 - (Extraction)
Au moyen d'un auxiliaire de filtration, on filtre à
<EMI ID=98.1>
de filtrat dont l'activité est à peu près l'équivalent de 30 g d'antibiotique Bu-2183 A, puis on agite le filtrat avec 3 litres de résine Amberlite IRC-50 sous forme ammonique. On sépare la résine, on la lave avec 10 litres d'eau, puis avec 5 litres d'hydroxyde d'ammonium N/50, après quoi on agite la résine avec
<EMI ID=99.1>
les antibiotiques. On combine les éluats actifs, on les concentre sous vide et on les lyophilise pour obtenir 18,6 g d'un
<EMI ID=100.1>
de l'eau et on verse la solution sur une colonne de 400 ml de résine Amberlite CG-50 sous forme ammonique. On lave la colonne avec 2,2 litres d'eau, puis 3 litres d'bydroxyde d'ammonium
<EMI ID=101.1>
monium N/20. On recueille les fractions éluées dont on apprécie le pouvoir antibiotique sur gélose avec B. subtilisa de même que par chromatographie en couche mince (système S-117 et ninhydrine). On combine les fractions convenables, on les concentre sous vide et on les lyophilise pour obtenir les solides ci-après:
<EMI ID=102.1>
<EMI ID=103.1>
On dissout dans de l'eau les 2,7 g d'antibiotique
Bu-2183 A brut obtenu dans l'exemple 2 et on verse la solution sur une colonne de 80 ml de résine Amberlite CG-50 sous forme ammonique. On élue la colonne avec de l'hydroxyde d'ammonium
N/20 et on recueille l'éluat par fractions de 15 ml. On examine les différentes fractions par chromatographie en couche
mince et à la ninhydrine, de même que par dosage biologique,
puis on combine les fractions convenables, on les concentre
sous vide et on les lyophilise pour obtenir les solides suivants:
<EMI ID=104.1>
A l'analyse l'échantillon d'antibiotique Bu-2183 A pur donne les résultats suivants:
<EMI ID=105.1>
Le spectre infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire de cet antibiotique sont donnés aux Fig. 1 et 2. Un résumé de l'analyse du spectre de résonance magnétique nuclé-
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
s = singulet; d = doublet; t = triplet; q= quadruplet; m = multiplet
EXEMPLE 4 - (Préparation de l'antibiotique Bu-2181 B)
On dissout dans de l'eau les 3,3 g d'antibiotique Bu-2183 B brut obtenu dans l'exemple 2 et on verse la solution sur une colonne de 130 ml de résine Amberlite CG-50 sous forme ammonique. On élue la colonne avec de l'hydroxyde d'ammonium N/20 en recueillant des fractions de 15 ml. On examine les fractions par chromatographie en couche mince et à la ninhydrine, de même que par dosage biologique, puis on combine les fractions convenables, on les concentre sous vide et on les lyophilise pour obtenir les solides ci-après:
<EMI ID=108.1>
L'analyse d'un échantillon pur d'antibiotique Bu-2183 B donne les résultats suivants:
<EMI ID=109.1>
Le sepctre infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire de cet antibiotique sont donnés aux Fig. 5 et 6. Un résumé de l'examen du spectre de résonance magnétique nucléaire est donné ci-après:
<EMI ID=110.1>
s = singulet; d = doublet; m = multiplet
<EMI ID=111.1>
couche mince et réaction à la ninhydrine. On combine les fractions convenables qu'on concentre sous vide et qu'on lyophilise pour obtenir les solides suivants:
<EMI ID=112.1>
EXEMPLE 6 - (Préparation de l'antibiotique Bu-2183 A2)
Au cours de la purification de l'antibiotique Bu-2183 A comme dans l'exemple 3, on isole des fractions de tête un nouveau constituant actif auquel on attribue l'indice Bu-2183 A2' L'antibiotique Bu-2183 A2 diffère de l'antibiotique Bu-2183 A
à la chromatographie en couche mince des systèmes S-117 et S-122 comme indiqué ci-après:
<EMI ID=113.1>
Le spectre infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire de l'antibiotique Bu-2183 A2 sont donnés aux Fig. 3 et 4. Un résumé de l'analyse du spectre de résonance magnétique nucléaire est donné ci-après:
<EMI ID=114.1>
REVENDICATIONS
1.- Procédé pour produire le complexe antibiotique Bu-2183, caractérisé en ce qu'on cultive Pseudomonas sp.,
<EMI ID=115.1>
une température de 4 à 37[deg.]C, jusqu'à formation d'une quantité sensible du complexe Bu-2183 par cet organisme dans le milieu de culture.