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PATENTANSPRÜCHE
1. Protein KUD-PC, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften: (a) Elementaranalyse: enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel; C 49,98%, H 7,27%, N 15,23%, S 1,08%; (b) Molekulargewicht: 11 500 nach der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese; (c) Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung); (d) spezifische Drehung: [ai0 = -55,8, c = 1,0, HzO; (e) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 1 dargestellt; (f) Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 2 dargestellt; (g) Löslichkeit: löslich in Wasser, unlöslich in organischen Lösungsmitteln; (h) Farbreaktionen: positiv:
Folin-Lowry-, Biuret- und Rydon-Smith-Reaktionen, negativ: Phenol-H2SO4- und Anthron-H2SO4-Reaktionen, HC1-Hydrolysat: positiv auf Ninhydrin-Reaktion; (i) Natur: pH 4 bis 8 in 0,1%iger wässeriger Lösung; (Farbe und Kristallform: farblose Kristalle; (k) Aminosäurezusammensetzung: das molare Verhältnis der Aminosäureanalyse des HC1-Hydrolysates ist die folgende: Aspartinsäure 0,144 Threonin 0,258 Serin 0,226 Glutaminsäure 0,141 Prolin 0,111 Glycin 0,250 Alanin 0,363 Valin 0,265 Isoleucin 0,016 Leucin 0,117 Methionin Tyrosin 0,020 Phenylalanin 0.079 Lysin 0,089 Arginin 0,040 Histidin (Spuren) (1) Elektrophorese:
das elektrophoretische Profil der SDS Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ist in Fig. 3 dargestellt, und die Substanz weist eine einzige Spitze auf.
2. Verfahren zur Herstellung der neuen proteinartigen Substanz KUD-PC, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das Protein KUD-PC erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, in einem Nährmedium erzeugt, das Protein KUD-PC in der Kulturmasse anreichert und die derart erhaltene proteinartige Substanz KUD-PC daraus isoliert.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der die proteinartige Substanz KUD-PC erzeugende Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, Streptosporangium pseudovulgalae PO-357 FERM-P Nr. 3571 ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das neue Protein KUD-PC und auf dessen Herstellung. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Protein KUD PC, welches durch Züchtung eines das Protein KUD-PC erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, erzeugt wird, und die Antitumorwirksamkeit erhöht.
Es wurde gefunden, dass ein Mikroorganismenstamm PO.
357, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört und aus einer Bodenprobe, gesammelt in Setagaya-ku, Tokyo, Japan, isoliert wurde, das Antibiotikum PO-357 erzeugt (welches später als Sporamycin bezeichnet wurde), welche antibakterielle Aktivität gegen Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis sowie Antitumorwirksamkeit aufweist. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Substanz sowie die taxonimischen Eigenschaften des erzeugenden Mikroorganis.
menstammes wurden in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 53-7601 offenbart.
Es wurde nun eine physiologisch-aktive Substanz gefunden, welche keine antibakterielle Aktivität besitzt, elektropho retisch von Sporamycin verschieden ist und die Antitumorwirksamkeit von Antitumorsubstanzen erhöht, und diese phy siologisch aktive Substanz wurde als das Protein KUD-PC bezeichnet.
Das neue Protein KUD-PC der vorliegenden Erfindung (im folgenden bezeichnet als KUD-PC) weist die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften auf: (a) Elementaranalyse: enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel; C 49,98oö, H 7,270 ó, N 15,23%, S 1,08''in (gefunden nach dem Trocknen bei 100 " während 3 Stunden im Vakuum).
(b) Molekulargewicht: 11 500 berechnet durch Vergleich mit Standard-Substanzen (Standard-Polypeptid oder Standard-Protein vom Molekulargewicht 2512 bis 16949) durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese: (c) Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung); (d) spezifische Drehung: [aD = - 55,8 (c = 1,0, H20); (e) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
UV-Spektrum von KUD-PC in wässeriger Lösung und 0,1 N NaOH ist in Fig. 1 dargestellt; Xma Y 253,259,265,268 (Schulter), 275, 280 (Schulter) nm, g ' NjOH = 294 nm; (f) Infrarot-Adsorptionsspektrum: Fig. 2 (KBr); (g) Löslichkeit: löslich in Wasser und unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, Aceton und Benzol; (h) Farbreaktion: positiv: Folin-Lowry, Biret- und Rydon.
Smith-Reaktion, negativ: Phenol-H2SO4- und Anthron H2SO4-Reaktion, positiv für Ninhydrin-Reaktion: HCI- Hydrolysat; (i) Farbe und Kristallform: farblose Kristalle, Kristalle erhalten durch Ultrafiltration von wässriger Lösung sind Kristalle von hexagonalen Systemen und durch Ammoniumsulfat ausgesalzene Kristalle sind prismatisch; (i) Natur: pH 4 bis 8 (0,1 '!oige wässerige Lösung von KUD-PC); (k) Aminosäureanalyse:
KUD-PC (5 mg) wurde hydrolysiert mit HCI in einem versiegelten Röhrchen und durch Flüs sigchromatographie (Hitachi Model 0,34-2U) analysiert: Aminosäure (ILM) Aspartinsäure 0,144 Threonin 0,258 Serin 0,226 Glutaminsäure 0,141 Prolin 0,111 Glycin 0,250 Alanin 0,363 Valin 0,265 Isoleucin 0,016 Leucin 0,117 Methionin
Aminosäure (llM) Tyrosin 0,020 Phenylalanin 0,079 Lysin 0,089 Arginin 0,040 Histidin (Spur) (1) Elektrophorese: das elektrophoretische Profil, analysiert durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und ausgezeichnet durch einen Chromato-Scanner (Shimazu CS-910) ist in Fig. 3 dargestellt als einzelne Substanz.
Das elektrophoretische Muster mittels Celluloseacetatmembran-Elektrophorese (Cellulo Gel RS, pH 2, 1 M Acetat Formiat-Puffer, 200 V, 1 Stunde, Amido schwarz 1OB-Färbung) ist in Fig. 4 als einzelnes Band dargestellt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des neuen Proteins KUD-PC ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen das Protein KUD-PC erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, in einem Nährmedium züchtet und das gebildete KUD-PC daraus isoliert.
Medium Wachstum Saccharose- Nitrat-Agar schwach
Glucose-Aspargin-Agar schwach
Glycerin-Aspargin-Agar schwach anorganisches Salz-Stärke-Agar schwach
Tyrosin-Agar mässig
Nähr-Agar mässig-gut Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar gut
Hafermehl-Agar gut 3. Physiologische Eigenschaften (1) Wachstumstemperatur: möglich bis 43 "C, optimales Wachstum bei etwa 27 bis 30 "C.
(2) Melaninerzeugung: negativ auf Tyrosin-Agar.
(3) Verflüssigung von Gelatine: positiv.
(4) Hydrolyse von Stärke: positiv.
(5) Peptonisierung von Milch: positiv.
(6) H2S-Bildung: negativ.
(7) Nitratreduktion: positiv.
4. Verwertung der Kohlenstoffquelle
Beobachtet auf Pridham-Gottlieb-Agarmedium, enthaltend 0,05% Hefeextrakt.
Verwertung: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Mannose.
Mögliche Verwertung: D-Galactose, D-Raffinose, L Rhamnose, D-Fructose.
Keine Verwertung: Inosit, Saccharose.
5. Zellenwandzusammensetzung
Die Analyse der Zellwände erfolgte nach der Methode von Becker et al. [appl. Micorbiol., 13, 236-243 (1965)].
DAP* Glycin Arabinose Galactose
Meso-Typ -* - - * Diaminopinolinsäure.
** nicht festgestellt.
Der KUD-PC erzeugende Stamm gehört zur Gattung Streptosporangium, wie oben beschrieben, und der Stamm PO-357, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört und durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, ist nur ein Beispiel für einen in der vorliegenden Erfindung mit Erfolg anwendbaren Mikroorganismus.
Die taxonomischen Eigenschaften des genannten Stammes sind die folgenden: 1. Morphologische Eigenschaften
Die mikroskopische Untersuchung ergab, dass das Luftmycelium gerade ist, wobei sich die meisten Sporangien an der Spitze des Myceliums befinden. Die Grösse des Sporangiums beträgt 5 bis 10 u, durchschnittlich 7,5 u im Durchmesser. Die Länge der Sporangien, welche Lufthyphen tragen, ist kurz und im allgemeinen etwa 3 u. Die Sporen sind rund oder eiförmig, mit glatter Oberfläche und einem Durchmesser von 0,9 bis 1,4 u. Es wurden keine Flagellen beobachtet.
2. Kultureigenschalten auf verschiedenen Medien
Beobachtung bei 27 "C nach 10- bis 14tägiger Züchtung.
Rückseite Luft-Mycelium lösliches Pigment hellorange milchig-weiss keines hellgelb milchig-weiss keines hellgelb milchig-weiss keines bräunlichweiss-weiss milchig-weiss keines hellorange hellorange keines orange orange keines orange orange keines dunkelorange dunkelorange keines
Verschiedene der obigen taxonomischen Eigenschaften weisen deutlich darauf hin, dass der Stamm PO-357 ein Mikroorganismus ist, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört.
Unter den bekannten Arten ist Streptosporangium pseudovulgalae Nonomura [J. Ferm. Tech. Japan, 47, 701-709 (1969)] nahe verwandt mit dem Stamm PO-357, doch bestehen Unterschiede, insbesondere in der Farbe des Luftmyceliums und in den biologischen Aktivitäten. Deshalb wird der Stamm PO-357 bezeichnet als Streptosporangium pseudovulgalae PO-357. Der Stamm wurde am 25. Mai 1976 im Institute for Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi l-chome, Yatabe-machi, Tsubuka-gun, Ibarakiken 305, Japan, hinterlegt und mit der Hinterlegungs-Nummer: FERM P Nr. 3571 bezeichnet.
In der vorliegenden Erfindung können nicht nur Streptosporangium sp. PO-357, sondern auch dessen natürliche oder künstliche Mutanten, erhalten durch Einwirkung von Ultraviolett-, Röntgenstrahlen, Strahlungs- oder chemischen Mutagenen, wie auch die Mikroorganismen, welche zur Gattung Streptosporangium gehören und die Fähigkeit besitzen, das neue Protein KUD-PC zu erzeugen, für die Herstellung von KUD-PC verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung werden die KUD-PC erzeugenden Mikroorganismen, welche zur Gattung Streptosporangium gehören, in einem üblichen Medium gezüchtet.
Die Züchtung kann in dem üblichen Medium im allgemeinen wie für Streptomyces durchgeführt werden. Bezüglich des Mediums kann ein Nährmedium verwendet werden, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können Glucose, Sacharose, Melassen, Stärke, Dextrin, Glycerin und organische Säuren allein oder in Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquellen eignen sich Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Soyabohnenpulver, Maiseinweichflüssigkeit, Baumwollsamenkuchen, Casein, Soyabohnenprotein-Hydrolysat, Aminosäuren und Harnstoff allein oder in Mischungen. Falls erforderlich, können anorganische Salze, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumoder Phosphatsalze zugesetzt werden.
Ferner können gegebenenfalls Nähr-Spurenelemente oder Wachstumsanreger, welche das Wachstum der Mikroorganismen oder die Erzeugung von KUD-PC beschleunigen, zugesetzt werden.
Die Züchtung kann vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, z.B. in einer Schüttelkultur oder in einer submersen belüfteten Kultur bei neutralem pH und 27 bis 30 "C während 40 bis 72 Stunden erfolgen. KUD-PC wird in der Kulturbrühe erzeugt. Die Züchtung sollte vorzugsweise beendet werden, wenn die höchste Anreicherung an KUD-PC in der Kulturbrühe erreicht ist. Die Züchtungsbedingungen, wie die Zusammensetzung des Kulturmediums, das pH, die Temperatur, die Bewegung und die Belüftung, können je nach dem verwendeten Stamm und anderen Bedingungen gewählt werden. Schaumverhinderungsmittel, wie Siliconöl, Pflanzenöl oder oberflächenaktive Mittel können zugesetzt werden, falls notwendig.
Da das erzeugte KUD-PC zur Hauptsache in der Kulturbrühe enthalten ist, kann das KUD-PC vorzugsweise aus dem Kulturfiltrat isoliert werden, welches durch Filtration oder Zentrifugation nach eventuellem Zusatz eines Filtrierhilfsmittels abgetrennt wird. Die Isolierung von KUD-PC aus dem Kulturfiltrat kann durch Anwendung der Natur von KUD-PC erfolgen, gemäss welcher das KUD-PC in Wasser löslich ist und in organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, Aceton oder Benzol unlöslich ist. Im allgemeinen kann eine konventionelle Isolier- und Reinigungsmethode für Protein oder Polypeptide angewendet werden.
Aus Aussalzen mit Hilfe von Ammoniumphosphat oder Ammoniumchlorid, die fraktionelle Ausfällung mit Hilfe von Methanol, Äthanol oder Aceton, die Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschern, Ionenaustauschercellulose oder Ionenaustauscher-Sephadex, die Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, Silicagel, Aluminiumoxid, Hydroxyapatit, Zellulose oder Adsorptionsharz, wie HP-10-Harz, die Gel-Filtrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex oder Biogel , die Elektrophorese, die Gegenstromverteilung, die Dialyse, die Ultrafiltration oder die Konzentration können einzeln oder in Kombination oder wiederholt angewendet werden. Die Eluierung in der Chromatographie kann mittels Wasser, wässerigem Alkohol, wässerigem Aceton, Puffer oder wässriger Lösung von anorganischen oder organischen Salzen erfolgen.
Eine Ausführungsform der Isolierung und Reinigung von KUD-PC wird im folgenden ausführlich beschrieben.
Die mit einer Filterhilfe versetzte Kuturbrühe wird filtriert, um die Mycelien zu entfernen. Ammoniumsulfat wird zum Kulturfiltrat in 90 ,Óiger Sättigung unter Kühlung bei neutralem pH zugesetzt. Der ausgesalzene Niederschlag wird durch Filtration oder Zentrifugation gesammelt und in Wasser oder einer neutralen Pufferlösung gelöst. Die Lösung wird unter Kühlung dialysiert oder einer Ultrafiltration unter Verwendung einer semipermeablen Membran zur Entsalzung unterworfen. Als Beispiel einer semipermeablen Membran kann eine synthetische semipermeable Membran verwendet werden, welche Teilchen mit Molekulargewicht unter 1000 und über 10 000 abscheidet, wie UH-L, UK-10 (Produkt von Toyo Roshi Co., Tokyo).
Die zu entsalzende Lösung wird durch eine Säule aus Ionenaustauschercellulose oder Ionenaustauscher- Sephadex nach dem Waschen mit Wasser geführt, um durch ein Eluierungslösungsmittel eluiert zu werden.
Beispiele von lonenaustauschercellulose sind DEAE-Cellulose, ECTEOLA -Cellulose, SE-Cellulose und CM-Cellulose.
Die obigen Ionenaustauschercellulose oder Ionenaustauscher- Sephadex wird vorzugsweise gepuffert mit einer Pufferlösung. Die Eluierungsflüssigkeit ist ein Puffer von anorganischem oder organischem Salz. Beispiele geeigneter anorganischer Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Phosphatsalze, und Beispiele von organischen Salzen sind Natriumacetat oder Natriumformiat in einer Konzentration von 0,01 bis 1 M/Liter. Beispiele von Pufferlösungen sind Phosphat-, Acetat-, Citrat- oder Trishydroxymethylaminomethanpuffer. Das pH der Pufferlösung beträgt pH 5 bis 8, bevorzugt wird ein neutrales pH bei einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 M/ Liter. Im obigen Eluierungsverfahren können die Konzentration der anorganischen oder organischen Salze und der Pufferlösung sowie das pH gegebenenfalls stufenweise oder kontinuierlich verändert werden.
Die Konzentration oder die Entsalzung wird durch Aussalzen durch Ammoniumsulfat, Ultrafiltration oder Dialyse durchgeführt. Die Reinigung der konzentrierten oder entsalzten Lösung von KUD-PC wird bevorzugt durch Gel-Filtrationschromatographie durchgeführt. Beispiele von Gel-Filtrationsmitteln sind Biogel P10 , Biogel P-30 oder Sephadex G-75 (Markennamen).
Die Eluierung kann mit Wasser oder Pufferlösung erfolgen.
Das KUD-PC kann aus der derart hochgereinigten Lösung von KUD-PC kristallisiert werden. Beispielsweise kann die hochgereinigte Eluatlösung von KUD-PC, erhalten durch Ionenaustauscherchromatographie und/oder Gel-Fil trationschromatographie, der Ultrafiltrationskonzentration und/oder Ammoniumsulfatausfällung unterworfen werden, um das kristalline KUD-PC zu erhalten. Wenn es nicht kristallisiert kann KUD-PC durch weitere Chromatographieoder Lyophilisierungsverfahren isoliert werden.
Die biologischen Eigenschaften von KUD-PC sind die folgenden: 1) Antimikrobielle Wirkung
KUD-PC zeigt keine antibakterielle Wirkung gegen Testorganismen, wie Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis und Bacillus cereus.
2) Cytoclasis-Wirkung
Cytoclasis- (cytotoische) Wirkung von KUD-PC ist in Tabelle I dargestellt, in welcher KUD-PC eine starke cytoclasische Wirkung gegen BHK-Zellen aufweist.
Tabelle I KUD-PC Sporamycin 3H-TdR IH-UR Protein ug/ml U/ml
0 2,5 4 21 22
0 5 5 24 23
0 10 55 30 42
0,1 2,5 27 -13 22
1 2,5 26 -27 28 10 2,5 42 0 17
0,1 5 49 14 42
1 5 34 - 3 30 10 5 33 -12 23
0,1 10 84 43 52
1 10 68 44 41 10 10 42 5 30 3) Antitumorwirkung (1) Experimentelle Methode: (a) Sarcoma 180, 1 x 105 Zellen, werden subcutan in ddY Mäuse inoculiert. Nach 3 Tagen wird ein Gemisch von Sporamycin und KUD-PC intravenös verabreicht. Weiteres KUD-PC wird intravenös an den Tagen 4, 5 und 6 verabreicht, um die Lebensverlängerungswirkungen zu beobachten.
(b) Wirkung gegen Ehrlich-Ascites-Carcinoma:
Ehrlich-Ascites-Carinoma, 2,5 x 106 Zellen, werden intraperitoneal in ddy-Mäuse (5 Mäuse in einer Gruppe, 5 Wochen alt) inoculiert. Am nächsten Tag wird ein Gemisch von Sporamycin und KUD-PC verabreicht, um die lebensverlängernde Wirkung zu beobachten.
(2) Evaluierung: behandelt x 100-100 = Lebensverlängerung (%) nicht behandelt x 100-100 = Lebensverlängerung (%) (3) Kombinationswirkung von KUD-PC und Sporamycin gegen tierische transplantierbare Carcinoma, Ehrlich-Ascites
Carcinoma ist in Tabelle Il-l und II-2 dargestellt, gemäss welchen KUD-PC eine Antitumorwirksamkeit von Sporamy cin erhöht.
Tabelle II-I
Probe Lebens- Anzahl Mäuse
KUD-PC Sporamycin verlängerung mit über 60 mg/kg U/kg (%) Tagen Lebens verlängerung
0 0 0 0/7
2,5 0 10 0/7
10 0 13 0/7
0 3,000 35 0/7
2,5 3,000 65 2/7
10 3,000 70 3/7
0 6,000 43 1/7
2,5 6,000 161 5/7
10 6,000 161 4/7
Tabelle II-2
Sporamycin KUD-PC Anzahl Lebensverlänge (U/mg) (mg/kg) Zwischenleben- rungstage ( /0) verlängerungs tage - - 21 0
1500 10 33 57
2,5 29 38
0,63 38 81
0,15 32 52 - 29 38
750 10 27 29
2,5 33 57
0,63 45 114
0,15 32 52 - 26 24
188 10 23 10
2,5 25 19
0,63 43 105
0,15 37 76 - 25 19 4) Toxizität
Akute Toxizität (LDso) von KUD-PC ist wie folgt: Mäuse i.p. LD5o > 2000 mg/kg Mäuse i.v.
LDso > 2000 mg/kg
In den beiliegenden Zeichnungen stellt:
Fig. 1 das UV-Spektrum von KUD-PC,
Fig. 2 das IR-Spektrum von KUD-PC,
Fig. 3 das elektrophoretische Profil von KUD-PC in der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, Fig. 4 di e Cellul die Celluloseacetat-Membran-Elektrophorese von KUD-PC, und
Fig. 5 die Biogel P-30 -Säulenchromatographie von KUD-PC und Sporamycin dar.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1
Eine Öse voll Mikroorganismen aus einer Schrägkultur von Streptosporangium pseudovulgalae PO-357, FERM-P Nr.3571, wurden in ein flüssiges Medium A inokuliert, welches 2,0% Glukose, 0,3% Trockenhefe, 0,5% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,3% Calciumcarbonat, und 0,5% Natriumchlorid enthielt (pH 7,0, 100 ml) in einem 500 ml Sakaguchi Kolben, und der Schüttelkultur bei 70 Touren pro Minute bei 27 C während 72 Stunden unterworfen. 10 ml dieser Impfkultur wurde in Medium B inokuliert, welches 0,2% Glukose, 1,5% Stärke, 0,15% Trockenhefe, 0,23% Pepton, 0,3% Fleischextrakt und 0,25% Calciumcarbonat enthielt (100 ml, pH 7,0) in zehn 500 ml Sakaguchi-Kolben und diese bei 170 Touren pro Minute, bei 27 "C während 48 Stunden der Schüttelkultur unterworfen.
1 Liter dieser zweiten Impfkultur wurde in 130 Liter des Mediums A in einem 200 Liter Tank aus rostfreiem Stahl inokuliert und der submersen Belüftungskultur unter einer Belüftung von 100 Litern/Minute, Rühren mit 250 Touren pro Minute, einem inneren Druck von 0,5 kg/cm2, bei 28 C während 72 Stunden unterworfen. Das KUD-PC wurde durch Celluloseacetat-Membran-Elektrophorese in der Kulturbrühe festgestellt. Die Kulturbrühe (115 Liter) wurde auf unter "C gekühlt, mit Hyflosupercel (Markenname) (2,3 kg) versetzt und durch eine Filterpresse filtriert.
Das filtrierte Mycelium wurde mit Wasser gewaschen, das Waschwasser mit der filtrierten Brühe vereint und das Ganze auf unter 5 C gekühlt, dann mit 400 g Hyflosupercel versetzt und mit Ammoniumsulfat (82,5 kg) bis zu einer 90%igen Ammoniumsulfatsättigung vermischt. Das Gemisch wurde bei unter 5 "C während 1 Stunde gerührt und der derart gebildete Niederschlag gesammelt, um 900 g nasses festes Material zu gewinnen. Die folgenden Operationen wurden in einem verdunkelten Raum bei unter 5 C durchgeführt.
Das oben erhaltene feste Material wurde in 3 Liter Wasser gelöst, filtriert, um unlösliches Material zu entfernen, und dieses letztere mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung wurden vereint (total 4 Liter). Ammoniumsulfat (2,5 kg) wurde zugesetzt, um eine 90%ige Sättigung an Ammoniumsulfat zu erzielen, das Gemisch während 1 Stunde gerührt und filtriert, um das ausgefällte Material (102 g) zu erhalten, welches in 450 ml Wasser gelöst wurde. Die Lösung wurde mit einer Cellophanröhre gegen deionisiertes Wasser (30 Liter) dialysiert während 3 Tagen. Das deionisierte Wasser wurde einmal täglich ersetzt. Die derart erhaltene entsalzte Lösung (1170 ml) wurde auf eine Säule (9 x 50 cm) aus DEAE-Zellulose (Produkt von Brown Co., USA, körniger Typus) verbracht, welche zuvor mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,5 bis 8,0) gepuffert worden war.
Die Eluierung erfolgte mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,4, 6,4 Liter) und 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,4, 5 Liter) in der angegebenen Reihenfolge, wobei das Eluat in 30-ml-Fraktionen fraktioniert wurde. Jede Fraktion wurde nach der Folin-Lawry-Protein nachweismethode und durch biologischen Versuch unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P untersucht, und KUD-PC wurde in den Fraktionen Nr. 181 bis 300 festgestellt sowie Sporamycin in den Fraktionen Nr. 321 bis 400. Die Fraktionen, welche KUD-PC enthielten, wurden gesammelt (3,8 Liter) und mit Ammoniumsulfat versetzt, um eine 409obige Sättigung von Ammoniumsulfat zu erzielen, worauf das Gemisch von dem im Laufe einer Stunde gebildeten Niederschlag abfiltriert wurde.
Amoniumsulfat wurde zu dem Filtrat zugesetzt, um eine 90%ige Sättigung zu erzielen, das Gemisch während 1 Stunde gerührt und der Niederschlag gesammelt, welcher in Wasser aufgelöst wurde. Die Lösung (78 ml) wurde über eine Säule (6,0 x 62 cm) aus Biogel P-30 (Markenname, Biorad Laboratories Co.) geführt, mit Wasser eluiert für die Gelfiltration und das Eluat in Fraktionen von je 20 g fraktioniert. Jede Fraktion wurde wie oben nach der Proteinnachweismethode und der biologischen Methode untersucht, wobei die Fraktionen Nr. 41 bis 54(280 ml) erhalten wurden. Die vereinten Fraktionen wurden auf 10 ml konzentriert durch Ultrafiltrationsmembran UH-1 und anschliessend über Nacht unter Kühlung stehen gelassen.
Die ausgeschiedenen Kristalle wurden filtriert, mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und getrocknet, um farblose Kristalle vom hexagonalen System von KUD-PC (120 mg) zu erhalten, Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung).
Die erste Mutterlauge und Waschlösung wurden vereint, mit Ammoniumsulfat auf eine 25%ige Sättigung versetzt und während 3 Tagen unter Kühlung in einem dunklen Raum stehen gelassen. Die ausgeschiedene Kristalle wurden filtriert, mit einer kleinen Menge kalten Wasser gewaschen und getrocknet, wobei prismatische farblose Kristalle von KUD-PC (770 mg) erhalten wurden. Die zweite Mutterlauge und Waschlösung wurden vereint und mit Ammoniumsulfat bis zu 30%iger Sättigung versetzt, um 560 mg Kristalle zu erhalten. Ferner wurde diese dritte Mutterlauge mit Ammoniumsulfat bis zu einer Ammoniumsulfatsättigung von 60% behandelt, um weitere 450 mg Kristalle zu erhalten.
Die derart erhaltenen farblosen Kristalle vom hexagonalen System und prismatischen Kristalle wurden der Elektrophorese mit einer Celluloseacetatmembran (Chemetron Co., Cellulogel RS , 5 x 12 cm) (1 M Acetat-Formiat-Puffer, pH 2, 200 V, 1 Stunde, gefärbt mit Amid schwarz lOB) unterworfen. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, wurden einzelne identische Banden in derselben Position gefunden. Das elektrophoretische Profil von SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese der farblosen Kristalle vom hexagonalen System ist in Fig. 3 dargestellt (untersucht mit Scanner, Shimazu CS-910), in welcher eine einzelne Bande gefunden wurde.
Beispiel 2
Die Hauptkulturbrühe (116 Liter), welche auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 dargestellt, erhalten wurde, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um die entsalzte Lösung (1080 ml) zu erhalten. Die Lösung wurde auf eine Säule (9 x 50 cm) aus DEAE-Zellulose verbracht, welche zuvor mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,0 bis 7,4) gepuffert worden war, und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, und KUD-PC und Sporamycin enthaltende Fraktionen Nr. 121 bis 260 zu erhalten. Die Fraktionen wurden vereint und wie in Beispiel 1 behandelt auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 90% und Biogel P-30 -Säulenchromatographie, um KUD-PC in den Fraktionen Nr. 41 bis 50 sowie Sporamycin in den Fraktionen Nr. 53 bis 64 zu erhalten. Das Biogel P-30 -Säulenchromatographie-Muster ist in Fig. 5 dargestellt.
Die Fraktionen, welche KUD-PC enthielten, wurden durch Ultrafiltration und Kristallisation auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um farblose Kristalle vom hexagonalen (730 mg) [Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung)], prismatische Kristalle (1,48 g) und Kristalle (0,9 g) zu erhalten.
Diese Kristalle wiesen ein einzelnes Band in derselben elektrophoretischen Position durch Zelluloseacetat-Membran Elektrophorese auf.
Beispiel 3
Eine Hauptkulturbrühe, welche wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, um durch DEAE-Zellulosesäulechromatographie Niederschläge mit Ammoniumsulfat von 40 bis 9Ob Sättigung von KUD-PC enthaltenden Fraktionen zu erhalten.
Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst (70 ml) und über eine Säule (6 x 78 cm) aus Sephadex G-50 , welche zuvor mit Wasser aufgequollen worden war, zwecks Gelfiltrationschromatographie geführt. Das mit Wasser erhaltene Eluat wurde in 20-g-Fraktionen fraktioniert. Jede Fraktion wurde durch Proteinbestimmung untersucht, wobei die Fraktionen Nr. 56 bis 80 erhalten wurden, welche KUD-PC enthielten.
Die Lösung wurde entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert, und das Konzentrat (100 ml) wurde lyophilisiert, um weisses, pulveriges KUD-PC (1,45 g) zu erhalten.
Das Produkt zeigte eine einzelne Bande in der Zelluloseacetat-Membran-Elektrophorese und bestätigte dieselbe Substanz wie die farblosen Kristalle vom hexagonalen System und die prismatischen Kristalle, welche im Beispiel 1 erhalten wurden.
Beispiel 4
In Beispiel 1 wurde die Fermentierung im 200-Liter-Tank während 96 Stunden durchgeführt, um eine Hauptkulturbrühe (114 Liter) zu erhalten. Das KUD-PC wurde in der Brühe durch Zelluloseacetat-Membran-Elektrophorese festgestellt, während Sporamycin im biologischen Versuch nicht festgestellt wurde.
Die Hauptkulturbrühe wurde nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 gereinigt, um Farblose Kristalle vom hexagonalen System (50 mg) [Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zer- setzung)] und prismatische Kristalle (1,89 g) zu erhalten.
Diese Kristalle wiesen eine einzelne Bande in der Zelluloseacetat-Elektrophorese auf.
** WARNING ** beginning of DESC field could overlap end of CLMS **.
PATENT CLAIMS
1. Protein KUD-PC, characterized by the following physicochemical properties: (a) Elemental analysis: contains carbon, hydrogen, nitrogen, oxygen and sulfur; C 49.98%, H 7.27%, N 15.23%, S 1.08%; (b) Molecular weight: 11,500 after SDS polyacrylamide gel electrophoresis; (c) Melting point: 258 to 260 C (decomposition); (d) specific rotation: [ai0 = -55.8, c = 1.0, HzO; (e) Ultraviolet absorption spectrum: as shown in Fig. 1; (f) Infrared absorption spectrum: as shown in Figure 2; (g) Solubility: soluble in water, insoluble in organic solvents; (h) color reactions: positive:
Folin-Lowry, Biuret and Rydon-Smith reactions, negative: phenol-H2SO4 and anthron-H2SO4 reactions, HC1 hydrolyzate: positive for ninhydrin reaction; (i) Nature: pH 4 to 8 in 0.1% aqueous solution; (Color and crystal form: colorless crystals; (k) amino acid composition: the molar ratio of the amino acid analysis of the HC1 hydrolyzate is the following: aspartic acid 0.144 threonine 0.258 serine 0.226 glutamic acid 0.141 proline 0.11 glycine 0.250 alanine 0.363 valine 0.265 isoleucine 0.016 leucine 0.117 methionylalineine 0.079 lysine 0.089 arginine 0.040 histidine (traces) (1) electrophoresis:
the electrophoretic profile of SDS polyacrylamide gel electrophoresis is shown in Figure 3 and the substance has a single tip.
2. A process for the preparation of the new protein-like substance KUD-PC, characterized in that a microorganism producing the protein KUD-PC, which belongs to the genus Streptosporangium, is produced in a nutrient medium, the protein KUD-PC is enriched in the culture mass and so obtained proteinaceous substance KUD-PC isolated from it.
3. The method according to claim 2, characterized in that the protein-like substance KUD-PC producing microorganism, which belongs to the genus Streptosporangium, is Streptosporangium pseudovulgalae PO-357 FERM-P No. 3571.
The present invention relates to the new protein KUD-PC and to its production. In particular, the present invention relates to the protein KUD PC, which is produced by culturing a microorganism producing the protein KUD-PC, which belongs to the genus Streptosporangium, and increases the anti-tumor activity.
It has been found that a microorganism strain PO.
357, which belongs to the genus Streptosporangium and was isolated from a soil sample collected in Setagaya-ku, Tokyo, Japan, produces the antibiotic PO-357 (which was later called sporamycin), which has antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis as well Has antitumor activity. The physicochemical properties of this substance as well as the taxonomic properties of the producing microorganism.
have been disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 53-7601.
A physiologically active substance has now been found which has no antibacterial activity, is electrophoretically different from sporamycin and increases the antitumor activity of antitumor substances, and this physiologically active substance has been referred to as the protein KUD-PC.
The new protein KUD-PC of the present invention (hereinafter referred to as KUD-PC) has the following physicochemical properties: (a) Elemental analysis: contains carbon, hydrogen, nitrogen, oxygen and sulfur; C 49.98oö, H 7.270 ó, N 15.23%, S 1.08 '' (found after drying at 100 "for 3 hours in vacuo).
(b) Molecular weight: 11,500 calculated by comparison with standard substances (standard polypeptide or standard protein of molecular weight 2512 to 16949) by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: (c) Melting point: 258 to 260 C (decomposition); (d) Specific rotation: [aD = - 55.8 (c = 1.0, H20); (e) Ultraviolet absorption spectrum:
UV spectrum of KUD-PC in aqueous solution and 0.1 N NaOH is shown in Fig. 1; Xma Y 253,259,265,268 (shoulder), 275, 280 (shoulder) nm, g 'NjOH = 294 nm; (f) Infrared adsorption spectrum: Fig. 2 (KBr); (g) Solubility: soluble in water and insoluble in common organic solvents such as alcohol, acetone and benzene; (h) Color reaction: positive: Folin-Lowry, Biret- and Rydon.
Smith reaction, negative: phenol H2SO4 and anthrone H2SO4 reaction, positive for ninhydrin reaction: HCl hydrolyzate; (i) Color and crystal form: colorless crystals, crystals obtained by ultrafiltration of aqueous solution are crystals of hexagonal systems and crystals salted out by ammonium sulfate are prismatic; (i) Nature: pH 4 to 8 (0.1% aqueous solution from KUD-PC); (k) Amino acid analysis:
KUD-PC (5 mg) was hydrolyzed with HCI in a sealed tube and analyzed by liquid chromatography (Hitachi Model 0.34-2U): amino acid (ILM) aspartic acid 0.144 threonine 0.258 serine 0.226 glutamic acid 0.141 proline 0.111 glycine 0.250 alanine 0.363 valine 0.265 Isoleucine 0.016 leucine 0.117 methionine
Amino acid (IIM) tyrosine 0.020 phenylalanine 0.079 lysine 0.089 arginine 0.040 histidine (lane) (1) electrophoresis: the electrophoretic profile, analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and distinguished by a chromatographic scanner (Shimazu CS-910) is shown in Fig 3 shown as a single substance.
The electrophoretic pattern using cellulose acetate membrane electrophoresis (Cellulo Gel RS, pH 2, 1 M acetate formate buffer, 200 V, 1 hour, amido black 10B staining) is shown in FIG. 4 as a single band.
The process according to the invention for producing the new protein KUD-PC is characterized in that a microorganism which produces the protein KUD-PC and belongs to the genus Streptosporangium is cultivated in a nutrient medium and the KUD-PC formed is isolated therefrom.
Medium growth sucrose-nitrate agar weak
Glucose-asparagine agar weak
Glycerin asparagine agar weak inorganic salt starch agar weak
Tyrosine agar moderate
Nutrient agar moderate-good yeast extract-malt extract agar good
Oatmeal agar good 3. Physiological properties (1) Growth temperature: possible up to 43 "C, optimal growth at around 27 to 30" C.
(2) Melanin production: negative for tyrosine agar.
(3) Liquefaction of gelatin: positive.
(4) Starch hydrolysis: positive.
(5) Peptonization of milk: positive.
(6) H2S formation: negative.
(7) Nitrate reduction: positive.
4. Utilization of the carbon source
Observed on Pridham-Gottlieb agar medium containing 0.05% yeast extract.
Utilization: D-glucose, L-arabinose, D-xylose, D-mannose.
Possible uses: D-galactose, D-raffinose, L rhamnose, D-fructose.
No recycling: inositol, sucrose.
5. Cell wall composition
The cell walls were analyzed according to the Becker et al. [appl. Micorbiol., 13, 236-243 (1965)].
DAP * glycine arabinose galactose
Meso-type - * - - * diaminopinolinic acid.
** not found.
The strain producing KUD-PC belongs to the genus Streptosporangium as described above, and the strain PO-357, which belongs to the genus Streptosporangium and isolated by the inventors of the present invention, is only one example of one which can be used successfully in the present invention Microorganism.
The taxonomic properties of the named strain are as follows: 1. Morphological properties
Microscopic examination revealed that the aerial mycelium is straight, with most sporangia at the top of the mycelium. The size of the sporangium is 5 to 10 u, on average 7.5 u in diameter. The length of the sporangia bearing aerial hyphae is short and generally about 3 u. The spores are round or egg-shaped, with a smooth surface and a diameter of 0.9 to 1.4 u. No flagella was observed.
2. Culture intrinsic on different media
Observation at 27 "C after 10- to 14-day cultivation.
Reverse air-mycelium soluble pigment light orange milky white none light yellow milky white none light yellow milky white none brownish white white milky white none light orange light orange none orange orange none orange orange none dark orange dark orange none
Several of the above taxonomic properties clearly indicate that the PO-357 strain is a microorganism belonging to the Streptosporangium genus.
Streptosporangium pseudovulgalae Nonomura [J. Ferm. Tech. Japan, 47, 701-709 (1969)] closely related to the PO-357 strain, but there are differences, particularly in the color of aerial mycelium and in biological activities. Therefore, the PO-357 strain is called Streptosporangium pseudovulgalae PO-357. The strain was born on May 25, 1976 in the Institute for Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi l-chome, Yatabe-machi, Tsubuka-gun, Ibarakiken 305, Japan, deposited and with the deposit number: FERM P No. 3571.
In the present invention, not only Streptosporangium sp. PO-357, but also its natural or artificial mutants, obtained by exposure to ultraviolet, X-rays, radiation or chemical mutagens, as well as the microorganisms that belong to the Streptosporangium genus and have the ability to produce the new protein KUD-PC , can be used for the production of KUD-PC.
In the present invention, the KUD-PC producing microorganisms belonging to the genus Streptosporangium are grown in a common medium.
The cultivation can be carried out in the usual medium in general as for Streptomyces. Regarding the medium, a nutrient medium can be used which contains assimilable carbon and nitrogen sources and inorganic salts. As assimilable carbon sources, glucose, sucrose, molasses, starch, dextrin, glycerin and organic acids can be used alone or as a mixture. Suitable nitrogen sources are peptone, meat extract, yeast extract, dry yeast, soybean powder, corn steep liquor, cottonseed cake, casein, soybean protein hydrolyzate, amino acids and urea, alone or in mixtures. If necessary, inorganic salts such as sodium, potassium, calcium, magnesium or phosphate salts can be added.
Furthermore, nutrient trace elements or growth stimulants which accelerate the growth of the microorganisms or the production of KUD-PC can optionally be added.
Cultivation can preferably be carried out under aerobic conditions, e.g. in a shaking culture or in a submerged aerated culture at neutral pH and 27 to 30 "C for 40 to 72 hours. KUD-PC is produced in the culture broth. Cultivation should preferably be stopped when the highest concentration of KUD-PC in The culture conditions such as the composition of the culture medium, pH, temperature, agitation, and aeration can be selected depending on the strain used and other conditions, and anti-foaming agents such as silicone oil, vegetable oil or surfactants can be added , if required.
Since the KUD-PC produced is mainly contained in the culture broth, the KUD-PC can preferably be isolated from the culture filtrate, which is separated off by filtration or centrifugation after any filter aid has been added. KUD-PC can be isolated from the culture filtrate by using the nature of KUD-PC, according to which the KUD-PC is soluble in water and insoluble in organic solvents such as alcohol, acetone or benzene. In general, a conventional isolation and purification method for protein or polypeptides can be used.
From salting out with the aid of ammonium phosphate or ammonium chloride, fractional precipitation with the help of methanol, ethanol or acetone, ion exchange chromatography using ion exchangers, ion exchange cellulose or ion exchange Sephadex, adsorption chromatography using activated carbon, silica gel, aluminum oxide, hydroxyapatite resin, cellulose or adsorbent such as HP-10 resin, gel filtration chromatography using Sephadex or Biogel, electrophoresis, countercurrent distribution, dialysis, ultrafiltration or concentration can be used singly or in combination or repeatedly. Chromatography elution can be carried out using water, aqueous alcohol, aqueous acetone, buffer or aqueous solution of inorganic or organic salts.
An embodiment of the insulation and cleaning of KUD-PC is described in detail below.
The cutaneous broth with a filter aid is filtered to remove the mycelia. Ammonium sulfate is added to the culture filtrate in 90% saturation with cooling at neutral pH. The salted-out precipitate is collected by filtration or centrifugation and dissolved in water or a neutral buffer solution. The solution is dialyzed with cooling or subjected to ultrafiltration using a semi-permeable membrane for desalination. As an example of a semipermeable membrane, there can be used a synthetic semipermeable membrane that deposits particles with molecular weights below 1000 and above 10,000, such as UH-L, UK-10 (product of Toyo Roshi Co., Tokyo).
The solution to be desalted is passed through a column of ion exchange cellulose or ion exchange Sephadex after washing with water to be eluted by an elution solvent.
Examples of ion exchange cellulose are DEAE cellulose, ECTEOLA cellulose, SE cellulose and CM cellulose.
The above ion exchange cellulose or ion exchange Sephadex is preferably buffered with a buffer solution. The elution liquid is a buffer of inorganic or organic salt. Examples of suitable inorganic salts are sodium chloride, potassium chloride, ammonium chloride, ammonium sulfate or phosphate salts, and examples of organic salts are sodium acetate or sodium formate in a concentration of 0.01 to 1 M / liter. Examples of buffer solutions are phosphate, acetate, citrate or trishydroxymethylaminomethane buffers. The pH of the buffer solution is pH 5 to 8, a neutral pH at a concentration of 0.001 to 0.5 M / liter is preferred. In the above elution process, the concentration of the inorganic or organic salts and the buffer solution and the pH can be changed stepwise or continuously, if necessary.
The concentration or desalination is carried out by salting out using ammonium sulfate, ultrafiltration or dialysis. The cleaning of the concentrated or desalted solution from KUD-PC is preferably carried out by gel filtration chromatography. Examples of gel filtration media are Biogel P10, Biogel P-30 or Sephadex G-75 (brand names).
The elution can be done with water or buffer solution.
The KUD-PC can be crystallized from the highly purified solution of KUD-PC. For example, the highly purified eluate solution of KUD-PC obtained by ion exchange chromatography and / or gel filtration chromatography can be subjected to the ultrafiltration concentration and / or ammonium sulfate precipitation to obtain the crystalline KUD-PC. If it does not crystallize, KUD-PC can be isolated by further chromatography or lyophilization procedures.
The biological properties of KUD-PC are the following: 1) Antimicrobial effect
KUD-PC shows no antibacterial activity against test organisms such as Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Bacillus cereus.
2) Cytoclasis effect
Cytoclasis (cytotonic) activity of KUD-PC is shown in Table I, in which KUD-PC has a strong cytoclastic activity against BHK cells.
Table I KUD-PC Sporamycin 3H-TdR IH-UR protein µg / ml U / ml
0 2.5 4 21 22
0 5 5 24 23
0 10 55 30 42
0.1 2.5 27 -13 22
1 2.5 26 -27 28 10 2.5 42 0 17
0.1 5 49 14 42
1 5 34 - 3 30 10 5 33 -12 23
0.1 10 84 43 52
1 10 68 44 41 10 10 42 5 30 3) Antitumor effect (1) Experimental method: (a) Sarcoma 180, 1 x 105 cells, are inoculated subcutaneously in ddY mice. After 3 days, a mixture of sporamycin and KUD-PC is administered intravenously. Additional KUD-PC is administered intravenously on days 4, 5 and 6 to monitor the life extension effects.
(b) Effect against Ehrlich Ascites Carcinoma:
Ehrlich ascites carinoma, 2.5 x 106 cells, are inoculated intraperitoneally into ddy mice (5 mice in a group, 5 weeks old). The next day, a mixture of sporamycin and KUD-PC is administered to observe the life-prolonging effects.
(2) Evaluation: treated x 100-100 = life extension (%) not treated x 100-100 = life extension (%) (3) combination effect of KUD-PC and sporamycin against animal transplantable carcinoma, Ehrlich-Ascites
Carcinoma is shown in Tables II-1 and II-2, according to which KUD-PC increases the antitumor activity of sporamy cin.
Table II-I
Sample life- number of mice
KUD-PC sporamycin extension with over 60 mg / kg U / kg (%) days of life extension
0 0 0 0/7
2.5 0 10 0/7
10 0 13 0/7
0 3,000 35 0/7
2.5 3.000 65 2/7
10 3,000 70 3/7
0 6,000 43 1/7
2.5 6.000 161 5/7
10 6,000 161 4/7
Table II-2
Sporamycin KUD-PC Number of life extensions (U / mg) (mg / kg) Interim life days (/ 0) extension days - - 21 0
1500 10 33 57
2.5 29 38
0.63 38 81
0.15 32 52-29 38
750 10 27 29
2.5 33 57
0.63 45 114
0.15 32 52 - 26 24
188 10 23 10
2.5 25 19
0.63 43 105
0.15 37 76 - 25 19 4) Toxicity
Acute toxicity (LDso) of KUD-PC is as follows: mice i.p. LD5o> 2000 mg / kg mice i.v.
LDso> 2000 mg / kg
In the accompanying drawings:
1 shows the UV spectrum of KUD-PC,
2 shows the IR spectrum of KUD-PC,
Fig. 3 shows the electrophoretic profile of KUD-PC in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, Fig. 4 the cellul the cellulose acetate membrane electrophoresis of KUD-PC, and
Fig. 5 shows the Biogel P-30 column chromatography of KUD-PC and sporamycin.
The following examples illustrate the present invention.
example 1
An eyelet full of microorganisms from a slant culture of Streptosporangium pseudovulgalae PO-357, FERM-P No. 3571, was inoculated into a liquid medium A which contained 2.0% glucose, 0.3% dry yeast, 0.5% peptone, 0, Contained 5% meat extract, 0.3% calcium carbonate, and 0.5% sodium chloride (pH 7.0, 100 ml) in a 500 ml Sakaguchi flask and subjected to shake culture at 70 rpm at 27 ° C for 72 hours. 10 ml of this inoculum was inoculated in medium B, which contained 0.2% glucose, 1.5% starch, 0.15% dry yeast, 0.23% peptone, 0.3% meat extract and 0.25% calcium carbonate (100 ml , pH 7.0) in ten 500 ml Sakaguchi flasks and subjected to the shaking culture at 170 rpm, at 27 ° C. for 48 hours.
1 liter of this second inoculum was inoculated into 130 liters of medium A in a 200 liter stainless steel tank and the submerged aeration culture under aeration of 100 liters / minute, stirring at 250 revolutions per minute, an internal pressure of 0.5 kg / cm2, subjected to 28 C for 72 hours. The KUD-PC was determined by cellulose acetate membrane electrophoresis in the culture broth. The culture broth (115 liters) was cooled to below "C, mixed with hyflosupercel (brand name) (2.3 kg) and filtered through a filter press.
The filtered mycelium was washed with water, the wash water combined with the filtered broth and the whole cooled to below 5 C, then mixed with 400 g of hyflosupercel and mixed with ammonium sulfate (82.5 kg) to a 90% ammonium sulfate saturation. The mixture was stirred at below 5 "C for 1 hour and the precipitate thus formed was collected to recover 900 g of wet solid material. The following operations were carried out in a darkened room at below 5 C.
The solid material obtained above was dissolved in 3 liters of water, filtered to remove insoluble material, and the latter was washed with water. The filtrate and the washing solution were combined (total 4 liters). Ammonium sulfate (2.5 kg) was added to achieve 90% saturation of ammonium sulfate, the mixture was stirred for 1 hour and filtered to give the precipitated material (102 g) which was dissolved in 450 ml of water. The solution was dialyzed with a cellophane tube against deionized water (30 liters) for 3 days. The deionized water was replaced once a day. The desalted solution (1170 ml) thus obtained was placed on a column (9 × 50 cm) of DEAE cellulose (product from Brown Co., USA, granular type), which had previously been coated with 0.002 M phosphate buffer (pH 7.5 to 8 , 0) had been buffered.
Elution was carried out with 0.002 M phosphate buffer (pH 7.4, 6.4 liters) and 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4, 5 liters) in the order given, the eluate being fractionated in 30 ml fractions. Each fraction was assayed by the Folin-Lawry protein detection method and by biological assay using Staphylococcus aureus 209P, and KUD-PC was found in fractions # 181-300 and sporamycin in fractions # 321-400. The fractions containing KUD-PC were collected (3.8 liters) and ammonium sulfate was added to achieve 409 saturation of ammonium sulfate, after which the mixture was filtered off from the precipitate formed over an hour.
Ammonium sulfate was added to the filtrate to achieve 90% saturation, the mixture was stirred for 1 hour and the precipitate collected, which was dissolved in water. The solution (78 ml) was passed over a column (6.0 x 62 cm) of Biogel P-30 (brand name, Biorad Laboratories Co.), eluted with water for gel filtration and the eluate fractionated in fractions of 20 g each. Each fraction was examined according to the protein detection method and the biological method as above, whereby fractions No. 41 to 54 (280 ml) were obtained. The combined fractions were concentrated to 10 ml through ultrafiltration membrane UH-1 and then left overnight with cooling.
The separated crystals were filtered, washed with a small amount of water and dried to obtain colorless crystals of the hexagonal system of KUD-PC (120 mg), melting point: 258 to 260 ° C (decomposition).
The first mother liquor and washing solution were combined, mixed with ammonium sulfate to a 25% saturation and left to stand in a dark room for 3 days with cooling. The separated crystals were filtered, washed with a small amount of cold water and dried, whereby prismatic colorless crystals of KUD-PC (770 mg) were obtained. The second mother liquor and washing solution were combined and ammonium sulfate was added up to 30% saturation to obtain 560 mg of crystals. Furthermore, this third mother liquor was treated with ammonium sulfate to an ammonium sulfate saturation of 60% to obtain an additional 450 mg of crystals.
The colorless crystals of the hexagonal system and prismatic crystals obtained in this way were stained by electrophoresis using a cellulose acetate membrane (Chemetron Co., Cellulogel RS, 5 × 12 cm) (1 M acetate formate buffer, pH 2, 200 V, 1 hour) Amid black lOB). As can be seen from Fig. 4, individual identical bands were found in the same position. The electrophoretic profile of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the colorless crystals from the hexagonal system is shown in Fig. 3 (examined with scanner, Shimazu CS-910), in which a single band was found.
Example 2
The main culture broth (116 liters) obtained in the same manner as in Example 1 was treated in the same manner as in Example 1 to obtain the desalted solution (1080 ml). The solution was placed on a column (9 x 50 cm) of DEAE cellulose, which had previously been buffered with 0.002 M phosphate buffer (pH 7.0 to 7.4), and purified in the same manner as in Example 1, and KUD Obtain fractions No. 121 to 260 containing PC and sporamycin. The fractions were pooled and treated to 90% ammonium sulfate saturation and Biogel P-30 column chromatography as in Example 1 to obtain KUD-PC in fractions # 41-50 and sporamycin in fractions # 53-64. The Biogel P-30 column chromatography pattern is shown in Fig. 5.
The fractions containing KUD-PC were treated by ultrafiltration and crystallization in the same manner as in Example 1 to give colorless crystals of hexagonal (730 mg) [melting point: 258 to 260 C (decomposition)], prismatic crystals (1.48 g) and crystals (0.9 g).
These crystals had a single band in the same electrophoretic position by cellulose acetate membrane electrophoresis.
Example 3
A main culture broth obtained as described in Example 1 was purified in the same manner as in Example 1 to obtain precipitates with ammonium sulfate from 40 to 9Ob saturation of fractions containing KUD-PC by DEAE cellulose column chromatography.
The precipitate was dissolved in water (70 ml) and passed over a column (6 x 78 cm) of Sephadex G-50, which had previously been swollen with water, for gel filtration chromatography. The eluate obtained with water was fractionated in 20 g fractions. Each fraction was examined by protein determination, whereby fractions No. 56 to 80 were obtained, which contained KUD-PC.
The solution was desalted and concentrated by ultrafiltration, and the concentrate (100 ml) was lyophilized to obtain white powdery KUD-PC (1.45 g).
The product showed a single band in cellulose acetate membrane electrophoresis and confirmed the same substance as the colorless hexagonal system crystals and the prismatic crystals obtained in Example 1.
Example 4
In Example 1, fermentation was carried out in a 200 liter tank for 96 hours to obtain a main culture broth (114 liters). The KUD-PC was found in the broth by cellulose acetate membrane electrophoresis, while sporamycin was not found in the biological test.
The main culture broth was purified by the same procedure as in Example 1 to obtain colorless hexagonal system crystals (50 mg) [melting point: 258 to 260 ° C (decomposition)] and prismatic crystals (1.89 g).
These crystals had a single band in cellulose acetate electrophoresis.