DE2443560C2

DE2443560C2 -

Info

Publication number: DE2443560C2
Application number: DE2443560A
Authority: DE
Inventors: Yasuo Higashikurume Tokio/Tokyo Jp Koyama; Masaki Tokio/Tokyo Jp Syoji; Nakao Sendai Miyagi Jp Ishida
Original assignee: KAYAKU ANTIBIOTIC RESEARCH Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: KAYAKU ANTIBIOTIC RESEARCH Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1973-09-11
Filing date: 1974-09-11
Publication date: 1987-08-20
Also published as: DK138511C; JPS5413516B2; DE2443560A1; BE819520A; FR2242990A1; DK138511B; CH592734A5; JPS5052289A; DK477174A; FR2242990B1; GB1471909A

Description

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Antibiotikum mit einer hohen antibakteriellen Wirksamkeit und Antitumorwirksamkeit zu schaffen.It is an object of the present invention to provide a new antibiotic with a high antibacterial effectiveness and To create anti-tumor effectiveness.

Diese Aufgabe wird durch das Antibiotikum des Anspruchs 1 gelöst.This object is achieved by the antibiotic of claim 1 solved.

Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung dieses Antibiotikums (vgl. Anspruch 2).The invention further relates to the production of this antibiotic (cf. claim 2).

Die japanische Patentanmeldung Nr. 21 752/1967 und die US- Patentschrift 33 34 022 beschreiben die Ansammlung einer makromolekularen Antitumorsubstanz in Kulturmaterial von Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, sowie ein Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Neocarzinostatin. Die Erfinder haben ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Neocarzinostatin in zwei Fraktionen, welche als N-1 und N-2 bezeichnet werden, gefunden (japanische Patentanmeldung Nr. 680/1972, US-Patentschrift Nr. 37 18 741).Japanese Patent Application No. 21 752/1967 and US Patent 33 34 022 describe the accumulation of a Macromolecular antitumor substance in culture material from Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, as well as a Process for the separation and recovery of neocarzinostatin. The inventors have a cleaning and separation method of neocarzinostatin in two fractions, which are called N-1 and N-2 can be found (Japanese Patent Application No. 680/1972, U.S. Patent No. 37 18 741).

Es hat sich nun herausgestellt, daß man aus dem Kulturmaterial noch eine weitere Fraktion, die Ma-Fraktion, isolieren kann, welche eine Reihe von physikochemischen Eigenschaften sowie ein antibakterielles Spektrum hat, welche von den entsprechenden Eigenschaften der Fraktionen N-1 und N-2 wesentlich verschieden sind. It has now been found that the cultural material isolate yet another faction, the Ma faction which can have a number of physicochemical properties as well as an antibacterial spectrum, which of the corresponding properties of fractions N-1 and N-2 are significantly different.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus ist ein Neocarzinostatin erzeugender Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptomyces gehört. Es handelt sich um Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, welcher im obigen Patent beschrieben wurde. Es sind auch bereits andere Neocarzinostatin erzeugende Streptomyces-Mikroorganismen bekannt.The microorganism used according to the invention is a Neocarzinostatin producing microorganism, which belongs to the genus Streptomyces is one. It is about to Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, which was described in the above patent. There are already others Streptomyces microorganisms producing neocarzinostatin known.

Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, wurde durch Nakao Ishida et al. gefunden und bezeichnet und am American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 15 945 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus hat die nachstehenden bakteriologischen Eigenschaften:Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, was by Nakao Ishida et al. found and labeled and on the American Type Culture Collection filed under number ATCC 15 945. This microorganism has the following bacteriological Characteristics:

(1) morphology (a) Conidia branching pattern

Die Sporensphäre der Konidien ist in Zickzackart unterteilt, und zwar von einem Punkt der Lufthyphen an. Die Länge ist im allgemeinen klein. Im allgemeinen liegen geschlossene oder offene Spiralen vor, und man beobachtet keine quirligen Wirbel.The spore sphere of the conidia is divided into zigzags, from a point of the air hyphae. The length is generally short. In general there are closed or open spirals, and one do not observe lively eddies.

(b) conidia

Bei Beobachtung unter dem Elektronenmikroskop zeigt die Oberfläche der Sporen eine für das jeweilige Verfahren charakteristische Gestalt, und insbesondere sind die Vorsprünge mehr haarförmig als nadelförmig. Die Sporen sind insgesamt oval, und sie haben eine Abmessung von etwa 1,5×2,0 µm.When observed under the electron microscope shows the surface of the spores is one for the respective process characteristic shape, and in particular the projections are more hair-shaped than needle-shaped. The spores are oval as a whole and they have one dimension of about 1.5 × 2.0 µm.

(2) Properties in different culture media (3) Biochemical properties

(a) Nitrite formation: is observed.
(b) Melanoid formation: none.
(c) Sugar utilization.

Bei Prüfung mit dem Agar-Medium von Pridham und Gottlieb als Grundmedien verwertet und zersetzt dieser Stamm ohne weiteres Stärke, Dextrin, Maltose, Rohrzucker, Lactose, Mannose, Galaktose, Glukose, Fruktose, Xylose, Arabinose, Rhamnose, Glyzerin, Mannit und Inosit. Eine nur schwache Verwertung wird bei Inulin, Dulcit, Soribt und Salicin beobachtet. Auf Raffinose ist das Wachstum unbefriedigend. Der Mikroorganismus scheint jedoch Raffinose zu verwerten.When tested with the agar medium from Pridham and Gottlieb this strain is used and decomposed as basic media without further starch, dextrin, maltose, cane sugar, lactose, Mannose, galactose, glucose, fructose, xylose, arabinose, Rhamnose, glycerin, mannitol and inositol. A weak one Utilization is done with inulin, dulcit, soribt and salicin observed. The growth on raffinose is unsatisfactory. However, the microorganism appears to utilize raffinose.

Die erwähnten Eigenschaften unterscheiden den vorliegenden Stamm von allen Spezies in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1957. Unter denjenigen Arten, welche entfernt dem vorliegenden Mikroorganismus gleichen, seien Streptomyces albus und Streptomyces griseolus genannt. Diese und Streptomyces pseudogriolus, welcher von Okami 1955 als Pseudo-Xanthomycin erzeugende Art beschrieben wurde (J. of Antibiotics, A, S. 126, Bd. 8, 1955), sind die nächsten Verwandten des Mikroorganismus.The properties mentioned distinguish the present Strain of all species in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1957. Among those species that removed the present microorganism are Streptomyces called albus and streptomyces griseolus. This and Streptomyces pseudogriolus, which Okami 1955 as Pseudo-xanthomycin-producing species has been described (J. of Antibiotics, A, p. 126, vol. 8, 1955) are the closest relatives of the microorganism.

Streptomyces pseudogriseolus bildet jedoch ein lösliches Pigment in einem Gelatinemedium und löst Gelatine langsam bis einigermaßen rasch auf. Diese Eigenschaften unterscheiden den erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismus grundlegend von dem genannten bekannten Mikroorganismus. Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus löst Gelatine nicht auf und erzeugt kein lösliches Pigment. Außerdem erzeugt Streptomyces pseudogriseolus das Pseudo- Xanthomycin, welches nicht gegen Krebs wirksam ist und kein großes Molekulargewicht aufweist.Streptomyces pseudogriseolus, however, forms a soluble one Pigment in a gelatin medium and slowly dissolves gelatin until fairly quickly. These properties differ the microorganism used according to the invention fundamentally from the above known microorganism. The microorganism used according to the invention does not dissolve gelatin and does not produce a soluble pigment. Streptomyces pseudogriseolus also creates the pseudo- Xanthomycin, which is not effective against cancer and none has large molecular weight.

Die Versuche bestätigen, daß es sich um eine Variante von Streptomyces carzinostaticus handelt, welcher hier als Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, bezeichnet wird.The experiments confirm that it is a variant of Streptomyces carzinostaticus acts, which here as Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya becomes.

Die Kultivierung erfolgt nach herkömmlichen Methoden. Man kann verschiedene Materialien als Kulturmedien und/oder Nährmedien einsetzen. Bevorzugt sind jedoch Materialien, welche als Stickstoffquelle dienen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Proteinhydrolysat, anorganisches Nitrat, Ammoniumsulfat oder dergleichen. Ferner sollte eine Kohlenstoffquelle zugegen sein, wie Dextrose, Lactose, Maltose, Stärke, Glyzerin, Melasse oder dergleichen, und zwar in vergleichbar großen Mengen. Verschiedene anorganische Salze und Hilfsstoffe oder dergleichen können - falls erwünscht - zugesetzt werden. Zur Bereitung eines flüssigen Kulturmediums mit den beschriebenen Nährstoffquellen in großem Maßstab verwendet man vorzugsweise die submerse-aerobo-Kultur. Die Kulturtemperatur sollte bei etwa 25 bis 30°C und vorzugsweise bei etwa 27 bis 28°C liegen. Der pH der Kultur sollte bei etwa 6 bis 9 und vorzugsweise bei etwa pH 7 liegen. Der Neocarzinostatin erzeugende Stamm wird unter Luftzutritt und unter Rührung während 2 bis 5 Tagen bei 28°C in einem sterilen Medium bei pH 7,2 kultiviert. Das Medium enthält einen Fleischextrakt, Pepton, Natriumchlorid und Kalziumkarbonat. Es werden verschiedene Medien eingesetzt, welche jeweils hinsichtlich der Kohlenstoffquelle differieren. Bei den Kohlenstoffquellen handelt es sich zum Beispiel um Glyzerin, Dextrose, Lactose, Rohrzucker, Maltose, Stärke oder dergleichen. Ein Medium mit einem Gehalt an Dextrose als Kohlenstoffquelle ist am stabilsten und zeigt die stärkste Neocarzinostatin-Produktion. In diesem Fall hat sich ein Zusatz von Hefeextrakt als brauchbar zur Steigerung der Produktivität der Kultur erwiesen.The cultivation is carried out according to conventional methods. Man can use different materials as culture media and / or culture media deploy. However, materials which are preferred serve as a nitrogen source, such as peptone, meat extract, yeast, Corn steep liquor, soybean meal, peanut meal, protein hydrolyzate, inorganic nitrate, ammonium sulfate or the like. There should also be a carbon source such as dextrose, lactose, maltose, starch, glycerin, molasses or the like, in comparable large amounts. Various inorganic salts and auxiliaries or the like can be added if desired. For preparation a liquid culture medium with the described Large scale nutrient sources are preferably used the submerged aerobic culture. The culture temperature should at about 25 to 30 ° C and preferably at about 27 to 28 ° C lie. The pH of the culture should be around 6 to 9 and preferably be around pH 7. The Neocarzinostatin Generating Trunk is kept in air and with stirring for 2 to Cultivated for 5 days at 28 ° C in a sterile medium at pH 7.2. The medium contains a meat extract, peptone, sodium chloride and calcium carbonate. There are different ones Media used, each with regard to the carbon source differ. It deals with the carbon sources for example, glycerin, dextrose, lactose, cane sugar, Maltose, starch or the like. A medium with one The content of dextrose as a carbon source is the most stable and shows the strongest neocarcinostatin production. In this Fall has an addition of yeast extract as useful for Proven to increase the productivity of the culture.

Es wurde festgestellt, daß ein Kulturmedium, welches Stärke enthält, zu einem ausgezeichneten Wuchs des Organismus führt. Ein Medium, welches Stärke, Natriumchlorid und andere anorganische Salze und Hefeextrakt und Sojabohnenpulver enthält, wurde als Keimkultur verwendet.It has been found that a culture medium, which is starch contains, to an excellent growth of the organism leads. A medium containing starch, sodium chloride and others contains inorganic salts and yeast extract and soybean powder, was used as a seed culture.

Bei Durchführung der Fermentation bei 28°C unter Schütteln und unter Verwendung eines optimalen Kulturmediums bei pH 7,2 (2,0% Stärke, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,5% trockene Hefe, 0,25% Natriumchlorid, 0,35% Kalziumkarbonat, 0,005% Manganchlorid, 0,005% Kupfersulfat, 0,005% Zinksulfat) sinkt der pH des Mediums innerhalb 24 Stunden auf 6,8 bis 6,0 und steigt danach im Zeitraum von 44 bis 72 Stunden auf 6,8 bis 7,3. Die Wirksamkeit der Kulturlösung gegen Krebs ist maximal.When performing the fermentation at 28 ° C with shaking and using an optimal culture medium pH 7.2 (2.0% starch, 2.0% soybean meal, 0.5% dry yeast, 0.25% sodium chloride, 0.35% calcium carbonate, 0.005% manganese chloride, 0.005% copper sulfate, 0.005% zinc sulfate) drops the pH of the medium to 6.8 to 6.0 within 24 hours and then increases to 6.8 to in the period from 44 to 72 hours 7.3. The effectiveness of the culture solution against cancer is maximum.

Zur Isolierung des Neocarzinostatins wird das Kulturmedium durch herkömmliches Filtrieren, Zentrifugieren oder durch andere Methoden in einen flüssigen Anteil und einen festen Anteil, welcher das Mycel enthält, getrennt. Neocarzinostatin, welches wasserlöslich ist, findet sich im großen und ganzen in flüssigem Anteil.The culture medium is used to isolate the neocarcinostatine by conventional filtration, centrifugation or by other methods into a liquid portion and a solid Share that contains the mycelium, separated. Neocarzinostatin, which is water-soluble can be found on the whole in liquid proportion.

Zur Abtrennung des erfindungsgemäßen Antibiotikums (Ma- Fraktion) macht man sich die Unterschiede in den Eigenschaften des angestrebten Produkts und der anderen Fraktionen und Verunreinigungen zunutze. Insbesondere werden Fällungstechniken angewandt, wobei Verunreinigungen ausgefällt werden. Dies geschieht durch Änderung des pH-Werts des Kulturfiltrats, oder es werden Metallionen wie Bariumchlorid, Zinkchlorid oder dergleichen zu dem Kulturfiltrat gegeben, welche eine Ausfällung der Verunreinigungsproteine bewirken, oder es wird eine fraktionierte Ausfällung durchgeführt, indem man die Salzkonzentration verändert, wobei Ammoniumsulfat eingesetzt wird. Andere Fällungstechniken umfassen die Zugabe eines mit Wasser frei mischbaren organischen Lösungsmittels zur Bewirkung einer fraktionierten Ausfällung. Hierzu eignet sich Äthanol, Azeton oder dergleichen. Ein weiteres Verfahren besteht in der Elutionierung, welche auf Adsorptionsunterschieden beruht. Dies ist insbesondere der Fall bei natürlichen Adsorptionsmitteln wie Kaolin oder Celit oder bei synthetischen Adsorptionsmitteln wie Amberlit XAD-2 bis 12 oder bei Kationenaustauschern wie Amberlit IR-120, IRC-50 oder bei Anionenaustauschern wie IRA-410, IR-45 oder bei ionenaustauschender Cellulose wie Diäthylaminoäthyl(DEAE) cellulose, Triäthylaminoäthyl(TEAE)cellulose oder Phospho(P)cellulose und bei ionenaustauschendem Sephadex wie Karboxymethyl(CM)-Sephadex oder Diäthyl-2-hydroxylpropylaminoäthyl(QAE)- Sephadex. Unterschiede im Molekulargewicht erlauben ebenfalls eine Auftrennung. In diesem Falle wird Cellophan oder eine andere Membran mit Molekularsiebbefähigung oder ein Gel wie Sephadex oder Biogel eingesetzt. Die genannten Methoden können allein oder in Kombination in beliebiger Reihenfolge angewandt werden.To separate the antibiotic according to the invention (ma Fraction) you make the differences in the properties the desired product and the other fractions and Take advantage of impurities. In particular, precipitation techniques applied, whereby impurities are precipitated. This is done by changing the pH of the culture filtrate, or metal ions such as barium chloride, zinc chloride or the like added to the culture filtrate, which cause precipitation of the contaminant proteins, or fractional precipitation is carried out by the salt concentration changed, using ammonium sulfate becomes. Other precipitation techniques include adding one organic solvent freely miscible with water for effect a fractional precipitation. Suitable for this ethanol, acetone or the like. Another procedure consists in elution, which is based on differences in adsorption is based. This is particularly the case with natural adsorbents such as kaolin or celite or with synthetic adsorbents such as Amberlit XAD-2 bis 12 or with cation exchangers such as Amberlit IR-120, IRC-50 or with anion exchangers such as IRA-410, IR-45 or at ion-exchanging cellulose such as diethylaminoethyl (DEAE) cellulose, triethylaminoethyl (TEAE) cellulose or phospho (P) cellulose and with ion-exchanging Sephadex like Carboxymethyl (CM) -Sephadex or diethyl-2-hydroxylpropylaminoethyl (QAE) - Sephadex. Differences in molecular weight also allow separation. In this case Cellophane or other membrane with molecular sieve capability or a gel such as Sephadex or Biogel is used. The methods mentioned can be used alone or in combination in any order.

Zum Beispiel kann man Amberlit XAD-2 zu dem Kulturfiltrat geben, und zwar in einer Menge von 0,5 Volumenprozent. Pigmente und neutrale Verunreinigungen werden adsorbiert, und das Ganze wird abfiltriert. Das erhaltene Filtrat wird auf pH 3,5 bis 5,5 eingestellt, und dann wird eine äquivalente Mischung aus Kaolin und Celit in einer Menge von 1% (Gewicht/ Volumen) zugesetzt. Verunreinigungen des Filtrats wie Chromoproteine werden dabei absorbiert und zusammen mit dem ausgefällten Produkt abfiltriert. Sodann wird Ammoniumsulfat zu dem erhaltenen Filtrat gegeben, und das gewünschte Produkt wird ausgefällt. Die erhaltene Ausfällung wird in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst, und die Verunreinigungen an anorganischen Substanzen und an organischen Salzen werden durch Dialyse unter Verwendung einer semipermeablen Membran oder durch Gelfiltration entfernt. Die so erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit Amberlit IR-120 gegossen, und die basischen Verunreinigungen werden dabei adsorbiert und entfernt. Danach wird die aktive Fraktion auf pH 5,0 eingestellt und lyophilisiert. Das erhaltene Pulver enthält 10 bis 60% der Ma-Fraktion. Eine wäßrige Lösung dieser rohen Ma-Fraktion wird auf eine Säule mit einem Ionenaustauschharz- (DEAE)-Cellulose gegeben, und das gewünschte Produkt (Ma-Fraktion) wid adsorbiert. Das adsorbierte Produkt wird mit Pufferlösung eluiert und fraktioniert, indem man die Salzkonzentration der Pufferlösung stufenweise anhebt. Dabei werden ausgezeichnete Ergebnisse erzielt. Bei Verwendung dieser Technik kann die Ma-Fraktion in gereinigter Form abgetrennt werden. In dieser Form enthält die abgetrennte Fraktion keine sauren Verunreinigungen und keine Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht. Nunmehr werden anorganische oder organische Salze, welche in der Ma- Fraktion enthalten sind und welche Teile der Pufferlösung sind, vollständig durch Ultrafiltration oder Gelfiltration entfernt, so daß man eine hochgereinigte Ma-Fraktion erhält. Die Ma-Fraktion des Neocarzinostatins, welche - wie beschrieben - erhalten wird, ist vollständig frei von Verunreinigungen. Diese Fraktion zeigt ein symmetrisches Muster bei der Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex, CMC, DEAE oder dergleichen und ist bei der Ultrazentrifugierung und bei der Elektrophorese homogen. Die Homogenität kann ferner klar demonstriert werden, wenn man eine mit Tritium nach der Tritiumgaskontaktmethode markierte Ma-Fraktion in ähnlicher Weise reinigt und abtrennt.For example, one can add Amberlit XAD-2 to the culture filtrate give, in an amount of 0.5 volume percent. Pigments and neutral impurities are adsorbed, and the whole is filtered off. The filtrate obtained is on pH adjusted to 3.5 to 5.5, and then becomes an equivalent Mixture of kaolin and celite in an amount of 1% (weight / Volume) added. Contamination of the filtrate such as Chromoproteins are absorbed and together with filtered off the precipitated product. Then ammonium sulfate added to the filtrate obtained, and the desired one Product is failing. The precipitate obtained is in a small amount of water dissolved, and the impurities of inorganic substances and organic salts by dialysis using a semipermeable membrane or removed by gel filtration. The solution thus obtained is poured onto a column with Amberlit IR-120, and the basic impurities are adsorbed and removed. The active fraction is then adjusted to pH 5.0 and lyophilized. The powder obtained contains 10 to 60% of the Ma group. An aqueous solution of this crude Ma fraction is placed on a column with an ion exchange resin Given (DEAE) cellulose, and the desired product (Ma fraction) is adsorbed. The adsorbed product is eluted with buffer solution and fractionated by the Gradually raise the salt concentration of the buffer solution. Here excellent results are achieved. Using this technique allows the Ma fraction to be purified Form are separated. In this form contains the separated Fraction no acidic impurities and none High molecular weight contaminants. Now be inorganic or organic salts, which are Fraction are included and what parts of the buffer solution are completely by ultrafiltration or gel filtration removed so that a highly purified Ma fraction is obtained. The Ma fraction of neocarcinostatine, which - how described - is completely free of Impurities. This fraction shows a symmetrical one Pattern Using Column Chromatography from Sephadex, CMC, DEAE or the like and is with the Ultracentrifugation and homogeneous in electrophoresis. Homogeneity can also be clearly demonstrated if one with tritium using the tritium gas contact method marked Ma fraction cleans and separates in a similar manner.

Die Ma-Fraktion des Neocarzinostatins, welche wie oben beschrieben erhalten wird, hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:The Ma fraction of neocarcinostatine, which is as described above obtained has the following physical and chemical properties:

(1) shape
The substance (lyophilized) is an amorphous white to slightly yellowish-white powder.
(2) Elemental analysis
C: 47.91%, H: 6.63%, N: 14.56%, S: 1.26%, O: 29.64%.
(3) sedimentation constant
The sedimentation constant is measured in an aqueous solution of the Ma fraction at a concentration of 0.5 to 1.0 g / dl and at 20 ° C. and at 56,000 rpm and in photographic recordings at intervals of 32 minutes and is S. ₂₀, W = 1.5 S.
(4) molecular weight
The molecular weight of the substance is determined using molecular sieve because the molecular weight is very large. The Ma fraction is gel filtered through a Sephadex G-75 column equilibrated with 0.02 M Tris-HCl buffer solution (pH 7.30) containing 0.1 M sodium chloride, together with proteins of known molecular weight such as egg albumin (45,000), chymotrypsinogen (25,700), myoglobin (17,800), cytochrome C (12,400) and bacitracin (1450), with the same buffer solution. The molecular weight of the Ma fraction is determined to be 13,200 by comparing each elution volume (Ve) with the respective logarithmic values of the known molecular weights ( FIG. 3).
(5) Amino acid composition
If the Ma fraction of the neocarzinostatin is hydrolyzed in a sealed tube with 6 N hydrochloric acid for 24 hours and at 110 ° C. or for 48 hours at 110 ° C. or for 72 hours at 110 ° C., the amino acids are obtained according to Table 1. Since tryptophan is decomposed and denatured under the hydrolysis conditions, the Ma fraction is hydrolyzed under reduced pressure in a sealed tube with 6 N hydrochloric acid, which contains 5% thioglycolic acid, at 110 ° C. for 64 hours in order to add the tryptophan determine. From the results of the amino acid analysis of these hydrolyzates it is concluded that the Ma fraction contains 20 different amino acid residues, which make up a total of 104 amino acids.
Table 1

Ma Fraction Amino Acid Composition (Amino Acid Auto Analyzer)
(6) decomposition point
The Ma fraction of neocarzinostatin discolors noticeably at 263 ° C and decomposes with foaming at 276 ° C.
(7) rotation dispersion
FIGS. 6 and 7 show the rotation of dispersion spectra of Ma-fraction. The spectra are recorded at a concentration of 0.5% and at wavelengths in the range from 330 to 650 µm and at 0.04% and at wavelengths in the range from 220 to 400 µm, in a cell of 5 mm at room temperature. The following rotations are observed at 370, 270 and 277 mµ:
[ α ] ₃₇₀ = -286 °, [ α ] ₂₇₀ = -1120 ° (trough) and [ α ] ₂₂₇ = + 2000 ° (peak).
The crossing point at which a specific rotation [ α ] = 0 is observed is 253 mµ.
(8) Specific rotation
[ α ] = - 87 ° (C = 1, H₂O).
(9) Ultraviolet absorption spectrum
Fig. 8 shows the ultraviolet absorption spectra of the Ma fraction dissolved in water and in 0.1 N sodium hydroxide solution. Table 2 shows the optical densities at the maximum absorption and at the shoulder absorption.
Table 2
(10) Infrared absorption spectrum
Typical protein absorption according to FIG. 9.
(11) Solubility
The Ma fraction of neocarzinostatin is slightly soluble in water, slightly soluble in methanol, slightly soluble in ethanol and acetone.
(12) Color reactions
The Ma fraction responds positively to the biuret, folin, phenol, peptide and ninhydrin reactions. The Ma fraction reacted negatively to the molar, anthrone, phenol-sulfuric acid, iron chloride and molybdenum blue reaction.
(13) electrophoresis
An electrophoretic conversion of the Ma fraction of the neocarzinostatin in a cellulose acetate membrane (Sepraphor III) is carried out at the pH values 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 and 8.0, which with citrate -Phosphate buffer solution were set (internal thickness: µ = 0.2). The test is carried out at 0.8 mA / cm and at room temperature (20 ° C.) for 80 minutes. As Table 3 shows, the Ma fraction migrates to the anode, most strongly at pH 5.0.
Table 3

pH values of the electrophoresis of the Ma fraction and wall distance from the starting point
(14) Isoelectric point
It is impossible to determine an isoelectric point of the Ma fraction because it behaves differently than normal substances in the electrophoretic field. The Ma fraction is held by adsorption on a carboxymethyl cellulose chromatographic column and eluted with a pH gradient of 2.80 to 5.0. The isoelectric point is 3.30 according to an estimate of the pH at the position where the Ma fraction is eluted.

Stability of the Ma fraction of neocarzinostatin (1) The stability of the Ma fraction of neocarzinostatin at different pH values

Die Auswirkung des pH-Werts auf die Stabilität der Ma- Fraktion ist in Tabelle 4 dargestellt. Eine 2,0-mg/ml- Lösung der Ma-Fraktion des Neocarzinostatins (s. Tabelle 4) wurde auf 55°C erhitzt, und die Restaktivität nach 94 und 118 Stunden wurde anhand der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea geschätzt. Die Restaktivität ist in Tabelle 4 angegeben (%). Man erkennt, daß die Ma-Fraktion in der Gegend des Neutralpunktes instabil ist und bei pH 5,00 die größte Stabilität hat. The effect of pH on the stability of the Fraction is shown in Table 4. A 2.0 mg / ml Solution of the Ma fraction of neocarcinostatine (see Table 4) was heated to 55 ° C, and the residual activity after 94 and 118 hours was based on antibacterial activity against Sarcina lutea. The residual activity is in Table 4 given (%). It can be seen that the Ma Group is unstable in the area of the neutral point and at pH 5.00 has the greatest stability.

Tabelle 4 Table 4

Die Stabilität der Ma-Fraktion bei verschiedenen pH The stability of the Ma fraction at different pH

(2) Stability of the Ma fraction when irradiated with ultraviolet rays

Die Stabilität der Ma-Fraktion bei Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen ist in Tabelle 5 dargestellt. Ein Quarzrohr mit einer Weite von 0,1 cm wird mit einer 2,0-mg/ml- Lösung der Ma-Fraktion des Neocarzinostatins, welche auf pH 5,0 eingestellt wurde, gefüllt, und diese Lösung wird aus einem Abstand von 10 cm mit Hilfe einer 19-W-Ultraviolett- Sterilisierungslampe mit ultravioletten Strahlen bestrahlt. Gemäß der Tabelle werden 0 bis 20 Minuten nach Beginn der Bestrahlung Proben genommen. Die Restaktivität zu jedem Zeitpunkt wird anhand der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea geschätzt. Die Restaktivitätswerte sind in Tabelle 5 zusammengestellt (%). Man erkennt, daß die Ma- Fraktion innerhalb kurzer Zeit bei Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen in einer Reaktion der 0-ten Ordnung denaturiert.The stability of the Ma fraction when irradiated with ultraviolet rays are shown in Table 5. A Quartz tube with a width of 0.1 cm is filled with a 2.0 mg / ml Solution of the Ma fraction of Neocarzinostatins, which on pH 5.0 was adjusted, filled, and this solution is made a distance of 10 cm using a 19 W ultraviolet Sterilization lamp irradiated with ultraviolet rays. According to the table, 0 to 20 minutes after the start of the Radiation samples taken. The residual activity to everyone Point in time is based on the antibacterial activity Sarcina lutea appreciated. The residual activity values are in Table 5 compiled (%). It can be seen that the ma Fraction within a short time when irradiated with ultraviolet Radiate in a 0th order reaction denatured.

Tabelle 5 Table 5

Stabilität der Ma-Fraktion bei Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen Stability of the Ma fraction when irradiated with ultraviolet rays

(3) Stability of the Ma fraction of neocarcinostatine different temperatures

Die Stabilität der Ma-Fraktion bei -20°C, 4°C, 6-9°C, 25°C und 37°C ist in Tabelle 6 angegeben. Eine 2-mg/ml-Lösung der Ma-Fraktion wird auf pH 5,0 eingestellt und im verschlossenen Rohr unter Ausschluß von Licht auf -20°C, 4°C, 6-9°C, 25°C und 37°C erhitzt, und die Restaktivität wird nach 0 bzw. 2 bzw. 4 bzw. 6 bzw. 8 Monaten anhand der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea geschätzt. Die Restaktivitätswerte (%) sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Man erkennt, daß die Ma-Fraktion bei Ausschluß von Licht recht stabil ist. The stability of the Ma fraction at -20 ° C, 4 ° C, 6-9 ° C, 25 ° C and 37 ° C is given in Table 6. A 2 mg / ml solution the Ma fraction is adjusted to pH 5.0 and sealed Tube in the absence of light to -20 ° C, 4 ° C, 6-9 ° C, 25 ° C and 37 ° C heated, and the remaining activity after 0 or 2 or 4 or 6 or 8 months based on the antibacterial Activity against Sarcina lutea estimated. The Residual activity values (%) are summarized in Table 6. It can be seen that the Ma group excludes light is quite stable.

Tabelle 6 Table 6

Die Stabilität der Ma-Fraktion bei verschiedenen Temperaturen The stability of the Ma fraction at different temperatures

(4) The stability of the Ma fraction when irradiated with γ rays

Die Stabilitätswerte der Ma-Fraktion bei Bestrahlung mit γ-Strahlen sind in Tabelle 7 zusammengestellt. Eine 1,5-mg/ml-Lösung der Ma-Fraktion wird auf pH 5,0 eingestellt und dann mit den γ-Strahlen von Kobalt 60 (⁶⁰Co) in einem verschlossenen Rohr unter Ausschluß von Licht bei Zimmertemperatur bestrahlt. Die Restaktivität nach Bestrahlung wird in 8 Stufen von 0 bis 2,5 M Rad gemäß Tabelle 7 bestimmt. Dies geschieht durch Schätzen anhand der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea.The stability values of the Ma fraction when irradiated with γ rays are summarized in Table 7. A 1.5 mg / ml solution of the Ma fraction is adjusted to pH 5.0 and then irradiated with the γ- rays of cobalt 60 (⁶⁰Co) in a sealed tube with the exclusion of light at room temperature. The residual activity after irradiation is determined in 8 steps from 0 to 2.5 M Rad according to Table 7. This is done by estimating the antibacterial activity against Sarcina lutea.

Die Restaktivitätswerte (%) sind in Tabelle 7 angegeben. The residual activity values (%) are given in Table 7.

Tabelle 7 Table 7

Stabilität der Ma-Fraktion bei Bestrahlung mit γ-Strahlen Stability of the Ma fraction when irradiated with γ rays

Die Ma-Fraktion des Neocarzinostatins besitzt die folgenden biologischen Eigenschaften:The Ma fraction of neocarcinostatine has the following biological properties:

(1) Antimicrobial effect

Die antimikrobielle Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz ist in Tabelle 8 angegeben. Bei Messung der minimalen Hemmkonzentration mit Hilfe der Agar-Verdünnungsmethode wird festgestellt, daß die erfindungsgemäße Substanz eine starke antibakterielle Wirkung gegen Gram-positive Bakterien zeigt und das Wachstum von säurefesten Bakterien inhibiert. The antimicrobial effect of the substance according to the invention is given in Table 8. When measuring the minimum inhibitory concentration using the agar dilution method found that the substance of the invention strong antibacterial effect against Gram-positive bacteria shows and inhibits the growth of acid-fast bacteria.

Tabelle 8 Table 8

(2) Effect of the Ma fraction on Hela cells

Die Ma-Fraktion verhindert die Zunahme der Hela-S₃-Zellen bei einer Konzentration von 0,1 mcg/ml und bewirkt eine Regenerierung der Zellen.The Ma fraction prevents the increase in Hela S₃ cells at a concentration of 0.1 mcg / ml and causes a Regeneration of the cells.

(3) Toxicity of the Ma fraction in animal experiments

Die Ma-Fraktion, aufgelöst in physiologischer Kochsalzlösung, wird bei Ratten vom Wistar-Stamm mit einem Gewicht von 120 bis 160 g intraperitoneal in einer Dosis von 1,04, 2,5, 6,0 und 14,4 mg/kg (Einzeldosis) verabreicht. Eine Gruppe besteht jeweils aus 8 Tieren. Die LD₅₀-Werte wurden nach einer siebentägigen Beobachtungszeit errechnet.The Ma fraction, dissolved in physiological saline, in rats of the Wistar strain weighing 120 to 160 g intraperitoneally in a dose of 1.04, 2.5, 6.0 and 14.4 mg / kg (single dose) administered. A group consists of 8 animals each. The LD₅₀ values were after a seven-day observation period.

(4) Anti-tumor activity of the Ma fraction

Die Antitumorwirkung der erfindungsgemäßen Substanz kann eindrucksvoll bei Ratten und Mäusen demonstriert werden. Donryu-Ratten werden intraperitoneal mit 1 000 000 Ascitestumorzellen (Yoshida-Sarkom) geimpft, und die erfindungsgemäße Substanz wird in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst und intraperitoneal in Einzeldosen von 10,0, 7,5, 5,0, 2,5, 1,0, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 und 0,001 mg/kg verabreicht, und zwar beginnend nach 72 Stunden nach Tumorimpfung. Die Biopsie der Krebszellen in der Bauchhöhle wird 24 und 48 Stunden nach Verabreichung durchgeführt. Unmittelbar danach werden die Tiere anatomisch untersucht. Die Metastasen des Yoshida-Sarkoms und die Toxizität der Ma-Fraktion in bezug auf die inneren Organe werden untersucht. Es wird festgestellt, daß die Ma-Fraktion einen erheblichen therapeutischen Einfluß ausübt, ohne auf die mit einem Tumor behafteten Ratten toxisch zu wirken. Daraus ergibt sich, daß der therapeutische Koeffizient sehr groß ist. Da die wirksame Dosis bei 200 liegt (Einzeldosis) und die akute Toxizität der Ma-Fraktion bei 4 mg/kg liegt, beträgt das therapeutische Verhältnis der minimal wirksamen Dosis, welche die Lebensdauer der mit einem Tumor behafteten Ratten verlängert, 400.The antitumor effect of the substance according to the invention can impressively demonstrated in rats and mice. Donryu rats become intraperitoneal with 1,000,000 ascitic tumor cells (Yoshida sarcoma) vaccinated, and the invention Substance is dissolved in physiological saline and intraperitoneally in single doses of 10.0, 7.5, 5.0, 2.5, 1.0, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 and 0.001 mg / kg administered, starting after 72 hours after tumor vaccination. The biopsy of cancer cells in the abdominal cavity is performed 24 and 48 hours after administration. Immediately afterwards, the animals are examined anatomically. The metastases of Yoshida sarcoma and the toxicity of the Ma fraction with regard to the internal organs are examined. It is noted that the Ma Group has a has significant therapeutic influence without affecting the to be toxic to rats afflicted with a tumor. It follows that the therapeutic coefficient is very large. Since the effective dose is 200 (single dose) and the acute toxicity of the Ma fraction 4 mg / kg, the therapeutic ratio is minimal effective dose, which affects the lifespan of the a tumor-bearing rat, 400.

Ferner wurde die Aktivität der Ma-Fraktion auch hinsichtlich eines Ascitestumors von Mäusen (Sarcoma-180-ascites- Krebs) (L-1210 ascetische Leukämie) untersucht. Wenn man zum Beispiel Mäuse intraperitoneal mit 4 000 000 180-Ascitestumorzellen (Sarkom) impft und die Ma-Fraktion 6mal täglich intraperitoneal verabreicht, und zwar beginnend nach 24 bis 48 Stunden nach Impfung mit den Tumorzellen, und zwar mit einem weiten Dosisbereich von 1,0 bis 0,05 mg/kg Körpergewicht, so wird die Ansammlung von Flüssigkeit in der Bauchhöhle wirksam unterdrückt, ohne daß sich eine Toxizität gegenüber den Mäusen zeigt. Die Lebensdauer der Mäuse wird drastisch erhöht, und die Wirkungsbreite bei einer täglichen Dosis beträgt 20.Furthermore, the activity of the Ma Group was also regarding an ascitic tumor of mice (Sarcoma-180-ascites- Cancer) (L-1210 ascetic leukemia). If for example mice intraperitoneally with 4,000,000 Vaccinates 180 ascites tumor cells (sarcoma) and the Ma fraction Administered intraperitoneally 6 times a day, starting after 24 to 48 hours after vaccination with the tumor cells, with a wide dose range of 1.0 up to 0.05 mg / kg body weight, the accumulation of Abdominal fluid effectively suppressed without that there is toxicity to the mice. The Mice lifespan is increased drastically, and the range of effects at a daily dose is 20.

Desgleichen kann die Ma-Fraktion die Lebensdauer von Mäusen, welche mit einem Tumor (wie L-1210) behaftet sind, merklich verlängern. Bisher war hierfür kein wirksames Antitumor- Antibiotikum bekannt. Diese Verlängerung der Lebensdauer wird bei 5,76 bis 0,4 mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Verabreichung erreicht. Das Mittel wird an jedem zweiten Tag den Mäusen verabreicht, und zwar an den jeweiligen Tagen 9mal.Similarly, the Ma fraction can control the lifespan of mice, which have a tumor (such as L-1210) are noticeable extend. So far, no effective anti-tumor Antibiotic known. This extension of life becomes at 5.76 to 0.4 mg / kg body weight with intraperitoneal Administration reached. The remedy will given to mice every other day 9 times a day.

Die Wirkung auf das Yoshida-Sarkom von Ratten wurde bereits bei dem Kulturfiltrat bemerkt und durch die gesamte Aufarbeitung hindurch verfolgt. Sodann wurde festgestellt, daß die Durchführung des Reinigungsverfahrens unter ständigem Testen der Hemmwirkung bei Sarcina lutea ebenso wirksam ist wie die Durchführung der Extraktion auf der Basis der Tumoraktivität der Substanz.The effect on Yoshida sarcoma in rats has already been noticed at the culture filtrate and through the whole Followed up processing. Then it was found that the implementation of the cleaning process under constant Testing the inhibitory effect on Sarcina lutea as well is effective like performing the extraction on the Basis of the tumor activity of the substance.

Die oben beschriebenen Eigenschaften der Ma-Fraktion des Neocarzinostatins bestätigen, daß es sich bei diesem Produkt um eine neue Substanz handelt.The properties of the Ma fraction of the Neocarzinostatins confirm that this product is a new substance.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die Beispiele zeigen, daß mit Hilfe einer Kombination verschiedener Einzelextraktionsverfahren die Ma-Fraktion mit hohem Reinheitsgrad erhalten werden kann.In the following, the invention is based on exemplary embodiments explained in more detail. The examples show that with Using a combination of different single extraction processes obtained the Ma fraction with a high degree of purity can be.

Example 1

200 l Kulturmedium (pH 7,2±0,2) werden in einem Gefäß von 400 l bereitet und auf 120°C während 30 Minuten erhitzt und sterilisiert. Dieses Kulturmedium enthält 2,0% Stärke, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,5% trockenen Hefeextrakt, 0,25% Natriumchlorid, 0,35% gefälltes Calziumcarbonat, 0,005% Magnesiumchlorid, 0,005% Kupfersulfat und 0,005% Zinksulfat. 200 l culture medium (pH 7.2 ± 0.2) are placed in a vessel of 400 l and heated to 120 ° C for 30 minutes and sterilized. This culture medium contains 2.0% starch, 2.0% soybean meal, 0.5% dry yeast extract, 0.25% sodium chloride, 0.35% precipitated calcium carbonate, 0.005% magnesium chloride, 0.005% copper sulfate and 0.005% zinc sulfate.

0,3 Volumenprozent einer Impfkultur von Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya, welche zuvor in einem Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung während 24 Stunden kultiviert wurde, wurde zur Impfung verwendet. Die Fermentation wurde unter Belüftung (300 l/min) durchgeführt, und die Kultur wurde mit 180 U/min gerührt. Falls übermäßige Schäumung eintritt, kann gegebenenfalls ein Antischäumungsmittel zugesetzt werden. Nach 12 Stunden nach Beginn der Kultur wird die antibakterielle Aktivität der Kulturbrühe untersucht. Diese erreicht nach 44 Stunden ein Maximum (die Antitumorwirkung gegen Mäuse-Ascitestumor wird parallel zur antibakteriellen Aktivität festgestellt). Der pH des Kulturmediums beträgt zu dieser Zeit 7,2. Die Kultivierung wird nach 46 Stunden unterbrochen, und das Kulturmedium wird durch eine Filterpresse filtriert, und der Festkörper, welcher das Mycel enthält, wird entfernt. Man erhält auf diese Weise 180 l eines Kulturfiltrats. Dieses Kulturfiltrat hemmt das Wachstum von Sarcina lutea bei Verdünnung auf das 700fache, und es hemmt ferner das Wachstum eines Ascitestumors (Yoshida-Sarkom) bei Verdünnung auf das 100fache. Das Kulturfiltrat enthält etwa 100 bis 400 mcg der Ma-Fraktion/ml.0.3 volume percent of a Streptomyces inoculum carzinostaticus var. F-41, Kuroya, which was previously in one Culture medium of the same composition for 24 hours was cultured, was vaccinated used. The fermentation was under aeration (300 l / min) and the culture was carried out with Stirred at 180 rpm. If excessive foaming occurs, an anti-foaming agent may optionally be added will. After 12 hours from the beginning of the culture, the Antibacterial activity of the culture broth was examined. This reaches a maximum after 44 hours (the anti-tumor effect against mouse ascites tumor is parallel to the antibacterial Activity detected). The pH of the culture medium at this time is 7.2. The cultivation will interrupted after 46 hours, and the culture medium is filtered through a filter press, and the solid, which contains the mycelium is removed. You get on this way 180 l of a culture filtrate. This culture filtrate inhibits the growth of Sarcina lutea when diluted 700 times, and it also inhibits growth of an ascitic tumor (Yoshida sarcoma) when diluted 100 times. The culture filtrate contains about 100 to 400 mcg of the Ma fraction / ml.

Das so erhaltene Kulturfiltrat wird mit Amberlite XAD versetzt, so daß eine 0,5%ige (Gewicht/Volumen) Mischung entsteht, und die erhaltene Mischung wird während 10 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wird mittels einer gesättigten Oxalsäurelösung auf pH 3,5 bis 4,0 eingestellt. Zu dem so erhaltenen Filtrat gibt man eine äquivalente Mischung von Kaolin und Celit, so daß eine 1%ige (Gewicht/Volumen) Mischung entsteht. Das Filtrat wird 15 Minuten gerührt und ausgefällt, und die am Adsorptionsmittel abgeschiedenen Verunreinigungen werden durch Filtration entfernt. Das erhaltene Filtrat wird durch Zugabe von Ammoniumsulfat ausgesalzt, wobei man eine 65%ige (Gewicht/ Volumen) Lösung erhält. Dies geschieht unterhalb 15°C, worauf während zwei Stunden gerührt wird. Der erhaltene Niederschlag wird durch eine Filterpresse abfiltriert. Die Filterpresse wurde zuvor mit einer solchen Menge Celit beschichtet, daß eine 0,2%ige (Gewicht/Volumen) Mischung entsteht, und die Feststoffe werden gesammelt. Zu diesem Niederschlag gibt man 10 l Wasser, wobei eine wäßrige Lösung gebildet wird, welche sodann mit gesättigter Natriumbikarbonatlösung auf pH 6,5 eingestellt wird und dann während 15 Minuten filtriert und gerührt wird. Das Filtrat wird in einem Cellophanschlauch, welcher von einer geeigneten Menge Natriumsulfat umgeben ist, eingefüllt, ausgesalzt und durch Anlegen eines geeigneten Drucks während 20 Stunden eingeengt. Der Niederschlag wird abfiltriert, und das erhaltene Filtrat wird verworfen. Zu dem Niederschlag gibt man 0,3 l Wasser, wobei eine wäßrige Lösung gebildet wird. Diese wird in einen Cellophanschlauch gefüllt und gegen reines Wasser bei 4°C während 24 Stunden dialysiert, um das Ammoniumsulfat und die niederen molekularen Verunreinigungen zu entfernen. 0,5 l der erhaltenen Lösung werden in eine Sephadex-G-50-Säule mit den Innenabmessungen 10 cm×90 cm, welche zuvor vollständig mit Wasser gewaschen wurde, gegossen und sodann unter Verwendung von Wasser als Elutionierungsmittel gelfiltriert. Die Flüssigkeit wird kontinuierlich fraktioniert, wobei jeweils 100 ml aufgefangen werden. Dabei werden die aktiven Fraktionen gewonnen. Hierzu wird die antibakterielle Aktivität gegen Sarcina lutea PCI 1001 als Indikator für die Antitumoraktivität der einzelnen Fraktionen herangezogen. Die so erhaltenen aktiven Fraktionen werden in eine Säule mit den Innenabmessungen 7,4 cm×60 cm, welche mit einem Ionenaustauscherharz gepackt ist (Amberlite IR 120; H⁺-Typ) und welche zuvor vollständig mit Wasser gewaschen wurde, gegossen und mit reinem Wasser eluiert, während die Verunreinigungen adsorbiert werden. Die Flüssigkeit wird kontinuierlich fraktioniert, und 100 ml werden jeweils aufgefangen. Die aktiven Fraktionen werden durch Messung der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea PCI 1001 festgestellt. Die so erhaltenen aktiven Fraktionen werden lyophilisiert, wobei man 50 g einer rohen Ma-Fraktion des Neocarzinostatins mit leicht gelblich-brauner Färbung erhält. Das erhaltene Pulver inhibiert das Wachstum von Sarcina lutea PCI 1001 bei einer Konzentration von 1,0 mcg/ml und inhibiert vollständig das Wachstum des Ascitestumors (Yoshida-Sarkom) bei Ratten bei einer einmaligen Verabreichung von 10 mcg/ml.The culture filtrate thus obtained is with Amberlite XAD offset so that a 0.5% (weight / volume) Mixture arises, and the mixture obtained is stirred for 10 minutes and then filtered. The filtrate is adjusted to pH 3.5 using a saturated oxalic acid solution set to 4.0. Add to the filtrate thus obtained an equivalent mixture of kaolin and celite so that a 1% (weight / volume) mixture is created. The filtrate is stirred and precipitated for 15 minutes, and that on the adsorbent deposited impurities are removed by filtration away. The filtrate obtained is obtained by adding Salted out ammonium sulfate, whereby a 65% (weight / Volume) solution. This happens below 15 ° C, followed by stirring for two hours. The received one Precipitation is filtered off by a filter press. The filter press was previously equipped with one Amount of Celite coated that is 0.2% (weight / volume) Mixture is created and the solids are collected. 10 l of water are added to this precipitate, whereby an aqueous solution is formed, which is then saturated Sodium bicarbonate solution adjusted to pH 6.5 and then filtered and stirred for 15 minutes. The filtrate is in a cellophane tube, which from surrounded by a suitable amount of sodium sulfate, salted out and by applying a suitable pressure concentrated for 20 hours. The precipitate is filtered off, and the filtrate obtained is discarded. To the precipitate is added 0.3 l of water, an aqueous Solution is formed. This is in a cellophane tube filled and against pure water at 4 ° C during Dialyzed for 24 hours to get the ammonium sulfate and the lower to remove molecular contaminants. 0.5 l the solution obtained are placed in a Sephadex G-50 column with the inner dimensions 10 cm × 90 cm, which were previously complete was washed with water, poured and then gel filtered using water as the eluent. The liquid is continuously fractionated collecting 100 ml each. The active fractions won. For this, the antibacterial Activity against Sarcina lutea PCI 1001 as an indicator used for the antitumor activity of the individual fractions. The active fractions thus obtained are in a column with the inner dimensions 7.4 cm × 60 cm, which is packed with an ion exchange resin (Amberlite IR 120; H⁺ type) and which have been completely washed with water beforehand was poured and eluted with pure water while the Impurities are adsorbed. The liquid will continuously fractionated, and 100 ml are collected in each case. The active fractions are determined by measuring the antibacterial activity against Sarcina lutea PCI 1001 detected. The active fractions thus obtained are lyophilized, 50 g of a crude Ma fraction of the Neocarzinostatins with a slightly yellowish-brown color. The powder obtained inhibits the growth of Sarcina lutea PCI 1001 at a concentration of 1.0 mcg / ml and completely inhibits the growth of ascitic tumor (Yoshida sarcoma) in rats given once of 10 mcg / ml.

50 g der rohen Ma-Fraktion des Neocarzinostatins werden in 150 ml einer 0,02 M Tris-Salzsäure-Pufferlösung von pH 7,3 aufgelöst, und es wird unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose eine Ionenaustauschchromatographie durchgeführt. Dabei wird die Diäthylaminoäthylcellulose vollständig mittels einer 0,02 M Tris-Salzsäure-Pufferlösung von pH 7,3 gepuffert und in eine Chromatographiesäule aus Glas mit den Abmessungen 7,4 cm×60 cm eingefüllt, und 10 l der gleichen Pufferlösung werden auf die Säule gegeben, bis der Inhalt vollständig äquilibriert ist. 150 ml der Lösung der Ma-Fraktion werden auf die Säule gegeben und adsorbiert. Sodann wird mit 40 l einer 0,02 M Tris-Salzsäure-Lösung mit einem pH von 7,3 eluiert und ferner mit 4,0 l einer Lösung, welche durch Zugabe einer solchen Menge Kochsalz zu der gleichen Pufferlösung, daß eine Konzentration von 1 M erhalten wird, hergestellt wurde. Dabei wird ein linearer Konzentrationsgradient verwirklicht. Das Eluat wird kontinuierlich mittels eines Zeiner-Dialysators vom Typ L-D-3 dialysiert. Dieses Gerät ist am Boden der Säule angebracht. Die Flüssigkeit wird in Mengen von jeweils 100 ml kontinuierlich gesammelt. 50 g of the raw Ma fraction of the neocarzinostatin are in 150 ml of a 0.02 M Tris hydrochloric acid buffer solution of pH 7.3 dissolved and it is made using diethylaminoethyl cellulose Ion exchange chromatography performed. The Diethylaminoethylcellulose completely using a 0.02 M Tris hydrochloric acid buffer solution of pH 7.3 buffered and in a chromatography column made of glass with the dimensions 7.4 cm × 60 cm and 10 l of the same buffer solution are placed on the column until the contents are complete is equilibrated. 150 ml of the Ma fraction solution are placed on the column and adsorbed. Then is mixed with 40 l of a 0.02 M Tris hydrochloric acid solution with a pH of 7.3 eluted and further with 4.0 l of a solution which by adding such an amount of table salt to the same Buffer solution that a concentration of 1 M is obtained, was produced. This creates a linear concentration gradient realized. The eluate is continuously by means of of a L-D-3 type Zeiner dialyzer. This The device is attached to the bottom of the column. The liquid is continuously collected in amounts of 100 ml each.

Bei Messung der optischen Dichte bei 280 mµ (ein Maß für die Menge des Proteins) und der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea der einzelnen Fraktionen erhält man das Elutionierungsbild gemäß Fig. 1. Bei Durchführung dieses Verfahrens können die Pigmente und die Säureverunreinigungen entfernt werden. Wie Fig. 1 zeigt, führt diese Verfahren zu einer vollständigen Fraktionierung in aktive Fraktionen, d. h. in eine Ma-Fraktion und in eine Mb-Fraktion. Die Ma-Fraktion, d. h. 600 ml der Fraktionen 32 bis 37 werden lyophilisiert, wobei man 26,5 g eines hell-gelblich-weißen Pulvers erhält. 26 g dieses Pulvers werden in 100 ml reinem Wasser aufgelöst und unter Verwendung von Sephadex G-25 gelfiltriert. Hierzu wird mit 0,01 M Essigsäurepufferlösung gepufferter Sephadex G-25 in eine Chromatographiesäule aus Glas mit den Abmessungen 4,6 cm×140 cm gefüllt. Sodann werden 15 l der Pufferlösung in die Säule gegeben, und der Inhalt wird äquilibriert. 100 ml der Ma-Lösung werden in die Säule gegeben und unter Verwendung der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Flüssigkeit wird kontinuierlich in Mengen von jeweils 20 ml aufgefangen. Durch Messung der optischen Dichte bei 280 mµ und der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea einer jeden Fraktion wird die Ma-Fraktion ausgesondert und dann lyophilisiert, wobei man 11,2 g eines vollständig entsalzten weißen Puffers erhält. Im Hinblick auf die Stabilität der Ma-Fraktion wird die obige Reinigung bei einer Tiefentemperatur unterhalb 10°C durchgeführt.When measuring the optical density at 280 mμ (a measure of the amount of protein) and the antibacterial activity against Sarcina lutea of the individual fractions, the elution image according to FIG. 1 is obtained . When this method is carried out, the pigments and the acid impurities can be removed. As shown in FIG. 1, this method leads to complete fractionation into active fractions, ie into a Ma fraction and an Mb fraction. The Ma fraction, ie 600 ml of fractions 32 to 37, are lyophilized, 26.5 g of a light yellowish white powder being obtained. 26 g of this powder are dissolved in 100 ml of pure water and gel filtered using Sephadex G-25. For this purpose, Sephadex G-25 buffered with 0.01 M acetic acid buffer solution is poured into a chromatography column made of glass with the dimensions 4.6 cm × 140 cm. Then 15 liters of the buffer solution are added to the column and the contents are equilibrated. 100 ml of the Ma solution are added to the column and eluted using the same buffer solution. The liquid is continuously collected in amounts of 20 ml each. By measuring the optical density at 280 mµ and the antibacterial activity against Sarcina lutea of each fraction, the Ma fraction is separated and then lyophilized, whereby 11.2 g of a completely desalted white buffer is obtained. In view of the stability of the Ma fraction, the above cleaning is carried out at a depth below 10 ° C.

Example 2

Zur Bestätigung der Vollständigkeit der Abtrennung mit Hilfe von Diäthylaminoäthylcellulose gemäß Beispiel 1 wird eine ähnliche Abtrennung unter Verwendung einer mit Tritium markierten rohen Ma-Fraktion durchgeführt. Hierzu werden 50 mg der rohen Ma-Fraktion mit Tritiumgas (20 Ci) während 5 Tagen kontaktiert, und dann wird das instabile Tritium durch Einengen im Vakuum entfernt, nachdem Wasser zugegeben wurde. Dabei erhält man 38 mg/40 mCi Pulver. Zu diesem gibt man 100 mg der rohen Ma-Fraktion, und die erhaltene Mischung wird in 3 ml einer 0,02 M Tris-Pufferlösung von pH 7,3 aufgelöst. Diese Lösung wird in eine DEAE-Cellulose-Säule mit den Abmessungen 2,1 cm×40 cm gegeben, welche zuvor vollständig mit der gleichen Pufferlösung gepuffert wurde. Die Ma-Fraktion wird adsorbiert. Sodann wird mit 200 ml einer 0,02 M Tris-Pufferlösung (pH 7,3) und 200 ml einer Lösung, welche durch Zugabe einer zur Bereitung einer Konzentration von 1 M ausreichenden Menge Natriumchlorid zu der Pufferlösung hergestellten Lösung eluiert, wobei ein linearer Konzentrationsgradient eingestellt wird. Die Flüssigkeit wird kontinuierlich gesammelt, und zwar in Mengen von jeweils 4 ml. Durch Messung der optischen Dichte bei 280 mµ und der Radioaktivität des Tritiums mittels eines Scintillationszählers der jeweiligen Fraktionen erhält man ein Eluierungsbild gemäß Fig. 2. Die Ma-Fraktion wird abgetrennt und lyophilisiert. Sie wird in 2 ml einer 0,01 M Essigsäurelösung aufgelöst und auf eine Sephadex-G-25-Säule mit den Abmessungen 1,6 cm ×102 cm gegeben, welche zuvor vollständig gepuffert und mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert wurde. Dann folgt die Gelfiltration. Die Flüssigkeit wird kontinuierlich abgetrennt, und zwar in Mengen von jeweils 4 ml. Durch Messung der optischen Dichte bei 280 mµ wird die antibakterielle Aktivität gegen Sarcina lutea einer jeden Fraktion untersucht. Ferner wird die Radioaktivität des Tritiums festgestellt. Auf diese Weise wird die Ma-Fraktion ausgesondert. Diese wird sodann lyophilisiert, wobei man 62,1 mg einer mit Tritium markierten reinen Ma-Fraktion erhält. Die minimale Wachstumshemmkonzentration dieser Fraktion gegen Sarcina lutea PCI 1001 beträgt 0,1 mcg/ml. Dies geschieht durch eine Messung nach der Pulpenscheibenmethode, und die Fraktion zeigt eine Radioaktivität von 10,58 µCi/mg. To confirm the completeness of the separation with the aid of diethylaminoethyl cellulose according to Example 1, a similar separation is carried out using a crude Ma fraction marked with tritium. For this, 50 mg of the crude Ma fraction are contacted with tritium gas (20 Ci) for 5 days, and then the unstable tritium is removed by concentration in vacuo after water has been added. This gives 38 mg / 40 mCi powder. 100 mg of the crude Ma fraction are added to this, and the mixture obtained is dissolved in 3 ml of a 0.02 M Tris buffer solution of pH 7.3. This solution is placed in a DEAE cellulose column with the dimensions 2.1 cm × 40 cm, which was previously completely buffered with the same buffer solution. The Ma fraction is adsorbed. Then, with 200 ml of a 0.02 M Tris buffer solution (pH 7.3) and 200 ml of a solution which is eluted by adding a solution prepared to prepare a concentration of 1 M sufficient amount of sodium chloride to the buffer solution, whereby a linear concentration gradient is set. The liquid is continuously collected, in each case in amounts of 4 ml. By measuring the optical density at 280 mμ and the radioactivity of the tritium using a scintillation counter of the respective fractions, an elution image according to FIG. 2 is obtained . The Ma fraction is separated off and lyophilized. It is dissolved in 2 ml of a 0.01 M acetic acid solution and placed on a Sephadex G-25 column measuring 1.6 cm × 102 cm, which has been completely buffered beforehand and equilibrated with the same buffer solution. Then gel filtration follows. The liquid is continuously separated, in quantities of 4 ml each. By measuring the optical density at 280 mµ, the antibacterial activity against Sarcina lutea of each fraction is examined. The radioactivity of the tritium is also determined. In this way, the Ma group is separated. This is then lyophilized to obtain 62.1 mg of a pure Ma fraction labeled with tritium. The minimum growth inhibitory concentration of this fraction against Sarcina lutea PCI 1001 is 0.1 mcg / ml. This is done by measuring using the pulp disk method, and the fraction shows a radioactivity of 10.58 µCi / mg.

Example 3

Zur Bestätigung der Reinheit der Ma-Fraktion gemäß Beispielen 1 und 2 wird eine Elektrophorese unter Verwendung einer Celluloseacetatmembran durchgeführt. Hierzu wird eine Pufferlösung mit den pH-Werten 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 und 8,0 hergestellt, und zwar unter Verwendung einer Phosphat-Citrat-Pufferlösung mit einer Ionenstärke von µ=0,2. Es wird eine solche Menge der Ma-Fraktion in der jeweiligen Pufferlösung aufgelöst, daß man eine Konzentration von 10% erhält. Sepraphore III mit den Abmessungen 2,5 cm×17 cm wird mit der jeweiligen Pufferlösung gepuffert, worauf 0,0008 ml/cm der Ma-Fraktion daraufgegeben werden und worauf die elektrophoretische Wanderung unter 0,8 mA/cm (konstanter Strom) bei 20°C während 80 Minuten durchgeführt wird. Unmittelbar nach Beendigung der Elektrophorese wird die Membran mit Ponceau-3-R gefärbt und danach unter Verwendung einer 1%igen Essigsäurelösung entfärbt. Die Ergebnisse gemäß Tabelle 3 werden erhalten, wenn man den Abstand zwischen der verfärbten Position und der Ausgangsposition mißt. Die elektrophoretische Wanderung der Ma-Fraktion, welche mit Tritium markiert wurde, wird unter 0,8 mA/cm (konstanter Strom) bei Zimmertemperatur (20°C) während 80 Minuten durchgeführt, nachdem die Membran mit einer Pufferlösung (pH 7,0) gepuffert wurde und nachdem 0,0008 ml/cm einer 1%igen Ma-Fraktion daraufgegeben wurden. Nach beendeter Elektrophorese wird die Membran an der Luft getrocknet und nicht gefärbt, und danach wird das Wandlungsbild gemäß Fig. 5 in Form eines einzelnen Peaks in einem Abstand von 3,1 cm vom Ausgangspunkt (zur Anode hin) mittels eines Scintillationszählers für Dünnschichtchromatographie festgestellt. Das erhaltene Ergebnis stimmt mit dem vorherigen Test, bei dem mit Ponceau-3-R angefärbt wurde, überein. To confirm the purity of the Ma fraction according to Examples 1 and 2, electrophoresis is carried out using a cellulose acetate membrane. For this purpose, a buffer solution with the pH values 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 and 8.0 is prepared, using a phosphate-citrate buffer solution with an ionic strength of µ = 0.2. An amount of the Ma fraction is dissolved in the respective buffer solution so that a concentration of 10% is obtained. Sepraphore III with the dimensions 2.5 cm × 17 cm is buffered with the respective buffer solution, then 0.0008 ml / cm of the Ma fraction is added and then the electrophoretic migration below 0.8 mA / cm (constant current) at 20 ° C is carried out for 80 minutes. Immediately after electrophoresis is complete, the membrane is stained with Ponceau-3-R and then decolorized using a 1% acetic acid solution. The results shown in Table 3 are obtained by measuring the distance between the discolored position and the starting position. The electrophoretic migration of the Ma fraction, which was labeled with tritium, is carried out under 0.8 mA / cm (constant current) at room temperature (20 ° C.) for 80 minutes after the membrane with a buffer solution (pH 7.0) was buffered and after 0.0008 ml / cm 1% Ma fraction was put thereon. After electrophoresis is complete, the membrane is air-dried and not stained, and then the conversion image according to FIG. 5 is determined in the form of a single peak at a distance of 3.1 cm from the starting point (towards the anode) by means of a scintillation counter for thin-layer chromatography. The result obtained is in agreement with the previous test in which Ponceau-3-R was stained.

Example 4

Zur Bestimmung des isoelektrischen Punkts der Ma-Fraktion wird eine Chromatographie unter Verwendung von Carboxymethylcellulose (CM) durchgeführt. Ein Glasrohr wird zu diesem Zweck mit CM-Cellulose gepackt und vollständig mit einer 0,1 M Essigsäurelösung gepuffert. Die Säule hat die Abmessungen 2,1 cm×44 cm. 500 ml der gleichen Pufferlösung läßt man sodann durch die Säule laufen, um ein Gleichgewicht herzustellen. Eine Lösung von 60 mg der Ma-Fraktion in 2 ml der gleichen Pufferlösung wird auf die Säule gegeben und adsorbiert. Sodann wird mit 350 ml einer 0,1 M Essigsäurelösung und mit 350 ml einer 0,1 M Natriumacetatlösung unter Ausbildung eines linearen Konzentrationsgradienten eluiert. Die Flüssigkeit wird kontinuierlich in Mengen von jeweils 4 ml aufgefangen. Durch Messung des pH, der optischen Dichte bei 280 mµ und der antibakteriellen Aktivität gegen Sarcina lutea PCI 1001 einer jeden eluierten Fraktion wird das Eluierungsbild gemäß Fig. 4 erhalten. Der isoelektrische Punkt der Ma-Fraktion liegt bei 3,30 (Schätzung aufgrund des pH-Werts im Eluierungspunkt).Chromatography is carried out using carboxymethyl cellulose (CM) to determine the isoelectric point of the Ma fraction. For this purpose, a glass tube is packed with CM cellulose and completely buffered with a 0.1 M acetic acid solution. The column has the dimensions 2.1 cm × 44 cm. 500 ml of the same buffer solution is then passed through the column to equilibrate. A solution of 60 mg of the Ma fraction in 2 ml of the same buffer solution is added to the column and adsorbed. Then eluted with 350 ml of a 0.1 M acetic acid solution and with 350 ml of a 0.1 M sodium acetate solution to form a linear concentration gradient. The liquid is continuously collected in quantities of 4 ml each. The elution image according to FIG. 4 is obtained by measuring the pH, the optical density at 280 mμ and the antibacterial activity against Sarcina lutea PCI 1001 of each eluted fraction. The Ma fraction's isoelectric point is 3.30 (estimate based on pH at the elution point).

Fig. 1 zeigt das Eluierungsmuster bei der Reinigung von roher Ma-Fraktion bei Anwendung eines Salzkonzentrationsgradienten bei der Säulenchromatographie unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose. Fig. 1 shows the elution pattern in the purification of crude Ma fraction using a salt concentration gradient in column chromatography using diethylaminoethyl cellulose.

Fig. 2 zeigt ein Eluierungsmuster bei der Säulenchromatographie der rohen Ma-Fraktion, welche mit Tritium markiert wurde, unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose. Fig. 2 shows an elution pattern in the column chromatography of the crude Ma fraction which was labeled with tritium using diethylaminoethyl cellulose.

Fig. 3 zeigt ein Eluierungsmuster, erhalten bei Messung des Molekulargewichts von Standardproteinen und der Ma- Fraktion unter Verwendung von Sephadex G-75. Fig. 3 shows an elution pattern obtained when measuring the molecular weight of standard proteins and the Ma fraction using Sephadex G-75.

Fig. 4 zeigt ein Eluierungsmuster, erhalten durch Säulenchromatographie der Ma-Fraktion unter Verwendung von Carboxymethylcellulose. Fig. 4 shows an elution pattern obtained by column chromatography of the Ma fraction using carboxymethyl cellulose.

Fig. 5 zeigt ein Muster der Elektrophorese der Ma-Fraktion, welche mit Tritium markiert wurde. Fig. 5 shows a pattern of the electrophoresis of the Ma fraction which was labeled with tritium.

Fig. 6 zeigt ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Ma-Fraktion. Fig. 6 shows an ultraviolet absorption spectrum of the Ma fraction.

Fig. 7 zeigt ein sichtbares Rotationsdispersionsspektrum der Ma-Fraktion. Fig. 7 shows a visible rotational dispersion spectrum of the Ma fraction.

Fig. 8 zeigt ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Ma-Fraktion. Fig. 8 shows an ultraviolet absorption spectrum of the Ma fraction.

Fig. 9 zeigt ein Infrarotspektrum der Ma-Fraktion (Kalium-Bromid-Tablette). Fig. 9 shows an infrared spectrum of Ma fraction (potassium bromide tablet).

Claims

1. Antibiotic with the following characteristic properties:

(1) Elemental analysis:
C: 47.91%, H: 6.63%, N: 14.56%, S: 1.26%, O: 29.64%.
(2) Molecular weight: 13,200.
(3) Amino acid composition:
Aspartic acid 11, threonine 11 or 12, serine 10, glutamic acid 5, proline 2, glycine 14, alanine 16, 1/2 cystine 4, valine 11, methionine 0, isoleucine 1, leucine 6, tyrosine 1, phenylalanine 5, histidine 0, Tryptophan 3, lysine 1, arginine 3.
(4) Decomposition point: 276 ° C.
(5) Specific rotation: [ α ] = - 87 ° (C = 1, H₂O).
(6) Ultraviolet absorption spectrum:
(7) Solubility:
Easily soluble in water, moderately soluble in methanol, slightly soluble in ethanol and acetone.
(8) Color reaction:
Positive biuret; Folin, phenol, peptide and ninhydrin reaction and negative molar, anthrone, phenol, sulfuric acid, iron chloride and molybdenum blue reaction.

2. A process for the preparation of the antibiotic according to claim 1, characterized in that Streptomyces carzinostaticus var. F-41, Kuroya = ATCC 15945, is cultivated and the antibiotic is isolated from the culture solution by

(a) precipitation of the impurities by changing the pH or by adding metal ions;
(b) fractional precipitation by changing the salt concentration with ammonium sulfate;
(c) fractional precipitation by adding a freely miscible organic solvent:
(d) Elution with kaolin, celite, amberlite XAD 2 to 12, amberlite IR-120, IRC-50, IRA-410, IR-45, DEAE-cellulose, TEAE-cellulose, P-cellulose, CM-Sephadex or QAE- Sephadex and / or
(e) separation with cellophane, Sephadex or Biogel.