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PATENTANSPRÜCHE
1. Protein KUD-PC, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Eigenschaften: (a) Elementaranalyse: enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel; C 49,98%, H 7,27%, N 15,23%, S 1,08%; (b) Molekulargewicht: 11 500 nach der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese; (c) Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung); (d) spezifische Drehung: [ai0 = -55,8, c = 1,0, HzO; (e) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 1 dargestellt; (f) Infrarot-Absorptionsspektrum: wie in Fig. 2 dargestellt; (g) Löslichkeit: löslich in Wasser, unlöslich in organischen Lösungsmitteln; (h) Farbreaktionen: positiv:
Folin-Lowry-, Biuret- und Rydon-Smith-Reaktionen, negativ: Phenol-H2SO4- und Anthron-H2SO4-Reaktionen, HC1-Hydrolysat: positiv auf Ninhydrin-Reaktion; (i) Natur: pH 4 bis 8 in 0,1%iger wässeriger Lösung; (Farbe und Kristallform: farblose Kristalle; (k) Aminosäurezusammensetzung: das molare Verhältnis der Aminosäureanalyse des HC1-Hydrolysates ist die folgende: Aspartinsäure 0,144 Threonin 0,258 Serin 0,226 Glutaminsäure 0,141 Prolin 0,111 Glycin 0,250 Alanin 0,363 Valin 0,265 Isoleucin 0,016 Leucin 0,117 Methionin Tyrosin 0,020 Phenylalanin 0.079 Lysin 0,089 Arginin 0,040 Histidin (Spuren) (1) Elektrophorese:
das elektrophoretische Profil der SDS Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ist in Fig. 3 dargestellt, und die Substanz weist eine einzige Spitze auf.
2. Verfahren zur Herstellung der neuen proteinartigen Substanz KUD-PC, dadurch gekennzeichnet, dass man einen das Protein KUD-PC erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, in einem Nährmedium erzeugt, das Protein KUD-PC in der Kulturmasse anreichert und die derart erhaltene proteinartige Substanz KUD-PC daraus isoliert.
3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der die proteinartige Substanz KUD-PC erzeugende Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, Streptosporangium pseudovulgalae PO-357 FERM-P Nr. 3571 ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das neue Protein KUD-PC und auf dessen Herstellung. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Protein KUD PC, welches durch Züchtung eines das Protein KUD-PC erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, erzeugt wird, und die Antitumorwirksamkeit erhöht.
Es wurde gefunden, dass ein Mikroorganismenstamm PO.
357, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört und aus einer Bodenprobe, gesammelt in Setagaya-ku, Tokyo, Japan, isoliert wurde, das Antibiotikum PO-357 erzeugt (welches später als Sporamycin bezeichnet wurde), welche antibakterielle Aktivität gegen Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis sowie Antitumorwirksamkeit aufweist. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Substanz sowie die taxonimischen Eigenschaften des erzeugenden Mikroorganis.
menstammes wurden in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 53-7601 offenbart.
Es wurde nun eine physiologisch-aktive Substanz gefunden, welche keine antibakterielle Aktivität besitzt, elektropho retisch von Sporamycin verschieden ist und die Antitumorwirksamkeit von Antitumorsubstanzen erhöht, und diese phy siologisch aktive Substanz wurde als das Protein KUD-PC bezeichnet.
Das neue Protein KUD-PC der vorliegenden Erfindung (im folgenden bezeichnet als KUD-PC) weist die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften auf: (a) Elementaranalyse: enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel; C 49,98oö, H 7,270 ó, N 15,23%, S 1,08''in (gefunden nach dem Trocknen bei 100 " während 3 Stunden im Vakuum).
(b) Molekulargewicht: 11 500 berechnet durch Vergleich mit Standard-Substanzen (Standard-Polypeptid oder Standard-Protein vom Molekulargewicht 2512 bis 16949) durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese: (c) Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung); (d) spezifische Drehung: [aD = - 55,8 (c = 1,0, H20); (e) Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
UV-Spektrum von KUD-PC in wässeriger Lösung und 0,1 N NaOH ist in Fig. 1 dargestellt; Xma Y 253,259,265,268 (Schulter), 275, 280 (Schulter) nm, g ' NjOH = 294 nm; (f) Infrarot-Adsorptionsspektrum: Fig. 2 (KBr); (g) Löslichkeit: löslich in Wasser und unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, Aceton und Benzol; (h) Farbreaktion: positiv: Folin-Lowry, Biret- und Rydon.
Smith-Reaktion, negativ: Phenol-H2SO4- und Anthron H2SO4-Reaktion, positiv für Ninhydrin-Reaktion: HCI- Hydrolysat; (i) Farbe und Kristallform: farblose Kristalle, Kristalle erhalten durch Ultrafiltration von wässriger Lösung sind Kristalle von hexagonalen Systemen und durch Ammoniumsulfat ausgesalzene Kristalle sind prismatisch; (i) Natur: pH 4 bis 8 (0,1 '!oige wässerige Lösung von KUD-PC); (k) Aminosäureanalyse:
KUD-PC (5 mg) wurde hydrolysiert mit HCI in einem versiegelten Röhrchen und durch Flüs sigchromatographie (Hitachi Model 0,34-2U) analysiert: Aminosäure (ILM) Aspartinsäure 0,144 Threonin 0,258 Serin 0,226 Glutaminsäure 0,141 Prolin 0,111 Glycin 0,250 Alanin 0,363 Valin 0,265 Isoleucin 0,016 Leucin 0,117 Methionin
Aminosäure (llM) Tyrosin 0,020 Phenylalanin 0,079 Lysin 0,089 Arginin 0,040 Histidin (Spur) (1) Elektrophorese: das elektrophoretische Profil, analysiert durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und ausgezeichnet durch einen Chromato-Scanner (Shimazu CS-910) ist in Fig. 3 dargestellt als einzelne Substanz.
Das elektrophoretische Muster mittels Celluloseacetatmembran-Elektrophorese (Cellulo Gel RS, pH 2, 1 M Acetat Formiat-Puffer, 200 V, 1 Stunde, Amido schwarz 1OB-Färbung) ist in Fig. 4 als einzelnes Band dargestellt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des neuen Proteins KUD-PC ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen das Protein KUD-PC erzeugenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört, in einem Nährmedium züchtet und das gebildete KUD-PC daraus isoliert.
Medium Wachstum Saccharose- Nitrat-Agar schwach
Glucose-Aspargin-Agar schwach
Glycerin-Aspargin-Agar schwach anorganisches Salz-Stärke-Agar schwach
Tyrosin-Agar mässig
Nähr-Agar mässig-gut Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar gut
Hafermehl-Agar gut 3. Physiologische Eigenschaften (1) Wachstumstemperatur: möglich bis 43 "C, optimales Wachstum bei etwa 27 bis 30 "C.
(2) Melaninerzeugung: negativ auf Tyrosin-Agar.
(3) Verflüssigung von Gelatine: positiv.
(4) Hydrolyse von Stärke: positiv.
(5) Peptonisierung von Milch: positiv.
(6) H2S-Bildung: negativ.
(7) Nitratreduktion: positiv.
4. Verwertung der Kohlenstoffquelle
Beobachtet auf Pridham-Gottlieb-Agarmedium, enthaltend 0,05% Hefeextrakt.
Verwertung: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Mannose.
Mögliche Verwertung: D-Galactose, D-Raffinose, L Rhamnose, D-Fructose.
Keine Verwertung: Inosit, Saccharose.
5. Zellenwandzusammensetzung
Die Analyse der Zellwände erfolgte nach der Methode von Becker et al. [appl. Micorbiol., 13, 236-243 (1965)].
DAP* Glycin Arabinose Galactose
Meso-Typ -* - - * Diaminopinolinsäure.
** nicht festgestellt.
Der KUD-PC erzeugende Stamm gehört zur Gattung Streptosporangium, wie oben beschrieben, und der Stamm PO-357, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört und durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, ist nur ein Beispiel für einen in der vorliegenden Erfindung mit Erfolg anwendbaren Mikroorganismus.
Die taxonomischen Eigenschaften des genannten Stammes sind die folgenden: 1. Morphologische Eigenschaften
Die mikroskopische Untersuchung ergab, dass das Luftmycelium gerade ist, wobei sich die meisten Sporangien an der Spitze des Myceliums befinden. Die Grösse des Sporangiums beträgt 5 bis 10 u, durchschnittlich 7,5 u im Durchmesser. Die Länge der Sporangien, welche Lufthyphen tragen, ist kurz und im allgemeinen etwa 3 u. Die Sporen sind rund oder eiförmig, mit glatter Oberfläche und einem Durchmesser von 0,9 bis 1,4 u. Es wurden keine Flagellen beobachtet.
2. Kultureigenschalten auf verschiedenen Medien
Beobachtung bei 27 "C nach 10- bis 14tägiger Züchtung.
Rückseite Luft-Mycelium lösliches Pigment hellorange milchig-weiss keines hellgelb milchig-weiss keines hellgelb milchig-weiss keines bräunlichweiss-weiss milchig-weiss keines hellorange hellorange keines orange orange keines orange orange keines dunkelorange dunkelorange keines
Verschiedene der obigen taxonomischen Eigenschaften weisen deutlich darauf hin, dass der Stamm PO-357 ein Mikroorganismus ist, welcher zur Gattung Streptosporangium gehört.
Unter den bekannten Arten ist Streptosporangium pseudovulgalae Nonomura [J. Ferm. Tech. Japan, 47, 701-709 (1969)] nahe verwandt mit dem Stamm PO-357, doch bestehen Unterschiede, insbesondere in der Farbe des Luftmyceliums und in den biologischen Aktivitäten. Deshalb wird der Stamm PO-357 bezeichnet als Streptosporangium pseudovulgalae PO-357. Der Stamm wurde am 25. Mai 1976 im Institute for Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi l-chome, Yatabe-machi, Tsubuka-gun, Ibarakiken 305, Japan, hinterlegt und mit der Hinterlegungs-Nummer: FERM P Nr. 3571 bezeichnet.
In der vorliegenden Erfindung können nicht nur Streptosporangium sp. PO-357, sondern auch dessen natürliche oder künstliche Mutanten, erhalten durch Einwirkung von Ultraviolett-, Röntgenstrahlen, Strahlungs- oder chemischen Mutagenen, wie auch die Mikroorganismen, welche zur Gattung Streptosporangium gehören und die Fähigkeit besitzen, das neue Protein KUD-PC zu erzeugen, für die Herstellung von KUD-PC verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung werden die KUD-PC erzeugenden Mikroorganismen, welche zur Gattung Streptosporangium gehören, in einem üblichen Medium gezüchtet.
Die Züchtung kann in dem üblichen Medium im allgemeinen wie für Streptomyces durchgeführt werden. Bezüglich des Mediums kann ein Nährmedium verwendet werden, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können Glucose, Sacharose, Melassen, Stärke, Dextrin, Glycerin und organische Säuren allein oder in Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquellen eignen sich Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Soyabohnenpulver, Maiseinweichflüssigkeit, Baumwollsamenkuchen, Casein, Soyabohnenprotein-Hydrolysat, Aminosäuren und Harnstoff allein oder in Mischungen. Falls erforderlich, können anorganische Salze, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumoder Phosphatsalze zugesetzt werden.
Ferner können gegebenenfalls Nähr-Spurenelemente oder Wachstumsanreger, welche das Wachstum der Mikroorganismen oder die Erzeugung von KUD-PC beschleunigen, zugesetzt werden.
Die Züchtung kann vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, z.B. in einer Schüttelkultur oder in einer submersen belüfteten Kultur bei neutralem pH und 27 bis 30 "C während 40 bis 72 Stunden erfolgen. KUD-PC wird in der Kulturbrühe erzeugt. Die Züchtung sollte vorzugsweise beendet werden, wenn die höchste Anreicherung an KUD-PC in der Kulturbrühe erreicht ist. Die Züchtungsbedingungen, wie die Zusammensetzung des Kulturmediums, das pH, die Temperatur, die Bewegung und die Belüftung, können je nach dem verwendeten Stamm und anderen Bedingungen gewählt werden. Schaumverhinderungsmittel, wie Siliconöl, Pflanzenöl oder oberflächenaktive Mittel können zugesetzt werden, falls notwendig.
Da das erzeugte KUD-PC zur Hauptsache in der Kulturbrühe enthalten ist, kann das KUD-PC vorzugsweise aus dem Kulturfiltrat isoliert werden, welches durch Filtration oder Zentrifugation nach eventuellem Zusatz eines Filtrierhilfsmittels abgetrennt wird. Die Isolierung von KUD-PC aus dem Kulturfiltrat kann durch Anwendung der Natur von KUD-PC erfolgen, gemäss welcher das KUD-PC in Wasser löslich ist und in organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol, Aceton oder Benzol unlöslich ist. Im allgemeinen kann eine konventionelle Isolier- und Reinigungsmethode für Protein oder Polypeptide angewendet werden.
Aus Aussalzen mit Hilfe von Ammoniumphosphat oder Ammoniumchlorid, die fraktionelle Ausfällung mit Hilfe von Methanol, Äthanol oder Aceton, die Ionenaustauscherchromatographie unter Verwendung von Ionenaustauschern, Ionenaustauschercellulose oder Ionenaustauscher-Sephadex, die Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Aktivkohle, Silicagel, Aluminiumoxid, Hydroxyapatit, Zellulose oder Adsorptionsharz, wie HP-10-Harz, die Gel-Filtrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex oder Biogel , die Elektrophorese, die Gegenstromverteilung, die Dialyse, die Ultrafiltration oder die Konzentration können einzeln oder in Kombination oder wiederholt angewendet werden. Die Eluierung in der Chromatographie kann mittels Wasser, wässerigem Alkohol, wässerigem Aceton, Puffer oder wässriger Lösung von anorganischen oder organischen Salzen erfolgen.
Eine Ausführungsform der Isolierung und Reinigung von KUD-PC wird im folgenden ausführlich beschrieben.
Die mit einer Filterhilfe versetzte Kuturbrühe wird filtriert, um die Mycelien zu entfernen. Ammoniumsulfat wird zum Kulturfiltrat in 90 ,Óiger Sättigung unter Kühlung bei neutralem pH zugesetzt. Der ausgesalzene Niederschlag wird durch Filtration oder Zentrifugation gesammelt und in Wasser oder einer neutralen Pufferlösung gelöst. Die Lösung wird unter Kühlung dialysiert oder einer Ultrafiltration unter Verwendung einer semipermeablen Membran zur Entsalzung unterworfen. Als Beispiel einer semipermeablen Membran kann eine synthetische semipermeable Membran verwendet werden, welche Teilchen mit Molekulargewicht unter 1000 und über 10 000 abscheidet, wie UH-L, UK-10 (Produkt von Toyo Roshi Co., Tokyo).
Die zu entsalzende Lösung wird durch eine Säule aus Ionenaustauschercellulose oder Ionenaustauscher- Sephadex nach dem Waschen mit Wasser geführt, um durch ein Eluierungslösungsmittel eluiert zu werden.
Beispiele von lonenaustauschercellulose sind DEAE-Cellulose, ECTEOLA -Cellulose, SE-Cellulose und CM-Cellulose.
Die obigen Ionenaustauschercellulose oder Ionenaustauscher- Sephadex wird vorzugsweise gepuffert mit einer Pufferlösung. Die Eluierungsflüssigkeit ist ein Puffer von anorganischem oder organischem Salz. Beispiele geeigneter anorganischer Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Phosphatsalze, und Beispiele von organischen Salzen sind Natriumacetat oder Natriumformiat in einer Konzentration von 0,01 bis 1 M/Liter. Beispiele von Pufferlösungen sind Phosphat-, Acetat-, Citrat- oder Trishydroxymethylaminomethanpuffer. Das pH der Pufferlösung beträgt pH 5 bis 8, bevorzugt wird ein neutrales pH bei einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 M/ Liter. Im obigen Eluierungsverfahren können die Konzentration der anorganischen oder organischen Salze und der Pufferlösung sowie das pH gegebenenfalls stufenweise oder kontinuierlich verändert werden.
Die Konzentration oder die Entsalzung wird durch Aussalzen durch Ammoniumsulfat, Ultrafiltration oder Dialyse durchgeführt. Die Reinigung der konzentrierten oder entsalzten Lösung von KUD-PC wird bevorzugt durch Gel-Filtrationschromatographie durchgeführt. Beispiele von Gel-Filtrationsmitteln sind Biogel P10 , Biogel P-30 oder Sephadex G-75 (Markennamen).
Die Eluierung kann mit Wasser oder Pufferlösung erfolgen.
Das KUD-PC kann aus der derart hochgereinigten Lösung von KUD-PC kristallisiert werden. Beispielsweise kann die hochgereinigte Eluatlösung von KUD-PC, erhalten durch Ionenaustauscherchromatographie und/oder Gel-Fil trationschromatographie, der Ultrafiltrationskonzentration und/oder Ammoniumsulfatausfällung unterworfen werden, um das kristalline KUD-PC zu erhalten. Wenn es nicht kristallisiert kann KUD-PC durch weitere Chromatographieoder Lyophilisierungsverfahren isoliert werden.
Die biologischen Eigenschaften von KUD-PC sind die folgenden: 1) Antimikrobielle Wirkung
KUD-PC zeigt keine antibakterielle Wirkung gegen Testorganismen, wie Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis und Bacillus cereus.
2) Cytoclasis-Wirkung
Cytoclasis- (cytotoische) Wirkung von KUD-PC ist in Tabelle I dargestellt, in welcher KUD-PC eine starke cytoclasische Wirkung gegen BHK-Zellen aufweist.
Tabelle I KUD-PC Sporamycin 3H-TdR IH-UR Protein ug/ml U/ml
0 2,5 4 21 22
0 5 5 24 23
0 10 55 30 42
0,1 2,5 27 -13 22
1 2,5 26 -27 28 10 2,5 42 0 17
0,1 5 49 14 42
1 5 34 - 3 30 10 5 33 -12 23
0,1 10 84 43 52
1 10 68 44 41 10 10 42 5 30 3) Antitumorwirkung (1) Experimentelle Methode: (a) Sarcoma 180, 1 x 105 Zellen, werden subcutan in ddY Mäuse inoculiert. Nach 3 Tagen wird ein Gemisch von Sporamycin und KUD-PC intravenös verabreicht. Weiteres KUD-PC wird intravenös an den Tagen 4, 5 und 6 verabreicht, um die Lebensverlängerungswirkungen zu beobachten.
(b) Wirkung gegen Ehrlich-Ascites-Carcinoma:
Ehrlich-Ascites-Carinoma, 2,5 x 106 Zellen, werden intraperitoneal in ddy-Mäuse (5 Mäuse in einer Gruppe, 5 Wochen alt) inoculiert. Am nächsten Tag wird ein Gemisch von Sporamycin und KUD-PC verabreicht, um die lebensverlängernde Wirkung zu beobachten.
(2) Evaluierung: behandelt x 100-100 = Lebensverlängerung (%) nicht behandelt x 100-100 = Lebensverlängerung (%) (3) Kombinationswirkung von KUD-PC und Sporamycin gegen tierische transplantierbare Carcinoma, Ehrlich-Ascites
Carcinoma ist in Tabelle Il-l und II-2 dargestellt, gemäss welchen KUD-PC eine Antitumorwirksamkeit von Sporamy cin erhöht.
Tabelle II-I
Probe Lebens- Anzahl Mäuse
KUD-PC Sporamycin verlängerung mit über 60 mg/kg U/kg (%) Tagen Lebens verlängerung
0 0 0 0/7
2,5 0 10 0/7
10 0 13 0/7
0 3,000 35 0/7
2,5 3,000 65 2/7
10 3,000 70 3/7
0 6,000 43 1/7
2,5 6,000 161 5/7
10 6,000 161 4/7
Tabelle II-2
Sporamycin KUD-PC Anzahl Lebensverlänge (U/mg) (mg/kg) Zwischenleben- rungstage ( /0) verlängerungs tage - - 21 0
1500 10 33 57
2,5 29 38
0,63 38 81
0,15 32 52 - 29 38
750 10 27 29
2,5 33 57
0,63 45 114
0,15 32 52 - 26 24
188 10 23 10
2,5 25 19
0,63 43 105
0,15 37 76 - 25 19 4) Toxizität
Akute Toxizität (LDso) von KUD-PC ist wie folgt: Mäuse i.p. LD5o > 2000 mg/kg Mäuse i.v.
LDso > 2000 mg/kg
In den beiliegenden Zeichnungen stellt:
Fig. 1 das UV-Spektrum von KUD-PC,
Fig. 2 das IR-Spektrum von KUD-PC,
Fig. 3 das elektrophoretische Profil von KUD-PC in der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, Fig. 4 di e Cellul die Celluloseacetat-Membran-Elektrophorese von KUD-PC, und
Fig. 5 die Biogel P-30 -Säulenchromatographie von KUD-PC und Sporamycin dar.
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1
Eine Öse voll Mikroorganismen aus einer Schrägkultur von Streptosporangium pseudovulgalae PO-357, FERM-P Nr.3571, wurden in ein flüssiges Medium A inokuliert, welches 2,0% Glukose, 0,3% Trockenhefe, 0,5% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,3% Calciumcarbonat, und 0,5% Natriumchlorid enthielt (pH 7,0, 100 ml) in einem 500 ml Sakaguchi Kolben, und der Schüttelkultur bei 70 Touren pro Minute bei 27 C während 72 Stunden unterworfen. 10 ml dieser Impfkultur wurde in Medium B inokuliert, welches 0,2% Glukose, 1,5% Stärke, 0,15% Trockenhefe, 0,23% Pepton, 0,3% Fleischextrakt und 0,25% Calciumcarbonat enthielt (100 ml, pH 7,0) in zehn 500 ml Sakaguchi-Kolben und diese bei 170 Touren pro Minute, bei 27 "C während 48 Stunden der Schüttelkultur unterworfen.
1 Liter dieser zweiten Impfkultur wurde in 130 Liter des Mediums A in einem 200 Liter Tank aus rostfreiem Stahl inokuliert und der submersen Belüftungskultur unter einer Belüftung von 100 Litern/Minute, Rühren mit 250 Touren pro Minute, einem inneren Druck von 0,5 kg/cm2, bei 28 C während 72 Stunden unterworfen. Das KUD-PC wurde durch Celluloseacetat-Membran-Elektrophorese in der Kulturbrühe festgestellt. Die Kulturbrühe (115 Liter) wurde auf unter "C gekühlt, mit Hyflosupercel (Markenname) (2,3 kg) versetzt und durch eine Filterpresse filtriert.
Das filtrierte Mycelium wurde mit Wasser gewaschen, das Waschwasser mit der filtrierten Brühe vereint und das Ganze auf unter 5 C gekühlt, dann mit 400 g Hyflosupercel versetzt und mit Ammoniumsulfat (82,5 kg) bis zu einer 90%igen Ammoniumsulfatsättigung vermischt. Das Gemisch wurde bei unter 5 "C während 1 Stunde gerührt und der derart gebildete Niederschlag gesammelt, um 900 g nasses festes Material zu gewinnen. Die folgenden Operationen wurden in einem verdunkelten Raum bei unter 5 C durchgeführt.
Das oben erhaltene feste Material wurde in 3 Liter Wasser gelöst, filtriert, um unlösliches Material zu entfernen, und dieses letztere mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung wurden vereint (total 4 Liter). Ammoniumsulfat (2,5 kg) wurde zugesetzt, um eine 90%ige Sättigung an Ammoniumsulfat zu erzielen, das Gemisch während 1 Stunde gerührt und filtriert, um das ausgefällte Material (102 g) zu erhalten, welches in 450 ml Wasser gelöst wurde. Die Lösung wurde mit einer Cellophanröhre gegen deionisiertes Wasser (30 Liter) dialysiert während 3 Tagen. Das deionisierte Wasser wurde einmal täglich ersetzt. Die derart erhaltene entsalzte Lösung (1170 ml) wurde auf eine Säule (9 x 50 cm) aus DEAE-Zellulose (Produkt von Brown Co., USA, körniger Typus) verbracht, welche zuvor mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,5 bis 8,0) gepuffert worden war.
Die Eluierung erfolgte mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,4, 6,4 Liter) und 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,4, 5 Liter) in der angegebenen Reihenfolge, wobei das Eluat in 30-ml-Fraktionen fraktioniert wurde. Jede Fraktion wurde nach der Folin-Lawry-Protein nachweismethode und durch biologischen Versuch unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P untersucht, und KUD-PC wurde in den Fraktionen Nr. 181 bis 300 festgestellt sowie Sporamycin in den Fraktionen Nr. 321 bis 400. Die Fraktionen, welche KUD-PC enthielten, wurden gesammelt (3,8 Liter) und mit Ammoniumsulfat versetzt, um eine 409obige Sättigung von Ammoniumsulfat zu erzielen, worauf das Gemisch von dem im Laufe einer Stunde gebildeten Niederschlag abfiltriert wurde.
Amoniumsulfat wurde zu dem Filtrat zugesetzt, um eine 90%ige Sättigung zu erzielen, das Gemisch während 1 Stunde gerührt und der Niederschlag gesammelt, welcher in Wasser aufgelöst wurde. Die Lösung (78 ml) wurde über eine Säule (6,0 x 62 cm) aus Biogel P-30 (Markenname, Biorad Laboratories Co.) geführt, mit Wasser eluiert für die Gelfiltration und das Eluat in Fraktionen von je 20 g fraktioniert. Jede Fraktion wurde wie oben nach der Proteinnachweismethode und der biologischen Methode untersucht, wobei die Fraktionen Nr. 41 bis 54(280 ml) erhalten wurden. Die vereinten Fraktionen wurden auf 10 ml konzentriert durch Ultrafiltrationsmembran UH-1 und anschliessend über Nacht unter Kühlung stehen gelassen.
Die ausgeschiedenen Kristalle wurden filtriert, mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und getrocknet, um farblose Kristalle vom hexagonalen System von KUD-PC (120 mg) zu erhalten, Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung).
Die erste Mutterlauge und Waschlösung wurden vereint, mit Ammoniumsulfat auf eine 25%ige Sättigung versetzt und während 3 Tagen unter Kühlung in einem dunklen Raum stehen gelassen. Die ausgeschiedene Kristalle wurden filtriert, mit einer kleinen Menge kalten Wasser gewaschen und getrocknet, wobei prismatische farblose Kristalle von KUD-PC (770 mg) erhalten wurden. Die zweite Mutterlauge und Waschlösung wurden vereint und mit Ammoniumsulfat bis zu 30%iger Sättigung versetzt, um 560 mg Kristalle zu erhalten. Ferner wurde diese dritte Mutterlauge mit Ammoniumsulfat bis zu einer Ammoniumsulfatsättigung von 60% behandelt, um weitere 450 mg Kristalle zu erhalten.
Die derart erhaltenen farblosen Kristalle vom hexagonalen System und prismatischen Kristalle wurden der Elektrophorese mit einer Celluloseacetatmembran (Chemetron Co., Cellulogel RS , 5 x 12 cm) (1 M Acetat-Formiat-Puffer, pH 2, 200 V, 1 Stunde, gefärbt mit Amid schwarz lOB) unterworfen. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, wurden einzelne identische Banden in derselben Position gefunden. Das elektrophoretische Profil von SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese der farblosen Kristalle vom hexagonalen System ist in Fig. 3 dargestellt (untersucht mit Scanner, Shimazu CS-910), in welcher eine einzelne Bande gefunden wurde.
Beispiel 2
Die Hauptkulturbrühe (116 Liter), welche auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 dargestellt, erhalten wurde, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um die entsalzte Lösung (1080 ml) zu erhalten. Die Lösung wurde auf eine Säule (9 x 50 cm) aus DEAE-Zellulose verbracht, welche zuvor mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,0 bis 7,4) gepuffert worden war, und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, und KUD-PC und Sporamycin enthaltende Fraktionen Nr. 121 bis 260 zu erhalten. Die Fraktionen wurden vereint und wie in Beispiel 1 behandelt auf eine Ammoniumsulfatsättigung von 90% und Biogel P-30 -Säulenchromatographie, um KUD-PC in den Fraktionen Nr. 41 bis 50 sowie Sporamycin in den Fraktionen Nr. 53 bis 64 zu erhalten. Das Biogel P-30 -Säulenchromatographie-Muster ist in Fig. 5 dargestellt.
Die Fraktionen, welche KUD-PC enthielten, wurden durch Ultrafiltration und Kristallisation auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um farblose Kristalle vom hexagonalen (730 mg) [Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zersetzung)], prismatische Kristalle (1,48 g) und Kristalle (0,9 g) zu erhalten.
Diese Kristalle wiesen ein einzelnes Band in derselben elektrophoretischen Position durch Zelluloseacetat-Membran Elektrophorese auf.
Beispiel 3
Eine Hauptkulturbrühe, welche wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde, wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, um durch DEAE-Zellulosesäulechromatographie Niederschläge mit Ammoniumsulfat von 40 bis 9Ob Sättigung von KUD-PC enthaltenden Fraktionen zu erhalten.
Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst (70 ml) und über eine Säule (6 x 78 cm) aus Sephadex G-50 , welche zuvor mit Wasser aufgequollen worden war, zwecks Gelfiltrationschromatographie geführt. Das mit Wasser erhaltene Eluat wurde in 20-g-Fraktionen fraktioniert. Jede Fraktion wurde durch Proteinbestimmung untersucht, wobei die Fraktionen Nr. 56 bis 80 erhalten wurden, welche KUD-PC enthielten.
Die Lösung wurde entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert, und das Konzentrat (100 ml) wurde lyophilisiert, um weisses, pulveriges KUD-PC (1,45 g) zu erhalten.
Das Produkt zeigte eine einzelne Bande in der Zelluloseacetat-Membran-Elektrophorese und bestätigte dieselbe Substanz wie die farblosen Kristalle vom hexagonalen System und die prismatischen Kristalle, welche im Beispiel 1 erhalten wurden.
Beispiel 4
In Beispiel 1 wurde die Fermentierung im 200-Liter-Tank während 96 Stunden durchgeführt, um eine Hauptkulturbrühe (114 Liter) zu erhalten. Das KUD-PC wurde in der Brühe durch Zelluloseacetat-Membran-Elektrophorese festgestellt, während Sporamycin im biologischen Versuch nicht festgestellt wurde.
Die Hauptkulturbrühe wurde nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 gereinigt, um Farblose Kristalle vom hexagonalen System (50 mg) [Schmelzpunkt: 258 bis 260 C (Zer- setzung)] und prismatische Kristalle (1,89 g) zu erhalten.
Diese Kristalle wiesen eine einzelne Bande in der Zelluloseacetat-Elektrophorese auf.