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BESCHREIBUNG
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Die Erfindung betrifft eine neue Proteinsubstanz KUD-PC und ihre Herstellung.
Insbesondere betrifft die Erfindung die neue Proteinsubstanz KUD-PC, die durch Kultivierung
eines die Proteinsubstanz KUD-PC produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptosporangium
erzeugt wird und \ Antitumoraktivität erhöht, Es wurde gefunden, daß ein zur Gattung
Streptosporangium gehörender Stamm PO-357, der aus einer bei Setagaya-ku, Toky,
Japan, genommenen Bodenprobe isoliert wurde, das Antibiotikum P0-357 (später als
Sporamycin bezeichnet) produzierte, das antibakterielle Aktivität gegen Staphylococcus
aureus und Bacillus subtilis und Antitumorwirkung zeigt. Die physicochemischen Eigenschaften
dieser Substanz und die taxonomischen Eigenschaften des produzierenden Mikroorganismusstammes
sind in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 53-7601 beschrieben.
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Es wurde nun eine physiologisch aktive Substanz gefunden, die keine
antibakterielle Wirkung besitzt, elektrophoretisch von Spommycin verschieden ist
und die Antitumoraktivität einer Antitumorsubstanz erhöht, und diese physiologisch
aktive Substanz wurde als Protein KUD-PC bezeichnet.
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Das erfindungsgemäße neue Protein KUD-PC (nachfolgend
als
KUD-PC bezeichnet) hat die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften.
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1.Elementaranalyse, enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff,
Sauerstoff und Schwefel, C 49,98%, H 7,27%, N 15,23%, S 1,08% (gefunden nach 3-stündigem
Trocknen bei 100°C im Vakuum), 2.Molekulargewicht: 11.500, berechnet durch Vergleich
mit Standardsubstanzen (Standard Polypeptid oder Standardprotein des Molekulargewichts
2512-16949) bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, 3.Schmelzpunkt: 258-2600C
(Zersetzung), 4.Spezifische Drehung: [α]D20 = -55,80 (c=1,0, H20), 5 .Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
UV-Spektrum von KUD-PC in wäßriger Lösung und 0,1 N-NaOH zeigt die Fig. 1, #H2O
: 253, 259, 265, 268 (Schulter), 275, 280 max (Schulter) nm, 0,lN NaOH = 294 nm,
max 6.Infrarot-Absorptionsspektrum: Fig. 2 (KBr), 7.Löslichkeit: Löslich in Wasser
und unlöslich in den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln wie Alkohol, Aceton
und Benzol,
8.Farbreaktion: Positiv: Folin-Lowry, Biuret und Rydon-Smith-Reaktionen,
Negativ: Phenol-H2 SO4 und Anthron-H2 SO4 Reaktionen, positiv für die Ninhydrinreaktion:
HCl-Hydrolysat, 9.Farbe und Kristallform: Farblose Kristalle, die durch Ultrafiltration
einer wäßrigen Lösung erhaltenen Kristalle sind Kristalle des hexagonalen Systems,
und durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat erhaltene Kristalle sind prismatisch, 10.pH-Wert:
4-8 (0,1%--ige wäßrige Lösungvon KUD-PC), ll.Aminosäureanalyse: KUD-PC (5 mg) wird
mit HC1 in einem versiegelten Rohr hydrolisiert und mittels Flüssigchromatographie
(Hitachi Modell 034-2U) analysiert, Aminosäure (pM) Aspararaginsäure 0,144 Threonin
0,258 Serin 0,226 Glutaminsäure 0,141 Prolin 0,111 Glycin 0,250 Alanin 0,363 Valin
0,265 Isoleucin 0,016
Leucin 0,117 Methionin-Tyrosin 0,020 Phenylalanin
0,079 Lysin 0,089 Arginin 0,040 Histidin (Spuren) 12.Elektorphorese: Das durch Analyse
mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und einem Chromato-Detektor (Shimazu
CS-910) aufgezeichnete elektrophoretische Profil zeigt in Fig. 3 eine einzige Substanz.
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Das durch Celluloseacetat-Membranelektrophorese (Cellulogel RS, pH
2, 1M Acetat-Formiatpuffer, 200 V, 1 h, Anfärbung durch Amidoschwarz 10B) erhaltene
elektrophoretische Muster zeigt in Fig. 4 eine einzelne Bande.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es eine neue Proteinsubstanz
KUD-PC bereitzustellen, die die vorgenannten physikalisch - chemischen Eigenschaften
aufweist.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren
zur Herstellung einer neuen Proteinsubstanz KUD-PC bereitzustellen, daß dadurch
gekennzeichnet ist, daß man die Proteinsubstanz KUD-PC
produzierende
Mikroorganismen der Gattung Streptosposanqium kultiviert, in der kultivierten Masse
das KUD-PC anreichert und das so erhaltene KUD-PC daraus isoliert.
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KUD-PC prodüzierende Stämme gehören zu der oben beschriebenen Gattung
Streptosporangium, und der zur Gattung Streptosporangium gehörende von den Erfindern
isolierte Stamm PO-357 ist nur beispielhaft für die wirksame erfindungsgemäße Verwendung.
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Die taxonomischen Eigenschaften des Stammes sind die folgenden: 1.
Morphologische Eigenschaften Eine mikroskopische Prüfung zeigte ein gerades Luftmycel
mit viel Sporangium an der Spitze des Mycels. Die Größe des Sporangiums beträgt
5-10pm, durchschnittlich 7,5 pm im Durchmesser. Die Länge der Lufthyphen tragenden
Sporangia ist kurz und beträgt meistens ca. 3 Mm. Die Sporen sind rund oder eiförmig
mit einer glatten Oberfläche und einem Durchmesser von 0,9 bis 1,4 pm.
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Flagella werden nicht beobachtet.
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2. Kultivierungscharakteristika in verschiedenen Medien.
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Beobachtungen bei 270C, 10-14 tägige Kultivierung
Medium
Wachstum Rückseite Luftmycel lösliches Pigment Sucrose-Nitrat Agar schlecht blaßorange
milchigweiß keines Glucose-Asparagin Agar schlecht blaßgelb milchigweiß keines Glycerin-Aspargin
Agar schlecht blaßgelb milchigweiß keines Anorganisches Salzbräunlichstärke-Agar
schlecht milchigweiß keines weiß - weiß Tyrosin Agar mäßig blaßorage blaßorange
keines Nährargar Agar mäßig - gut orange orange keines Hefextrakt-Malzextrakt Agar
gu orange orange keines Hafermehl Agar dunkelorange dunkelorange keines
3.
Physiologische Eigenschaften 1) Wachstumstemperatur: Möglich bei 430C, optimales
Wachstum bei ca. 27-30"C 2) Melaninproduktion: Negativ an Tyrosin Agar 3) Verflüssigung
von Gelatine: Positiv 4) Hydrolyse von Stärke: Positiv 5) Peptonisierung von Milch:
Positiv 6) H2S-Bildung: Negativ 7) Nitratreduktion: Positiv 4. Verwertung von Kohlenstoffquellen
Beobachtet an Pridham Gottlieb Agar Medium, das 0,05% Hefeextrakt enthält.
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Verwertung: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D- MamXose Vermutliche
Verwertung: D-Galactose, D-Raffinose, L-Rhamnose, D-Fructose.
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Keine Verwertung: Inosit, Saccharose.
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5.Zusammensetzung der Zellwand Die Analyse der Zellwände wurde nach
der Methode von Becker et al (Appl. Microbiol, 13, 236-243 (1965)) durchgeführt.
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DAP* Glycin Arabinose Galactose Meso Typ * Diaminopimelinsäure **
nicht bestimmt Verschiedene der obigen taxonomissben Eigenschaften
lassen
einen Stamm PO-357 klar als Mikroorganismus der Gattung Streptosporangium erkennen.
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Unter den bekannten Spezies ist Streptosporangium pseudovulgale Nonomura
(J.Ferm. Tech. Japan, 47 701-709 (1969)) mit dem Stamm PO-337 eng verwandt, aber
es bestehen Unterschiede, insbesondere in der Farbe des Luftmycels und in ihren
biologischen Aktivitäten. Der Stamm PO-357 wird deshalb als Streptosporangium pseudovulgale
PO-357 bezeichnet. Der Stamm wurde im Institute forIvIicrobial Industry, Agency
of Industrial Science and Technology hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer
FERM-P Nr. 3571 bezeichnet.
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Zur Herstellung von KUD-PC können erfindungsgemäß nicht nur Streptosporangium
sp. PO-357, sondern auch seine durch Ultraviolett-, Röntgenstrahlen-Bestrahlungs-oder
chemischen Mutagenese erhaltenen natürlichen oder künstlichen Mutanten davon verwendet
werden, sowie Mikroorganismen der Gattung Streptosporangium mit einer die neue Proteinsubstanz
KUD-PC produzierenden Aktivität.
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Erfindungsgemäß wird der das UD-PC produzierende Mikroorganismus der
Gattung Streptosporanium in einem konventionellen Medium kultiviert. Die Kultivierung
kann in dem im allgemeinen für Streptomyces konventionellen Medium durchgeführt
werden. Als Medium kann ein Nährmedium verwendet werden, daß assimilierbare Kohlenstoff
und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen
werden Glucose, Sucrose, Molasse, Stärke, Dextrin, Glycerin und organische Säuren
einzeln oder in Kombination verwendet. Als Stickstoffquellen werden P-l,ton,
Fleischextrakt,
Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenpulver, Maisbrühlauge (corn stegs liquor), Baumwollsamenkuchen,
Kasein, Sojabohnenproteinhydrolisat, Aminosäuren und Harnstoff einzeln oder in Kombination
verwendet. Wenn erforderlich, wird ein anorganisches Salz wie z.B. Natrium, Kalium,
Calcium, Magnesium oder Phosphatsalze hinzugefügt. Gegebenenfalls können weiters
Spuren von Nährelementen oder Wachstumsstimmulanzen zugefügt werden, die das Wachstum
der Mikroorganismen oder die Produktion von KUD-PC beschleunigen.
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Die Kultivierung kann vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt
werden, wie z.B. in einer Schüttelkultur oder einer eingetauchten Belüftungskultur
bei neutralem pH-Wert, bei 27-300C und während 40 bis 72 h.
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Das KUD-PC wird in einer Bouillon gebildet. Die Kultivierung sollte
vorzugsweise bei der höchsten Akumulation von KUD-PC in der Bouillon beendet werden.
Die Kultivierungsbedingungen wie z. B. Zusammensetzung der Kultur, pH-Wert, Temperatur,
Bewegung und Belüftung können abhängig vom verwendeten Stamm und anderen Bedingungen
gewählt werden. Wenn notwendig können Antischaummittel, wie z.B. Silikonöl, Pflanzenöl
oder oberflächenaktive Mittel zugefügt werden.
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Da das in der so erhaltenen Bouillon entstandene KUD-PC hauptsächlich
in der Bouillon gefunden wird, kann das KUD-PC vorzugsweise aus dem durch Filtration
oder Zentrifugation, gegebenenfalls nach Zugabe von Filterhilfsmitteln, abgetrennten
Kulturfiltrat isoliert werden.
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Die Isolierung von KUD-PC aus dem Kulturfiltrat kann
unter
Berücksichtigung der Eigenschaften von KUD-PC, wonach KUD-PC in Wasser löslich und
in organischen Lösungsmitteln wie z.B. Alkohol, Aceton oder Benzol unlöslich ist,
durchgeführt werden. Im allgemeinen können konventionelle Isolierungs- und Reinigungsmethoden
für Protein oder Polypeptide verwendet werden.
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Aussalzung durch Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid, fraktionierte
Fällung durch Methanol, Ethanol oder Aceton, Ionenaustauschchromatographie unter
Verwendung von Ionenaustauscher, Ionenaustausch Cel-lulose oder Ionen--austausch
Sephadex, Adsorptionschromat ographie unter Verwendung von Aktivkohle, Silicagel,
Aluminiumoxid, Hydroxyapatit, Cellulose oder einem Adsorptionsharz wie z.B. HP-10
Harz, Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephadex oder Biogel, Elektrophorese,
Gegenstromverteilung, Dialyse, Ultrafiltration oder Konzentrationsverfahren können
einzeln, in Kombination oder wiederholt angewendet werden. Die Elution der Chromatographie
kann mit Wasser, wäßrigem Alkohol, wäßrigem Aceton, Puffer oder wäßrigen Lösungen
anorganischer oder organischer Salze durchgeführt werden.
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Nachfolgend wird eine Ausführungsform für die Isolierungs-und Reinigungsverfahren
für KUD-PC beschrieben.
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Bouillon, der Filterhilfsmittel zugefügt wurden, wird zur Entfernung
von Mycel filtriert. Zum Kulturfiltrat wird Ammoniumsulfat unter Kühlen bei neutralem
pH-Wert bis zur 90%-igen Sättigung zugefügt. Der ausgesalzene Niederschlag wurde
durch Filtration oder Zentrifugation gesammelt und in Wasser oder neutraler Pufferlösung
gelöst. Zur Entsalzung wird die Lösung unter
Kühlen dialysiert
oder einer Ultrafiltration unter Verwendung einer semipermeablen Membran unterworfen.
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Beispiele für semipermeable Membranen sind synthetische semipermeable
Membranen, mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze unter 1000 und über 10000,
wie z.B.
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UH-L, UK-10 (Erzeugnis von Toyo Roshi Co., Tokyo).
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Die entsalzte Lösung wird durch eine Säule von Ionenaustauschcellulose
oder Ionenaustauschsephadex geschickt, und nach dem Waschen mit Wasser mit einem
Elutionslösungsmittel eluiert.
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Beispiele für Ionenaustauschcellulose sind DEAE-Cellulose, ECTEOLA-Cellulose,
SE-Cellulose und CM-Cellulose.
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Die obige Ionenaustauschcellulose oder Ionenaustauschsephadex wird
vorzugsweise vorher mit einer verdünnten Pufferlösung gepuffert. Die Elutionsflüssigkeit
ist ein Puffer eines anorganischen oder organischen Salzes.
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Beispiele für anorganische Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Phosphatsalze und von organischen Salzen Natriumacetat
oder Natriumformiat, mit einer Konzentration von 0,01 bis 1 M/1.
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Beispiele für Pufferlösungen sind Phosphat, Acetat, Citrat oder Trishydroxymethylaminomethan-Puffer.
Der pH-Wert der Pufferlösung beträgt 5-8 und ist vorzugsweise neutral, bei einer
Konzentration von 0401 bis 0,5 M/1. In dem obigen Elutionsverfahren können die Konzentration
der anorganischen oder organischen Salze
und der Pufferlösung,
und der pH-Wert wahlweise mittels Gradienten oder kontinuierlich geändert werden.
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Die Konzentrierung und das Entsalzen werden durch Aussalzung mit Ammoniumsulfat,
Ultrafiltration oder Dialyse durchgeführt.
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Die Reinigung der konzentrierten oder entsalzten Lösung von KUD-PC
wird vorzugsweise durch Gelfiltrationschromatographie durchgeführt. Beispiele für
Gelfiltrationsmittel sind Biogel P-10, Biogel P-30 oder Sephadex G-75 (Handelsnamen).
Die Elution wird mit Wasser oder Pufferlösung durchgeführt.
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KUD-PC kann aus der so erhaltenen hochgereinigten Lösung von KUD-PC
auskristallisiert werden. Z.B.wird hochgereinigte Elutionslösung von KUD-PC der
Ionenaustauschchromatographie und/oder Gelfiltrationschromatographie durch Konzentrierung
mittels Ultrafiltration ünd /oder Ammoniumsulfatfällung behandelt, um kristallines
KUD-PC zu erhalten. Wenn nicht kristallisiert, kann KUD-PC durch weitere Chromatographie
oder Lyophilisierungsverfahren isoliert werden.
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Biologische Eigenschaften von KUD-PC sind die folgenden 1. Antimikrobische
Wirkung: KUD-PC zeigt keine antibakterielle Wirkung an Testorganismen wie z.B. Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis und Bacillus cereus.
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2. Cytoclastische Wirkung: Die Cytoclastische (cytotoxische) Wirkung
von KUD-PC
wird in Tabelle 1 gezeigt, wonach KUD-PC eine starke
cytoclastische Wirkung an BHK-Cellen besitzt.
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Tabelle 1 KUD-PC Sporamycin ³H-TdR ³H-UR Protein 0 pg /ml 2,5 U/ml
4 21 22 0 5 5 24 23 0 10 55 30 42 0,1 2,5 27 -13 22 1 2,5 26 -27 28 10 2,5 42 0
17 0,1 5 49 14 42 1 5 34 -3 30 10 5 33 -12 23 0,1 10 84 43 52 1 10 68 44 41 10 10
42 5 30 3. Antitumorwirkung: (1) Experimentelle Methode: (i) Sarcom 180, 1 x 10
Zellen,werden subkutan in ddY-Mäuse eingeimpft. Nach 3 Tagen wird eine Mischung
von Sporamycin und KUD-PC intravenös verabreicht.
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Weiteres KUD-PC wird am 4, 5 und 6 Tag intravenös verabreicht, um
die lebensverlängernden Wirkungen zu beobachten.
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(ii) Wirkung gegen Ehrlich Ascites Carcinom 6 Ehrlich Ascites Carcinom,
2,5 x 10 Zellen, werden
intraperitoneal in ddY-Mäuse eingeimpft
(5 Mäuse in einer Gruppe, 5 Wochen alt). Am nächsten Tag wird eine Mischung von
Sporamycin und KUD-PC intraperitoneal verabreicht, um die Lebensverlängerung in
Tagen zu beobachten.
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(2) Auswertung: behandelte behandelte x 100 - 100 = Verhältnis der
Lebensnicht behandelte verlängerung (%) (3) Der kombinierte Effekt von KUD-PC und
Sporamycin gegen tierisches transplantierbares Carcinom, Ehrlich -Ascites Carcinom
zeigt Tabelle 2-1 und -2, wonach KUD-PC die Antitumorwirkung von Sporamscin verstärkt.
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(4) Toxizität: Akute Toxizität (LD50) von KUD-PC ist die folgende.
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Mäuse i.p. LD50 >2000 mg/kg Mäuse i.v. LD50 >2000 mg/kg Die
folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie darauf zu beschränken.
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Tabelle 2-1 Verhältnis der Zahl der Mäuse Lebensver- >60 Tage
Lebens-Probe längerung (%) verlängerung KUD-PC Sporamycin 0 mg/kg OE/kg 0% 0/7 2,5
0 10 0/7 10 0 13 0/7 0 3,000 35 0/7 2,5 3,000 65 2/7 10 3,000 70 3/7 0 6,000 43
1/7 2,5 6,000 >161 5/7 10 6,000 >161 4/7 Tabelle 2-2 Sporamycin KUD-PC Zahl
der inter- verhältnis mediären Lebens- der Lebensverlängerung verlängerung (E/kg)
(mg/kg) in Tagen - ~ 21 0 1500 10 33 57 2,5 29 38 0,63 38 81 0,15 32 52 - 29 38
750 10 27 29 2,5 33 57 0,63 45 114 0,15 32 52 - 26 24
Fortsetzung
Tabelle 2-2 Sporamycin KUD-PC Zahl der inter- Verhältnis mediaren Lebens- der Lebens-(E/kg)
(mg/kg) verlängerung in Tagen verlängerung 188 10 23 10 2,5 25 19 0,63 43 105 0,15
37 76 25 19 Beispiel 1 Eine Schleife voll Mikroorganismen aus einer geneigten Kultur
von Streptosporangium pseudovulgale PO-357 FERM-P Nur. 3571 wurde in einer 500 ml
Sakaguchi-Flasche einem flüssigen Medium A eingeimpft, das 2,0% Glucose, 0,3% Trockenhefe,
0,5% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,3 Calciumcarbonat und 0,5% Natriumchlorid enthält
(pH 7,0, 100 ml), und unter Bewegung bei 70 upm, 27"C 72 h lang kultiviert. Diese
Impfkultur (10 ml) wurde in das Medium B in 10 100 ml Sakaguchi-Flaschen eingeimpft,
das 0,2% Glucose, 1,5% Stärke, 0,15% Tockenhefe, 0,23% Pepton, 0,3% Fleischextrakt
und 0,25E Calciumcarbonat (100 ml, pH ist 7,e) enthält, und bei 170 upm und 27"C
48 h lang unter Bewegung kultiviert. Die zweite Impfkultur (1 1) wurde in einem
200 1 rostfreiem Stahltank in das Medium A (130 1) eingeimpft, und 72 h lang in
einer eingetauchten belüfteten Kultur (submerged aeration culture ) bei einer Belüftung
von 100 1/min, einer Bewegung von 250 upm, einem inneren Druck von
0,5
kg/cm2 bei 28"C kultiviert. KUD-PC wurde durch Celluloseacetat-Membranelektrophorese
in der Bouillon bestimmt. Die Bouillon (115 1) wurde unter 5"C gekühlt, Hyflosupercel
(Handelsname) (2,3 kg) hinzugefügt und mittels einer Filterpresse filtriert. Das
gefilterte Mycel wurde mit Wasser gewaschen, mit der gefilterten Bouillon vereinigt,
die unter 50C gekühlt wurde, und dann Hyflosupercel (400 g) zugegeben, und dann
Ammoniumsulfat (2,5 kg) bis zu 90%-iger Ammoniumsulfatsättigung.
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Die Mischung wurde unterhalb 50C 1 h lang gerührt, und der so erhaltene
Niederschlag gesammelt um ein feuchtes festes Material ( 900 g) zu erhalten. Die
folgenden Verfahrensschritte wurden in einem Dunkelraum unterhalb von 50C durchgeführt.
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Das obige feste Material wurde in Wasser (3 1) gelöst, zur Entfernung
unlöslichen Materials filtriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung
wurden vereinigt (insgesamt 4 1). Ammoniumsulfat (2,5 kg) wurde zur 90%-igen Ammoniumsulfat-Sättigung
zugefügt, 1 h lang gerührt und der Niederschlag (102 g) filtriert, der in Wasser
gelöst wurde (450 ml). Die Lösung wurde gegen. deionisiertes Wasser (30 1) mit einem
Cellophanschlauch 3 Tage lang dialysiert. Das deionisierte Wasser wurde einmal an
jedem Tag ersetzt. Die so erhaltene entsalzte Lösung (1170 ml) wurde auf eine Säule
(9 x 50 cm) von DEAE-Cellulose (Produkt von Brown Co., U.S.A., körniger Typ) aufgebracht,
die vorher mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,5 - 8,0) gepuffert wurde. Die Elution
wurde
mit 0,002 M Phosphatpuffer (pH 7,4, 6,4 1) und 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,4, 5
Z)in.dieser Reihenfolge durchgeführt und jeweils 30 ml Fraktionen fraktioniert.
Jede Fraktion wurde der Folin-Lowry-Proteinbestimmungsmethode und einer Bio-Analyse
unter Verwendung von Staphylococcus aureus 209P unterworfen, und KUD-PC in den Fraktionen
Nr. 181-300 und Sporamycin in den Fraktionen Nr. 321-400 gefunden.
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Die das KUD-PC enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt (3,8 1) und
zur Bildung einer 40%-igen Ammoniumsulfat-Sättigung Ammoniumsulfat zugefügt, und
der innerhalb 1 h gebildete Niederschlag dann abfiltriert. Zum Filtrat wurde zur
Bildung einer 90%-igen Sättigung Ammoniumsulfat zugefügt, dann 1 h lang gerührt
und der Niederschlag gesammelt, der dann in Wasser gelöst wurde.
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Die Lösung (78 ml) wurde auf eine Säule (6,0 x 62 cm) von Biogel P-30
(Handelsname, Biorad Laboratories Co.) aufgebracht, mit Wasser zur Gelfiltration
eluiert und in Fraktionen (20 g) fraktioniert. Jede Fraktion wurde einer Proteinbestimmung
und einer Bio-Analyse wie vorstehend beschrieben unterworfen, und die Fraktionen
Nr. 41-54 (280 ml) erhalten. Die vereinigten Fraktionen wurden auf 10 ml mittels
Ultrafiltration-Membran UH-1 konzentriert, und unter Kühlen über Nacht stehengelassen.
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Die ausgefallenen Kristalle wurden filtriert, und mit einer kleinen
Menge Wasser gewaschen und getrocknet, und es wurden hexagonale farblose Kristalle
von KUD-PC (120 mg) erhalten. Schmelzpunkt 258-2600C (Zersetzung).
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Die erste Mutterlauge und die Waschlösung wurden vereinigt, Ammoniumsulfat
bis zu 25%-iger Sättigung zugefügt und unter Kühlen 3 Tage lang in einem Dunkelraum
stehengelassen.
Die ausgefallenen Kristalle wurden filtriert, mit einer kleinen Menge kalten Wasser
gewaschen und getrocknet, und es wurden prismatische farblose Kristalle von KUD-PC
(770 mg) erhalten.
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Die zweite Mutterlauge und Waschlösung wurden vereinigt und Ammoniumsulfat
bis zu 30%-iger Sättigung zugegeben, um Kristalle (560 mg) zu erhalten. Weiters
wurde die dritte Mutterlauge mit Ammoniumsulfat bis zu einer 60%-igen Ammoniumsulfat-Sättigung
behandelt um Kristalle (450 mg) zu erhalten. Die so erhaltenen hexagonalen farblosen
Kristalle und prismatischen Kristalle wurden einer Elektrophorese mit Celluloseacetat-Membran
(CHEMETRON Co., Cellulogel RS, 5 x 12cm) (1M Acetat-Formiat-Puffer, pH 2, 200 V,
1 h, angefärbt mit Amidschwarz 10 B) unterworfen. Wie aus der Fig. 4 ersichtlich
ist, wurden einzelne identische Banden in der gleichen Lage gefunden. Das elektrophoretische
Profil der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der hexagonalen farblosen Kristalle
zeigt Fig. 3 (aufgezeichnet durch den Detektor Shimazu CS-910), in welchem eine
einzelne Bande auftritt.
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Beispiel 2 Die nach dem im gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben
erhaltene Hauptbouillon (116 1) wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt,
um eine entsalzte Lösung (1080 ml) zu erhalten. Die Lösung wurde auf eine Säule
(9 x 50cm) von DEAE-Cellulose, die vorher mit 0,002 M Phosphatpuffer pH 7,0-7,4)
gepuffert wurde, aufgebracht, und nach
dem gleichen Verfahren wie
in Beispiel 1 beschrieben gereinigt, um KUD-PC und Sporamycin enthaltende Fraktionen
Nr. 121-260 zu erhalten. Die Fraktionen wurden vereinigt und auf die gleiche Weise
wie in Beispiel 1 beschrieben für eine 90%-ige Ammoniumsulfat-Sättigung und Biogel
B-30 Säulenchromatographie behandelt, und es wurde KUD-PC in den Fraktionen Nr.
41-50 und Sporamycin in den Fraktionen Nr. 53-64 erhalten. Die Fig. 5 zeigt das
Ergebnis der Biogel P-30 Säulenchromatographie.
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Die KUD-PC enthaltenen Fraktionen wurden durch Ultrafiltration und
Kristallisation in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, und
es wurden hexagonale farblose Kristalle (730 mg ; Schmelzpunkt 258-260"C; Zersetzung),
prisamtische Kristalle (1,48 g) und Kristalle (0,9 g) erhalten. Bei der Celluloseacetat-Membranelektrophorese
wurde für diese Kristalle eine einzelne Bande in der gleichen elektrophoretischen
Position festgestellt.
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Beispiel 3 Die nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 erhaltene
Hauptbouillon wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt,
und nach 40 - 90%-iger Ammoniumsulfat-Sättigung aus den KUD-PC enthaltenden Fraktionen
der DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie ein Niederschlag erhalten. Der Niederschlag
wurde in Wasser (70 ml) gelöst, und zur Gelfiltrationschromatographie auf eine Säule
(6 x 78cm) vonSephadex G-50, das vorher mit Wasser gequellt wurde, aufgebracht.
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Das Wassereluat wurde in 20 g-Fraktionen fraktioniert-.
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jede Fraktion wurde einer Proteinbestimmung unterworfen,
und
es wurden KUD-PC enthaltende Fraktionen Nr.
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56-80 erhalten. Die Lösung wurde entsalzt und durch Ultrafiltration
konzentriert, und das Konzentrat (100 ml) wurde lyophilisiert, wobei ein weißes
Pulver von KUD-PC (1,45 g) erhalten wurde.
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Das Produkt zeigte bei der Celluloseacetat-Membranelektrophorese eine
einzelne Bande und erwies sich als die gleiche Substanz wie die hexagonalen farblosen
Kristalle und prismatischen Kristalle, die nach Beispiel 1 erhalten wurden.
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Beispiel 4 Wie in Beispiel 1 wurde eine Fermentation in einem 200
1 Tank 96 h lang durchgeführt und eine Hauptbouillon (114 1) erhalten. In der Bouillon
wurde KUD-PC durch Celluloseacetat-Membranelektrophorese bestimmt, und Sporamycinwurde
bei der Bio-Analyse nicht gefunden.
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Die Hauptbouillon wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel
1 beschrieben gereinigt und hexagonale farblose Kristalle (50 mg, Schmelzpunkt 258-2600C,
Zersetzung) und prismatische Kristalle (1,89 g) erhalten. Diese Kristalle zeigten
bei der Celluloseacetat-Elektrophorese eine einzelne Bande.
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4. Kurze Erläuterung der Figuren: Fig. 1: UV-Spektrum von KUD-PC Fig.
2: IR-Spektrum von KUD-PC Fig. 3: Elektrophoretisches Profil von KUD-PC bei der
SDS-Polyacrylamid-Gelelectro-
phorese, Fig. 4: Cellulsoeacetat-Membranelektrophorese
von KUD-PC, und Fig. 5: Biogel P-30 Säulenchromatographie von KUD-PC und Sporamycin