DE3419076C2

DE3419076C2 -

Info

Publication number: DE3419076C2
Application number: DE3419076A
Authority: DE
Inventors: Iwao Tokio/Tokyo Jp Umezawa; Kanki Yokohama Jp Komiyama
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1983-12-28
Filing date: 1984-05-22
Publication date: 1987-08-20
Also published as: JPS60141293A; GB8710389D0; GB8412289D0; GB2152028B; GB2152028A; FR2557455B1; US4550021A; GB2188624B; DE3419076A1; FR2557455A1; GB2188624A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung des Stammes Streptomyces sp. FERM BP-571 zur mikrobiologischen Herstellung des Antibiotikums 81-484.

In der prioritätsälteren, jedoch nicht vorveröffentlichten EP-A 84 306 190.4 wird ein Antibiotikum mit Antitumorwirkung beschrieben, das aus einem Actinomyceten gewonnen wird und als Cl-1957B bezeichnet wird. Als Summelformel ist C₃₃H₄₈O₇ angegeben. Gemäß einer ebenfalls nicht vorveröffentlichten Literaturstelle aus "The J. of Antibiotics", Bd. 38, Nr. 2 (1985) entsprechen die ¹³C-NMR-Spektren des erfindungsgemäß gewonnenen Antibiotikums 81-484 denen der in EP-A 84 306 190.4 beschriebenen Substanz.

Es wurde gefunden, daß ein Stamm 81-484 eines Mikroorganismus vom Genus Streptomyces, der keine Antibiotika-Aktivitäten gegen Gram-positive und -negative Bakterien aufweist und der aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die in der Chiba-prefecture, Japan, gesammelt wurde, eine antibiotische Substanz produziert, die antimikrobielle Aktivität gegen einige Arten von Pilzen hat und die eine wachstumsinhibierende Aktivität gegen P388 Mäuseleukämie und Sarcoma 180 Zellen zeigt. Diese antibiotische Substanz wurde isoliert aus der kultivierten Masse und gereinigt und hatte neue physikochemikalische Eigenschaften. Diese Substanz wird bezeichnet als Antibiotikum 81-484.

Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, ein Verfahren zu schaffen zur Herstellung von Antibiotikum 81-484 (oder einem Salz davon).

Der Antibiotikum 81-484 produzierende Mikroorganismus gehört zu dem Genus Streptomyces und wurde vom Erfinder isoliert und Stamm 81-484 genannt.

Taxonomische Eigenschaften dieses Stamms 81-484 sind wie folgt dargestellt:

(a) Morphologische Eigenschaften:
Stamm 81-484 wächst reichlich fadenförmig auf vielen Agarplattenmedien. Eine Zergliederung des Substratmycels wurde nicht beobachtet. Wenn Luftmycelien gebildet werden, sind die Sporangiophoren gerade oder lose unvollständige Spiralen mit Sporenketten von mehr als 20 Sporen an der Spitze und keine Sporangien wurden beobachtet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt und elypsenförmig mit 0,8 µm bei der größeren Achse, × 0,4 µm bei der kleineren Achse.
(b) Die Wachstumsbedingungen auf verschiedenen Medien bei 27°C bei dreiwöchiger Kultur waren wie folgt:
Der Verfahren wurde durchgeführt nach einem Verfahren von ISP (International Streptomyces Project).
Die Farbe wurde bestimmt unter Heranziehung von "Color Harmony Manual (4. Edition) Wilhelm Ostwald".
(c) Physiologische Eigenschaften:
- (1) Wachstumstemperatur: gewachsen bei 20 bis 37°C und bei 27°C optimales Wachstum.
- (2) Gelatineverflüssigung (Glucose-Pepton-Gelatine-Medium): negativ.
- (3) Stärkehydrolyse (Stärke-anorganisches Agarmedium): negativ.
- (4) Koagulation und Peptonisierung von Magermilch (10% Magermilchmedium): negativ für Koagulation, positiv für Peptonisierung.
- (5) Bildung von Melaninpigmenten (Tyrosinagarmedium und Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium): negativ.
- (6) Bildung von H₂S (Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium): negativ.
- (7) Bildung von Sulfit (Sulfatmedium): positiv.
(d) Assimilation von Kohlenstoffquellen:
(beobachtet auf Pridham-Gottlieb Agarmedium bei 27°C für einen Monat):
(++: gute Verwertung, +: Verwertung, -: keine Verwertung): L-Arabinose- D-Xylose- D-Glucose++ D-Fructose- Saccharose- Inositol+ L-Rhamnose+ Raffinose- D-Mannitol-
(e) Zusammensetzung der Zellwand:
(Verfahren nach Becker et al. [Appl. Microbiol., 13, 236-243 1965]): LL-Diaminopimelinsäure.

Nach den taxonomischen Eigenschaften oben gehört der Stamm 81-484 zum Genus Streptomyces. Und die genaue Spezies dieses Stamms wurde nicht beleuchtet, so daß sie als Streptomyces 81-484 bezeichnet wird. Dieser Stamm wurde hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan und bezeichnet als FERM-P 7371-Diese Hinterlegung wurde vom FRI in die Hinterlegung FERM BP-571 umgewandelt.

In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der das Antibiotikum 81-484 produzierende Mikroorganismus in einem geeignetem Medium für Streptomyceten kultiviert.

Nährmedien, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und, falls erforderlich, anorganisches Salz enthalten, können verwendet werden. Beispiele von assimilierbaren Kohlenstoffquellen sind Glucose, Melasse, Stärke, Dextrin, Cellulose, Glycerin oder organisches Salz. Diese können in Kombination oder einzeln verwendet werden. Beispiele von assimilierbaren Stickstoffquellen sind organischer Stickstoff wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Baumwollsaatöl, Casein, Sojabohnenprotein-Hydrolysat, Aminosäure und Harnstoff oder anorganischer Stickstoff wie Nitrat und Ammoniumsalz. Falls erforderlich, kann ein anorganisches Salz von Natrium, Kalium, Kalzium oder Magnesium in Phosphat und anderen verwendet werden.

Weiterhin kann, falls erforderlich, ein Spurennährstoff, ein Wachstumsstimulant oder ein Vorläufer des Antibiotikums 81-484 gegebenenfalls zu dem Medium zugegeben werden.

Die Kultivierung wird ausgeführt im allgemeinen durch Schüttelkultur oder Belüftungs-Bewegungskultur. Bevorzugt für industrielle Herstellung ist Submersbelüftungskultur. Der pH des Mediums ist vorzugsweise ein neutraler pH. Die Kultivierungstemperatur ist bei 20 bis 37°C, im allgemeinen bei 24 bis 30°C und bevorzugt bei 27°C. Die Kultivierungszeit ist gewöhnlich vier bis sechs Tage für flüssige Kulturen. Die Kultivierung kann vorzugsweise beendet werden bei einer maximalen Antibiotikum-Produktion im Medium. Die oben erwähnten Kultivierungsbedingungen, Temperatur, Rühren, Belüftung und andere Kultivierungsbedingungen sollten natürlich kontrolliert werden. Antischaummittel wie Silikonöl, pflanzliches Öl und oberflächenaktives Mittel kann zugegeben werden, um Schäumen zu verhindern.

Antibiotikum 81-484 wird hauptsächlich in einem Kulturfiltrat gesammelt und die so kultivierte Masse wird gefiltert mit Hilfe einer Filterhilfe wie Celite oder Hyflo-supercel (Warenzeichen) oder zentrifugiert, um die Mycelien abzutrennen und das Filtrat, aus dem das Antibiotikum vorzugsweise isoliert wird.

Das Antibiotikum 81-484 ist auch im Mycel enthalten und wird isoliert durch Extraktion mit Methanol oder Aceton, anschließendes Konzentrieren dieses Extrakts im Vakuum und Reinigen auf demselben Weg wie bei der Isolation aus dem Filtrat.

Da das Antibiotikum 81-484 unlöslich in Hexan und Wasser ist und löslich in vielen Arten organischer Lösungsmittel, z. B. alkoholischen Lösungsmitteln wie Methanol oder Ethanol, chloroformartigen Lösungsmitteln wie Dichlormethan oder Chloroform oder ketonartigen Lösungsmitteln wie Aceton oder Methylisobutylketon und sauer ist, wird die Reinigung durchgeführt durch Anwendung dieser Eigenschaften. Im allgemeinen wird das Kulturfiltrat extrahiert mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel wie Chloroform, Methylisobutylketon, Ethylacetat oder Butylacetat, um es in das organische Lösungsmittel zu überführen. Bei der Extraktion wird der pH des Kulturfiltrats vorzugsweise auf 3,0 bis 5,0 vorher eingestellt.

Die organische Lösungsmittelschicht wird gegebenenfalls gewaschen mit wäßriger Lösung von Ethylendiamin-Tetraacetat zum Entfernen von Metallionen und wird dehydratisiert durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat, wasserfreiem Magnesiumsulfat oder Perlgel. Die dehydratisierte organische Lösungsmittelschicht wird im Vakuum konzentriert. Obwohl Antibiotikum 81-484 stabil ist beim Erhitzen, wird die Konzentration vorzugsweise unter 60°C durchgeführt. Hexan oder Petrolether werden zugegeben zu den Konzentraten, um das Antibiotikum 81-484 zu fällen. Das so erhaltene Präzipitat wird mit Hexan gewaschen und gereinigt durch Filtration und Zentrifugation, dann kann das Antibiotikum 81-484 erhalten werden als rohe, bräunlichgefärbte Substanz.

Eine weitere Reinigung wird durchgeführt durch Anwendung der unterschiedlichen Löslichkeit von Antibiotikum 81-484 und der Verunreinigung, dem Unterschied in dem Verteilungsverhältnis für zwei unmischbare Flüssigkeitenphase oder dem Unterschied bei der Adsorption für Adsorbenzien. Bevorzugtes Mittel ist die Chromatographie z. B. Adsorptions-Chromatographie unter Verwendung eines Adsorptions-Harzes wie Silicagel, Aluminat, aktivierte Cellulose oder Hydroxyappatit HP-20, reversephase Verteilungs-Chromatographie unter Verwendung von silaniertem Silicagel oder Octadecyl-silaniertem Silikagel, Molekularsieb-Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von Sephadex LH 20 oder Toyopearl (Warenzeichen) oder Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex oder DEAE-Toyopearl (Warenzeichen).

Auf diese Weise kann Antibiotikum 81-484 gereinigt werden unter Anwendung dieser Mittel der Chromatographie, Elektrophorese, Gegenstromverteilung, Ultrafiltration oder Destillation und anderen einzeln oder in Kombination gegebenenfalls in Reihen davon. Zum Beispiel wird die rohe Substanz, aufgelöst in einer kleinen Menge Chloroform oder Benzol, adsorbiert in einer gepackten Silicagel-Säule und wird chromatographiert mit einer Mischung von Hexan-Aceton. Aktive Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wird aufgelöst in einer kleinen Menge Chloroform und wird adsorbiert in einer Silikagelsäule und chromatographiert mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform und Methanol. Aktive Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum konzentriert. Die Konzentrate werden aufgelöst in einer kleinen Menge Methanol und wieder chromatographiert durch Adsorbieren mit reverse phase Silicagel-Säule und Eluieren mit einer Mischung von Methanol-Wasser um das Antibiotikum 81-484 zu reinigen.

Das Antibiotikum 81-484 ist eine saure Substanz und kann als ein Salz durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispiele von Salzen sind ein pharmakologisch annehmbares, nichttoxisches Salz, z. B. ein Alkalisalz wie Natrium oder Kalium, Erdalkalisalz wie Kalzium oder Magnesium oder bekannte Salze mit organischen Aminen.

Die physiko-chemischen und biologischen Eigenschaften des auf diese Weise gewonnenen Antibiotikums 81-484 sind wie folgt:

I. Physiko-chemische Eigenschaften

1) Eigenschaften: farblos oder blaßgelblich viskoses öliges Material.
2) Elementarformel: C₃₃H₄₈O₇ (Massenspektrum mit hoher Auflösung).
3) Molekulargewicht: 556 (Field desorption Massenspektrum).
4) Schmelzpunkt: kein klarer Schmelzpunkt (ölig bei 10 bis 100°C).
5) spez. Drehung: [α] = -151°C (c=0,1, Methanol).
6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: gezeigt in Fig. 1 (in Methanol).
7) Infrarotabsorptionsspektrum: gezeigt in Fig. 2 (KBr Preßling).
8) Löslichkeit: unlöslich in Hexan und Wasser, löslich in Diethylether, Methanol, Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat, Butylacetat, Aceton, Benzol.
9) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: gezeigt in Fig. 3 (400 Hz, CDCl₃, TMS).
10) Beschaffenheit: saure Substanz.
11) Farbreaktion: negativ: Ninhydrin, Anthron-H₂SO₄ Eisenchlorid,
positiv: Jod, Antimontrichlorid,
leicht positiv: Zatkis Reagenz.
12) Silikagel Dünnschichtchromatographie (Träger: Silikagel 60, Merck):
Rf=0,33 (Ethylacetat : Methanol=40 : 1)
Rf=0,28 (Chloroform : Methanol=10 : 1).

II. Biologische Eigenschaften (1) Antimikrobielles Spektrum

MIC: minimale inhibitorische Konzentration Analysiert mit Papier-Diskmethode unter Verwendung von ToYo Disc, Durchmesser 8 mm dick (Warenname) auf Nähragar (Agar: 1,0% **0,5%), außer auf *Kartoffelagar.

Antibiotikum 81-484 zeigt antimikrobielle Aktivität gegen einige Arten von Pilzen aber zeigt keine anitbakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien.

(2) Antitumor-Aktivität

1) Wirkung auf P388 Mauseleukämie:
P388 Mauseleukämie, 1 × 10⁵ Zellen, wurden intraperitoneal in fünf Mäuse einer Gruppe, CDF₁, weiblich, Alter 5 Wochen, eingeimpft und das Antibiotikum wurde verabreicht, wie gezeigt in Tabelle 1.

Tabelle 1

Das Datum der Verabreichung wurde als Tag 0 gesetzt am Tag der Tumorimpfung. Die Zahl für die Lebensspanne ist ausgedrückt durch einen Mittelwert für fünf Mäuse in einer Gruppe.

Das Verhältnis der Lebensverlängerung ist berechnet nach der folgenden Gleichung:

2) Wirkung auf Sarkoma 180:
Sarcoma 180, 1 × 10⁶ Zellen, wurden intraperitonal in Mäuse, Stamm ICR, weiblich, fünf Wochen alt, geimpft und behandelt, wie gezeigt in Tabelle 2.

Tabelle 2

Der Tag der Verabreichung ist als Tag 0 an dem Tag der Tumorimpfung gesetzt. Die Anzahl der Lebensspannentage sind als Mittelwert von fünf Mäusen in einer Gruppe gezeigt und das Verhältnis der Lebensverlängerung ist berechnet nach der Gleichung oben 1).

Wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt, hat das Antibiotikum 81-484 Antitumoraktivität gegen P388 Leukämie und Sarkoma 180 Ascites Carcinoma.

Bisher wurde von Antibiotika, die ähnliche Eigenschaften wie Antibiotikum 81-484 hatten, berichtet als Antibiotikum ATS-1287 (Janan. Unexam. Pat. Publ., No. 55-118 499) und als Leptomycin A und B (J. Antibiotics, 36[6], 639-650 [1983]). Jedoch ist das Antibiotikum ATS-1287 verschieden in bezug auf die spez. Drehung und das NMR-Spektrum. Leptomycin A und B sind verschieden in bezug auf die Molekularformel, die spez. Drehung und das NMR-Spektrum.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.

Beispiel 1 Kultivierung von Stamm 81-484

Ein flüssiges Kulturmedium (pH 7) (Medium A) (100 ml × 30) in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben, bestehend aus Glucose 2%, Pepton 0,5 ml, Fleischextrakt 0,5%, trockener Hefe 0,3%, NaCl 0,5% und Calciumcarbonat 0,3% wurde sterilisiert. Eine Öse von Streptomyces FERM BP-571 wurde auf ein Schrägagarmedium, bestehend aus Glucose 1%, Pepton 0,5%, Fleischextrakt 0,5%, NaCl 0,3% und Agar 1,2% geimpft und bei 27°C 72 Stunden lang mit einer Amplitude von 17 cm, 120 Schüttelungen pro Minute geschüttelt und kultiviert, um eine Saatkultur vorzubereiten.

Die Saatkultur (2,5 l) wurde aseptisch beimpft in das Medium A (120 l) in dem 200 l Fermenter und aerob kultiviert, um die flüssige Kultur zu erhalten (ungefähr 120 l).

Beispiel 2 Extraktion von Antibiotikum 81-484

Die flüssige Kultur, erhalten nach Beispiel 1, wurde gefiltert nach Zugabe einer Filterhilfe. Filtrat und Mycel wurden extrahiert und der Extrakt durch eine Amberlite XAD-7 (Warenzeichen) Säule (51) geleitet, um das aktive Prinzip zu adsorbieren. Die Säule wurde gewaschen mit Wasser und 20%igem wäßrigem Ethanol, um die Verunreinigungen zu eluieren und das aktive Prinzip wurde eluiert mit 40%igem wäßrigem Ethanol. Das Eluat (251) wurde im Vakuum konzentriert bis auf ungefähr 300 ml und das Präzipitat wurde entfernt durch Filtration. Das Konzentrat wurde unter Zugabe von Ethylacetat gründlich gerührt. Die abgetrennte Ethylacetatschicht wurde dehydratisiert durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat und im Vakuum konzentriert, um das ölige Antibiotikum 81-484 (20 g) zu erhalten.

Beispiel 3 Reinigung durch Silikagelchromatographie

Das ölige Material, erhalten im Beispiel 2, wurde auf eine Säule (46 × 600 mm) von Silikagel 60 (Merck) gepackt, die vorher mit Hexan gepackt wurde, und eluiert mit einem Gradienten, der sich von Hexan zu Aceton änderte. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum konzentriert und nochmals adsorbiert an einer Säule mit Silikagel, die vorher mit Hexan gepackt wurde, und eluiert mit einem Gradienten von Hexan zu Ethylacetat. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum konzentriert, um das rohe Antibiotikum 81-484 (100 mg, Reinheit 50%) zu erhalten.

Beispiel 4 Isolation durch HPLC

HPLC (Japan. Spectrophot. TRIROTAR-V, UVIDE-100-V, Vl-613, GP-A40) wurde für die weitere Reinigung angewendet. Octadecylsilikan-Silikagel (Showa Denko Co. Fine SIL C₁₈-10) wurde in einer Säule aus rostfreiem Stahl gepackt (10 × 250 mm, Showa Denko Co.).

Das rohe Antibiotikum 81-484 (1 mg), erhalten im Beispiel 3, wurde gelöst in Methanol (100 µl) und in die Säule injiziert, entwickelt mit einer Mischung von Wasser : Methanol (30 : 70, Medium für HPLC) und chromatographiert. Der Peak, der dem Antibiotikum 81-484 entsprach, wurde gesammelt durch Detektieren bei 220 nm UV-Absorption. Methanol wurde destilliert im Vakuum und Ethalacetat wurde zugegeben zu dem Test. Die Mischung wurde gerührt bei einem sauren pH, um das Antibiotikum in die Ethylacetatschicht zu bringen. Die Ethylacetatschicht wurde gewaschen mit gereinigtem Wasser und im Vakuum getrocknet, um das gereinigte Antibiotikum 81-484 zu erhalten (400 µg). Dieselben Operationen wurden wiederholt, um das Antibiotikum 81-484 zu erhalten (ungefähr 200 mg).

4. Kurze Erklärung der Zeichnungen

Fig. 1: UV-Spektrum von Antibiotikum 81-484.

Fig. 2: IR-Spektrum von Antibiotikum 81-484.

Fig. 3: NMR-Spektrum von Antibiotikum 81-484.

Claims

Verwendung des Stammes Streptomyces sp. FERM BP-571 mikrobiologischen Herstellung des Antibiotikums 81-484 mit folgenden Eigenschaften:
- (1) Elementaranalyse: C₃₃H₄₈O₇ (Massenspektrum mit hoher Auflösung)
- (2) Molekulargewicht: 556 (Field disorption (FD) Massenspektrum)
- (3) Schmelzpunkt: nicht scharf (ölig bei 10 bis 100°C)
- (4) Spez. Drehung: (α) = -151° (c=0,1, Methanol)
- (5) ultraviolettes Absorptionsspektrum: wie in Fig. 1 (in Methanol)
- (6) Infrarotabsorptionsspektrum: wie in Fig. 2 (KBr Preßling)
- (7) Löslichkeit: Unlöslich in Hexan und Wasser, löslich in Diethylether, Methanol, Ethanol, Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat, Butylacetat, Aceton und Benzol.
- (8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: wie in Fig. 3 (CDCl₃, TMS)
- (9) Beschaffenheit: saure Substanz
- (10) Farbreaktion: negativ auf Ninhydrin, Anthron-H₂SO₄ und Eisen-3-chlorid-Reaktion; positiv auf Jod und Antimontrichlorid; leicht positiv auf Zatkis-Reagenz,
wobei die Fig. 1, 2 und 3 Bestandteile dieses Anspruchs sind.