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Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C. Deacetoxycephalosporin C eignet sich zur Herstellung von 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure, die abgekürzt auch als 7-ADCA bezeichnet wird.
Deacetoxycephalosporin C, das die Strukturformel
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Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird Deacetoxycephalosporin C gebildet, indem man Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 züchtet. Das Verfahren wird durchgeführt, indem man den obigen Mikroorganismus in einem wässerigen Nährkulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und ferner anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen so lange züchtet, bis im Kulturmedium eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität entstanden ist.
S. clavuligerus produziert zusammen mit Deacetoxycephalosporin C ferner 7- (5-Amino-5-carboxyvaleramido) -7-methoxy-3- oarbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carbonsäureund7- (5-Ammo-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl- 3-cephem-4-carbonsäure, die beide auch als Antibiotica A-15886I und A-1688611 bezeichnet werden.
Deacetoxycephalosporin C wird vom Mikroorganismus zwar in geringeren Mengen gebildet als die andern erwähnten Cephalosporine, es lässt sich jedoch mühelos von diesen Antibiotica abtrennen und chromatographisch in reiner Form isolieren, wie dies im folgenden beschrieben wird.
Der für das erfindungsgemässe Verfahren verwendete Mikroorganismus wurde aus Bodenproben von Südamerika isoliert. Der Organismus wurde aus den Bodenproben isoliert, indem man gewisse Mengen der Bodenproben in sterilem destilliertem Wasser suspendierte und die Suspensionen auf Nähragar aufstrich. Die so beimpften Nähragarplatten wurden dann mehrere Tage bei etwa 25 bis 350C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Mikroorganismenkolonien mittels einer sterilen Platinöse auf Schrägagar übertragen.
Die Agarschrägen wurden dann inkubiert, um so geeignete Mengen in Inoculum zur Bildung von Deacetoxycephalosporin C zu bekommen.
Bei dem für das erfindungsgemässe Verfahren eingesetzten Mikroorganismusstamm handelt es sich um einen Actinomyceten, der nach Verfahren identifiziert wurde, welche zur Charakterisierung von Streptomyces species für das International Streptomyces Projekt empfohlen wurden (Shirling et al., Methods für Cha-
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Die taxonomischen Eigenschaften von S. clavuligerus NRRL 3585 sind in den folgenden Tabellen und Aus- führungen zusammengefasst. Die Zuordnung der Farbnamen in diesen Tabellen wurdenach der ISCC-NBS-Methode vorgenommen, wie sie Kelly etal. in The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names (U. S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D. C. 1955') beschrieben wurde.
Die in Klammer angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Tresner und Backus-Farbtabellen (Tresner
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die Bezeichnungen der Farbreiter sind unterstrichen. Die Farbblöcke von Maerz und Paul (Maerz et al., Dictionary of Color [McGraw-HillBookCo., Inc., New York, 1950]) sind in Klammern angegeben. Sofern nichts anderes gesagt ist, liess man alle Kulturen 14 Tage bei 300C wachsen.
S. clavuligerus NRRL 3585 liess sich schwierig in Genus Streptomyces klassifizieren, da es sich dabei um eine atypische sporophore Morphologie handelt. Die bei der Zellwandanalyse erhaltenen Werte zeigen jedoch, dass diese Kultur als Species aus Streptomyces genus anzusehen ist. Dieser Organismus wird daher als neue Species behandelt und mit dem Namen Streptomyces clavuligerus bezeichnet.
Dieser Organismus bildet in charakteristischer Weise ein umfangreiches Netzwerk kurzer sympodialverzweigter Lufthyphen, die sich eventuell in Sporen teilen. Es werden kurze keilförmige Seitenäste gebildet, die normalerweise aus je 1 bis 4 Sporen entstehen. Es entstehen keine Substratkonidien. Im Elektronenmikroskop lassen sich glattwandige Sporen feststellen.
Zellwandpräparationen enthalten das L, L-Isomere von Diaminopime1insäure und Glycin ausser den Hauptbestandteilen Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin. Die Sporen sind in der Masse grau, und das Pri- märmycel ist fahlgelb bis gelbbraun. Es wird kein lösliches Pigment gebildet. Die Kultur verfügt über einen optimalen Temperaturbereich von 26 bis 300C. Bei 370C kommt es zu keinem Wachsen. Morphologisch ähnelt diese Kultur bestimmten Stämmen von Thermonospora und Micromonospora.
Die Eigenschaften von S. clavuligerus NRRL 3585 sind in den folgenden Tabellen und Ausführungen zusammengefasst.
Morphologie von S. clavuligerus NRRL 3585
Auf einem umfangreichen Luftmycel werden Sporophoren gebildet, und diese bestehen aus einem Netzwerk kurzer sympodialvernetzter Hyphen. Normalerweise entspringen 1 bis 4 Sporen an kurzen keulenförmigen Seitenästen. Unter Umständen teilen sich Sporophoren auch in Segmente auf, wodurch sich Ketten von Sporen bilden. Die Sporen haben normalerweise Abmessungen von 0,34 bis 0,84 x 0, 85 x 3, 3 je., im Mittel 0,64 x 1, 53 g. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass die Sporen glattwandig sind. Im Substratmycel werden keine Sporen gebildet.
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Tabelle I : Kulturcharakteristiken von S. clavuligerus NRRL 3585
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<tb>
<tb> Medium <SEP> Wachstumscharakteristiken
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 2 <SEP> (Hefe-Malz-Extrakt-Agar) <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrgräulichgelb <SEP> [12K3],
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> dunkelgrau <SEP> (G) <SEP> 3ih <SEP> [21B1],
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 3 <SEP> (Hafermehl-Agar) <SEP> mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelb <SEP> [11Cl], <SEP> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> b <SEP> [27A1], <SEP> kein <SEP> lösliches
<tb> Pigment
<tb> ISP <SEP> No.
<SEP> 4 <SEP> (anorganischer <SEP> Salz-Star-reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrgräulichgelb <SEP> [12B2], <SEP>
<tb> ke-Agar) <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> mittelgrau <SEP> (GY) <SEP> 2fe <SEP> [45A1],
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 5 <SEP> (Glycerin-Asparagin-Agar) <SEP> leidliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgrun <SEP> [10B1],
<tb> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> a, <SEP> kein <SEP> lösliches
<tb> Pigment
<tb> Tomatenpaste-Hafermehl-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrgräulichgelb <SEP> [11E4],
<tb> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> hellgräulicholiv <SEP> (GN) <SEP> 1-1/2ig
<tb> [21B1], <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Emerson-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelb <SEP> [11C1],
<tb> Luftmycel <SEP> spärlich,
<SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Bennet-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrhellgelb <SEP> [11J2],
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> dunkelgräulichgrün <SEP> (GN)
<tb> 24-1 <SEP> ! <SEP> 2ih <SEP> [23A3], <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Czapek-Agar <SEP> spärliches <SEP> Wachstum
<tb> Glucose-Asparagin-Agar <SEP> mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgrun <SEP> [10B1],
<tb> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> b <SEP> [27A1], <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> mässiges <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelb <SEP> [10B2], <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> gelblichgrau <SEP> (GY) <SEP> 2dc <SEP> [10A2], <SEP> kein
<tb> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Nähr-Agar <SEP> leidliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgrün <SEP> [10B1],
<tb> Lufmycel <SEP> spärlich, <SEP> weiss,
<SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Calciummalat <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> Umkehrfahlgelbgriin <SEP> [10B1],
<tb> Luftmycel <SEP> leidlich, <SEP> weiss <SEP> (W) <SEP> a
<tb> Wirkung <SEP> auf <SEP> Milch <SEP> keine <SEP> Koagulation, <SEP> Aufklaren <SEP> innerhalb <SEP> von <SEP> 17 <SEP> Tagen
<tb> Nitratreduktion <SEP> negativ
<tb> Gelatineverflüssigung <SEP> keine
<tb> Einfluss <SEP> der <SEP> pu-wanderung <SEP> auf <SEP> optimaler <SEP> pH-Bereich <SEP> zum <SEP> Wachsen <SEP> 5,0 <SEP> bis <SEP> 6, <SEP> 0,
<tb> das <SEP> Wachstum <SEP> Wachstum <SEP> jedoch <SEP> keine <SEP> Sporulation <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> bis
<tb> 8,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> Melaninproduktion
<tb> Pepton-Eisen-Agar <SEP> und
<tb> Trypton-Hefeextrakt-Brühe <SEP> keine
<tb> Temperaturbedingungen <SEP> Wachstum <SEP> und <SEP> Sporulation <SEP> sind <SEP> bei <SEP> 26 <SEP> bis <SEP> 300C <SEP> gut,
<tb> bei <SEP> 37 C <SEP> oder <SEP> darüber <SEP> kein <SEP> Wachstum
<tb> Hauptsächliche <SEP> Bestandteile <SEP> der <SEP> L, <SEP> L-Diaminopimelinsäure, <SEP> Glycin, <SEP> Glutaminsäure,
<tb> gesamten <SEP> Zellhydrolysate <SEP> Asparaginsäure, <SEP> Alanin <SEP> und <SEP> Leucin <SEP>
<tb>
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In Tabelle II sind die Ergebnisse der Kohlenstoffutilisation zusammengefasst, die man bei Versuchen mit S. clavuligerus NRRL 3585 erhält.
In dieser Tabelle werden folgende Symbole verwendet : + = Wachstum und Utilisation - = kein Wachstum, keine Utilisation (+) = mögliche Utilisation (-) = fragliche Utilisation
Tabelle II
Kohlenstoffutilisation für NRRL 3585
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<tb>
<tb> Verbindung <SEP> Wachstumsverhalten <SEP>
<tb> L-Arabitiose
<tb> Rhanmose
<tb> FructoseD-Xylose
<tb> Melezitose <SEP> (-) <SEP>
<tb> Raffinose
<tb> Dextrose
<tb> Cellobiose
<tb> Maltose <SEP> + <SEP>
<tb> Saccharose
<tb> Cellulose
<tb> Inosit <SEP> (+) <SEP>
<tb> Mannit
<tb> Na-Glutamat <SEP> (+) <SEP>
<tb>
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diums in Mengen vor, die für ein entsprechendes Wachsen der erfindungsgemäss verwendeten Actinomycete ausreichen.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann variiert werden. Dieser Anfangs-pH-Wert des Mediums sollte zweckmässigerweise jedoch zwischen 6,5 und 7,2 liegen. Wie bei andern Actinomyceten, so steigt auch im vorliegenden Fall der pH-Wert des Mediums allmählich während der Wachstumsperiode des Organismus, während der das Antibioticum gebildet wird, und kann hiebei einen Wert von 6,7 bis 7,5 oder darüber errei- chen, wobei der End-pH-Wert wenigstens vom ursprünglichen pH-Wert des Mediums, den im Medium vor- handenen Puffern und der jeweiligen Wachstumszeit für den Organismus abhängt.
Submerse aerobe Kulturbedingungen sind die Bedingungen der Wahl für die Produktion von Deacetoxy- cephalosporin C. Zur Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen bedient man sich einer Schüttelflaschen- und Oberflächenkultur in Flaschen. Für die Herstellung grosser Mengen wird eine submerse aerobe Kultur in sterilen Tanks hevorzugt, Tanks bevorzugt.
Das Medium im sterilen Tank kann mit einer sporulierten Suspension inokuliert werden. Wegen der bei
Verwendung einer sporulierten Suspension beobachteten Wachstumsverzögerung verwendet man als Inokulum vorzugsweise jedoch die vegetative Form der Kultur.
Auf diese Weise umgeht man die Wachstumsverzögerung und kann die Fermentationsvorrichtungen bes- ser ausnutzen. Vorzugsweise stellt man daher zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus her, indem man eine verhältnismässig kleine Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus inokuliert.
Sobald dabei ein junges aktives vegetatives Inokulum entstanden ist, überträgt man dieses vegetative Inokulum aseptisch auf den grossen Tank. Das Medium, in dem man das vegetative Inokulum produziert, kann entweder gleich oder verschieden sein von dem für die grosstechnische Produktion verwendeten Medium.
Der Mikroorganismus, der Deacetoxycephalosporin C produziert, wächst über einen breiten Temperaturbereich zwischen etwa 25 und 370C. Zu optimaler Produktion scheint es bei Temperaturen von 26 bis 30 C zu kommen. Eine maximale Produktion an Antibiotikum erhält man normalerweise innerhalb von etwa 36 bis 72 h nach Inokulation des Kulturmediums.
Wie bei aeroben submersen Kulturverfahren üblich, wird auch im vorliegenden Fall sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein ausreichendes Wachsen des Organismus und eine entsprechende Bildung an Antibioticum sollte man hiebei bei der Tankproduktion mit einem Luftvolumen von 0,2 bis 0,4 Volumina Luft pro Minute pro Volumen Kultur arbeiten. Bevorzugt arbeitet man bei einem Luftvolumen von 0,40 Volumina Luft pro Minute und pro Volumen Kulturmedium.
Die Konzentration antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium lässt sich während der Fermentationszeit ohne weiteres verfolgen, indem man Proben des Kulturmediums bezüglich ihrer hemmenden Wirkung gegenüber dem Wachsen von Mikroorganismen untersucht, von denen man weiss, dass sie durch Deacetoxycephalosporin C inhibiert werden. Die Organismen Sarcina lutea und Salmonella gallinarum erwiesen sich für diesen Zweck als geeignet. Die Untersuchung der Proben kann an Hand des bekannten turbidometrischen Verfahrens oder an Hand des üblichen Scheibenplattenverfahrens durchgeführt werden.
Zu einer maximalen Produktion an antibiotischer Wirksamkeit kommt es im allgemeinen innerhalb von einem bis 3 Tagen nach Inokulation des Kulturmediums bei einem submersen aeroben Kulturverfahren oder bei einem Schüttelflaschen-Kulturverfahren.
Die vom Streptomyceten während der Fermentation gebildete antibiotische Aktivität tritt in der antibiotischen Brühe auf. Die beim erfindungsgemässen Verfahren angewandten Isoliertechniken sind daher so ausgelegt, dass man aus der Brühe ein Maximum des Antibioticum gewinnen kann.
Hiezu werden beispielsweise Mycel und ungelöste Feststoffe aus der Fermentationsbrühe in bekannter Weise entfernt, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe kann man dann das Gemisch der entstandenen Antibiotica, beispielsweise durch Extraktion oder Adsorption, gewinnen.
Deacetoxycephalosporin C wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe als Bestandteil des bei der Fer- mentation produzierten antibiotischen Gemisches gewonnen. Das Deacetoxycephalosporin C wird dann von den andern antibiotischen Bestandteilen dieses Gemisches (beispielsweise den oben erwähnten Antibiotica A-16 8861, A-16 886II und A-16 884) abgetrennt und als praktisch reine Verbindung säulenchromatographisch isoliert.
Zur Gewinnung des antibiotischen Gemisches durch Adsorptionstechniken werden Ionenaustauscherharze bevorzugt. Diese Gewinnung kann jedoch genausogut auch mit Adsorptionsmaterialen erfolgen, wie Aktivkohle, Silicagel, Aluminiumoxyd oder Cellulose.
Deacetoxycephalosporin C und die oben erwähnten gleichzeitig gebildeten Antibiotica können in der Fermentationsbrühe in Salzform oder in amphoterer Form (zwitterionischer Form) vorliegen, u. zw. je nach dem End-pH-Wert der Brühe. Das Gemisch der Antibiotica kann beispielsweise durch Adsorptionschromatographie oder durch Ionenaustauscherchromatographie gewonnen und in die einzelnen Bestandteile aufgetrennt werden, wenn diese in einer der genannten Formen oder als Gemisch hievon vorliegen.
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Die Eluatfraktionen werden durch Papierchromatographie oder durch einen mikrobiociden Versuch ständig überwacht, und alle Fraktionen, die hienach lediglich Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert. Die ersten Eluatfraktionen enthalten die bekannten Antibiotica A-16 8861 und 16886TI,
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(5-Amino-5-earboxyvaleramido)-7-methoxy-3-earbamoyloxymethyl-3-cephenk-4-earbonsäureBeispiel l : Herstellung von Deacetoxycephalosporin C mit S. clavuligerus NRRL 3585.
Zur Herstellung einer sporulierten Kultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 lässt man den Organismus auf einem Nährschrägagar wachsen :
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<tb>
<tb> Dextrin <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> hydrolysiertes <SEP> Casein
<tb> (''N-Z <SEP> Amin-Typ <SEP> A, <SEP> t1 <SEP>
<tb> Sheffield <SEP> Chemical
<tb> Company, <SEP> Lindhurst, <SEP> N. <SEP> J.) <SEP> 2, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Rinderextrakt <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Meer-Agar <SEP> (dreimal
<tb> gewaschen) <SEP> 20, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> deionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
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Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf PH 7, 0 eingestellt.
Der Schrägagar wird mit Sporen von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 inokuliert und 4 bis 5 Tage bei 300C inkubiert. Der Schrägagar wird dann mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und schliesslich sorgfältig abgekratzt, um so von ihm die Sporen und Zellen in Form einer wässerigen Suspension zu entfernen. Einen Milliliter der erhaltenen Suspension verwendet man zum Inokulieren von je 100 ml Mengen eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Glucose <SEP> 15, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 15,00 <SEP> g
<tb> Maisschlempefeststoffe <SEP> 5, <SEP> 00g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2,00 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> deionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wird durch Zusatz von Natriumhydroxyd auf PH 6,7 eingestellt.
Das erhaltene vegetative Medium schüttelt man 24 bis 48 h bei 300C auf einem Reziprokschüttler mit einer Geschwindigkeit mit 108 Umdr/min bei einem Ausschlag von etwa 5 cm. Das so hergestellte Inokulum verwendet man dann zu der im folgenden beschriebenen Produktion von Deacetoxycephalosporin C.
In einen 40 I fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl werden 241 eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben :
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<tb>
<tb> Antifoam <SEP> A <SEP> (Ein <SEP> von <SEP> Corning
<tb> Company, <SEP> Midland, <SEP> Mich.,
<tb> vertriebenes <SEP> Antischaummittel) <SEP> 5,00 <SEP> g
<tb> Stärke <SEP> 1125, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Nadrisol
<tb> (National <SEP> Distillers
<tb> Produkts <SEP> Co., <SEP> N. <SEP> Y., <SEP> N. <SEP> Y.) <SEP> 125,00 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehlgrütze <SEP> 500,00 <SEP> g
<tb> Glycerin <SEP> 187,50 <SEP> g
<tb> N-Z <SEP> Amin <SEP> A <SEP> 125, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Eisen <SEP> (ll) <SEP> sulfat-heptahydrat <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> kaltes <SEP> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 24 <SEP> 1
<tb>
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Ansatz mit einem mechanischen Rührer bei 420 Umdr/min rührt.
Der End-pH-Wert liegt bei 6, 3.
Etwa 751 der gesamten Brühe, die man durch Vereinigung der gesamten Brühen aus drei wie oben beschrieben ausgeführten Fermentationen erhält, werden unter Verwendung von Diatomeenerde in einer Menge von 5 g pro 100 ml filtriert.
Das dabei erhaltene Brühenfiltrat wird dann auf eine 9, 5 x130 cm Säule gegeben, die mit 8 1 Aktivkohle (Pittsburg CAL. 12 x 40 ; Pittsburg Activated Carbon Co.) bepackt ist, wobei die Aufgabegeschwindigkeit 60 ml pro Minute beträgt. Die Säule wird anschliessend mit 101 deionisiertem Wasser (PH 5, 2) gewaschen, worauf man die an der Aktivkohle adsorbierte Aktivität entfernt, indem man auf die Säule 50% iges wässeriges Aceton aufgibt.
Die die antibiotische Aktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Entfernung von Aceton im Vakuum eingeengt, und das dabei erhaltene Konzentrat gibt man auf eine 9, 5 x 140 cm Säule, die mit Dowex 1-X1 (einem stark basischen Anionenaustauscherharz, das von Dow Chemical Co. Midland, Mich., vertrieben wird) in der Formiatform bepackt ist. Die Säule wird dann mit 101 deionisiertem Wasser gewaschen, worauf man die auf der Säule befindliche Aktivität mit 0, 1 molarem Ammoniumformiat entfernt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und in einer Geschwindigkeit von 60 ml pro Minute auf eine 9, 5 x 100 cm Säule gegeben, die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 x 40) bepackt ist.
Die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, worauf man die auf der Säule befindliche Aktivität mit
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einem 1 : 4 Gemisch aus Aceton und Wasser mit einer Geschwindigkeit von 60 ml pro Minute eluiert. Hiebei erhält man 15 Fraktionen aus je 21. Durch anschliessende Eluierung mit einem 1 : 1 Gemisch aus Aceton und
Wasser erhält man 18 Fraktionen mit je einem Liter. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zum Entfer- nen von Aceton im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.
40 g der vereinigten lyophilisierten Präparationen werden mit 41 Methanol durch 16h langes Rühren mit einem Magnetrührer extrahiert. Die in Methanol unlöslichen Stoffe werden abfiltriert, worauf man die in Me- thanol löslichen Stoffe mit 5 Volumina Aceton ausfällt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und ge- trocknet. Die Ausbeute beträgt 20,6 g.
Die dabei erhaltene Präparation löst man in einem Minimum Wasser, und die erhaltene Lösung gibt man mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute auf eine mit Dextran (Sephadex G-25 ; Pharmacie Fine Chemi- cals, Piscatawa, N. J.) bepackte 5,8 x 120 cm Säule. Die in der Säule befindliche Aktivität wird mit deioni- siertem Wasser eluiert, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert.
10 g des oben erhaltenen Materials werden in 256 ml eines Gemisches aus Acetonitril und Wasser (55 : 45) gelöst, und die erhaltene Lösung gibt man auf eine 5, 5 x 85 cm Säule, die mit einem in einem Lö- sungsmittelgemisch aus Acetonitril und Wasser (7 : 3) hergestellten Silicagel bepackt ist.
Die Aufgabe erfolgt in einer Geschwindigkeit von 3 ml pro Minute. Nach Aufgabe der Probe wird die
Säule mit einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser (7 : 3) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 ml pro Minute eluiert. Die am meisten aktiven Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum zur Trockne eingedampft und lyophilisiert.
50 g des obigen lyophilisierten antibiotischen Gemisches, das man durch Vereinigung des Materials aus mehreren in obiger Weise durchgeführten Versuchen hergestellt, werden in 80 ml Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung adsorbiert man an mikrokristalline Cellulose. Die dabei erhaltene Mischung wird getrocknet und dann auf eine 7, 4 x 115 cm Säule gegeben, die mit mikrokristalliner Cellulose meinem Gemisch aus Acetonitril: n-Propanol: Wasser (l ; l : 0,5, V : V : V) bepackt ist.
Die Säule wird dann mit dem gleichen Lösungsmittelsystem mit einer Geschwindigkeit von 18 ml pro Minute eluiert. Fraktionen von jeweils 11 Eluat werden gesammelt, und alle Fraktionen, die auf Grund der Papierchromatographie oder eines mikrobiologischen Versuches Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, und das erhaltene Konzentrat wird schliesslich lyophilisiert, wodurch man praktisch reines Deacetoxycephalosporin C in Form des Ammoniumsalzes erhält.
12 g des gefriergetrockneten Produktes werden in folgender Weise weiter gereinigt. Das erhaltene Material wird in 75 ml Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung gibt man auf eine 3,0 x 70 cm Säule, die mit einem in Wasser hergestellten Amberlit XAD-4-Harz (Röhm und Haas, Philadelphia, Pa.) bepackt ist. Das auf der Säule befindliche Produkt wird mit Wasser in einer Geschwindigkeit von 2,5 ml pro Minute eluiert, wobei man eine Reihe von Eluatfraktionen von jeweils 20 ml auffängt. Die erhaltenen Eluatfraktionen werden ständig papierchromatographisch und mikrobiologisch untersucht.
Diejenigen Fraktionen, die lediglich Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert, wodurch man Deacetoxycephalosporin C hoher Reinheit mit folgenden Eigenschaften erhält :
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<tb>
<tb> Elementaranalyse <SEP> für <SEP> C14H18N3O6SNa <SEP> :
<tb> berechnet: <SEP> C <SEP> 44,32; <SEP> H <SEP> 4,78; <SEP> N <SEP> 11,08; <SEP> S <SEP> 8,45
<tb> gefunden: <SEP> C <SEP> 44,80; <SEP> H <SEP> 5,34; <SEP> N <SEP> 11,74; <SEP> S <SEP> 7,88
<tb>
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Ämax 260 (e 58 00) Potentiometrische Titration (66%iges DMF) :
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<tb>
<tb> Anfangs-pH-Wert <SEP> von <SEP> 5,0
<tb> pKa <SEP> 4, <SEP> 0, <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> und <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
EMI8.4
spiel 1 beschriebenen Verfahren, wobei man jedoch einProduktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet :
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<tb>
<tb> Distillers'solubles <SEP> (Nadrisol) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> (Nutrisoy <SEP> 200 <SEP> D <SEP> ; <SEP>
<tb> Archer <SEP> Daniels <SEP> Midland <SEP> Co.,
<tb> ChicÅago, <SEP> Ill.) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Proteinmelasse <SEP> (Blackstrap) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Hafermehl <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
An Stelle eines Rotationsschüttlers verwendet man ferner einen mit 108 Hüben pro Minute betriebenen Reziprokschüttler.
Bei s pie 1 3 : Pilotanlagenproduktion von Deacetoxycephalosporin C.
Ein 40 1 fassender Fermenter aus rostfreiem Stahl wird mit 24 1 Medium folgender Zusammensetzung beschickt :
EMI9.2
<tb>
<tb> Antifoam <SEP> A <SEP> (ein <SEP> von <SEP> Dow <SEP> Corning
<tb> vertriebenes <SEP> Antischäummittel) <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Dextrin <SEP> 700 <SEP> (A. <SEP> E. <SEP> Staley <SEP> Mfg. <SEP> Co.,
<tb> Decator, <SEP> Ill.) <SEP> 50, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Sojabohnengrütze <SEP> 25, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Melasse <SEP> (Blackstrap) <SEP> 3, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Kaliumbiphosphat <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> kaltes <SEP> Leitungswasser <SEP> auf <SEP> 25 <SEP> 1
<tb>
Der Ausgangs-pH-Wert liegt bei 6, 5 und wird nicht eingestellt.
Das Medium sterilisiert man 30 min bei 120 C, und es wird dann abgekühlt und mit 5% des nach Beispiel 1 hergestellten vegetativen Inokulums beimpft. Sodann fermentiert man den Ansatz 66 h bei 30 C, wobei man mit Luft in einer Menge von 0, 35 V/ V/min belüftet und mit einem mechanischen Rührer mit 420 Umdr/min rührt. Der pH-Endwert beträgt 7, 5.
Etwa 601 der oben erhaltenen Brühe werden unter Verwendung von Diatomeenerde filtriert. Das Brühenfiltrat leitet man dann über eine 9, 6 x150 cm Säule, die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 x 40, Hersteller Pittsburgh Activated Carbon Co.) bepackt ist.
Die Säule wird so lange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom farblos ist, und die an der Kohle adsorbierte Aktivität entfernt man dann, indem man 50% iges wässeriges Aceton über die Säule leitet. Die die gewünschte Aktivität enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Entfernung von Aceton im Vakuum eingeengt, und das Konzentrat gibt man dann auf eine 5, 9 x 104 cm Säule, die mit IRA-68-Harz (Formiatform) (einem von Röhm und Haas Co. Philadelphia, Pa., hergestellten Anionenaustauscherharz, das man zur Umwandlung des Harzes in die Formiatform mit Ameisensäure wäscht) bepackt ist.
Die Säule wird so lange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom klar und farblos ist, und die auf der Säule befindliche Aktivität wird dann durch Waschen mit 0, 1 molarer Ammoniumformiatlösung entfernt. Die
EMI9.3
den vereinigt, zur Entfernung von Acetonitril im Vakuum eingeengt und schliesslich gefriergetrocknet. Hiebei erhält man 25 bis 30 g Feststoffe.
Die gefriergetrocknete Präparation löst man in einem Minimum Wasser, und gibt die erhaltene Lösung dann in eine mit mikrokristalliner Cellulose bepackte Säule von 7, 2 x 60 cm, wobei diese Cellulose in 70%igem wässerigemAcetonitril suspendiert ist und man die Säule vor Aufgabe der aktiven Probe mit Acetonitril wäscht.
Nach erfolgter Aufgabe der Probe wird die Säule mit einem Säulenvolumen Acetonitril gewaschen, worauf man die auf der Säule befindliche Aktivität mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt
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und auf etwa 200 ml eingeengt, und aus dem dabei erhaltenen Konzentrat fällt man den darin enthaltenen Wirkstoff durch Zugabe von 10 Volumina Aceton aus. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 9 bis 12 g.
20 g des oben erhaltenen Materials werden in einer minimalen Wassermenge gelöst, und die erhaltene Lösung gibt man auf eine Silicagelsäule (7, 2 x 60 cm). Das verwendete Silicagel wird vorher mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen und zum Bepacken der Säule in 70% Acetonitril suspendiert. Nach Aufgeben der Probe wäscht man die Säule mit einem Säulenvolumen Acetonitril, worauf die in der Säule befindliche Aktivität mit 70%igem Acetonitril eluiert wird.
Es werden mehrere Fraktionen aufgefangen, und kleine Teilmengen hievon werden zur Identifizierung des in jeder Fraktion vorhandenen antibiotischen Faktors papierchromatographisch untersucht. Das bekannte Antibioticum A-16 884 (7-Methoxycephalosporin C) geht zusammen mit den Anfangsfraktionen von der Säule, während sich das Deacetoxycephalosporin C erst bei den späteren Fraktionen sammeln lässt.
Alle Fraktionen, die auf Grund der papierchromatographischen Analyse nur Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden vereinigt und dann gefriergetrocknet. Die nach den oben erwähntenlaolier-und Reinigungs- verfahren erhaltene lyophilisierte Präparation ist praktisch reines Deacetoxycephalosporin C in Form des Ammoniumsalzes.
Beispiel 4 : Isolierung von Deacetoxycephalosporin C als Mononatriumsalz.
Etwa 60 l der gemäss Beispiel 3 erhaltenen Brühe werden unter Verwendung von Hyflo-Supercel filtriert.
Das Brühenfiltrat schickt mandurch eine 9, 6 x 150cm Säule, die mit Aktivkohle (Pittsburgh CAL. 12 x 40) bepackt ist. Die Säule wird so lange mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser farblos ist, und die in der
EMI10.1
lange mit Wasser gewaschen, bis der Abstrom klar und farblos ist, und die in der Säule befindliche Aktivität wird dann durch Waschen mit 0, 1 molarem Natriumacetat entfernt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und dann auf eine 4, 3 x 72 cm Säule gegeben, die mit Pittsburgh CAL. (12 x 40) Aktivkohle bepackt ist. Die
Säule wird mit dem 6fachen Säulenvolumen Wasser gewaschen, worauf man die in der Säule befindliche Aktivität mit 30%igem wässerigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung des Acetons im Vakuum eingeengt und schliesslich gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 20 bis 30 g.
Die Analyse ergibt einen Natriumgehalt von 2, 5%.
Das hiebei erhaltene rohe antibiotische Gemisch der Natriumsalze wird über mikrokristalliner Cellulo- se chromatographiert, worauf man das Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C aus dem Salzgemisch über Silicagel nach dem in Beispiel 3 für die Isolierung des Ammoniumsalzes von Deacetoxycephalosporin C beschriebenen chromatographischen Trennverfahren abtrennt.
Das auf diese Weise erhaltene Produkt lässt sich chromatographisch von Deacetoxycephalosporin C nicht mehr unterscheiden, das durch Hydrierung von Cephalosporin C nach dem in der USA-Patentschrift Nr. 3, 124, 576 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Das erhaltene Produkt verfügt über die im Beispiel 1 angegebenen physikalischen Eigenschaften.
Beispiel 5 : Herstellung von Deacetoxycephalosporin C in Form der freien Säure.
Das nach Beispiel 4 hergestellte Mononatriumsalz von Deacetoxycephalosporin C wird in destilliertem Wasser gelöst, und die so erhaltene Lösung versetzt man unter Rühren in kleinen Mengen mit sulfoniertem Polystyrolharz AG 50W-X4 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Cal.), bis der PH-Wert des Gemisches auf 2, 5 eingestellt ist. Sodann wird das Harz abfiltriert und das erhaltene Filtrat lyophilisiert, wodurch man die freie Säure von Deacetoxycephalosporin C in Form eines trockenen amorphen Feststoffes erhält.
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to a new process for the production of deacetoxycephalosporin C. Deacetoxycephalosporin C is suitable for the production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid, which is also referred to as 7-ADCA for short.
Deacetoxycephalosporin C, which has the structural formula
EMI1.1
EMI1.2
<Desc / Clms Page number 2>
According to the process of the present invention, deacetoxycephalosporin C is formed by cultivating Streptomyces clavuligerus NRRL 3585. The process is carried out by cultivating the above microorganism in an aqueous nutrient culture medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen and also inorganic salts submerged under aerobic fermentation conditions until a substantial amount of antibiotic activity has developed in the culture medium.
S. clavuligerus along with deacetoxycephalosporin C also produces 7- (5-amino-5-carboxyvaleramido) -7-methoxy-3-oarbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carboxylic acid and 7- (5-ammo-5-carboxyvaleramido) -3-carbamoyloxymethyl - 3-cephem-4-carboxylic acid, both of which are also known as antibiotics A-15886I and A-1688611.
Deacetoxycephalosporin C is indeed formed in smaller quantities by the microorganism than the other cephalosporins mentioned, but it can easily be separated from these antibiotics and isolated in pure form by chromatography, as described below.
The microorganism used for the method according to the invention was isolated from soil samples from South America. The organism was isolated from the soil samples by suspending certain amounts of the soil samples in sterile distilled water and spreading the suspensions on nutrient agar. The nutrient agar plates inoculated in this way were then incubated at about 25 to 350 ° C. for several days. At the end of the incubation period, the microorganism colonies were transferred to agar slants using a sterile platinum loop.
The agar slants were then incubated so as to obtain appropriate amounts in inoculum for deacetoxycephalosporin C formation.
The microorganism strain used for the method according to the invention is an actinomycete which was identified using methods recommended for the characterization of Streptomyces species for the International Streptomyces project (Shirling et al., Methods for Cha-
EMI2.1
The taxonomic properties of S. clavuligerus NRRL 3585 are summarized in the following tables and explanations. The assignment of the color names in these tables was made according to the ISCC-NBS method, as described by Kelly et al. in The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names (U.S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C. 1955 ').
The numbers in brackets refer to the Tresner and Backus color tables (Tresner
EMI2.2
the names of the color tabs are underlined. The Maerz and Paul color blocks (Maerz et al., Dictionary of Color [McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1950]) are shown in parentheses. Unless otherwise stated, all cultures were allowed to grow at 30 ° C. for 14 days.
S. clavuligerus NRRL 3585 was difficult to classify in the genus Streptomyces because it is an atypical sporophore morphology. However, the values obtained from the cell wall analysis show that this culture is to be regarded as a species from Streptomyces genus. This organism is therefore treated as a new species and given the name Streptomyces clavuligerus.
This organism characteristically forms an extensive network of short sympodial branched aerial hyphae, which may divide into spores. Short wedge-shaped side branches are formed, which normally consist of 1 to 4 spores each. There are no substrate conidia. Smooth-walled spores can be seen in the electron microscope.
Cell wall preparations contain the L, L isomers of diaminopime1ic acid and glycine in addition to the main components aspartic acid, glutamic acid and alanine. The spores are gray in bulk and the primary cycel is pale yellow to yellow-brown. No soluble pigment is formed. The culture has an optimal temperature range of 26 to 300C. There is no wax at 370C. Morphologically, this culture resembles certain strains of Thermonospora and Micromonospora.
The properties of S. clavuligerus NRRL 3585 are summarized in the following tables and explanations.
Morphology of S. clavuligerus NRRL 3585
Sporophores are formed on a large aerial mycelium, and these consist of a network of short sympodial cross-linked hyphae. Usually 1 to 4 spores arise on short club-shaped side branches. Sporophores may also divide into segments, creating chains of spores. The spores usually have dimensions of 0.34 to 0.84 x 0.85 x 3.3 each., On average 0.64 x 1.53 g. Electron microscopic examinations show that the spores are smooth-walled. No spores are formed in the substrate mycelium.
<Desc / Clms Page number 3>
Table I: Culture characteristics of S. clavuligerus NRRL 3585
EMI3.1
<tb>
<tb> Medium <SEP> growth characteristics
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 2 <SEP> (yeast-malt extract agar) <SEP> abundant <SEP> growth, <SEP> reverse grayish yellow <SEP> [12K3],
<tb> aerial mycelium <SEP> abundant, <SEP> dark gray <SEP> (G) <SEP> 3ih <SEP> [21B1],
<tb> no <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 3 <SEP> (oatmeal agar) <SEP> moderate <SEP> growth, <SEP> inverted pale yellow <SEP> [11Cl], <SEP> aerial mycelium <SEP> fair, <SEP> white <SEP> (W ) <SEP> b <SEP> [27A1], <SEP> no <SEP> soluble
<tb> pigment
<tb> ISP <SEP> No.
<SEP> 4 <SEP> (inorganic <SEP> salt star-abundant <SEP> growth, <SEP> reverse grayish yellow <SEP> [12B2], <SEP>
<tb> ke agar) <SEP> aerial mycelium <SEP> moderate, <SEP> medium gray <SEP> (GY) <SEP> 2fe <SEP> [45A1],
<tb> no <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> ISP <SEP> No. <SEP> 5 <SEP> (glycerine asparagine agar) <SEP> fair <SEP> growth, <SEP> inverted pale yellow green <SEP> [10B1],
<tb> aerial mycelium <SEP> fair, <SEP> white <SEP> (W) <SEP> a, <SEP> no <SEP> soluble
<tb> pigment
<tb> tomato paste oatmeal agar <SEP> abundant <SEP> growth, <SEP> reverse grayish yellow <SEP> [11E4],
<tb> aerial mycelium <SEP> moderate, <SEP> light grayish olive <SEP> (GN) <SEP> 1-1 / 2ig
<tb> [21B1], <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> Emerson agar <SEP> abundant <SEP> growth, <SEP> inverted pale yellow <SEP> [11C1],
<tb> aerial mycelium <SEP> sparse,
<SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> Bennet agar <SEP> abundant <SEP> growth, <SEP> reversed light yellow <SEP> [11J2],
<tb> aerial mycelium <SEP> abundant, <SEP> dark grayish green <SEP> (GN)
<tb> 24-1 <SEP>! <SEP> 2ih <SEP> [23A3], <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> Czapek agar <SEP> sparse <SEP> growth
<tb> glucose asparagine agar <SEP> moderate <SEP> growth, <SEP> inverted pale yellow green <SEP> [10B1],
<tb> aerial mycelium <SEP> fair, <SEP> white <SEP> (W) <SEP> b <SEP> [27A1], <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> Tyrosine Agar <SEP> moderate <SEP> growth, <SEP> inverted pale yellow <SEP> [10B2], <SEP> aerial mycelium <SEP> moderate, <SEP> yellowish gray <SEP> (GY) <SEP> 2dc < SEP> [10A2], <SEP> none
<tb> soluble <SEP> pigment
<tb> nutrient agar <SEP> fair <SEP> growth, <SEP> inverted pale yellow green <SEP> [10B1],
<tb> air mycelium <SEP> sparse, <SEP> white,
<SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> calcium malate <SEP> abundant <SEP> growth, <SEP> inverted pale yellow-green <SEP> [10B1],
<tb> aerial mycelium <SEP> fair, <SEP> white <SEP> (W) <SEP> a
<tb> Effect <SEP> on <SEP> milk <SEP> no <SEP> coagulation, <SEP> clearing <SEP> within <SEP> of <SEP> 17 <SEP> days
<tb> Nitrate reduction <SEP> negative
<tb> gelatin liquefaction <SEP> none
<tb> Influence of <SEP> of <SEP> pu migration <SEP> on <SEP> optimal <SEP> pH range <SEP> for <SEP> growth <SEP> 5.0 <SEP> to <SEP> 6 , <SEP> 0,
<tb> the <SEP> growth <SEP> growth <SEP> but <SEP> no <SEP> sporulation <SEP> at <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> to
<tb> 8,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> melanin production
<tb> Peptone Iron Agar <SEP> and
<tb> Tryptone Yeast Extract Broth <SEP> none
<tb> temperature conditions <SEP> growth <SEP> and <SEP> sporulation <SEP> are <SEP> at <SEP> 26 <SEP> to <SEP> 300C <SEP> good,
<tb> at <SEP> 37 C <SEP> or <SEP> above <SEP> no <SEP> growth
<tb> Main <SEP> components <SEP> of <SEP> L, <SEP> L-diaminopimelic acid, <SEP> glycine, <SEP> glutamic acid,
<tb> total <SEP> cell hydrolysates <SEP> aspartic acid, <SEP> alanine <SEP> and <SEP> leucine <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 4>
Table II summarizes the results of the carbon utilization obtained in experiments with S. clavuligerus NRRL 3585.
The following symbols are used in this table: + = growth and utilization - = no growth, no utilization (+) = possible utilization (-) = utilization in question
Table II
Carbon utilization for NRRL 3585
EMI4.1
<tb>
<tb> connection <SEP> growth behavior <SEP>
<tb> L-arabitiose
<tb> rhanmosis
<tb> FructoseD-Xylose
<tb> Melezitose <SEP> (-) <SEP>
<tb> raffinose
<tb> dextrose
<tb> cellobiose
<tb> Maltose <SEP> + <SEP>
<tb> sucrose
<tb> cellulose
<tb> Inositol <SEP> (+) <SEP>
<tb> mannitol
<tb> Na glutamate <SEP> (+) <SEP>
<tb>
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<Desc / Clms Page number 5>
diums in amounts sufficient for the Actinomycete used according to the invention to grow accordingly.
The initial pH of the culture medium can be varied. This initial pH value of the medium should, however, expediently be between 6.5 and 7.2. As with other actinomycetes, in the present case the pH value of the medium increases gradually during the growth period of the organism during which the antibiotic is formed, and can reach a value of 6.7 to 7.5 or more, wherein the final pH depends at least on the original pH of the medium, the buffers present in the medium and the respective growth time for the organism.
Submerse aerobic culture conditions are the conditions of choice for the production of deacetoxycephalosporin C. For the production of relatively small amounts, a shake flask and surface culture in bottles is used. For the production of large quantities, a submerged aerobic culture in sterile tanks is preferred, tanks preferred.
The medium in the sterile tank can be inoculated with a sporulated suspension. Because of the at
However, the vegetative form of the culture is preferably used as the inoculum using a sporulated suspension.
In this way one bypasses the growth retardation and can make better use of the fermentation devices. It is therefore preferable to first prepare a vegetative inoculum of the organism by inoculating a relatively small amount of the culture medium with the spore form of the organism.
As soon as a young, active vegetative inoculum has been created, this vegetative inoculum is aseptically transferred to the large tank. The medium in which the vegetative inoculum is produced can either be the same or different from the medium used for large-scale production.
The microorganism that produces deacetoxycephalosporin C grows over a wide temperature range between about 25 and 370C. Optimal production seems to occur at temperatures between 26 and 30 C. Maximum antibiotic production is normally obtained within about 36 to 72 hours of inoculating the culture medium.
As is customary with aerobic submerged culture processes, sterile air is blown through the culture medium in the present case as well. For sufficient growth of the organism and a corresponding formation of antibiotic, one should work with an air volume of 0.2 to 0.4 volumes of air per minute per volume of culture during tank production. It is preferred to work with an air volume of 0.40 volumes of air per minute and per volume of culture medium.
The concentration of antibiotic activity in the culture medium can be readily followed during the fermentation period by examining samples of the culture medium for their inhibitory effect on the growth of microorganisms which are known to be inhibited by deacetoxycephalosporin C. The organisms Sarcina lutea and Salmonella gallinarum were found to be suitable for this purpose. The examination of the samples can be carried out using the known turbidometric method or using the usual disk plate method.
A maximum production of antibiotic activity generally occurs within one to 3 days of inoculating the culture medium in a submerged aerobic culture process or a shake flask culture process.
The antibiotic activity produced by the streptomycete during fermentation appears in the antibiotic broth. The isolation techniques used in the process according to the invention are therefore designed in such a way that a maximum of the antibiotic can be obtained from the broth.
For this purpose, for example, mycelium and undissolved solids are removed from the fermentation broth in a known manner, for example by filtration or centrifugation, and the mixture of the antibiotics formed can then be obtained from the filtered or centrifuged broth, for example by extraction or adsorption.
Deacetoxycephalosporin C is obtained from the filtered fermentation broth as part of the antibiotic mixture produced during fermentation. The deacetoxycephalosporin C is then separated from the other antibiotic constituents of this mixture (for example the antibiotics A-16 8861, A-16 886II and A-16 884 mentioned above) and isolated as a practically pure compound by column chromatography.
Ion exchange resins are preferred for obtaining the antibiotic mixture by adsorption techniques. However, this extraction can just as well be done with adsorption materials such as activated carbon, silica gel, aluminum oxide or cellulose.
Deacetoxycephalosporin C and the above-mentioned simultaneously formed antibiotics can be present in the fermentation broth in salt form or in amphoteric form (zwitterionic form), u. between depending on the final pH of the broth. The mixture of antibiotics can be obtained, for example, by adsorption chromatography or by ion exchange chromatography and separated into the individual components if these are present in one of the forms mentioned or as a mixture thereof.
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The eluate fractions are constantly monitored by paper chromatography or by a microbiocidal test, and all fractions which then only contain deacetoxycephalosporin C are combined and lyophilized. The first eluate fractions contain the well-known antibiotics A-16 8861 and 16886TI,
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(5-Amino-5-earboxyvaleramido) -7-methoxy-3-earbamoyloxymethyl-3-cephenk-4-earboxylic acid Example 1: Preparation of deacetoxycephalosporin C with S. clavuligerus NRRL 3585.
To produce a sporulated culture of Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, the organism is grown on a nutrient agar slant:
EMI6.3
<tb>
<tb> Dextrin <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> yeast extract <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> hydrolyzed <SEP> casein
<tb> ('' N-Z <SEP> amine type <SEP> A, <SEP> t1 <SEP>
<tb> Sheffield <SEP> Chemical
<tb> Company, <SEP> Lindhurst, <SEP> N. <SEP> J.) <SEP> 2, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Beef extract <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Sea agar <SEP> (three times
<tb> washed) <SEP> 20, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> deionized <SEP> water <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
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The pH of the medium is adjusted to pH 7.0 by adding sodium hydroxide.
The agar slant is inoculated with spores of Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 and incubated for 4 to 5 days at 30 ° C. The agar slant is then covered with sterile distilled water and finally carefully scraped off in order to remove the spores and cells from it in the form of an aqueous suspension. One milliliter of the suspension obtained is used to inoculate 100 ml quantities of a vegetative medium with the following composition:
EMI7.1
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 15, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> soybean meal <SEP> 15.00 <SEP> g
<tb> Corn slurry solids <SEP> 5, <SEP> 00g
<tb> calcium carbonate <SEP> 2.00 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> deionized <SEP> water <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
The pH of the vegetative medium is adjusted to pH 6.7 by adding sodium hydroxide.
The vegetative medium obtained is shaken for 24 to 48 hours at 30 ° C. on a reciprocating shaker at a speed of 108 rev / min with a deflection of about 5 cm. The inoculum produced in this way is then used for the production of deacetoxycephalosporin C.
24 liters of a medium of the following composition are placed in a 40 l stainless steel fermenter:
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<tb>
<tb> Antifoam <SEP> A <SEP> (A <SEP> from <SEP> Corning
<tb> Company, <SEP> Midland, <SEP> Mich.,
<tb> distributed <SEP> antifoam agent) <SEP> 5.00 <SEP> g
<tb> Strength <SEP> 1125, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Nadrisol
<tb> (National <SEP> Distillers
<tb> Product <SEP> Co., <SEP> N. <SEP> Y., <SEP> N. <SEP> Y.) <SEP> 125.00 <SEP> g
<tb> Soybean meal groats <SEP> 500.00 <SEP> g
<tb> Glycerin <SEP> 187.50 <SEP> g
<tb> N-Z <SEP> amine <SEP> A <SEP> 125, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Iron <SEP> (ll) <SEP> sulfate heptahydrate <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> cold <SEP> tap water <SEP> on <SEP> 24 <SEP> 1
<tb>
EMI7.3
Mixture with a mechanical stirrer at 420 rev / min.
The final pH is 6.3.
About 75 liters of the total broth obtained by combining the total broths from three fermentations carried out as described above are filtered using diatomaceous earth in an amount of 5 g per 100 ml.
The resulting broth filtrate is then applied to a 9.5 × 130 cm column which is packed with 8 1 of activated carbon (Pittsburg CAL. 12 × 40; Pittsburg Activated Carbon Co.), the feed rate being 60 ml per minute. The column is then washed with 101 deionized water (PH 5, 2), whereupon the activity adsorbed on the activated charcoal is removed by adding 50% aqueous acetone to the column.
The fractions containing the antibiotic activity are combined and concentrated in vacuo to remove acetone, and the concentrate obtained is placed on a 9.5 x 140 cm column filled with Dowex 1-X1 (a strongly basic anion exchange resin available from Dow Chemical Co. Midland, Mich.) Is packaged in the formate form. The column is then washed with 101 deionized water, whereupon the activity on the column is removed with 0.1 molar ammonium formate. The active fractions are combined and added at a rate of 60 ml per minute to a 9.5 × 100 cm column which is packed with activated carbon (Pittsburgh CAL. 12 × 40).
The column is then washed with water, whereupon the activity on the column with
<Desc / Clms Page number 8>
a 1: 4 mixture of acetone and water at a rate of 60 ml per minute. This gives 15 fractions from 21 each. By subsequent elution with a 1: 1 mixture of acetone and
18 fractions of one liter each are obtained. The active fractions are combined, concentrated in vacuo to remove acetone and lyophilized.
40 g of the combined lyophilized preparations are extracted with 41% methanol by stirring for 16 hours with a magnetic stirrer. The substances insoluble in methanol are filtered off, whereupon the substances soluble in methanol are precipitated with 5 volumes of acetone. The precipitate obtained is filtered off and dried. The yield is 20.6 g.
The preparation obtained in this way is dissolved in a minimum of water, and the solution obtained is added at a rate of 1 ml per minute to a 5.8 × packed with dextran (Sephadex G-25; Pharmacie Fine Chemicals, Piscatawa, NJ) 120 cm column. The activity in the column is eluted with deionized water and the active fractions are combined and lyophilized.
10 g of the material obtained above are dissolved in 256 ml of a mixture of acetonitrile and water (55:45), and the solution obtained is applied to a 5.5 × 85 cm column which is filled with a solvent mixture of acetonitrile and Water (7: 3) prepared silica gel is packed.
The application takes place at a rate of 3 ml per minute. After the sample has been submitted, the
Column eluted with a mixture of acetonitrile and water (7: 3) at a flow rate of 5 ml per minute. The most active fractions are pooled, evaporated to dryness in vacuo and lyophilized.
50 g of the above lyophilized antibiotic mixture, which is prepared by combining the material from several experiments carried out in the above manner, is dissolved in 80 ml of water, and the resulting solution is adsorbed on microcrystalline cellulose. The resulting mixture is dried and then placed on a 7.4 x 115 cm column which is packed with microcrystalline cellulose my mixture of acetonitrile: n-propanol: water (l; l: 0.5, V: V: V) .
The column is then eluted with the same solvent system at a rate of 18 ml per minute. Fractions of 11 eluate each are collected, and all fractions which contain deacetoxycephalosporin C on the basis of paper chromatography or a microbiological test are combined and evaporated under reduced pressure, and the concentrate obtained is finally lyophilized, whereby practically pure deacetoxycephalosporin C is obtained in the form of Ammonium salt.
12 g of the freeze-dried product are further purified in the following manner. The material obtained is dissolved in 75 ml of water, and the solution thus obtained is applied to a 3.0 x 70 cm column packed with an Amberlite XAD-4 resin (Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.) Prepared in water is. The product on the column is eluted with water at a rate of 2.5 ml per minute, collecting a series of eluate fractions of 20 ml each. The eluate fractions obtained are continuously examined by paper chromatography and microbiologically.
Those fractions which only contain deacetoxycephalosporin C are combined and lyophilized, whereby deacetoxycephalosporin C of high purity is obtained with the following properties:
EMI8.1
<tb>
<tb> Elemental analysis <SEP> for <SEP> C14H18N3O6SNa <SEP>:
<tb> calculated: <SEP> C <SEP> 44.32; <SEP> H <SEP> 4.78; <SEP> N <SEP> 11.08; <SEP> S <SEP> 8.45
<tb> found: <SEP> C <SEP> 44.80; <SEP> H <SEP> 5.34; <SEP> N <SEP> 11.74; <SEP> S <SEP> 7.88
<tb>
EMI8.2
Ämax 260 (e 58 00) Potentiometric titration (66% DMF):
EMI8.3
<tb>
<tb> Initial pH value <SEP> of <SEP> 5.0
<tb> pKa <SEP> 4, <SEP> 0, <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> and <SEP> 10, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
EMI8.4
game 1, but using a production medium of the following composition:
<Desc / Clms Page number 9>
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<tb>
<tb> Distillers'solubles <SEP> (Nadrisol) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Soybean meal <SEP> (Nutrisoy <SEP> 200 <SEP> D <SEP>; <SEP>
<tb> Archer <SEP> Daniels <SEP> Midland <SEP> Co.,
<tb> ChicÅago, <SEP> Ill.) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Peanut flour <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Protein molasses <SEP> (Blackstrap) <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Oatmeal <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 10, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> tap water <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
Instead of a rotary shaker, a reciprocating shaker operated at 108 strokes per minute is also used.
At pie 1 3: Pilot plant production of deacetoxycephalosporin C.
A fermenter made of stainless steel with a capacity of 40 l is charged with 24 l medium of the following composition:
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<tb>
<tb> Antifoam <SEP> A <SEP> (a <SEP> from <SEP> Dow <SEP> Corning
<tb> distributed <SEP> anti-foaming agent) <SEP> 0, <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 5, <SEP> 00 <SEP> g <SEP>
<tb> Dextrin <SEP> 700 <SEP> (A. <SEP> E. <SEP> Staley <SEP> Mfg. <SEP> Co.,
<tb> Decator, <SEP> Ill.) <SEP> 50, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> soybean groats <SEP> 25, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Molasses <SEP> (Blackstrap) <SEP> 3, <SEP> 00 <SEP> g
<tb> Potassium biphosphate <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Calcium carbonate <SEP> 2, <SEP> 50 <SEP> g <SEP>
<tb> cold <SEP> tap water <SEP> on <SEP> 25 <SEP> 1
<tb>
The starting pH is 6.5 and is not adjusted.
The medium is sterilized for 30 minutes at 120.degree. C., and it is then cooled and inoculated with 5% of the vegetative inoculum prepared according to Example 1. The batch is then fermented for 66 hours at 30 ° C., venting with air in an amount of 0.35 V / V / min and stirring with a mechanical stirrer at 420 rev / min. The final pH value is 7.5.
About 60 liters of the broth obtained above is filtered using diatomaceous earth. The broth filtrate is then passed over a 9.6 × 150 cm column which is packed with activated carbon (Pittsburgh CAL. 12 × 40, manufacturer Pittsburgh Activated Carbon Co.).
The column is washed with water until the effluent is colorless, and the activity adsorbed on the carbon is then removed by passing 50% aqueous acetone over the column. The fractions containing the desired activity are combined and concentrated in vacuo to remove acetone, and the concentrate is then applied to a 5.9 x 104 cm column filled with IRA-68 resin (formate form) (one of Röhm and Haas Co . Philadelphia, Pa., Which is washed with formic acid to convert the resin to formate form).
The column is washed with water until the effluent is clear and colorless, and the activity on the column is then removed by washing with 0.1 molar ammonium formate solution. The
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the combined, concentrated in vacuo to remove acetonitrile and finally freeze-dried. This gives 25 to 30 g of solids.
The freeze-dried preparation is dissolved in a minimum of water, and the resulting solution is then placed in a column of 7.2 x 60 cm packed with microcrystalline cellulose, this cellulose being suspended in 70% aqueous acetonitrile and the column before the active sample is applied washes with acetonitrile.
After the sample has been applied, the column is washed with a column volume of acetonitrile, whereupon the activity on the column is eluted with methanol. The active factions are merged
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and concentrated to about 200 ml, and the active ingredient contained therein is precipitated from the concentrate obtained by adding 10 volumes of acetone. The precipitate is filtered off, washed with acetone and dried in vacuo. The yield is 9 to 12 g.
20 g of the material obtained above are dissolved in a minimum amount of water and the solution obtained is placed on a silica gel column (7.2 x 60 cm). The silica gel used is washed beforehand with water and then with methanol and suspended in 70% acetonitrile to pack the column. After applying the sample, the column is washed with one column volume of acetonitrile, whereupon the activity in the column is eluted with 70% acetonitrile.
Several fractions are collected and small aliquots are analyzed by paper chromatography to identify the antibiotic factor present in each fraction. The well-known antibiotic A-16 884 (7-methoxycephalosporin C) goes off the column together with the initial fractions, while the deacetoxycephalosporin C can only be collected in the later fractions.
All fractions which, on the basis of paper chromatographic analysis, contain only deacetoxycephalosporin C are combined and then freeze-dried. The lyophilized preparation obtained by the abovementioned lacquering and cleaning processes is practically pure deacetoxycephalosporin C in the form of the ammonium salt.
Example 4: Isolation of Deacetoxycephalosporin C as the monosodium salt.
About 60 l of the broth obtained according to Example 3 are filtered using Hyflo-Supercel.
The broth filtrate is sent through a 9.6 x 150cm column that is packed with activated carbon (Pittsburgh CAL. 12 x 40). The column is washed with water until the wash water is colorless, and that in the
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Washed with water for a long time until the effluent is clear and colorless, and the activity in the column is then removed by washing with 0.1 molar sodium acetate. The active fractions are pooled and then applied to a 4.3 x 72 cm column filled with Pittsburgh CAL. (12 x 40) activated charcoal is packed. The
Column is washed with 6 times the column volume of water, whereupon the activity in the column is eluted with 30% aqueous acetone. The active fractions are combined, concentrated in vacuo to remove the acetone and finally freeze-dried. The yield is 20 to 30 g.
The analysis shows a sodium content of 2.5%.
The crude antibiotic mixture of sodium salts obtained here is chromatographed over microcrystalline cellulose, whereupon the monosodium salt of deacetoxycephalosporin C is separated off from the salt mixture over silica gel according to the chromatographic separation process described in Example 3 for the isolation of the ammonium salt of deacetoxycephalosporin C.
The product obtained in this way can no longer be differentiated chromatographically from deacetoxycephalosporin C, which was produced by hydrogenation of cephalosporin C according to the process described in US Pat. No. 3, 124, 576. The product obtained has the physical properties given in Example 1.
Example 5: Production of Deacetoxycephalosporin C in the form of the free acid.
The monosodium salt of deacetoxycephalosporin C prepared according to Example 4 is dissolved in distilled water, and the resulting solution is admixed in small amounts with sulfonated polystyrene resin AG 50W-X4 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Cal.), While stirring, until the pH The value of the mixture is set to 2.5. The resin is then filtered off and the filtrate obtained is lyophilized, whereby the free acid of deacetoxycephalosporin C is obtained in the form of a dry amorphous solid.