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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C.
In der deutschen Offenlegungsschrift 1492053 ist ein Verfahren zur Gewinnung von C ephalosporin C, Penicillin N oder Cephalosporin P mittels einer Emericellopsis-Cephalosporium-Kultur beschrieben. Bei diesem Verfahren erfolgt die Züchtung des Mikroorganismus in kontinuierlicher Kultur in einem Gleichgewichtszustand, wobei wachstumsbegrenzende Nährstoffe in jedem Falle auf den Wert eingestellt werden, durch den die Bildung der Antibiotika begünstigt wird.
Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von Deacetoxycephalosporin C werden in einem wässerigen Kulturnährmedium unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen Paecilomyces carneus
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wesentliche Menge an Deacetoxycephalosporin C von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet wird, worauf das Deacetoxycephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert wird.
Die Cephalosporinverbindung Deacetoxycephalosporin C wird durch die folgende Strukturformel dargestellt :
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Das Mycel und andere unlösliche Stoffe werden abfiltriert und das filtrierte Kulturmedium wird mit
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zu entfernen. Das DeacetoxycephalosporinC wird aus dem wässerigen semi-gereinigten Kulturmedium durch Chromatographie auf folgende Weise gewonnen (Wenn hier von Kulturmedium oder -lösung beim Züchten von Mikroorganismen gesprochen wird, wird darunter das Medium verstanden, das man bei der Züchtung erhält. Dieses kann auch einfach als "Brühe" bezeichnet werden. Das Wort "Medium" wird in diesem Zusammenhang im Sinne des englischen Wortes"broth"verwendet.) : Das wässerige Medium wird zuerst über
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Aktivkohle chromatographiert.
Die mit Aktivkohle beschickte Säule wird mit Wasser gewaschen, um Verunreinigungen weiter zu entfernen, und danach wird die Aktivität mit 50% igem wässerigem Aceton eluiert.
Das Eluat wird konzentriert und über ein anionisches Austauschharz geleitet. Das Deacetoxycephalosporin C wird davon, bevorzugt mit einer 0, 15n Natriumacetatlösung, eluiert.
Die Eluate werden dann zur Trockne eingedampft oder lyophilisiert, wobei man eine rohe Deaoetoxycephalosporin C-Präparation erhält. Das Rohmaterial wird durch weitere Chromatographie über eine Cellulosesäule oder über Silicagel gereinigt. Die aktiven Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, werden entweder auf ein geringes Volumen konzentriert oder zur Trockne eingedampft. Das Konzentrat oder der trockene Feststoffrückstand wird in einer minimalen Menge an Isopropanol gelöst und die Lösung wird in Diäthyläther gegossen, um Deacetoxycephalosporin C als Natriumsalz auszufällen. Die Mikroorganismen, die beim erfindungsgemässen Verfahren nützlich sind, wurden als Glieder der Klasse Fungi imperfect klassifiziert, da sie keine geschlechtlichen Sporen bilden.
Sie wurden weiter in die Klasse Moniliales, die Familie Moniliaceae und die Gattung Paecilomyces klassifiziert.
Die obige Klassifizierung der Mikroorganismen, die bei der Erfindung nützlich sind, basiert auf den beobachteten morphologischen und Kultureigenschaften. In den folgenden Abschnitten erfolgt eine taxanomisehe Beschreibung des Mikroorganismus Paecilomyces carneus NRRL 5711. Die Bezugnahme auf "Maerz
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beziehtBook Co., Inc., New York [1950].
Morphologie und Kultureigenschaften von Paecilomyces.
Paecilomyces carneus NRRL 5711 (A 13215) :
A 13215 wird als Stamm von Paecilomyces carneus (Duchel und Heim) in der Ordnung Moniliales klassifiziert.
Die Kolonien sind allgemein samtartig bis flockig und die Tiefe des Luftfilzes variiert entsprechend dem Substrat. Das Wachstum auf Lösungsagar nach Czapek Ist relativ dünn und etwas funiculär. Die Kolonien sind im allgemeinen farblos, werden mit der Konidienentwicklung etwas verfärbt. Die Peripherien sind manchmal geringfiigig gekerbt oder gesägt und auf Agar nach Czapek sind sie durch ein Band vontiefsubmersem Mycel betont. Die Umkehrfarben haben leuchtend grünliche Tönungen bis zu gelben Tönungen, und in einigen Medien treten braune Tönungen auf.
Die verzweigten Konidiophoren, die von 100 bis 300 ja lang sind, entstehen aus dem Agar oder aus wuchernden Lufthyphen. Sich gabelnde Verzweigungen können Längen von 40 J. erreichen. Häufig treten
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in zahlreichen Arten auf den Konidiophoren und deren Verzweigungen. Sie können spitz als Einzelsterigma oder in Wirteln bis zu 5 auftreten. Sie können als Windungen längs der Hauptachse mit Internodien von 5 bis 20 J. l. auftreten. Im allgemeinen sind die Sterigmata in Wirteln stark divergent. Metuale sind weniger häufig, aber manchmal treten sie in Wirteln auf, wobei nur ein einziges Sterigma daran haftet. Die individuellen Sterigmata, die stark divergent sind, treten oft länger längs der Konidlophoren und deren Verzweigungen auf.
Die Form der Sterigmata typisiert die Gattung. Sie sind immer langzettig und sind praktisch zylindrisch von ihrer Basis bis auf ungefähr 75% ihrer Länge, wo sie stärker spitz zulaufen und eine lange dünne Röhre mit ungefähr 5, 0 x 0, 5 J. l. bilden.
Die Konidien sind unicellular, subkugelformig bis elliptisch, trocken und feingerauht und seeigelartig bis kleinstachelig. Sie bilden sich in langen Ketten und die Sporen scheinen durch eine Verbindungsbrücke zusammengehalten zu werden, ein Teil davon kann an den freien Konidien als kleine, herabhängende Zipfel, die geringer als 1 ju lang und 1 u breit sind, erkannt werden. Diese Oberflächeneigenschaften werden am besten an einem Ölimmersionsobjektiv beobachtet, wobei man Kontrastphasen-Beleuchtung verwendet. Zusätzlich zu diesen Konidien sind dickwandige, endständige Makrosporen (4, 9 x 3, 5 f. J,) an einigen Hyphen, die 100 x 3 J. l. lang sind, erkenntlich und die frei aus der Mycelmatte entstehen.
Auf Lösungsagar nach Czapek können die Kolonien bei 26 C in 10 Tagen Durchmesser von 32 mm erreichen, wobei danach kaum oder ein beschränktes weiteres Wachstum nach aussen beobachtet wird. Sie sind relativ flach, mit einer samtartigen bis flockigen Oberfläche und mässig funiculär. Die Oberfläche und Suboberflächen wachsen lederartig. Die Suboberflächen bilden Fächer heraus, die die Kolonie scharf begrenzen.
Nach 5Tagen sind die Kolonien weiss und werden gelblich-weiss (ISCC-NBS, 92) und nach 10 Tagen tragen sie
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nung. Die Umkehrfarbe ist dunkel-gelblich-grün (ISCC-NBS, 137), civettgrün (Maerz und Paul, 22-F-8).
Nach 3 Wochen ist die Umkehrfarbe hell-gelb-grun (ISCC-NBS, 119), rot-grün (Maerz und Paul, 19-D-1).
Die Konidienstrukturen variieren von einzelnen Sterigmata, die entweder spitz sind oder stark divergent
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ta, die an der Spitze angeordnet sind.
Gelegentlich sind eine oder zwei Windungen aus Sterigmata vorhanden, die die Konidlophoren unter dem
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Breite längs der breitesten Fläche gemessen wird. Die einzelnen divergenten Sterigmata können 20 g erreichen.
Die Konidiophoren bilden sich gabelnde Verzweigungen und diese Verzweigungen können Subverzweigungen bilden. Die Konidiophoren sind glattwandig und 2 bis 4 g breit. Lange Ketten aus hyalinen, seeigelartigen bis kleinstacheligen Konidien, die durch eine Verbindungsbrücke verbunden sind, entstehen aus den Sterigmata. In der Masse sind diese Konidien schwach rosa. Sie sind subkugelformig bis elliptisch und sind
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Das Zentrum kann gesprenkelt sein und die Kolonie kann sich nach aussen in strahlenförmig verlaufenden Falten erstrecken.
Ein fast weisser, 3 mm, samtartiger Rand - schwach gelb-grün (ISCC-NBS, 121), see- schaumgrün (Maerz undPaul, 18-A -1) - ergibt ein flockiges bis samtartiges Zentrum, das hell-grünlich-grau (ISCC-NBS, 154), flechtenartig grün (Maerz und Paul, 26-A-2) ist. Die umgekehrte Seite ist mit Ringen oder Streifen versehen, im Zentrum grünlich-gelb und von einem konzentrischen Ringmuster umgeben, das hellgelblich-grün (ISCC-NBS, 115) tibergriin (Maerz und Paul, 18-E-6) ist.
Die Formen und Muster der Konidien, Sterigmata und Konidiophoren sind so wie zuvor beschrieben. Die Konidien bezitzenbreiten imbereich von 2, 1 bis 3, 5 g und Längen im Bereich von 2, 8 bis 4, 9 jan, die durch-
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breit, die durchschnittliche Grösse beträgt 13, 2 x 3, ,u. Die Konidiophoren und Verzweigungen sind genauso wie auf Agar nach Czapek. Zusätzlich werden einzelne Makrosporen, die als Aleurosporen bezeichnet werden können, an der Spitze der Hyphenfilamente gebildet, die aus dem Agar und der wuchernden Lufthyphenmatte entstehen zu scheinen.
Auf Kartoffel-Dextrose-Agar tritt eine ähnliche Wachstums geschwindigkeit auf. Die Kolonie ist geringRigig gekerbt. Das Zentrum ist etwas flockig, fast ein samtartiger Filz, der ebenfalls etwas funiculär ist und es wird von einer Kreisperipherie umgeben, die aus kurzen Lufthyphen besteht. Das Zentrum ist gelb- lich-grau (ISCC-NBS, 93), gefärbt wie Holzasche (Maerz und Paul, 27-A-l) ; die Peripherie ist mittelgrau (ISCC-NBC, 265), platinfarben (Maerz und Paul, 45-A-3). Die Umkehrfarbe ist gräulich-olivgrün (ISCC- NBS, 127), bronzegrün (Maerz und Paul, 16-J-7).
DieBeziehungvonA13215zuP. carneus, Duchel undHeim, ist unmissverständlich wie vonA. H. S. Brown and J. Smith in "The Genus Paecilomyces Banier...", Trans. Brit. Mycol. Soc. 40 (1), 17-89 [1957] beschrieben. A13215-Sterigmata erscheinen möglicherweise länger zu sein. Die Aleurosporen, die auf Kartoffel-DextroseAgar beobachtet werden, wurden auch bei andern Paecilomyces species beobachtet, wie es von Raper und Thom in the Manual of the Penicilli beschrieben ist.
Weitere Penicillin N bildende Kulturen, die bei dem erfindungsgemässen Verfahren, bedingt durch ihre taxonomischen Ähnlichkeiten mit Paecilomyces carneus NRRL 5711 verwendet werden können, wurden als Glieder der Gattung Paecilomyces klassifiziert. Zwei solche Kulturen sind als Paecilomyces carneus A. T. C. C. 16329 und P. carneus NRRL 2622 identifiziert.
Die erfindungsgemäss verwendeten Paecilomyces carneus-Mikroorganismen besitzen wie die oben beschriebenen Fungi die morphologischen Eigenschaften der Bildung von Phiolensporen aus Phialiden, die entweder einzeln aus Hyphen oder aus verzweigten oder unverzweigten Konidiophoren gebildet werden.
Zwei der oben beschriebenen Stämme von Paecilomyces wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Ver-
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Research Serive, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt, wo den Kulturen die bei der zuvor angegebenen taxanomischen Beschreibung nach dem Namen der entsprechenden Kultur aufgeführten Zahlen als Eingangszahlen zugeordnet wurden.
Die restliche Kultur, die die letztere Bezeichnung ATCC besitzt, nämlich Paecilomyces carneus ATCC 16329, wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Verfügbarkeit bei der permanenten Kulturkollektion von American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt.
Wie zuvor erwähnt, wird ein Mikroorganismus, der bei der Erfindung verwendet wird, nach einem submersen aeroben Fermentationsverfahren kultiviert. Das Kulturmedium, das verwendet werden kann, kann irgendeines einer Anzahl von unterschiedlichen Medien sein. Beispielsweise kann man verschiedene Kohlenstoffquellen verwenden wie Saccharose, Glucose, Stärke und ähnliche Kohlenstoffquellen. Ähnlich kann man die Stickstoffquellen aus einer Vielzahl von Verbindungen auswählen wie Sojabohnenmehl, Sojabohnengriess oder -staub, Baumwollsamenöl, Erdnussmehl, Aminosäuren, Aminosäuremischungen, Peptonenu. ähnl.
Aus Wirschaftlichkeitsgründen bei der Herstellung, wegen der maximalen Ausbeute und der leichten Isolierung sind bestimmte Medien bevorzugt, beispielsweise sind Melassen eine bevorzugte Quelle von Kohlenhydraten, und bevorzugte Quellen von Stickstoff sind Sojabohnenmehl und Aminosäuren.
Anorganische Nährsalze, die in das Kulturmedium einverleibt werden können, umfassen die gewöhnli-
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chen Salze, die fähig sind,'Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-,
Bromid-, Nitrat-, Carbonat-, Eisen- (n)-, Eisen- (m)-, Magnesium-, Mangan-Ionen und ähnliche Ionen zu ergeben. Die erfindungsgemässen Fungi erfordern ähnlich wie andere Mikroorganismen, die Antibiotika er- geben, bestimmte unentbehrliche Spurenelemente für das Wachstum, Ihre Entwicklung und ihren Metabolis- mus. Solche Spurenelemente können zu dem Fermentationsmedium zugegeben werden, jedoch sind sie im allgemeinen in ausreichender Menge als Verunreinigungen in den andern Bestandteilen vorhanden, die zu dem Kulturmedium zugefügt werden.
Die erfindungsgemäss verwendeten Paecilomyces-Mikroorganismen können in Vorrichtungen kleiner
Grösse wie in 11-Schüttelkolben kultiviert werden, wobei man geringe Mengen an Deacetoxycephalosporin C erhält. Für eine Herstellung der Cephalosporinverbindungen in grösserem Massstab werden die Mikroorganis- men in Fermentationstanks in grösserem Massstab unter submersen, aeroben Fermentationsbedingungen kul- tiviert.
Bei derHerste1lung vonDeacetoxycephalosporin C in grösseremMassstab werden die Sporen der Organis- men auf einer Agar-Schrägfläche gehalten. Die Sporen aus der Schrägfläche werden verwendet, um ein vegetatives Medium mit geringem Volumen zu inokulieren. Das vegetative Medium wird inkubiert, wobei man eine starke frische, tiefwachsende Kultur des Mikroorganismus erhält. Dieses vegetative Wachstum wird dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in grösserem Massstab verwendet.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, weiteres vegetatives Medium als Inokulum fUr das Fermentationsmedium zu verwenden. Solche vegetativen Medien der zweiten Stufe oder Organmedien werden im allgemeinen verwendet, wenn das Volumen des Fermentationsmediums signifikant oder wesentlich grösser ist als das Volumen des ersten vegetativen Mediums. Auf diese Weise werden die Sporen der Organismen zuerst in einem geringen Volumen an vegetativem Medium kultiviert, wobei man das Inokulum für ein vegetatives Medium mit grösserem Volumen erhält.
Das vegetative Medium mit grösserem Volumen bildet dann eine ausreichende Konzentration an Organismus, um einen schnellen Beginn der Fermentation in einem Fermentationstank in grossem Massstab zu initieren. Das vegetative Medium kann die gleiche Zusammensetzung wie das Fermentationsmedium besitzen, oder es kann zusätzliche Bestandteile enthalten, um das Wachstum und die Bildung der Organismen in kleinem Massstab zu unterstützen.
Es wurde beobachtet, dass die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen Deacetoxycephalosporin C innerhalb eines pH-Bereiches von ungefähr pH 6, 2 bis ungefähr pH 8, 0 züchten und bilden. Während der submersen, aeroben Fermentation in Tanks in grossem Massstab nimmt der PlI-Wert des Mediums von einem Anfangs-pH-Wert von ungefähr 6, 5 auf einen End-pH-Wert von ungefähr 7, 5 zu.
Die erfindungsgemäss verwendeten Mikroorganismen können bei Temperaturen zwischen ungefähr 20 und 350C gezüchtet werden. Das Deaoetoxycephalosporin C scheint bei einer Temperatur von ungefähr 26 C in optimalen Ausbeuten gebildet zu werden.
Die maximaleBildungvon Deacetoxycephalosporin C tritt auf, wenn der Organismus in Tanks in grossem Massstab während einer Zeit zwischen ungefähr 4 und 7 Tagen gezüchtet wird. Wenn man jedoch in Vorrichtungen in kleinerem Massstab züchtet, wie in 11-Schüttelkolben, verläuft das Wachstum der Organismen schneller und Deacetoxycephalosporin C wird in einer kürzeren Zeit, beispielsweise während 2 oder 3 Tagen, gebildet.
Da der End-pH-Wert in Fermentationsmedium in grossem Massstab einen Wert von PH 8, 0 oder höher zu
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boliten. Einige der zuvor erwähnten Verbindungen sind säurelabil. Es ist daher bei der Gewinnung von
Deacetoxycephalosporin C aus dem Fermentationsmedium wünschenswert, das gesamte Fermentationsme- dium für kurze Zeit bei einem sauren pH-Wert zu behandeln, um einen Teil der mitgebildeten Verunreini- gungen zu zerstören. Bei Fermentationen in kleinem Massstab kann das Penicillin N durch die Zugabe einer
Penicillinase zu dem Medium zerstört werden.
Das Deacetoxycephalosporin C-Fermentationsprodukt wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe, die so behandelt wurde, gewonnen und von den andern Bestandteilen des Fermentationsmediums durch Chroma- tographie über einem Ionenaustauschharz abgetrennt. Es wird weiter durch Chromatographie über Cellulose oder Silikagel gereinigt und anschliessend ausgefällt und umkristallisiert.
Zu Beginn wird das filtrierte Fermentationsmedium einem vorläufigen Reinigungsverfahren unterwor- fen, wobei eine erste Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie n-Butanol, Amylacetat erfolgt, um Verunreinigungen zu entfernen. Das extrahierte Medium kann dann weiter vorbereitet werden, durch Chromatographie über aktiviertem Kohlenstoff gereinigt werden. Das extrahierte
Medium wird über einer Säule chromatographiert, die mit aktiviertem Kohlenstoff, beispielsweise Pittsburgh
12 x 40 Kohlenstoff, gepackt ist und die Säule wird dann mit Wasser gewaschen, um wasserlösliche, ge- färbte Verunreinigungen und wasserlösliche anorganische Stoffe zu entfernen.
Die Fermentationsprodukte werden dann mit 50%igem Aceton-Wasser von dem Kohlenstoff eluiert. Das
Eluat wird zu einer wässerigen Phase konzentriert, die dann über einem basischen, anionischen Austausch- harz chromatographiert wird. Unter den basischen anionischen Austauschharzen, die verwendet werden kön- nen, sind solche der Polystyrol quaternären Ammoniumart, beispielsweise solche, die im Handel unter den
Bezeichnungen Dowex 1, Dowex 2 (Dow Chemical Co., Midland, Mich. ) und solche, die unter den Bezeichnungen IRA-400, IRA-45, IRA-68 (Amberlite, Rohm and Haas, Philadelphia, Pa. ) erhältlich sind.
Die Harze können in dem Hydroxylzyklus, dem Acetatzyklus, dem Formiatzyklus oder andern geeig- neten Zyklen vorliegen bzw. verwendet werden. Das konzentrierte Eluat aus der Kohlenstoffsäure wird auf das anionische Austauschharz gegeben und dann wird das Harz mit Wasser gewaschen. Das Deacetoxycephalosporin C wird aus demAustauschharz inSalzform mit einer geeigneten schwachen Base eluiert, beispielsweise ist das Elutionslösungsmittel wünschenswerterweise, wenn die Säule im Acetatzyklus verwendet wird, eine wässerige Lösung aus Natriumacetat in einer Konzentration von ungefähr In oder geringer.
Die Konzentration der Natriumacetatlösung ist nicht kritisch. Um jedoch die Anwesenheit von überschüssigem anorganischem Salz (Natriumacetat) im Eluat aus der Austauschsäule zu vermeiden, liegt die wünschenswerte Konzentration an Natriumacetat zwischen ungefähr 0, In und 0, 5n. Eine besonders bevorzugte Konzentration für die Eluierung, die überschüssiges Salz in dem Eluat vermeidet, beträgt 0, 15n. Wird das Austauschharz in dem Formiatzyklus oder bei andern geeigneten Zyklen verwendet, so kann das entsprechende Salz in wässeriger Lösung als Elutionslösungsmittel verwendet werden. Beispielsweise kann man Ammoniumformiat verwenden, wenn das Harz in dem Formiatzyklus vorliegt.
Viele Fraktionen werden gesammelt und die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthalten, bestimmt durch Bioautogramm, werden vereinigt. Die vereinigten Eluate werden dann über aktiviertem Kohlenstoff chromatographiert, über überschüssige anorganische Salze, beispielsweise Natriumacetat, das als Salzlösung zum Eluieren verwendet wurde, zu entfernen. Die Kohlenstoffsäule wird mit Wasser gewaschen, um diese anorganischen wasserlöslichen Salze zu entfernen und das DeacetoxycephalosporinC wird dann aus der Säule mit einer 50%igen Aceton-Wasser-Mischung entfernt. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft oder, alternativ, wird das Aceton abdestilliert und die konzentrierte wässerige Lösung wird lyophili- siert, wobei man bei beiden Verfahren Deacetoxycephalosporin C als festes Rohprodukt erhält.
Die rohe Präparation von Deacetoxycephalosporin C wird durch Chromatographie über Cellulose oder Silikagel oder über andere geeignete nicht ionische Adsorbentien weiter gereinigt. Das Deaoetoxycephalosporin C wird aus der Säule mit Aceton : Wasser, 80 : 20, eluiert und viele Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C, bestimmt durch Papierchromatographie oder Bioautogramm, unter Verwendung eines Versuchsorganismus von Pseudomonas solanacearcum enthalten, werden vereinigt und auf ein geringes Volumen konzentriert oder bis zur Trockne eingedampft.
Der stark konzentrierte wässerige Rückstand oder der trockene Rückstand wird dann in einer minimalen Menge an Isopropylalkohol gelöst und die alkoholische Lösung wird in ein grosses Volumen an Diäthyl- äther gegossen. Das gereinigte Deacetoxycephalosporin C wird in Form des Salzes, das dem wässerigen Elutionsmittel, das man bei der Elution des anionischen Austauschharzes verwendet hatte, entspricht, erhalten. Wenn beispielsweise Natriumacetat als Elutionsmittel verwendet wurde, wird das Deacetoxycephalo- sporin C als Mononatriumsalz erhalten. Die Salzform des Deacetoxycephalosporins C wird filtriert und getrocknet.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendet man bevorzugt bei der Isolierung die folgenden Bedingungen. Die gesamte Fermentationsbrühe wird auf einen PlI-Wert von 2 durch ZugabevonSchwefelsäure
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Lactose <SEP> 1
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Sojapepton <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> lösliche <SEP> Stoffe, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Trocknen <SEP> von <SEP> Getreide <SEP> und
<tb> Malzextrakten <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Eisen- <SEP> (II) <SEP> -sulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Spuren <SEP> Minerallösung <SEP> 3 <SEP> 0,
<SEP> 625 <SEP>
<tb> Agar <SEP> 2
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
1. Enzymatischer Auszug von Sojabohnenmehl 2."Produlac", National Distillers Products Co.
3. Die Lösung enthält die folgenden Salze pro 100 ml entionisiertem
Wasser :
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<tb>
<tb> Gewicht <SEP> Salz
<tb> 0, <SEP> 102g <SEP> CuSO <SEP> . <SEP> 5H <SEP> O
<tb> 0, <SEP> 018 <SEP> g <SEP> FeSO4#7H2O
<tb> 0, <SEP> 126g <SEP> MnCl <SEP> '20
<tb> 0, <SEP> 024 <SEP> g <SEP> ZnSO4#7H2O
<tb>
Die Schrägplatten wurden während 7 Tagen bei einer Temperatur von 260C inkubiert. Die reifen Schrägkulturen wurden mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und mit einem sterilen Stab leicht gekratzt, wobei man die Sporensuspensionen erhielt.
Die Sporensuspensionen, die so erhalten wurden, wurden jeweils verwendet, um zwei getrennte sterile Wachstumsmedien der folgenden Zusammensetzung zu inokulieren :
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<tb>
<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Malzextrakt <SEP> 2
<tb> Maiswasser <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dikaliumhydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Calciumchloriddihydrat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> Spur <SEP> Minerallösung <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> gewünschte <SEP> Volumen
<tb>
1. Fussnote 3 wie oben
Der pH-Wert des vegetativen Mediums wurde vor der Behandlung in dem Autoklaven auf pH 6, 5 eingestellt.
Die inokulierten vegetativen Medien wurden bei einer Temperatur von 260C auf einer Rotations schüttelvorrichtung mit 250 Umdr/min mit einer Weite von 5, 08 cm während 48 h inkubiert.
Die inkubierten vegetativen Medien wurden dann als Inokulum für das Fermentationsmedium in einem Verhältnis von 1% vegetativem Medium pro Volumen Fermentationsmedium verwendet. Die sterilen Produktionsmedien, die verwendet wurden, hatten die folgende Zusammensetzung :
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<tb> Bestandteile <SEP> % <SEP> (Gew./Vol)
<tb> Saccharose <SEP> 4
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Natriumglutamat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Erdnussmehl <SEP> 2
<tb> Eisen- <SEP> )-ammoniumsulfathexahydrat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Kaliumnitrat <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> das <SEP> Volumen
<tb>
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Wasser gewaschen, um lösliche anorganische Stoffe, beispielsweise Natriumacetat, zu entfernen. Danach wurde die Säule mit 50%igem wässerigen Aceton eluiert.
Das Eluat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man eine rohe feste Präparation von Deacotoxycephalosporin C-natriumsalz erhielt.
Das rohe Material wurde weiter durch Chromatographie über einer Säule gereinigt, die mit Cellulose (Avicel pH 101) gepackt war. Das Antibiotikum wurde aus der Cellulosesäule mit einer Losungsmittelml- schung, die Acetonitril : Wasser (80 : 20) enthielt, eluiert. Es wurden viele Fraktionen gesammelt und dann wurden die Fraktionen, die Deacetoxycephalosporin C enthielten, vereinigt, wobei man zur Feststellung das oben beschriebene Chromatographiesystem verwendete.
Die vereinigten Fraktionen wurden dann zur Trockne eingedampft und der trockene Rückstand, der Deacetoxycephalosporin C enthielt, wurde in einer minimalen Menge Isopropanol gelöst. Die Alkohollösung wurde in eine Äthermenge gegossen, die ungefähr das 20-fache Volumen der Isopropanollösung hatte. Unter Rühren bildete sich das Natriumsalz von Deacetoxycephalosporin C als Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet, wobei man 126 mg des Antibitikums als Natriumsalz erhielt.
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Bei s pie I 2 : - In analoger Weise wie im Beispiel l angegeben wurde unter Anwendung der beschriebenen Medien, Kulturverfahren und Gewinnungsverfahren gearbeitet, jedoch an Stelle von Paecilomyces
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ten Fermentationsmedium ein Deacetoxycephalosporin C-Gehalt von 30 bis 40'Y/ml festgestellt.
Beispiel 3 : In analoger Weise wie im Beispiel 1 angegeben wurde unter Anwendung der beschrie benen Medien, Kulturverfahren und Gewinnungsverfahren gearbeitet, jedoch an Stelle von Paecilomyces carneus NRRL 5711 eine Kultur von Paecilomyces carneus NRRL 2622 eingesetzt. Dabei wurde im filtrierten Fermentationsmedium ein Deacetoxycephalosporin C-Gehalt von 75 bis 100 y/ml festgestellt.
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The invention relates to a process for the production of deacetoxycephalosporin C.
The German Offenlegungsschrift 1492053 describes a method for obtaining C ephalosporin C, penicillin N or Cephalosporin P by means of an Emericellopsis-Cephalosporium culture. In this method, the microorganism is cultivated in continuous culture in a state of equilibrium, with growth-limiting nutrients being adjusted in each case to the value by which the formation of the antibiotics is favored.
In the process according to the invention for the production of deacetoxycephalosporin C, Paecilomyces carneus are in an aqueous culture medium under submerged, aerobic fermentation conditions
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A substantial amount of deacetoxycephalosporin C is formed by the microorganism in the culture medium, whereupon the deacetoxycephalosporin C is isolated from the culture medium.
The cephalosporin compound deacetoxycephalosporin C is represented by the following structural formula:
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The mycelium and other insolubles are filtered off and the filtered culture medium is mixed with
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to remove. The deacetoxycephalosporinC is obtained from the aqueous semi-purified culture medium by chromatography in the following way (When speaking of culture medium or culture solution in the cultivation of microorganisms, this is understood to mean the medium obtained in the cultivation. This can also simply be as " Broth ". The word" medium "is used in this context in the sense of the English word" broth ".): The aqueous medium is first over
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Chromatographed activated carbon.
The column charged with activated charcoal is washed with water to further remove impurities and then the activity is eluted with 50% aqueous acetone.
The eluate is concentrated and passed over an anionic exchange resin. The deacetoxycephalosporin C is eluted therefrom, preferably with a 0.15N sodium acetate solution.
The eluates are then evaporated to dryness or lyophilized to give a crude deaoetoxycephalosporin C preparation. The raw material is purified by further chromatography on a cellulose column or on silica gel. The active fractions containing deacetoxycephalosporin C are either concentrated to a low volume or evaporated to dryness. The concentrate or dry solid residue is dissolved in a minimal amount of isopropanol and the solution is poured into diethyl ether to precipitate deacetoxycephalosporin C as the sodium salt. The microorganisms which are useful in the method according to the invention have been classified as members of the class Fungi imperfect because they do not form sexual spores.
They were further classified into the Moniliales genus, the Moniliaceae family, and the Paecilomyces genus.
The above classification of the microorganisms useful in the invention is based on the observed morphological and cultural characteristics. The following sections provide a taxonomic description of the microorganism Paecilomyces carneus NRRL 5711. The reference to "Maerz
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refers to Book Co., Inc., New York [1950].
Morphology and cultural characteristics of Paecilomyces.
Paecilomyces carneus NRRL 5711 (A 13215):
A 13215 is classified as a strain of Paecilomyces carneus (Duchel and Heim) in the order Moniliales.
The colonies are generally velvety to flaky and the depth of the air felt varies according to the substrate. The growth on solution agar according to Czapek is relatively thin and somewhat funicular. The colonies are generally colorless and become somewhat discolored as the conidia develop. The peripheries are sometimes slightly notched or sawed, and on Czapek agar they are accentuated by a band of deeply submerged mycelium. The reversal colors range from bright greenish tones to yellow tints, and brown tints appear in some media.
The branched conidiophores, which are 100 to 300 years long, arise from agar or from proliferating aerial hyphae. Bifurcating branches can reach lengths of 40 y. Kick frequently
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in numerous kinds on the conidiophores and their branches. They can be pointed as a single stigma or in whorls of up to 5. They can be used as turns along the main axis with internodes from 5 to 20 J. l. occur. In general, the sterigmata in whorls are highly divergent. Metuals are less common, but sometimes they appear in whorls with only a single sterigma attached. The individual sterigmata, which are strongly divergent, often appear longer along the conidlophora and its branches.
The form of the Sterigmata typifies the genus. They are always long-chain and are practically cylindrical from their base to about 75% of their length, where they taper more sharply and form a long, thin tube about 5.0 x 0.5 J. l. form.
The conidia are unicellular, sub-spherical to elliptical, dry and finely roughened and sea urchin-like to small prickly. They form in long chains and the spores seem to be held together by a connecting bridge, some of which can be recognized by the free conidia as small, drooping lobes that are less than 1 u long and 1 u wide. These surface properties are best observed on an oil immersion objective using contrast phase lighting. In addition to these conidia, thick-walled, terminal macrospores (4, 9 x 3, 5 f. J,) are found on some hyphae that are 100 x 3 years old. are long, recognizable and which arise freely from the mycelium mat.
On solution agar according to Czapek, the colonies can reach a diameter of 32 mm in 10 days at 26 C, after which hardly any or limited further growth outward is observed. They are relatively flat, with a velvety to flaky surface and moderately funicular. The surface and sub-surfaces grow leather-like. The sub-surfaces form compartments that sharply delimit the colony.
After 5 days the colonies are white and turn yellowish-white (ISCC-NBS, 92) and after 10 days they wear
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tion. The reverse color is dark yellowish green (ISCC-NBS, 137), civett green (Maerz and Paul, 22-F-8).
After 3 weeks the reverse color is light yellow-green (ISCC-NBS, 119), red-green (Maerz and Paul, 19-D-1).
The conidial structures vary from individual sterigmata, which are either pointed or strongly divergent
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ta, which are arranged at the top.
Occasionally one or two coils of sterigmata are present, which the conidlophora under the
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Width is measured along the widest surface. The individual divergent sterigmata can reach 20 g.
The conidiophores form bifurcated branches and these branches can form sub-branches. The conidiophores are smooth-walled and 2 to 4 g wide. Long chains of hyaline, sea urchin-like to small-prickly conidia, which are connected by a connecting bridge, arise from the sterigmata. In bulk these conidia are pale pink. They are subspherical to elliptical and are
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The center can be speckled and the colony can extend outward in radial folds.
An almost white, 3 mm, velvety edge - pale yellow-green (ISCC-NBS, 121), sea foam green (Maerz andPaul, 18-A -1) - results in a flaky to velvety center that is light-greenish-gray ( ISCC-NBS, 154), lichen-like green (Maerz and Paul, 26-A-2). The reverse side is provided with rings or stripes, greenish-yellow in the center and surrounded by a concentric ring pattern that is light yellowish-green (ISCC-NBS, 115) over green (Maerz and Paul, 18-E-6).
The shapes and patterns of the conidia, sterigmata and conidiophores are as previously described. The conidia are in the range from 2, 1 to 3, 5 g and lengths in the range from 2, 8 to 4, 9 jan, the through-
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wide, the average size is 13, 2 x 3,, u. The conidiophores and branches are the same as on agar according to Czapek. In addition, individual macrospores, which can be referred to as aleurospores, are formed at the tip of the hyphae filaments, which seem to arise from the agar and the overgrown aerial hyphae mat.
A similar rate of growth occurs on potato dextrose agar. The colony is slightly notched. The center is somewhat flaky, almost a velvety felt, which is also somewhat funicular and it is surrounded by a circular periphery, which consists of short aerial hyphae. The center is yellowish-gray (ISCC-NBS, 93), colored like wood ash (Maerz and Paul, 27-A-l); the periphery is medium gray (ISCC-NBC, 265), platinum colored (Maerz and Paul, 45-A-3). The reverse color is greyish-olive green (ISCC-NBS, 127), bronze green (Maerz and Paul, 16-J-7).
The relationship of A13215 to P. carneus, Duchel andHeim, is unmistakably like vonA. H. S. Brown and J. Smith in "The Genus Paecilomyces Banier ...", Trans. Brit. Mycol. Soc. 40 (1), 17-89 [1957]. A13215 sterigmata may appear to be longer. The aleurospores observed on potato dextrose agar have also been observed in other Paecilomyces species as described by Raper and Thom in the Manual of the Penicilli.
Further cultures which produce penicillin N, which can be used in the method according to the invention, due to their taxonomic similarities with Paecilomyces carneus NRRL 5711, were classified as members of the genus Paecilomyces. Two such cultures are identified as Paecilomyces carneus A. T. C. C. 16329 and P. carneus NRRL 2622.
The Paecilomyces carneus microorganisms used according to the invention, like the fungi described above, have the morphological properties of the formation of vial spores from phialides, which are formed either individually from hyphae or from branched or unbranched conidiophores.
Two of the above-described strains of Paecilomyces were used without restriction on the ver
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Research Serive, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, where the numbers listed in the taxanomic description given above after the name of the corresponding culture were assigned as input numbers to the cultures.
The remainder of the culture, bearing the latter designation ATCC, Paecilomyces carneus ATCC 16329, has been deposited with the permanent culture collection of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, with no limitation on availability.
As mentioned above, a microorganism used in the invention is cultured by a submerged aerobic fermentation process. The culture medium that can be used can be any of a number of different media. For example, one can use various carbon sources such as sucrose, glucose, starch and similar carbon sources. Similarly, the nitrogen sources can be selected from a variety of compounds such as soybean meal, soybean meal or dust, cottonseed oil, peanut flour, amino acids, amino acid mixtures, peptones, etc. similar
For reasons of economy in manufacture, maximum yield and ease of isolation, certain media are preferred, for example molasses are a preferred source of carbohydrates and preferred sources of nitrogen are soybean meal and amino acids.
Inorganic nutrient salts that can be incorporated into the culture medium include the usual
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Chen salts that are capable of 'sodium, potassium, ammonium, calcium, phosphate, sulfate, chloride,
Bromide, nitrate, carbonate, iron (n) -, iron (m) -, magnesium, manganese ions and similar ions. The fungi according to the invention, like other microorganisms which produce antibiotics, require certain indispensable trace elements for growth, their development and their metabolism. Such trace elements can be added to the fermentation medium, but they are generally present in sufficient quantities as impurities present in the other ingredients that are added to the culture medium.
The Paecilomyces microorganisms used according to the invention can be smaller in devices
Size as cultivated in 11 shake flasks, small amounts of deacetoxycephalosporin C being obtained. For the production of the cephalosporin compounds on a larger scale, the microorganisms are cultivated in fermentation tanks on a larger scale under submerged, aerobic fermentation conditions.
In the production of deacetoxycephalosporin C on a larger scale, the spores of the organisms are held on an agar inclined surface. The spores from the bevel are used to inoculate a low volume vegetative medium. The vegetative medium is incubated, resulting in a strong, fresh, deep-growing culture of the microorganism. This vegetative growth is then used as an inoculum for the fermentation medium on a larger scale.
In some cases it may be desirable to use additional vegetative medium as an inoculum for the fermentation medium. Such second stage vegetative media or organ media are generally used when the volume of the fermentation medium is significantly or substantially greater than the volume of the first vegetative medium. In this way, the spores of the organisms are first cultivated in a small volume of vegetative medium, the inoculum for a vegetative medium having a larger volume being obtained.
The larger volume vegetative medium then forms a sufficient concentration of organism to initiate a rapid start of fermentation in a fermentation tank on a large scale. The vegetative medium can be of the same composition as the fermentation medium, or it can contain additional ingredients to support the growth and formation of the organisms on a small scale.
It was observed that the microorganisms used according to the invention breed and form deacetoxycephalosporin C within a pH range from approximately pH 6.2 to approximately pH 8.0. During large-scale submerged, aerobic fermentation in tanks, the PlI of the medium increases from an initial pH of about 6.5 to a final pH of about 7.5.
The microorganisms used according to the invention can be grown at temperatures between approximately 20 and 350 ° C. The deaoetoxycephalosporin C appears to be formed in optimal yields at a temperature of about 26 ° C.
The maximum formation of deacetoxycephalosporin C occurs when the organism is grown in large-scale tanks for a period between about 4 and 7 days. However, when growing in smaller scale devices, such as 11 shake flasks, the organisms grow faster and deacetoxycephalosporin C is formed in a shorter time, for example 2 or 3 days.
Since the final pH value in fermentation medium on a large scale has a value of PH 8, 0 or higher
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bolites. Some of the aforementioned compounds are acid labile. It is therefore in the extraction of
Deacetoxycephalosporin C from the fermentation medium is desirable to treat the entire fermentation medium for a short time at an acidic pH value in order to destroy some of the impurities which are also formed. In small-scale fermentations, penicillin N can be removed by adding a
Penicillinase to be destroyed in the medium.
The deacetoxycephalosporin C fermentation product is obtained from the filtered fermentation broth, which has been treated in this way, and separated from the other constituents of the fermentation medium by chromatography over an ion exchange resin. It is further purified by chromatography over cellulose or silica gel and then precipitated and recrystallized.
At the beginning, the filtered fermentation medium is subjected to a preliminary purification process, a first extraction with a water-immiscible organic solvent such as n-butanol or amyl acetate being carried out in order to remove impurities. The extracted medium can then be further prepared, purified by chromatography over activated carbon. That extracted
Medium is chromatographed over a column filled with activated carbon, e.g. Pittsburgh
12 x 40 carbon, and the column is then washed with water to remove water-soluble, colored impurities and water-soluble inorganics.
The fermentation products are then eluted from the carbon with 50% acetone-water. The
Eluate is concentrated to an aqueous phase, which is then chromatographed over a basic, anionic exchange resin. Among the basic anionic exchange resins that can be used are those of the polystyrene quaternary ammonium type, for example those commercially available under the
Designations Dowex 1, Dowex 2 (Dow Chemical Co., Midland, Mich.) And those available under the designations IRA-400, IRA-45, IRA-68 (Amberlite, Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.).
The resins can be present or used in the hydroxyl cycle, the acetate cycle, the formate cycle or other suitable cycles. The concentrated eluate from the carbon acid is added to the anion exchange resin, and then the resin is washed with water. The deacetoxycephalosporin C is eluted from the exchange resin in salt form with a suitable weak base, for example the eluting solvent desirably when the column is used in the acetate cycle is an aqueous solution of sodium acetate at a concentration of about In or less.
The concentration of the sodium acetate solution is not critical. However, in order to avoid the presence of excess inorganic salt (sodium acetate) in the eluate from the exchange column, the desirable concentration of sodium acetate is between about 0. In and 0.5n. A particularly preferred concentration for the elution, which avoids excess salt in the eluate, is 0.15n. If the exchange resin is used in the formate cycle or in other suitable cycles, the corresponding salt in aqueous solution can be used as the elution solvent. For example, ammonium formate can be used when the resin is in the formate cycle.
Many fractions are collected and the fractions containing deacetoxycephalosporin C as determined by bioautograph are pooled. The combined eluates are then chromatographed over activated carbon to remove excess inorganic salts, e.g. sodium acetate, which was used as the salt solution for the elution. The carbon column is washed with water to remove these inorganic water-soluble salts and the deacetoxycephalosporin C is then removed from the column with a 50% acetone-water mixture. The eluate is evaporated to dryness or, alternatively, the acetone is distilled off and the concentrated aqueous solution is lyophilized, deacetoxycephalosporin C being obtained as a solid crude product in both processes.
The crude preparation of deacetoxycephalosporin C is further purified by chromatography over cellulose or silica gel or other suitable non-ionic adsorbents. The deaoetoxycephalosporin C is eluted from the column with acetone: water, 80:20, and many fractions are collected. The fractions containing deacetoxycephalosporin C as determined by paper chromatography or bioautograph using a test organism of Pseudomonas solanacearcum are pooled and concentrated to low volume or evaporated to dryness.
The highly concentrated aqueous residue or the dry residue is then dissolved in a minimal amount of isopropyl alcohol and the alcoholic solution is poured into a large volume of diethyl ether. The purified deacetoxycephalosporin C is obtained in the form of the salt which corresponds to the aqueous eluent which was used in the elution of the anionic exchange resin. For example, if sodium acetate was used as the eluent, the deacetoxycephalosporin C is obtained as the monosodium salt. The salt form of deacetoxycephalosporin C is filtered and dried.
In the process according to the invention, the following conditions are preferably used for the isolation. The entire fermentation broth is brought to a PII value of 2 by adding sulfuric acid
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<tb>
<tb> Ingredients <SEP>% <SEP> (w / v)
<tb> lactose <SEP> 1
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Soy peptone <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> soluble <SEP> substances, <SEP> get <SEP> through
<tb> drying <SEP> of <SEP> grain <SEP> and
<tb> Malt extracts <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Iron <SEP> (II) <SEP> sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Calcium carbonate <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> traces <SEP> mineral solution <SEP> 3 <SEP> 0,
<SEP> 625 <SEP>
<tb> agar <SEP> 2
<tb> water <SEP> on <SEP> the <SEP> desired <SEP> volume
<tb>
1. Enzymatic extract of soybean meal 2. "Produlac", National Distillers Products Co.
3. The solution contains the following salts per 100 ml deionized
Water :
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<tb>
<tb> weight <SEP> salt
<tb> 0, <SEP> 102g <SEP> CuSO <SEP>. <SEP> 5H <SEP> O
<tb> 0, <SEP> 018 <SEP> g <SEP> FeSO4 # 7H2O
<tb> 0, <SEP> 126g <SEP> MnCl <SEP> '20
<tb> 0, <SEP> 024 <SEP> g <SEP> ZnSO4 # 7H2O
<tb>
The inclined plates were incubated for 7 days at a temperature of 260C. The mature slants were covered with sterile distilled water and gently scratched with a sterile stick to obtain the spore suspensions.
The spore suspensions thus obtained were each used to inoculate two separate sterile growth media of the following composition:
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<tb>
<tb> Ingredients <SEP>% <SEP> (w / v)
<tb> peanut flour <SEP> 2
<tb> Malt extract <SEP> 2
<tb> Corn water <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Magnesium sulfate heptahydrate <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> Potassium dihydrogen phosphate <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Dipotassium hydrogen phosphate <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Calcium chloride dihydrate <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP>
<tb> track <SEP> mineral solution <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 625 <SEP>
<tb> water <SEP> on <SEP> the <SEP> desired <SEP> volume
<tb>
1. Footnote 3 as above
The pH of the vegetative medium was adjusted to pH 6.5 in the autoclave before the treatment.
The inoculated vegetative media were incubated at a temperature of 260C on a rotary shaker with 250 rev / min with a width of 5.08 cm for 48 h.
The incubated vegetative media were then used as inoculum for the fermentation medium in a ratio of 1% vegetative medium per volume of fermentation medium. The sterile production media used had the following composition:
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<tb> Ingredients <SEP>% <SEP> (w / v)
<tb> sucrose <SEP> 4
<tb> Glycerin <SEP> 1
<tb> Sodium glutamate <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> peanut flour <SEP> 2
<tb> Iron <SEP>) ammonium sulfate hexahydrate <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Potassium Nitrate <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Calcium carbonate <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> water <SEP> to <SEP> the <SEP> volume
<tb>
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Washed with water to remove soluble inorganic substances such as sodium acetate. The column was then eluted with 50% aqueous acetone.
The eluate was evaporated to dryness in vacuo to give a crude solid preparation of deacotoxycephalosporin C sodium salt.
The crude material was further purified by chromatography on a column packed with cellulose (Avicel pH 101). The antibiotic was eluted from the cellulose column with a solvent mixture containing acetonitrile: water (80:20). Many fractions were collected and then the fractions containing deacetoxycephalosporin C were pooled using the chromatography system described above for detection.
The combined fractions were then evaporated to dryness and the dry residue containing deacetoxycephalosporin C was dissolved in a minimal amount of isopropanol. The alcohol solution was poured into an amount of ether approximately 20 times the volume of the isopropanol solution. With stirring, the sodium salt of deacetoxycephalosporin C formed as a precipitate. The precipitate was filtered off and air dried to give 126 mg of the antibiotic as the sodium salt.
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In the case of pie I 2: - In a manner analogous to that indicated in Example 1, the media, culture methods and extraction methods described were used, but instead of Paecilomyces
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th fermentation medium a deacetoxycephalosporin C content of 30 to 40'Y / ml was found.
Example 3: The procedure was analogous to that given in Example 1, using the media, culture methods and recovery methods described, but instead of Paecilomyces carneus NRRL 5711 a culture of Paecilomyces carneus NRRL 2622 was used. A deacetoxycephalosporin C content of 75 to 100 μg / ml was found in the filtered fermentation medium.