NO155103B - Fremgangsmaate for fremstilling av substansen 41 200 rp etter isolering fra celler av stammen micrococcus sedogenes m 78. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en ny, biologisk aktiv substans betegnet med nr. 41

200 RP. Den nye substans oppnås ved å gå ut fra celler isolert fra en kultur av en ny mikroorganisme som kalles Micrococcus M78.

Den nye substans 41 200 RP oppnås ved at isolerte celler

av Micrococcus sedogenes stamme M78 behandles med lysozym, hvoretter forurensningene felles ut med kalsiumklorid og proteinen fjernes ved behandling med fenol, hvoretter det resulterende produkt underkastes en fraksjonering på molekylsikter. Substansen 41 200 RP består i det vesentlige av 11-18% aminosyrer (hvorav 5,5-7,5% alanin), 10-17% glukose, 10-17% aminosukkerarter og mindre enn 5% nukleinsyrer.

Substansen 41 200 RP isoleres vanligvis med et vanninnhold på mellom 2 og 6%. Den isolerte substans er et amorft, vannopp-løselig, hvitt pulver inneholdende karbon, hydrogen, oksygen, nitrogen, fosfor, svovel, klor, natrium og kalsium. Substansen har følgende elemehtæranalyse (beregnet på tørrvekten): C % = 45 - 47; H % = 7,1 - 7,6; O % = 35 - 38 (beregnet verdi); N%=4,0-5,8; P%=0,9-1,2; Cl%=0,1 -0,4;

S % <0,5; Na % = 2,0 - 3,0; Ca % = 0,9 - 1,9.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte

for fremstilling av en ny substans betegnet med nr. 41 200 RP som etter isolering ut fra celler av stammen Micrococcus sedogenes M78

i et medium som inneholder kilder av i det vesentlige assimiler-;bart karbon, nitrogen og svovel samt mineralsalter, og er et hvitt amorft pulver som i vannfri tilstand i det vesentlige består av 11-18% aminosyrer, 10-17% glukose, 10-17% aminosukkerarter og mindre enn 5% nukleinsyrer, og som har følgende elementanalyse:

C % = 45,47; H % = 7,1-7,6; 0 % = 35-38; N % = 4,0-5,7; )P % = 0,9-1,2; Cl % = 0,1-0,4; S % <0,5 Na % = 2,0-3,0; Ca % => 0,9-1,9; og hvis UV spektrum er vist i fig. 1 og IR spektrum i fig. 2; og som oppviser immunstimulerende egenskaper, og frem-gangsmåten karakteriseres ved at a) en vannsuspensjon av celler av Micrococcus sedogenes jstamme M 78 (NRRL B-3505) behandles med lysozym ved en konstant pH-verdi mellom 6,5 og 8 ved en temperatur nær 37°C i 1-3 timer; at b) et urent produkt i saltform isoleres fra den oppnådde suspensjonens væskefase hvoretter dette produkt renses ved behandling med kalsiumklorid for dannelse av en substans betegnet med nr. 32 919 RP; og at c) substansen 31 919 RP renses ved at en vannholdig oppløs-ning derav behandles med fenol hvoretter substansen fraksjoneres

på en molekylsikt, hvorved man samler den fraksjon som inneholder molekyler med høy molekylvekt og fra denne fraksjon isolerer substansen 41 200 RP.

i Lysozymet anvendes vanligvis i en mengde av 2-20 mg per g tørkede celler. Behandlingen gjennomføres ved en konstant pH-verdi mellom 6,5 og 8, fortrinnsvis nær 7, i 1-3 timer, fortrinnsvis 2 timer, og ved en temperatur nær 37°C. Hele behandlingen gjennomføres under kraftig omrøring.

Den oppnådde suspensjonens væskefase separeres vanligvis ved sentrifugering og de i oppløsning foreliggende stoffer med lave molekylvekter fjernes enten ved dialyse eller ved et membran med egnet porøsitet eller ved ultrafiltrering. Den herved oppnådde urene substansen kan isoleres i saltform ved lyofilisering av opp-løsnin<g>en . Ved dette stadium av fremstillingne består den oppnådde substans hovedsakelig av proteiner, nukleinsyrer, aminosukkerarter og mindre enn 5% polysakkarider. Substansen har følgende elementåranalyse: C % =41,5 - 44,9; H % = 5,6 - 5,9; 0% = 29,4 - 32,2; N % = 11,2 - 512,6; P % = 3,2 - 4,4; S % = 0,1 - 0,5; Cl % = 0,2- 0,4; sulfat-aske % = 11,4 - 15,4.

Den urene substans renses på følgende måte. Til en vann-oppløsning av substansen med konsentrasjon på mellom 10 og 40 g/l og fortrinnsvis 20 g/l, setter man en konsentrert oppløsning av ^kalsiumklorid inntil man oppnår en endelig kalsiumkloridkonsentra-sjon på mellom 5 og 50 g/l, fortrinnsvis 10 g/l. Den dannede utfelling fjernes ved filtrering og den resulterende oppløsning dialyseres (eller ultrafiltreres) hvoretter den behandles med en sterk kationveksler inneholdende substans som betegnes 32 919 RP, jkan separeres fra vannoppløsningen ved lyofilisering.

Substansen 32 919 RP består i det vesentlige av 24-33% aminosyrer, 26-33% nukleinsyrer, 11-17,5% aminosukkerarter (bestemmelsen skjer ifølge Elson-Morgans metode og resultatet uttrykkes som glukosamin) og 2,8-4,3% polysakkarider. Substansen har følgende elementæranalyse: C % = 44 - 48; H % = 5,2 - 6,7; 0 % = 29 - 33; N % = 10,0 - 11,6;

P % = 2,3 - 3,7; S % <0,5; Na % = 3,0 - 3,8; Ca % = 0,15 - 0,50.

Substansen 32 919 RP underkastes rensing på følgende

måte. En vannoppløsning av substansen 32 919 RP der konsentra-sjonen av 32 919 RP er mellom 10 og 50 g/L og fortrinnsvis 25 g/l, vaskes med et.like stort volum av en blanding av fenol og vann (fortrinnsvis inneholdende 10% vann) i 15 til 60 min. og fortrinnsvis 30 min. ved en temperatur nær 65°C. Etter avkjøling separeres vannfasen og vaskes med et klorert oppløsningsmiddel, fortrinnsvis kloroform, inntil den oppløsete fenol er fjernet. Vannfasen dialyseres deretter mot destillert vann. Den resulterende vannfase inneholdende den aktive substans lyofiliseres.

Det herved oppnådde produkt oppløses i vann som er buffret til pH 7 ved hjelp av et alkalimetallacetat, f. eks. natriumacetat. Den herved oppnådde oppløsning underkastes fraksjonering på en molekylsikt med høy porøsitet, slik som "Ultragel Ac A 22" eller "Sepharose 4 B" eller "Sepharose CL 4B". Man samler herved den fraksjon som inneholder en substans med høy molekylvekt. Substansen er 41200 RP isoleres deretter fra oppløsningen ved lyofilisering etter langvarig dialyse mot deionisert vann.

Microorganismen Micrococcus sedogenes stamme M 78 ved hvis dyrking under egnede betingelser man oppnår celler som kan anvendes for fremstilling av substansen 41 200 RP som bør anses å være en ny art tilhørende slekten Micrococcus.

Mikroorganismen er isolert fra en jordprøve samlet i

Brasil og isoleringen er gjennomført ifølge vanlige metoder for isolering av mikroorganismer. En prøve på mikroorganismen er deponert hos Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111. USA, der den er registrert den 14. august 1968 under nummeret NRRL B-3505. Prøver av mikroorganismen kan oppnås fra dette laboratoriet.

Mikroorganismens egenskaper er bestemt i h.h.t. de forskjellige identifikasjonsmetoder som finnes i "Manual of Micro-biological Methods", Society of A,erican Bacterologists, Mc Graw-Hill Book Company, New York (1957) samt de følgende verker: J. Dumas, "Bactériologie Médicale", Editions Médicales Flammarion, Paris (1951); S. Lambin of A. German, "Précis de Microbiologie", Collection des Précis de Pharmacie, Masson, Paris, (1961);

H. Cassagne, "Milieux de culture", Editions de la Tourelle, Paris

(1961); Skerman, "Guide to the Identification of the Genera of Bacteria". The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1967).

Bestemmelsen av slekten er gjort ifølge den identifiser-ingsnøkkel som angis i "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. opplag, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1 957) .

De morfologiske egenskaper hos stammen M 78 er studert ved statistiske dyrkninger i 24 t ved 26°C. Kulturene består hovedsakelig av ubevegelige, ikke syrebestandige, grampositive, kokkeformede celler med en diameter på 1-1,3 ym. Cellene er enten isolerte eller anordnet i grupper på 2 eller 4 celler eller anordnet som små kjeder på 4-16 celler eller anordnet i uregelmessige ansamlinger på 20-50 celler. Det er ikke observert sporer.

Skråkulturer på næringsagar danner et rikelig fettbelegg som er glatt eller meget ubetydelig rynket, luktfritt og ufarvet og har en myk konsistens. Kulturer på næringsagar i Petri-skåler har form av sirkulære kolonier med regelmessige kanter og glatt overflate. Disse kolonier er avflatede eller svakt konvekse samt mer eller mindre ugjennomskinnelige.

Kulturer i næringsbuljong med glukose er måtelig grumset, .savner pigment, er luktfrie og oppviser et fnokket sediment.

Ved dyrkning på poteter dannes stammen M 78 en fett, glatt, meget lyst gulaktig belegg. Det skjer ingen sverting av potetene og det dannes intet oppløselig pigment.

De biokjemiske egenskaper er studert på kulturer som er ^inkubert ved 26°C. De angitte resultater angis nedenfor.

i

Åndingstype: Strengt aerob.

Reduksjon av nitrater til nitriter: positiv.

Kromogenes: negativ.

Produksjon av indol: negativ.

Produksjon av H2S: negativ.

Flytendegjøring av gelatin: negativ i 21 døgn.

Hydrolyse av kaseing: positiv.

Prøve med metylrødt: negativ.

Prøve med avetylmetylkarbinol (Voges-Proskauers-reaksjon): negativ.

Dyrking på skummet melk: Ingen koagulering eller peptoni-sering; alkalisering av mediet fra pH 6/1 til pH 7,5 mellom den 1:ste og det 21:nde døgn.

Optimal utviklingstemperatur: 4°C - ingen utvikling

22 C - god utvikling

26 C - meget god utvikling

30QC - god utvikling

37QC - middels utvikling . , ... 45 C - ingen utvikling.

Katalase: positiv. ^

Oksidase: negativ.

Dannelse av syrer utfra glucider og følgende polyalkoholer (aerobt og anaerobt); syredannelse påvist ved hjelp av fenolrødt:

glukose: negativ,

galaktose: negativ,

arabinose: negativ,

sakkarose: negativ,

laktose: negativ,

mannitol: negativ,

glyserol: negativ.

Hydrolyse av stivelse: positiv.

Medium med eskulin: ingen sverting.

Dyrking av medium inneholdende konsentrasjoner av NaCl:

4% NaCl: middels utvikling.

10% NaCl: ingen utvikling.

Utnyttelse av karbamid som eneste nitrogenkilde: negativ. Urease: negativ.

Hydrolyse av chitin: negativ.

Dyrking på medium for autotrofi med (NH^)2S04 som eneste nitrogenkilde: ingen utvikling; ingen dannelse av nitriter utfra NH4<+>.

Ifølge den metode som er beskrevet av Pridham [Journal of Bacteriology, 56, 1 07-1 1 4, (1 948)] har man undersøkt hvilke karbonkilder som kan utnyttes av stammen M 78. Man har herved funnet at følgende karbonkilder utnyttes middels eller bra av stammen M 78: stivelse, etanol, natriumacetat, natriumpropionat, ravsyre, eplesyre, natriumsitrat, natriumpyruvat. Følgende karbonkilder utnyttes ikke eller tillater kun en dårlig utvikling: ribose, arabinose, glukose, laktose, maltose, sakkarose, trehalose, glyserol, mannitol, inositol, glutarsyre, natriumtartrat, galakt-uronsyre. Man har også undersøkt hvilke nitrogenkilder av stammen M 78 kan utnytte for sin utvikling, hvorved man haranvendt den ovenfor beskrevne metode ifølge Pridham og anvendt natriumsitrat som karbonkilde og erstattet NH^E^PO^ i basismediet med forskjellige nitrogenholdige forbindelser. Under disse forbindelser utnyttes følgende forbindelser godt eller middels: NaNC^f NaNG^/ NH^I^PO^, DL-aspargin, ravsyreimid, glysin, DL-alanin, DL-aspar-ginsyre, DL(+)glutaminsyre, L(-)tyrosin, DL-prolin. Følgende nitrogenholdige forbindelser utnyttes ikke: adenin, uracil, kreatinin, D(+)glukosamin, sarkosih, L(+)arginin, DL-metionin, betain.

De studerte bakterieceller inneholder ingen fotosyntetiske pigmenter, de er ikke istand til å utvikles på et medium for auto-trof i, de forplanter seg ved deling, de er sfæriske, enten isolerte eller anordnet i små korte kjeder eller i uregelmessige ansamlinger, og de oppviser ikke trikom. Ved hjelp av den identifi-seringsnøkkel som angis i "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. opplag, The Williams and Wilkins Company, Baltimoer, 1957, har disse egenskaper gjort det mulig å plassere stammen M78

i ordnene Eubacteriales (Buchanan, 1917).

Det faktum at bakterien M 78 er sfærisk, gram-positiv og strikt aerob, reduserer nitrater til nitritter, ikke er i stand til å gjære glucider anaerobt og ikke danne sporer, gjør det mulig å inordne bakterien i familien Micrococcaceae (Pribram, 1929).

Denne familie er oppdelt i seks slekter fordelt på to grupper avhengig av åndingstypen. Denne oppdeling gjør det mulig å henføre bakterien M 78 til den første gruppen som omfatter slekt-ende Micrococcus, Staphylococcus, Gaffkya og Sarcina. Denne gruppe er oppdelt i to undergrupper karakterisert av den måte på hvilken cellene er gruppert. De studerte bakterieceller forekommer ikke

systematisk i grupper i fire eller i knipper på åtte celler.

Denne egenskap gjør det mulig å henføre stammen M 78 til enten slekten Micrococcus eller slekten Staphylococcus.

Et stort antall egenskaper, spesielt det faktum at stammen M 78 ikke kan gøre glukose anaerobt og at den er strengt aerob, gjør det mulig å henføre stammen M 78 til slekten Micrococcus.

For sikrere å bestemme slekten har man gjennomført mange prøver med på den ene side stammen M 78 og på den annen side Staphylococcus aureus 209 P, Neisseria catarrhalis A 152 (IP) Strepto-3coccus faecalis ATCC 8043 og Streptococcus faecalis ATCC 9790. Disse sammenligningsforsøk har gjort det mulig å aliminere disse forskjellige slekter med kokkeformede celler, av hvilke enkelte hører til andre familier enn Micrococcaceae.

Blant de 16 beskrevne arter som hører til slekten Micro-5coccus oppviser følgende de største likheter med stammen M 78: Micrococcus varians, Micrococcus caseolyticus og Micrococcus colpogenes.

Stammen M 78 skiller seg fra Micrococcus varians spesielt ved at den ikke danner syrer fra glukose, laktose, sakkorose, glyserol Oog mannitol ved at den ikke gjør melken sur. Stammen M 78 skiller seg fra Micrococcus caseolyticus ved at den ikke gjør gelatin flytende, ikke peptoniserer melk og ikke danner syrer fra glukose, laktose, mannitol og glyserol. Stammen M 78 skiller seg fra Micrococcus colpogenes ved det viktige faktum at den ikke kan hydroly-<S>sere kitin og ved at dén er ureasenegativ.

Den studerte stamme oppviser således slike forskjeller i forhold til de beskrevne arter av slekten Micrococcus at det et mulig å betrakte den som en ny art. De celler som anvendes for fremstilling av substansen 41 20 0 RP oppnås ved at man dyrker Mikro-<l0>coccus sedogenes stamme M 78 på et dyrkingsmedium under egnede betingelser, hvoretter de under dyrkingen oppnådde celler separeres.

Dyrkingen av Micrococcus sedogenes stamme M 78 kan gjennom-føres i h.h.t. en hvilken som helst metode for aerob dyrking på overflaten eller i dypet, det siste er foretrukket av bekvemmelig-,<5>hetshensyn. Man anvender for dette formål slike poding- og gjær-ingsmetoder og slike typer av apparater som er i generell bruk innenfor denne industri.

Gjæringsmediet bør hovedsakelig inneholde kilder for assimilerbart karbon, assimilerbar nitrogen, assimilerbar fosfor og assimilerbart svovel, uorganiske stoffer og eventuelle til-vekstfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av velde-finerte forbindelser eller i form av komplekse dannelser som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse.

Som kilder for assimilerbart karbon kan man anvende karbo-hydrater slik som dextrinér og stivelse, eller andre karbonholdige forbindelser slik som alkoholer (etanol) eller visse organiske syrer slik som melkesyre og sitronsyre. Disse animalske eller vegetabilske oljer slik som fettolje eller soyaolje, kan med for-del erstatte disse forskjellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til disse. De egnede kilder for assimilerbart nitrogen er ytterst vekslende. Det kan være meget enkel kjemiske forbindelser slik som uorganiske eller organiske ammonium-salter eller visse aminosyrer. De kan også utgjøres av komplekse stoffer som hovedsakelig inneholder nitrogen i proteinform slik

som kasein, laktalbumin, gluten og hydrolysat derav, soyamel, jord-nøttmel, fiskemel, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, drank og maisstøp-væske. Svovel og fosfor tilføres vanligvis i tilstrekkelige mengd-er med de ovenfor nevnte komplekse stoffer. Svovel og fosfor kan imidlertid også tilsettes i form av sulfater og fosfater.

Blandt de tilsatte uorganiske stoffer kan visse ha en buffrende eller nøytraliserende virkning slik som alkalimetall-eller jordalkalimetallfosfater eller kalsium- eller magnesium-karbonater. Andre uorganiske stoffer gir den nødvendige ionelike-

5

vekt for utvikling av Micrococcus sedogenes stamme M 78, slik som klorider og sulfater av alkalimetaller og jordalkalimetter samt salter av zink, kobolt, jern kopper og mangan.

pH-verdien i gjæringsmediet bør ved dyrkingens begynnelse være mellom 6,0 og 7,8, fortrinnsvis mellom 6,5 og 7,5. Den for gjæringen optimale temperatur er mellom 25 og 30 oC, men en tilfreds-stillende produksjon oppnås ved temperaturer mellom 20 og 35°C.

Lufttilførselen ved gjøringen kan variere innen vide grenser. Man har imidlertid funnet at en lufttilførsel på 0,3-3 1/1 dyrkings-_buljong og minutt er spesielt egnet. Det maksimale utbytte oppnås etter 8-20 t dyrking, fortrinnsvis etter 15 t dyrking, hvorved den optimale tid hovedsakelig beror på det anvendte medium. Gjærings-mediets pH-verdi er ved avsluttet dyrking vanligvis mellom 7,3 og 8,8, fortrinnsvis mellom 8,0 og 8,4.

systematisk i grupper i fire eller i knipper på åtte celler.

Denne egenskap gjør det mulig å henføre stammen M 78 til enten slekten Micrococcus eller slekten Staphylococcus.

Et stort antall egenskaper, spesielt det faktum at

stammen M 78 ikke kan gøre glukose anaerobt og at den er strengt aerob, gjør det mulig å henføre stammen M 78 til slekten Micrococcus .

For sikrere å bestemme slekten har man gjennomført mange prøver med på den ene side stammen M 78 og på den annen side Staphylococcus aureus 209 P, Neisseria catarrhalis A 152 (IP) Streptococcus faecalis ATCC 8043 og Streptococcus faecalis ATCC 9790. Disse sammenligningsforsøk har gjort det mulig å aliminere disse forskjellige slekter med kokkeformede celler, av hvilke enkelte hører til andre familier enn Micrococcaceae.

Blant de 16 beskrevne arter som hører til slekten Micrococcus oppviser følgende de største likheter med stammen M 78: Micrococcus varians, Micrococcus caseolyticus og Micrococcus colpogenes.

Stammen M 78 skiller seg fra Micrococcus varians spesielt ved at den ikke danner syrer fra glukose, laktose, sakkorose, glyserol 'og mannitol ved at den ikke gjør melken sur. Stammen M 78 skiller seg fra Micrococcus caseolyticus ved at den ikke gjør gelatin flytende, ikke peptoniserer melk og ikke danner syrer fra glukose, laktose, mannitol og glyserol. Stammen M 78 skiller seg fra Micrococcus colpogenes ved det viktige faktum at den ikke kan hydroly-'sere kitin og ved at den er ureasenegativ.

Den studerte stamme oppviser således slike forskjeller i forhold til de beskrevne arter av slekten Micrococcus at det et mulig å betrakte den som en ny art. De celler som anvendes for fremstilling av substansen 41 200 RP oppnås ved at man dyrker Mikro-'coccus sedogenes stamme M 78 på et dyrkingsmedium under egnede betingelser, hvoretter de under dyrkingen oppnådde celler separeres.

Dyrkingen av Micrococcus sedogenes stamme M 78 kan gjennom-føres i h.h.t. en hvilken som helst metode for aerob dyrking på overflaten eller i dypet, det siste er foretrukket av bekvemmelig-'hetshensyn. Man anvender for dette formål slike poding- og gjær-ingsmetoder og slike typer av apparater som er i generell bruk innenfor denne industri.

Gjæringsmediet bør hovedsakelig inneholde kilder for assimilerbart karbon, assimilerbar nitrogen, assimilerbar fosfor og assimilerbart svovel, uorganiske stoffer og eventuelle til-vekstfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av velde-finerte forbindelser eller i form av komplekse dannelser som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse.

Som kilder for assimilerbart karbon kan man anvende karbo-hydrater slik som dextriner og stivelse, eller andre karbonholdige forbindelser slik som alkoholer (etanol) eller visse organiske syrer slik som melkesyre og sitronsyre. Disse animalske eller vegetabilske oljer slik som fettolje eller soyaolje, kan med for-

i

del erstatte disse forskjellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til disse. De egnede kilder for assimilerbart nitrogen er ytterst vekslende. Det kan være meget enkel kjemiske forbindelser slik som uorganiske eller organiske ammonium-salter eller visse aminosyrer. De kan også utgjøres av komplekse stoffer som hovedsakelig inneholder nitrogen i proteinform slik som kasein, laktalbumin, gluten og hydrolysat derav, soyamel, jord-nøttmel, fiskemel, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, drank og maisstøp-væske. Svovel og fosfor tilføres vanligvis i tilstrekkelige mengd-er med de ovenfor nevnte komplekse stoffer. Svovel og fosfor kan imidlertid også tilsettes i form av sulfater og fosfater.

Blandt de tilsatte uorganiske stoffer kan visse ha en buffrende eller nøytraliserende virkning slik som alkalimetall-eller jordalkalimetallfosfater eller kalsium- eller magnesium-karbonater. Andre uorganiske stoffer gir den nødvendige ionelike-

i

vekt for utvikling av Micrococcus sedogenes stamme M 78, slik som klorider og sulfater av alkalimetaller og jordalkalimetter samt salter av zink, kobolt, jern kopper og mangan.

pH-verdien i gjæringsmediet bør ved dyrkingens begynnelse være mellom 6,0 og 7,8, fortrinnsvis mellom 6,5 og 7,5. Den for gjæringen optimale temperatur er mellom 25 og 30°C, men en tilfreds-stillende produksjon oppnås ved temperaturer mellom 20 og 35°C.

Lufttilførselen ved gjøringen kan variere innen vide grenser. Man har imidlertid funnet at en lufttilførsel på 0,3-3 1/1 dyrkingsbuljong og minutt er spesielt egnet. Det maksimale utbytte oppnås i

etter 8-2 0 t dyrking, fortrinnsvis etter 15 t dyrking, hvorved den optimale tid hovedsakelig beror på det anvendte medium. Gjærings-mediets pH-verdi er ved avsluttet dyrking vanligvis mellom 7,3 og 8,8, fortrinnsvis mellom 8,0 og 8,4.

Mikroorganismen Micrococcus sedogenes stamme M 78 separeres deretter fra gjæringsmediet ved filtrering eller sentrifugering, hensiktsmessig etter surgjøring av gjæringsmediet til en pH-verdi av ca. 3 ved tilsetning av en uorganisk syre som saltsyre. For de etterfølgende behandlinger kan man enten anvende de oppnådde urene celler eller gjennomføre en dehydratisering ved lyofilisering eller ved vasking med alkohol eller aceton og etterfølgende tørking under et redusert trykk slik at man oppnår rensede tørre celler. Det er spesielt egnet å underkaste de oppnådde celler en oppvarming ved en temperatur mellom 120 og 130°C i 30-60 minutter før den etterfølgende anvendelse av cellene.

Den nye substans 41 200 RP oppviser bemerkelsesverdige

og nyttige biologiske egenskaper.

Ved intravenøs, subkutan, intraperitoneal eller intrana-sal inngivelse til mus øker den nye substans på signifikant måte musens motstandskraft mot infeksjoner fremkalt av vanlige dødlige doser av viruiente stammer av slike bakterier som Listeria mono-cytogenes, Staphylococcus aureus og Escherichia coli og slike

vira som encefalomyokarditvirus, mushepatitvirus, influensavirus (humanvirus tilpasset til mus, type AQ og A2), herpesvirus og arbovirus Semliki-Forest. Den økede motstandskraft er tilstede i minst 9 6 timer etter behandlingen.

Ved parenteral inngivelse til mus stimulerer den nye substans kraftig det retikulo-endoteliale systemets fagocytere

i evne og øker i milten antallet lymfocytter som produserer antilegemer. Den nye substans utøver en stimulerende virkning på overfølsomhetsreaksjoner av forsinket type og stimulerer produk-sjonen av antilegemer mot spesielle antigener.

Hos mus podet med tumorceller (slik som celler av sarkom i 180). fremmer den nye substans avstøting av tumorene ved frem-kalling av en nekrotisk reaksjon ved tumorene.

Under visse betingelser øker substansen ifølge oppfinnelsen antall lymfocyter T i milten og/eller øker disse lymfo-cyters cytolytiske virkning mot allogene tumorceller.

Avhengig av de anvendte forsøksbetingelser og inngivel-sesmåten er de aktive doser ved inngivelse til dyr i(mus) vanligvis mellom 0,03 og 3 mg/kg, fortrinnsvis mellom 0,3 og 1 mg/kg. En eneste behandling er vanligvis tilstrekkelig til at man skal

oppnå den ønskede virkning i et tidsrom på minst 48 timer.

Ved intravenøs inngivelse til mus er den letale dose

50% (DL5Q). av substansen 41 200 RP omtrent 23 mg/kg.

Oppfinnelsen illustreres ved følgende ikke begrensende eksempler. Proteininnholdet i eksemplene er bestemt ved hjelp av aminosyreanalyse. Glukoseinnholdet er bestemt ifølge antron-metoden. Fosforinnholdet er bestemt ifølge molybdatmetoden etter mineralisering. Innholdet av nukleinsyrer er bestemt ved absorpsjon ved 258 nm. Innholdet av aminosukkerarter er bestemt ifølge Elson-Morgans metode og uttrykkes som glukosamin, dvs.

at bestemmelsen er gjennomført ved hjelp av ninhydrin etter hydrolyse og separering ved hjelp av en autoanalysator Biotronik LC 6000 E.

Eksempel 1. (A). Fremstilling av celler.

I en gjæringsbeholder med volum på 170 liter ble det innført 1200 g pepton, 600 g kjøttekstrakt, 1200 cm 3soyaolje og vanlig springvann til tilsammen 110 liter.

pH-verdien ble innstilt til 6,90 ved tilsetning av 10N natriumhydroksydoppløsning, hvoretter mediet ble sterilisert ved gjennombobbling av vanndamp ved 122°C i 40 minutter. Etter avkjøling er buljongens volum 120 liter som en følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen, og pH-verdien er 6,70. Man poder med 200 cm 3 av en kultur av Micrococcus sedogenes stamme M 78, en kultur som er fremstilt ved dyrking i en omrystet E-kolbe.

Kulturen fikk utvikle seg ved 27°C i 14 timer under om-røring og under lufting med steril luft. Den er deretter egnet til anvendelse for poding av produksjonsmediet.

Produksjonsdyrkingen ble gjennomført i gjæringsbeholder med volum på 800 liter hvori det ble innført 4 kg L-melkesyre, 2 liter soyaolje, 2,4 kg ammoniumsulfat, 2 kg natriumklorid, 0,4 kg monokaliumfosfot, 0,8 kg MgS04.7H20, 0,02 kg CuS04.5H20, 0,012 kg ZnS04.7H20, 0,008 kg CoCl2.6H20 og vanlig ledningsvann til tilsammen 370 liter.

Mediets pH-verdi ble innstilt til 7,10 ved tilsetning av 2950 cm 3 10N natriumhydroksydoppløsning hvoretter dyrkningsmediet ble sterilisert ved gjennombobbling av vanndamp ved 122°C i 40 minutter. Etter avkjøling har dyrkingsbuljongen et volum på 400 liter som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen. Mediets pH-verdi som er lik 4,20 innstilles på 6,60 ved tilsetning av 210 0 cm 3 av en 5N vannoppløsning av natriumhydro-ksyd.

Man poder med 40 liter podekultur fra den ovenfor beskrevne dyrkingen i gjæringsbeholderen med volumet 170 liter. Kulturen for utvikle seg ved 2 7°C i 16 timer hvoretter man om-rører med et røreverk som roterer med 205 omdreininger per min-

3

utt og lufter med 15 m steril luft per time.

Etter avsluttet dyrking har dyrkingsbuljongen en pH-verdi på 8,20 og volumet er 440 liter.

Den oppnådde dyrkingsbuljong avkjøles til +4°C, og pH-verdien innstilles til 3 ved tilsetning av 4 liter 5N saltsyre. Cellene isoleres ved sentrifugering ved 4000 omdreininger /minutt (2900 g).

Cellene tas opp i 80 liter etanol ved temperaturen -10°C og omrøres der i 15 minutter hvoretter de isoleres ved sentrifugering og tørkes ved 35°C under et redusert trykk av 5 mm Hg i 15 timer. Man oppnår herved 150 0 g tørre celler.

(B) Fremstilling av 32919 RP.

1 kg av de under (A) fremstilte celler suspenderes i 40

liter sterilt destillert vann i en reaktor av rustfritt stål, utstyrt med en kappe for temperaturregulering ved hjelp av sir-kulerende vann samt et sentralt røreverk. pH-verdien innstilles til 7,0 ved tilsetning av 10N natriumhydroksydoppløsning.

Man tilsetter deretter 2 g lysozym og omrører i 2 timer ved 37°C hvoretter man periodisk justerer pH-verdien til 7,0

ved tilsetning av 5N natriumhydroksydoppløsning.

Blandingen sentrifugeres deretter på en maskin "Sharples M16" (to suksessive gjennomganger ved 17000 omdreininger/minutt og en strømning på 30 liter per time). Den overstående væske på 37 liter ultrafiltreres i et apparat UFP 20 utstyrt med et akryl-membran IRIS 3042, hvorved man resirkulerer retentatet og tilsetter 3 x 40 liter deionisert vann avkjølt til +4°C.

Man samler 7 liter konsentrert retentat fritt for små molekyler (molekylvekt lavere enn ca. 25000 dalton).. Retentatets pH-verdi innstilles til 7 ved hjelp av 5N natriumhydroksydopp-løsning, hvoretter den oppnådde oppløsning lyofiliseres. Herved

oppnås 147 g urent produkt.

31 g av det oppnåo dde produkt oppløses i 1550 cm 3 deionisert vann ved omrøring i 30 minutter ved en temperatur nær 20°C.

I løpet av 5 minutter og under konstant omrøring tilsetter man deretter 31 cm 3 av en vannoppløsning inneholdende 668 g kalsium-kloriddihydrat per liter. Man fortsetter omrøringen i ytterligere 30 minutter. Den dannede utfelling fjernes ved sentrifugering på en Sharples laboratoriemaskin, hvorved man arbeider ved 40000 omdreininger/minutt og ved en strømning av 5 liter/time.

Den overstående væske dialyseres gjennom et cellulosemembran i

3 døgn ved +4°C mot 3 x 40 liter deionisert vann.

3 Retentatet behandles deretter i en kolbe med 310 cm av

et kationebytter "DOWEX 50 X2" (sulfonert polystyren). i natrium-form. Man omrører i 1 time hvoretter man avfiltrerer ionebytteren og vasker denne på filteret med 310 cm 3 vann. Vaskeoppløsningen forenes med filtratet og den oppnådde blanding lyofiliseres.

Man oppnår herved 17 g av produktet 32 919 RP i saltform. Dette produkt er et hvitt pulver med et vanninnhold ifølge Fischer på 15,7%. Produktets tørrstoffinnhold inneholder 24,6% proteiner (summen av aminosyrene), 3,9% polysakkarider og 2 8,9% nukleinsyrer (bestemt ved hjelp av UV-spektrum).

Elementaranalyse: C % = 46,30; H % = 5,84; 0 % (beregnet). = 30,71;

N % = 10,04; P % = 3,11; S % <0,5; Na % = 3,70;

Ca % = 0,30.

(C) Rensing av 31 219 RP.

25 g av den under (B) oppnådde substans 32 919 RP opp-løses i 1 liter deionisert vann i en 2-liters reaktor utstyrt med røreverk og en anordning for regulering av temperaturen.

Man tilsetter 1 liter av en blanding av fenol og vann (109 cm<3 >vann/kg fenol). Den resulterende blanding oppvarmes til 65°C under kraftig omrøring. Omrøringen fortsettes i 30 minutter ved samme temperatur. Etter hurtig avkjøling av reaktoren i et is-bad til en temperatur nær 25°C separeres fasene ved sentrifugering ved 3300 g i 30 minutter ved hjelp av en avkjølt laboratoriemaskin (JOUAN type K 63 F med en kapasitet på 4 liter). Man oppnår herved 450 cm 3 vannfase.

Fenolfasen og mellomfasen ekstraheres på nytt med 1 liter deionisert vann i 30 minutter ved 65°C. Etter avkjøling og sentrifugering på ovenfor beskrevne måte oppnås ytterligere 1470 cm^

Vannfasen forenes og fenolen fjernes ved to etter hver-andre følgende vaskinger med 2 liter kloroform hver gang. Vannfasen klargjøres deretter ved sentrifugering ved 3300 g i 30 minutter. Man oppnår herved 180 0 cm 3 vannfase.

Denne klare vannfase dialyseres i 3 døgn ved +4°C mot

3 x 40 liter deionisert vann. Retentatet lyofiliseres hvorved man oppnår 14,5 g av et hvitt amorft pulver.

3

Man oppløser 8 g av dette pulver i 40 0 cm av en steril 0,1M natriumacetatbuffertløsning med pH 7. Denne fremstilles ved at 136,09 g natriumacetat av analysekvalitet oppløses i 0,90 liter deionisert vann hvoretter pH-verdien innstilles til 7,0 ved tilsetning av eddiksyre (d = 1,049) og volumet innstilles til 1 liter. Sterilisering skjer ved oppvarming i 45 minutter ved 122°C. Denne oppløsning fortynnes i forholdet 1/10 med sterilt deionisert vann akkurat før anvendelsestidspunktet.

Den oppnådde oppløsning av pulveret i bufferen helles på en kolonne av "SEPHAROSE CL 4B" med diameter 13,5 cm og høyde 65 cm, anbragt i et kalt rom (+4°C) og behandlet med en steril 0, IM natriumacetatbuf f er (pH 7,0).. Man eluerer med samme buffer med en strømning på 1,33 liter/time, hvorved man kontinuerlig registrerer absorpsjonen ved 230 nm i et eluatsjikt med tykkel-sen 0,1 cm.

Man samler først en fraksjon på 3,13 liter som kasseres. Den følgende fraksjon på 1,22 liter og som tilsvarer en absorb-sjonstopp ved 230 nm, innføres i et rør av regenerert cellulose "NOJAX" og dialyseres ved +4°C i 3 døgn mot 3 x 40 liter deionisert vann. Det oppnådde retentat på 1300 cm 3 lyofiliseres og det oppnåo dde faste stoff opptas i 93 cm 3 deionisert vann, og den resulterende oppløsning dialyseres i 48 timer ved +4°C under anvendelse av samme membran som ovenfor angitt mot 2 x 20 liter deionisert vann.' Det oppnådde retentat lyofiliseres.

Man oppnår derved 1,3 g av substansen 41 20 0 RP i form av et hvitt amorft pulver. Substansen UV-spektrum vises på fig.

1 i de ledsagende tegninger. Substansens IR-spektrum, bestemt under anvendelse av KBr-tabletter, vises på fig. 2. I fig. 2 angis på abskissen bølgelengden i ym langs den øvre skala og bølgetallet i cm ^ langs den undre skala og på ordinaten den optiske tetthet.

I den nedenfor følgende tabell angis de viktigste ab-sorpsjonssignaler i IR-spekteret for substansen 41 200 RP.

Den oppnådde substans 41 200 RP har et vanninnhold iføl-ge Fischer på 3,8%. Beregnet på tørt materiale inneholder substansen 12,3% aminosyrer hvorav 7% alanin, 11,95% glukose, mindre enn 1,3% nukleinsyrer som er bestemt ved hjelp av UV-spektrum og 16,3% aminosukkerarter.

Substansen har følgende elementanalyse:

C % = 45,58; H % = 7,47; N % = 4,85; O % =37;

P % = 1,17; Cl % = 0,25; Na % = 2,36; Ca % = 1,33;

S % ^0,5.

Ved elektroforese oppnås følgende resultater. I en 1%-ig agarosegel med barbitalbuffert (pH 8,6) og under en spenning av 6 V/cm migrerer substansen 41 200 RP mot anoden mot en hastighet av ca. 11 mm/time. Produktet påvises ved hjelp av Seiffs rea-gens etter periodisk oksydasjon eller ved hjelp av svart Soudan

B.

Eksempel 2.

Man arbeider på samme måte som i eksempel 1 (A).. Etter sentrifugering på ovenfor beskrevne måte oppnås ytterligere 1470

■3

cm vannfase.

Vannfasen forenes og fenolen fjernes ved to etter hver-andre følgende vaskinger med 2 liter kloroform hver gang. Vannfasen klargjøres deretter ved sentrifugering ved 3300 g i 30 minutter. Man oppnår herved 1800 cm 3 vannfase.

Denne klare vannfase dialyseres i 3 døgn ved +4°C mot

3 x 40 liter deionisert vann. Retentatet lyofiliseres hvorved man oppnår 14,5 g av et hvitt amorft pulver.

3

Man oppløser 8 g av dette pulver i 40 0 cm av en steril 0,1M natriumacetatbuffertløsning med pH 7. Denne fremstilles ved at 136,09 g natriumacetat av analysekvalitet oppløses i 0,90 liter deionisert vann hvoretter pH-verdien innstilles til 7,0 ved tilsetning av eddiksyre (d = 1,049) og volumet innstilles til 1 liter. Sterilisering skjer ved oppvarming i 45 minutter ved 122°C. Denne oppløsning fortynnes i forholdet 1/10 med sterilt deionisert vann akkurat før anvendelsestidspunktet.

Den oppnådde oppløsning av pulveret i bufferen helles på en kolonne av "SEPHAROSE CL 4B" med diameter 13,5 cm og høyde 65 cm, anbragt i et kalt rom (+4°C) og behandlet med en steril 0, IM natriumacetatbuf f er (pH 7,0).. Man eluerer med samme buffer med en strømning på 1,33 liter/time, hvorved man kontinuerlig registrerer absorpsjonen ved 230 nm i et eluatsjikt med tykkel-sen 0,1 cm.

Man samler først en fraksjon på 3,13 liter som kasseres. Den følgende fraksjon på 1,22 liter og som tilsvarer en absorb-sjonstopp ved 230 nm, innføres i et rør av regenerert cellulose "NOJAX" og dialyseres ved +4°C i 3 døgn mot 3 x 40 liter deionisert vann. Det oppnådde retentat på 1300 cm 3 lyofiliseres og det oppnådde faste stoff opptas i 93 cm 3 deionisert vann, og den resulterende oppløsning dialyseres i 48 timer ved +4°C under anvendelse av samme membran som ovenfor angitt mot 2 x 20 liter deionisert vann.' Det oppnådde retentat lyofiliseres.

Man oppnår derved 1,3 g av substansen 41 200 RP i form av et hvitt amorft pulver. Substansen UV-spektrum vises på fig.

1 i de ledsagende tegninger. Substansens IR-spektrum, bestemt under anvendelse av KBr-tabletter, vises på fig. 2. I fig. 2 angis på abskissen bølgelengden i ym langs den øvre skala og bølgetallet i cm ^ langs den undre skala og på ordinaten den optiske tetthet.

I den nedenfor følgende tabell angis de viktigste ab-sorpsjonssignaler i IR-spekteret for substansen 41 200 RP.

Den oppnådde substans 41 200 RP har et vanninnhold iføl-ge Fischer på 3,8%. Beregnet på tørt materiale inneholder substansen 12,3% aminosyrer hvorav 7% alanin, 11,95% glukose, mindre enn 1,3% nukleinsyrer som er bestemt ved hjelp av UV-spektrum og 16,3% aminosukkerarter.

Substansen har følgende elementanalyse:

C % = 45,58; H % = 7,47; N % = 4,85; 0 % = 37;

P % = 1,17; Cl % =0,25; Na % = 2,36; Ca % = 1,33;

S % <0,5.

Ved elektroforese oppnås følgende resultater. I en 1%-ig agarosegel med barbitalbuffert (pH 8,6) og under en spenning av 6 V/cm migrerer substansen 41 200 RP mot anoden mot en hastighet av ca. 11 mm/time. Produktet påvises ved hjelp av Seiffs rea-gens etter periodisk oksydasjon eller ved hjelp av svart Soudan

B.

Eksempel 2.

Man arbeider på samme måte som i eksempel 1 (A).. Etter 16 timers dyrking avkjøles dyrkingsbuljongen til 4°C og pH-verdien innstilles til 3 ved tilsetning av saltsyre. Cellene isoleres ved sentrifugering ved 4000 omdreininger/minutt. Den sure cellekaka oppvarmes deretter i en autoklav ved 122°C i 45 minutter. Etter avkjøling vaskes cellene med etanol, hvoretter de tørkes.

Man arbeider deretter på samme måte som i eksempel 1 (B) og 1 (C) og under anvendelse av de samme materialmengder. Man oppnår herved 0,55 g av substansen 41 200 RP i form av et hvitt amorft pulver. Dette pulver har et vanninnhold ifølge Fischer på 6%. Beregnet på tørrvekten inneholder produktet 17,7% aminosyrer, hvorav 7,2% alanin, 10,5% glukose, mindre enn 3% nukleinsyrer og 15,2% aminosukkerarter.

Produktet har følgende elementanalyse:

C % = 46,90; H % = 7,32; N % = 5,38; O % = 35;

P % = 1,08; Cl % = 0,18; Na % = 2,26; Ca % = 1,83;

S % <0,5.

Produktets IR-spektrum er identisk med et i eksempel 1 angitte IR-spektrum for substansen 41 200 RP.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en ny substans betegnet med nr. 41 200 RP som etter isolering ut fra celler av stammen Micrococcus sedogenes M 78 i et medium som inneholder kilder av i det vesentlige assimilerbart karbon, nitrogen og svovel samt mineralsalter, og er et hvitt amorft pulver som i vannfri tilstand i det vesentlige består av 11-18% aminosyrer, 10-17% glukose, 10-17% aminosukkerarter og mindre enn 5% nukleinsyrer, og som har følgende elementanalyse: C % = 45,47; H % = 7,1-7,6; 0 % = 35-38; N % = 4,0-5,7; P % = 0,9-1,2; Cl % = 0,1-0,4; S % <0,5; Na % = 2,0-3,0: Ca % = 9,9-1,9; og hvis UV spektrum er vist i fig. 1 og IR spektrum i fig. 2; og som oppviser immunstimulerende egenskaper,karakterisert ved at a) en vannsuspensjon av celler av Micrococcus sedogenes stamme M 78 (NRRL B-3505) behandles med lysozym ved en konstant pH-verdi mellom 6,5 og 8 ved en temperatur nær 37°C i 1-3 timer; at b) et urent produkt i saltform isoleres fra den oppnådde suspensjonens væskefase hvoretter dette produkt renses ved behandling med kalsiumklorid for dannelse av en substans betegnet med nr. 32 919 RP; og at c) substansen 31 919 RP renses ved at en vannholdig oppløs-ning derav behandles med fenol hvoretter substansen fraksjoneres på en molekylsikt, hvorved man samler den fraksjon som inneholder molekyler med høy molekylvekt og fra denne fraksjon isolerer substansen 41 200 RP.