PL140807B1 - Method of obtaining a protein capable of lovering cholesterol level in blood - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bialka obnizajacego poziom cholesterolu we krwi, które dalej w tekscie okreslane jest jako bialko CRP (jest to skrót od angielskiego terminu „cholesterol-reducing protein", co oznacza bialko zmniejszajace ilosc cholesterolu).Jak wiadomo, istnieje obecnie szereg preparatów farmaceutycznych, takich jak klofibrat lub preparaty pochodne, które proponowane sa jako srodki lecznicze do leczenia miazdzycy naczyn lub hiperlipidemii, którajestjedna z tak zwanych typowych chorób wieku sredniego lub starczego.Jednakze te znane srodki lecznicze nie pozwalaja na osiagniecie w pelni celów pozadanych z punktu widzenia na przyklad skutkówfarmakologicznych oraz dzialan ubocznych, a tym samym znacznie wzrosla potrzeba wytworzenia bardziej skutecznych i bezpiecznych lekarstw.W zwiazku z tym celem niniejszego wynalazku jest wytwarzanie nowego bialka obnizajacego poziom cholesterolu we krwi, czyli bialka CRP, które mozna bezpiecznie podawac ssakom i które skutecznie obniza poziom cholesterolu we krwi ssaków. Dalszym celem wynalazku jest wytwarza¬ nie farmaceutycznej kompozycji przciwdzialajacej miazdzycy naczyn lub powodujacej obnizenie poziomu cholesterolu we krwi, która jako skladnik czynny zawiera to nowe bialko CRP. Dalsze cele i zalety sposobu wedlug wynalazku omówiono w podanym ponizej opisie.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bialka obnizajacego poziom cholesterolu we krwi, które powoduje obnizenie poziomu cholesterolu we krwi ssaków i posiada nastepujace cechy charakterystyczne: a) masa czasteczkowa oznaczona metoda chromatografii zelowej: 30000+7000, b) punkt izoelektryczny: 7,9+0,2, c) sklad aminokwasów (% molowe): glicyna glutaminian lizyna walina treomna seryna 25,23 alanina 10,34 asparaginian 6,39 leucyna 5,41 izoleucyna 4,23 tyrozyna 3,46 prolina 10,98 8,20 5,58 5,18 4,19 2,621 140867 arginina 2,60 fenyloalanina 2,51 metionina 1,56 histydyna 1,30 cysteina 0,16 d) obraz elektroforezy: wyrazne pasmo po stronie anody przy elektroforezie na zelu poliakry- loamidu, charakteryzujacy sie tym, ze hoduje sie mikroorganizm nalezacy do rodzaju Streptococ- cus w odpowiedniej pozywce hodowlanej i z tej hodowli wyodrebnia sie bialko obnizajace poziom cholesterolu we krwi.Sposób wedlug wynalazku zostanie wyjasniony w podanym ponizej opisie, w, powiazaniu z zalaczonymi rysunkami, na których fig. 1 przedstawia obraz elektroforezy na zelu poliakryloamidu bialka CRP otrzymanego sposobem wedlug wynalazku, zas fig. 2 do 4 przedstawiaja przebieg eluowania przy chromatografii zelowej próbek z podanego w opisie przykladu I.W wyniku badan stwierdzono, ze nowe bialko otrzymane z mikroorganizmów nalezacych do rodzaju Streptococcus i/lub sklarowanego bulionu hodowli moze skutecznie obnizac poziom cholesterolu we krwi oraz ze skladnik ten wyodrebniony z tych tak zwanych bakterii zoladkowo-je- Iitowych i sklarowanego bulionu hodowli jest zasadniczo biorac nietoksyczny przy podawaniu doustnym.Ponizej szczególowo opisano zastosowane mikroorganizmy, sposoby wytwarzania, charakte¬ rystyki fizykochemiczne i dzialanie farmakologiczne bialka CRP otrzymanego sposobem wedlug wynalazku.Mikroorganizmy. 1. Gatunki W sposobie wedlug wynalazku stosuje sie mikroorganizmy nalezace do rodzaju Streptococ¬ cus, korzystnie Streptococcus faecium, Streptococus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus avium, Streptococcus durans, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus equi- nus oraz inne. Ponadto korzystnie mozna stosowac gatunki okreslane jako paciorkowce jelitowe.Typoweprzyklady takich mikroorganizmów wyodrebnionych z kalu zdrowych ludzi zostaly zdeponowane 15 lipca 1982 roku w Fermentation Research Institute (FRI) w Japonii (wszystkie numery podane w Tablicy 1 jako „FERM-P" odnosza sie do numerów depozytu we wspomnianym Instytucie) i przeniesione w tymze Fermentation Research Institute (jako Miedzynarodowym Urzedzie — Skladnicy w Japonii przewidzianym postanowieniami porozumienia budapeszten¬ skiego) pod podane w Tablicy 1 numery depozytów FERM-BP, zgodnie z postanowieniami porozumienia budapesztenskiego odnosnie miedzynarodowego uznania deponowania mikro¬ organizmów dla celów postepowania patentowego.Ta b e 1 a I Nazwa szczepu Streptococcus faecium Streptococcus faecalis Streptococcus avium Streptococcus salivarius Streptococcus durans Streptococcus mitis Streptococcus equinus ADV1009 ADV9001 AD2003 ADV10001 ADV3001 ADV7001 ADY8001 Numer depozytu FERM P-6624 FERM BP-296 FERM P-6625 FERM BP-297 FERM P-6626 FERM BP-298 FERM P-6627 FERM BP-299 FERM P-6628 FERM BP-300 FERM P-6629 FERM BP-301 FERM P-6630 FERM BP-302 2. Charakterystyki mikrobiologiczne mikroorganizmów Ogólne charakterystyki mikrobiologiczne Charakterystki mikrobiologiczne mikroorganizmów stosowanych w sposobie wedlug wynalaz¬ ku sa takie same, jak charakterystyki znanych mikroorganizmów nalezacych do identycznej klasy.Tak wiec ogólne charakterystki mikrobiologiczne, metody hodowli oraz inne wlasciwosci odpo¬ wiadaja opisanym w podanych ponizej pozycjach literatury naukowej: 1) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 wyd., s 490-509 (1974), 2) Int. J. Syst. Bact. 16, s. 114 (1966), 3) Microbiol. Immunol. 25 (3), 257-269 (1981), 4) J. Clin. Pathol. 33, 53-57 (1980), 5) J. General Microbiol. 128, 713-720 (1982), 6) Applied Microbiol. 23 (6), 1131-1139 (1972).140867 3 Typowewlasciwosci mikrobiologiczne wyzej wymienionych szczepów stosowanych w sposo¬ bie wedlug wynalazku mozna zestawic jak podano ponizej w tabeli 2: T a b e 1 a II Charakterystyki 1 ADV 1009 2 ADV 9001 3 AD 2003 4 Szczepy ADV 10001 5 ADV 3001 6 ADV 7001 7 ADV 8001 8 Ksztalt komórki Barwienie sie metoda Grama Hemoliza Wzrost w temperaturze 10°C Wzrost w temperaturze 45°C Wzrost w temperaturze 50°C Odpornosc na dzialanie tem¬ peratury 60°C przez 30 min Wzrost w pozywce hodowli przy pH 9,6 Zdolnosc redukcji blekitu metylenowego Uplynnianie zelatyny Wzrost w pozywce hodowli zawierajacej NaCl (6,5%) Wzrost w pozywce hodowli zawierajacej zólc (40%) Wytwarzanie amoniaku Hydroliza kwasu hipurowego Wzrost w pozywce hodowli zawierajacej telluryt Wzrost w pozywce hodowli zawierajacej TTC*1 Wytwarzanie kwasu ze zródla wegla glukoza eskulina inulina laktoza gliceryna arabinoza melezytoza sorbit Grupa antygenu + a + + + + ¦t + — + + + — — — + ± — + — + — — D + a + + — + + + — + + + ± + + T + — + + + + D + a ± + — + + — — — + NO*2 — — — r + — + ± + ± + Q/D/ sferoidalny + a — ± — — — — — — — — — NO NO + ¦ + + ± — — NO — K + a + + + + + + — + + + + — — + ± — • + — — — — D + a — ± — — — — — — — ± — NO NO + NO — ¦ ± — — NO — — + a — + — — — — — . — — — — — — T 4- ± — — — — — D I : chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolium * 2 : nie oznaczono 3. Metody hodowli bakterii Hodowla tych mikroorganizmów prowadzona jest w sposób konwencjonalny, na przyklad komórki bakteryjne mozna otrzymac przez stacjonarna hodowle przy dostepie tlenu w bulionie Rogosa o ponizej podanym skladzie i mozna je nastepnie zbierac przez odwirowanie.Sklad bulionu Rogosa Tryptikaza Wyciag drozdzowy Tryptoza K2HPO4 KH2PO4 Cytrynian triamoniowy Emulgator Tween 80 Glukoza Chlorowodorek cysteiny Roztwór soli *1 Woda destylowana uzupelnienie do 10g 5g 3g 3g 3g 2g Ig 20 g 0,2 g 5 ml 1 litra4 140 897 (pH 7, sterylizacja termiczna w temperaturze 121°C przez 15 minut) *1MgS04-7H20 ll,5g FeS04-7H20 0,68 g MnS04- 7H20 2A g Woda destylowana 100 ml Wytwarzanie bialka CRP Typoweprocesy wytwarzania bialka CRP sposobem wedlug wynalazku przebiegajajak nastepuje: 1. Zbieranie mikroorganizmów Kazdy z wymienionych powyzej szczepów zaszczepia sie w bulionie Rogosa, inkubuje bez miesza¬ nia w temperaturze 37°C przez 5 do 10 godzin przy dostepie tlenu az do otrzymania bulionu pozywki hodowli o pewnej znacznej koncentracji komórekbakteryjnych. Bulion hodowli w sposób ciagly odwirowuje sie z predkoscia 12000 obr/min. Zebrane komórki bakteryjne przemywa sie nastepnie 2 do 3 razy roztworem soli (0,85% NaCl). 2. Rozrywanie komórek bakteryjnych a) Przemyte komórki zawiesza sie w fizjologicznym roztworze soli i przez 10 minut utrzymuje sie w temperaturze 115°C celem rozerwania komórek. b) Komórki bakteryjne przemyte i zawieszone w fizjologicznym roztworze soli rozrywa sie przez poddawanie dzialaniu fal dzwiekowych, obróbce w prasie wysokocisnieniowej oraz innymi konwencjonalnymi sposobami. 3. Usuwanie tluszczu z komórki.Zawiesine rozerwanych komórek miesza sie z roztworem chloroform-metanol(2:1,% objetoscio¬ we). Skladniki rozpuszczalne w organicznym rozpuszczalniku usuwa sie nastepnie calkowicie przez odwirowanie w ciagu 10 minut przy 3000 obr/min i odrzuca sie warstwe chloroformowa. 4. Traktowanie enzymami proteolitycznymi.Odtluszczona powyzsza próbke traktuje sie w ogólnie przyjety sposób proteolitycznymi enzymami takimi, jak pronaza, trypsyna i pepsyna. W sposobie wedlug wynalazku najkorzystniej jest stoso¬ wac jako enzym proteolityczny pronaze. Warunki traktowania tym enzymem podano w Methods m Enzymology, vol. VIII, s. 26 (1966). 5. Oczyszczanie Otrzymana po odwirowaniu sklarowana ciecz z proteolitycznej mieszaniny reakcyjnej zadaje sie srodkami stracajacymi, takimi jak kwas trichlorooctowy lub siarczan amonowy, w celu stracenia frakcji bialkowej. Frakcje bialkowa traktuje sie z kolei odpowiednimi nukleazami w celu usuniecia wystepujacych w tej frakcji skladowych kwasów nukleinowych, takich jak DNA i RNA. Po kazdym dzialaniu enzymem ponownie przeprowadza sie dialize.Czesciowo oczyszczona frakcje poddaje sie nastepnie powtarzalnym dalszym zabiegom oczy¬ szczania, takim jak chromatografia zelowa i frakcjonowanie siarczanem amonowym, w wyniku czego otrzymuje sie ostatecznie czysty preparat bialka okreslany jako bialko CRP.Bialko CRP mozna najogólniej biorac otrzymac, w zaleznosci od jego charakterystyk fizyko¬ chemicznych, które omówiono ponizej, w wyniku szeregu szeroko stosowanych w tej dziedzinie operacji wyodrebniania i oczyszczania takich, jak wytracanie-rozpuszczanie i ekstrakcja, ekstrak¬ cja rozpuszczalnikowa, dializa, chromatografia kolumnowa, elektroforeza, chromatografia zelo¬ wa wzglednie ich kombinacji. W zwiazku z tym sposób wedlug wynalazku nie jest ograniczony do wymienionych w niniejszym opisie operacji.Takwiec przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania produktów obnizajacych poziom cholesterolu we krwi, które skladaja sie z bialka i które otrzymuje sie z mikroorganizmów nalezacych do rodzaju Streptococcus, poniewaz we frakcji bialkowej stwierdzono aktywnosc farmakologiczna. Opisano to szczególowo w podanych ponizej przykladach. Stwierdzono ponadto, ze sklarowana ciecz z bulionu pozywki hodowli wykazuje czynnosc obnizania poziomu cholesterolu we krwi, odpowiadajaca w przyblizeniu okolo 1/5 aktywnosci komórek bakteryjnych.Fizykochemiczne charakterystyki bialka CRP Bialko CRP wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazuje nastepujace charakterystyki fizykochemiczne i fizjologiczne: 1. Wlasciwosci chemiczne i rozpuszczalnosc Sproszkowana próbka otrzymana po rozlozeniu soli i liofilizacji byl nie rozplywajacy sie na powietrzu bialy proszek, bardzo dobrze rozpuszczalny w wodzie i rozpuszczalny w acetonie. W140 807 5 rzypadku zmieszania roztworu bialka CRP w niskiej temperaturze (4°C) z siarczanem amonowym lub kwasem triochlorooctowym zaobserwowano odpowiednio zmetnienie albo wytracenie sie osadu. 2. Masa czasteczkowa Mase czasteczkowa bialka CRP oszacowano na 30000 ± 7000 stosujac metode chromatografii zelowej przy uzyciu kolumny Toyopearl HW 55 (ToyosodaCo., Ltd.), doprowadzonej do stanu równowagi przy uzyciu 25 mM roztworu buforowego Tris-HCl zawierajacego 0,3 M NaCl (pH 7,5). 3. Punkt izoelektryczny Punkt izoelektryczny bialka CRP zmierzono metoda ogniskowania izoelektrycznego przy uzyciu 5% zelu poliakryloamidu zawierajacego Amfoline (pH 3,5 do 10, LKB Co., Ltd.), przy koncowym stezeniu 2% w temperaturze 4°C przy stalym napieciu 200 V przez 3 godziny. Jako roztwory elektrodowe dla anody i katody stosowano odpowiednio 0,02 M roztwór H3PO4 i 1 M roztwór NaCl. Wprowadzono próbke w ilosci 100//g i przeprowadzono barwienie próbki przy uzyciu barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250. Punkt izoelektryczny oznaczono na 7,9±0,2.Wartosc ta lezala pomiedzy danymi dla wzorcowych bialek hemoglobiny szczurów i mioglobiny kaszalotów. 4. Sklad aminokwasów Próbke 1 mg zawieszono w 1 ml 6 N HC1 i wprowadzono do ampulki, zamrozono w mieszani¬ nie suchy lód-metanol i pod zmniejszonym cisnieniem zastapiono powietrze gazowym N2- Wymiane gazu powtarza sie 3 razy i ampulke zatopiono pod zmniejszonym cisnieniem. Po hydrolizie w temperaturze 110°C przez 24 godziny w bloku grzejnym usunieto chlorowodór przez odparowanie obrotowe pod zmniejszonym cisnieniem i próbke rozpuszczono w 200/ii 1/50 N HO.Nastepnie 50//l tej próbki poddano analizie w analizatorze aminokwasów (szybki analizator aminokwasów — Model 835 High Speed Amino Acid Analyzer, Hitachi, Ltd.). Sklad aminokwa¬ sów próbki bialka CRP podano w tabeli 3.Tabe la III.Aminokwas glicyna alanina glutaminian asparaginian lizyna leucyna walina izoleucyna treonina tyrozyna seryna prolina arginina fenyloalanina metionina histydyna cysteina % molowe 25,23 10,98 10,34 8,20 6,39 5,58 5,41 5,18 4,23 4,19 3,46 2,62 2,60 2,51 1,56 1,30 0,16 5. Obraz elektroforezy krazkowej Krazkowe analizy elektroforetyczne bialka CRP (25fig) przeprowadzono na zelach poliakrylo¬ amidu (7% poliakryloamidu) w roztworze buforowym Tris-glicyny (pH 8,3) przy 4 mA/zel w ciagu 2,5 godziny. Uzyskano wyrazne pasmo bialka próbki w odleglosci 4,2 ± 0,2 cm od anody. Obraz zelu i rozkladu densytometrycznego elektroforezy przedstawiono na fig. 1. . 6. Charakterystyki fizjologiczne Bialko CRP wykazuje aktywnosc biologiczna, obnizajac poziom cholesterolu we krwi ssaków przy podawaniu doustnym. Podczas przechowywania bialka CRP aktywnosc ta jest stabilna w zakresie od co najmniej -80°C do 115°C oraz pH od 4,1 do 10,9.Dzialanie farmakologiczne bialka CRP 1. Skutki farmakologiczne6 140807 Jak przedstawiono w podanym ponizej przykladzie, lek przeciw miazdzycy naczyn zawiera¬ jacy bialko CRP wytworzone sposobem wedlug wynalazku moze spowodowac wyjatkowo skute¬ czne obnizanie poziomu cholesterolu we krwi ssaków. W zwiazku z tym lek tenjest przydatny jako srodek podawany leczniczo albo zapobiegawczo w przypadkach chorób zwiazanych z miazdzyca naczyn, hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia, nadmiarem lipidów w ustroju, kamica pecherzyka zólciowego, nadcisnieniem, cukrzyca i innymi zaburzeniami.Preparaty zawierajace jako skladnik czynny bialko CRP wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku mozna podawac ssakom doustnie, sródotrzewnowo i dozylnie, jak równiez wykorzystujac inne sposoby podawania. Stosowana dawka moze wynosic od okolo 1 /jg do 1 g/kg wagi ciala, korzystnie przy podawaniu doustnym od okolo 0,1 mg do 100 mg/kg wagi ciala. Mozna wybierac dowolna forme leku zawierajacego jako skladnik czynny bialko CRP wytwarzane sposobem wedlug wynalazku i tak mozna je stosowac jako roztwór w fizjologicznym roztworze soli oraz innych cieczach, zastrzyki, proszek otrzymywany przez liofilizacje lub innymi metodami, czopki, tabletki z powloka rozpuszczajaca sie dopiero wjelitach, tabletki do ssania podjezykiem, granulki, tabletki, kapsulki itd., z odpowiednimi nosnikami (na przyklad skrobia, dekstryna), podlozami rozcienczajacyim (na przyklad weglan wapniowy, laktoza), rozcienczalnikami (na przyklad fizjo¬ logiczny roztwór soli, woda destylowana) itd. 2. Ostra toksycznosc Jak podano to w przykladzie ponizej, wartosc LD50 bialka CRP wytwarzanego sposobem wedlug wynalazku wynosi powyzej 802 mg/kg wagi ciala, oznaczana na myszach przy podawaniu sródotrzewnowego. Substancja ta jest zasadniczo biorac nietoksyczna przy podawaniu doustnym.Wytwarzanie bialka CRP sposobem wedlug wynalazku zostanie zilustrowane podanymi ponizej przykladami.Przyklad I Wytwarzanie i oczyszczanie bialka CRP. Szczep Streptococcus faecium ADV 1009 (FERM BP-296) zaszczepiono w 21 bulionu Rogosaprzy koncowym stezeniu 1 X 106 komó¬ rek bakteryjnych/ml. Zaszczepiona pozywke poddano inkubacji w temperaturze 37°C przez 10 godzin bez mieszania przy dostepie tlenu, az do otrzymania 109 komórek bakteryjnych/ml bulionu hodowli. Komórki baktekryjne zebrano przez ciagle odwirowywanie z predkoscia 12000 obr/min, przemyto fizjologicznym roztworem soli (0,85% NaCl) i zawieszono w tym samym roztworze, otrzymujac 100 ml zawiesiny komórek o stezeniu 2X I010/ml.Otrzymana zawiesine komórek bakteryjnych poddano obróbce termicznej ogrzewajac na 10 minut do temperatury 115°C i 3 razy potraktowano mieszanina chloroform-metanol (2:1, sto¬ sunki objetosciowe), celem usuniecia tluszczów. Odtluszczona zawiesine bakteryjna wirowano przez 10 minut z predkoscia 3000 obr/min i odrzucono warstwe dolna, to znaczy chloroformowa.Warstwe wodna wykorzystano jako material wyjsciowy do dalszych etapów oczyszczania.Ten material wyjsciowy potraktowano 20 mg pronazy (Sigma proteaza typ XIV) w 100 ml fosforanowego roztworu buforowego (pH 7,8), zawierajacego 0,0015 M CaCU, w temperaturze 47°C przez 24 godziny, po czym w tych samych warunkach powtórzono traktowanie przy uzyciu 10 mg pronazy. Warunki eksperymentalne traktowania pronaza oparte sa i opisane w publikacji „Methods in Enzymology", vol. VIII, s. 26 (1966).Material potraktowany pronaza podzielono na frakcje osadu i sklarowanej cieczy nad nim przez odwirowanie przez 10 minut z predkoscia 3000 obr/min. Do frakcji sklarowanej cieczy dodano 1/9 objetosci 100% (% wagowo/objetosciowe) kwasu trichlorooctowego (TCA), odsta¬ wiono na 3 godziny w temperaturze 4°C przy stalym mieszaniu i nastepnie wirowano przez 10 minut z predkoscia 3000 obr/min celem uzyskania frakcji osadu i sklarowanej cieczy nad osadem.Do frakcji osadu dodano te sama objetosc 10% TCA i powtórzono ten sam proces. Otrzymany osad przemyto 3 razy eterem etylowym w celu usuniecia TCA, rozpuszczono w 50 ml wody destylowanej, zobojetniono 1N NaOH, poddano dializie celem calkowitego usuniecia TCA i na koniec odwirowano otrzymujac 345 mg wysuszono osadu.Do otrzymanego osadu (345 mg) dodano 5 ml 0,1 M buforu trisoctanowego (pH 8,0), 1 ml 0,1 M octanu magnezowego oraz 0,06 ml dezoksyrybonukleazy (2 mg/ml dezoksyrybonukleazy I (Sigma)), po czym poddano inkubacji w temperaturze 37°C przez 1 godzine. Nastepnie mieszanine reakcyjna poddano dializie wzgledem wody destylowanej przy uzyciu rurki z celulozy (Cellotube, Nakarai Kagakuyakuhin Co., Ltd., Japonia), dializuja substancje o masie czasteczkowej ponizej140W7 7 3500 przez 3 dni. Dializowana frakcje odparowano do sucha. Otrzymany material zawieszono nastepnie w 5 ml 0,05 M buforu octanowego (pH 4,6) zawierajacego 440 jednostek rybonukleazy T2 (Sigma), poddano inkubacji w temperaturze 37°C przez 3 godziny i poddano dializie wzgledem wody destylowanej. Dializowana frakcje o ciezarze czasteczkowym powyzej 20000 oznaczonojako oczyszczona frakcje I (sucha masa 285 mg).Powyzsza oczyszczona frakcje I ponownie potraktowano rybonukleaza T2 i poddano dializie celem otrzymania oczyszczonej frakcji II (sucha masa 274 mg). Oczyszczona frakcje II wprowa¬ dzono do chromatografu kolumnowego ToyopearlHW 55, doprowadzonego do stanu równowagi przy uzyciu 25 mM roztworu buforowego Tris-HCl (pH 7,5) zawierajacego 0,3 M NaCl. Chroma- togram kolumnowy frakcji II przy predkosci eluowania 1 ml/min przedstawiono na fig. 2; linia A przedstawia zawartosc bialka mierzona przez absorbancje przy fali 280 nm; linia B przedstawia zawartosc kwasu nukleinowego mierzona przez absorbancje przy fali 260 nm; zas linia C przedsta¬ wia zawartosc cukru oznaczana metoda wykorzystujaca fenol — H2SO4.Porcje eluowana pózniej niz przedstawiona linia D na fig. 2 (objetosc eluatu 67 ml) potrakto¬ wano siarczanem amonowym (nasycenie 55%) i ze sklarowanego plynu frakcjonowania siarcza¬ nem amonowym otrzymano oczyszczona frakcje III (sucha masa 205,5 mg).Na fig. 3 przedstawionochromatogram kolumnowy oczyszczonej frakcji III, wykonany w tych samych warunkach eksperymentalnych, co podano dla fig. 2.Poniewaz frakcja III zawiera sladowe ilosci cukrów, to frakcje te potraktowano 3 razy 10% TCA i poddano dializie w tych samych warunkach, po czym otrzymano ostatecznie oczyszczone bialko CRP (sucha masa 197,3 mg). Na fig. 4 przedstawiono chromatogram kolumnowy bialka CRP, wykonany w tych samych warunkach eksperymentalnych,jak dla 2 i fig. 3. Fizykochemiczne charakterystyki bialka CRP podano powyzej.W tablicy 4 zestawiono wydajnosc ogólna oraz ilosc bialka oznaczone metoda Lowry'ego, RNA oznaczone orcyna, DNA oznaczone difenyloamina, oraz cukrów oznaczane mieszanina fenol — H2SO4, dla poszczególnych preparatów. Podane w tablicy ilosci oznaczaja sucha mase (mg).T a b e 1 a IV.Frakcja Osad Oczyszczona frakcja I Oczyszczona frakcja 11 Oczyszczona frakcja III Bialko CRP Wydajnosc 345 285 274 205,5 197,3 Bialko 265,9 260,1 258,3 202,6 197,3 RNA 43,6 11,3 3,6 slady slady DNA 6,3 ' 1,2 0,8 slady slady Cukry 14,3 12,1 11,2 2,9 slady Aktywnosc wlasciwa 9,1 11,7 11,8 16,9 17,6 Podana w Tablicy4 aktywnosc wlasciwa oznacza wzgledna aktywnosc obnizenia cholesterolu przez kazda frakcja u konwencjonalnych szczurów na jednostke wagi, przy czym wspomniane wyzej, poddane obróbce termicznej komórki bakteryjne przyjeto za 1. Sposoby oznaczania aktyw¬ nosci pod wzgledem obnizania poziomu cholesterolu we krwi w toku eksperymentów na zwierze¬ tach podano ponizej w przykladzie II.Ponadto potwierdzono, ze w przedstawionym w tym przykladzie sposób bialko CRP mozna wyodrebniac i oczyszczac korzystajac z innych, wymienionych w Tablicy 1 szczepów bakteryjnych, przy czym wystepuja jedynie niewielkie róznice w wydajnosci.Przyklad II. Dzialanie farmakologiczne bialka CRP 1. Aktywnosc pod wzgledem obnizania poziomu cholesterolu we krwi (1) Przygotowano próbki bialka CRP w fizjologicznym roztworze soli, zawierajace odpowiednik 50 mg/kg wagi ciala liofilizowanego bialka CRP. Próbki te podawano doustnie w dziennej dawce 1 ml konwencjonalnym szczurom (18-tygodniowe samce, przecietna waga ciala 246 g, po 10 szczurów w kazdej grupie) oraz konwencjonalnym i jalowym myszom (18-tygodniowe samce, przecietna waga ciala 30 g, po 10 myszy w kazdej grupie). Szczury i myszy hodowano przez 8 do 12 tygodni. Nastepnie pobierano krew tetnicza z tetnic brzusznych tych zwierzat i przez wirowanie z pelnej krwi oddzielono próbki surowicy.Zawartosc cholesterolu oznaczono metoda Zurkowskiego (Choleskit, Kanto Kagaku K. K., Japonia).Wyniki oznaczen zestawiono w Tabeli 5. Podane w Tabeli wartosci oznaczaja spadek (%) wzgledem wartosci dla grup kontrolnych, którym nie podano próbek leku. Sklad podawanej zwierzetom bez ograniczen diety (w % wagowych) podano w Tabeli6.8 140 807 T a b e 1 a V.Zwierzeta Spadek (9C) Konwencjonalne szczury (12tygodni) 25,2 ±0,7 Konwencjonalne myszy (8tygodni) 33,5 ±1,1 Jalowe myszy (8 tygodni)_ 21,7 ±0,9 T a b c 1 a VI Sklad Kazeina Olej sojowy Skrobia pszeniczna Sole mineralne Mieszanka witaminowa Sproszkowana bibula filtracyjna Waga, % 20 10 61 4 2 3 2. Aktywnosc pod wzgledem obnizania cholesterolu we krwi (2) Wyzej wspomniane próbki podawano doustnie w dziennej dawce 1 ml konwencjonalnym szczurom (18-tygodniowe samce, przecietna waga ciala 238 g, po 15 szczurów w kazdej grupie) oraz konwencjonalnym i jalowym myszom (18-tygodniowe samce, przecietna waga ciala 31 g, po 10 myszy w kazdej grupie) przez 12 tygodni. Zawartosc cholesterolu we krwi oznaczonojak opisano powyzej, zas wyniki zestawiono w Tabeli7.Zastosowanie w tej Tabeli okreslenia „z dodatkiem cholesterolu" i „z dodatkiem fruktozy" oznaczaja odpowiednio dodatek 1% cholesterolu do wyzej podanej diety oraz zastapienie fruktoza calej ilosci skrobii pszenicznej w powyzszej diecie. Podane w Tabeli wartosci oznaczaja spadek zawartosci cholesterolu (%) wzgledem wartosci dla grupy kontrolnej, której nie podano próbek leku.TabelaVII.Zwierzeta Spadek (9f) Jalowe myszy*1' 35,4± 1,3 Konwencjonalne myszy*1 ' 38,9±0,7 Konwencjonalne szczury*1 ' 49,2±l,l Konwencjonalneszczury*2' 41,5± 1,3 l1 j Dicta l dodatkiem cholesterolu * ' Dieta z dodatkiem fruktozy 3. Aktywnosc pod wzgledem obnizania poziomu cholesterolu we krwi (3) Próbki w fizjologicznym roztworze soli, zawierajace 10 mg/ml bialka CRP podawano doust¬ nie w dziennej dawce 1 ml na szczura przez 2 tygodnie szczurom wykazujacym podwyzszony poziom cholesterolu we krwi (18-tygodniowe samce, przecietna waga ciala 250 g, po 5 szczurów w kazdej grupie), karmionym dieta z „dodatkiem cholesterolu". Poziom cholesterolu we krwi ozna¬ czono jak opisano powyzej, zas wyniki zestawiono w Tabeli 8. Wartoscpodana dla grupy, której podawano lek oznacza spadek poziomu cholesterolu (%) wzgledem wartosci dla grupy kontrolnej, której nie podawano próbek leku.TabelaVIII Zwierzeta Spadek (%) Gnip?, której podawano próbki leku 49,9 Grupakontrolna 0 4. Reakcja na dawke Próbki w fizjologicznym roztworze soli, zawierajace 0,1 mg-20 mg/ml bialka CRP podawano140807 9 doustnie w dziennej dawce 1 ml na szczura konwencjonalnym szczurom (6-tygodniowe samce, przecietna waga ciala 216 g, po 5 szczurów na grupe) przez 4 tygodnie. Poziom cholesterolu we krwi oznaczano jak opisano powyzej (grupie kontrolnej nie podawano próbek leku). Wyniki oznaczen zestawiono w Tabeli9.TabelaIX Dawkowanie (mg/szczura) Grupa kontrolna 0.1 ) 10 20 Spadek (przecietnie 9c) 0 9,8±0,7 14,3±1,2 47.9±1J 51,1±0,9 5. Ostra toksycznosc Próbki w fizjologicznym roztworze soli (0,5 ml/mysz) zawierajace 1,10 i 100 mg bialka CRP podawano sródotrzewnowo myszom ICR (6-tygodniowe samce, przecietna waga ciala 31,4t0,6 g, po 10 myszy w kazdej grupie). Badania tanatobiologiczne myszy prowadzono przez 14 dni. Grupie kontrolnej podawano fizjologiczny roztór soli.Wartosc LD50 obliczono wedlug metody Behrens-Karbera i wynosila powyzej 802 mg/kg wagi ciala. Przy podawaniu doustnym substancja ta byla zasadniczo biorac nietoksyczna. 6. Preparaty farmaceutyczne (1) 50 mg oczyszczonego bialka CRP zmieszano dokladnie z 250 mg oczyszczonej sproszko¬ wanej skrobii i uformowano tabletki do podawania doustnie. Tabletkata odpowiada dawce 1010 obrabianych termicznie komórek bakteryjnych/kg wagi ciala dla doroslej osoby o wadze ciala 50 kg. (2) Bialko CRP mozna jednorodnie zmieszac z podlozami rozcienczajacymi takimi,jak weglan wapniowy, laktoza, itp., srodkami poslizgowymi takimijak kwas stearynowy, talk itp. oraz innymi dodatkami i mozna nastepnie uformowac tabletki do podawania doustnie. Tabletkata nHnnwsada dziennej dawce 0,1 mg — 100 mg/kg wagi ciala. (3) 900 mg bialka CRP zawieszono i rozpuszczono w 30 ml wody destylowanej oslodzonej i nastepnie wykonano z niego syropy.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania bialka obnizajacego poziom cholesterolu we krwi, które powoduje obnizenie poziomu cholesterolu we krwi ssaków i posiada nastepujace cechy charakterystyczne: a) masa czasteczkowa oznaczona metoda chromatografii zelowej: 30000+7000, b) punkt izoelektryczny: 7,9±0,2, c) sklad aminokwasów (% molowe): glicyna glutaminian lizyna walina treonina seryna arginina metionina cysteina 25,23 alanina 10,34 asparaginian 6,39 leucyna 5,41 izoleucyna 4,23 tyrozyna 3,46 prolina 2,60 fenyloalanina 1,56 histydyna 0,16 10,98 8,20 5,58 5,18 4,19 2,62 2,51 1,30 d) obraz elektroforezy:wyrazne pasmo po stronie anody przy elektroforezie na zelu poliakry- loamidu, znamienny tym, ze hoduje sie mikroorganizm nalezacy do rodzaju Streptococcus w odpowiedniej pozywce hodowlanej i z tej hodowli wyodrebnia sie bialko obnizajace poziom cholesterolu we krwi. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, zejako hodowany miokroorganizm stosuje sie co najmniej jeden mikroorganizm taki jak S. faecium, S. faecalis, S. avium, S. bovis, S. salivarius, S. durans, S. mitis i S. equinus.10 140 807 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako hodowany mikroorganizm stosuje sie co najmniej jeden szczep taki jak S. faecium FERM BP-296, S. faecalis FERM BP-297, S. avium FERM BP-299, S. durans FERM BP-300, S. mitis FERM BP-301 i S. eauinus FERM BP-302. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze bialko obnizajace poziom cholesterolu we krwi otrzymuje sie z hodowli tak, ze rozrywa sie zebrane z hodowli komórki bakteryjne i wyodrebnia sie z nich frakcje bialkowa.Fig. I 0 ®140807 900r Fig. 2 750[ ;A ;B ;C —— ;D 5001- 250 100 50 0 50 (67) 75 100 Objetosc roztworu eluujacego [ml]140807 Fig. 3 900 750 F 500 250 h 50 75 100 Objetosc roztworu eluujacego [ml]140807 Fig. 4 O 50 75 100 Objetosc roztworu eluujgcego [ml] PL PL PL PL PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania bialka obnizajacego poziom cholesterolu we krwi, które powoduje obnizenie poziomu cholesterolu we krwi ssaków i posiada nastepujace cechy charakterystyczne: a) masa czasteczkowa oznaczona metoda chromatografii zelowej: 30000+7000, b) punkt izoelektryczny: 7,9±0,2, c) sklad aminokwasów (% molowe): glicyna glutaminian lizyna walina treonina seryna arginina metionina cysteina 25,23 alanina 10,34 asparaginian 6,39 leucyna 5,41 izoleucyna 4,23 tyrozyna 3,46 prolina 2,60 fenyloalanina 1,56 histydyna 0,16 10,98 8,20 5,58 5,18 4,19 2,62 2,51 1,30 d) obraz elektroforezy:wyrazne pasmo po stronie anody przy elektroforezie na zelu poliakry- loamidu, znamienny tym, ze hoduje sie mikroorganizm nalezacy do rodzaju Streptococcus w odpowiedniej pozywce hodowlanej i z tej hodowli wyodrebnia sie bialko obnizajace poziom cholesterolu we krwi.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, zejako hodowany miokroorganizm stosuje sie co najmniej jeden mikroorganizm taki jak S. faecium, S. faecalis, S. avium, S. bovis, S. salivarius, S. durans, S. mitis i S. equinus.10 140 807

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako hodowany mikroorganizm stosuje sie co najmniej jeden szczep taki jak S. faecium FERM BP-296, S. faecalis FERM BP-297, S. avium FERM BP-299, S. durans FERM BP-300, S. mitis FERM BP-301 i S. eauinus FERM BP-302.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze bialko obnizajace poziom cholesterolu we krwi otrzymuje sie z hodowli tak, ze rozrywa sie zebrane z hodowli komórki bakteryjne i wyodrebnia sie z nich frakcje bialkowa. Fig. I 0 ®140807 900r Fig. 2 750[ ;A ;B ;C —— ;D 5001- 250 100 50 0 50 (67) 75 100 Objetosc roztworu eluujacego [ml]140807 Fig. 3 900 750 F 500 250 h 50 75 100 Objetosc roztworu eluujacego [ml]140807 Fig. 4 O 50 75 100 Objetosc roztworu eluujgcego [ml] PL PL PL PL PL PL