PL101305B1 - Sposob wytwarzania luknomycyny,nowego antybiotyku grzybobojczego i niszczacego jednokomorkowce - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia luknomycyny, nowego antybiotyku grzybobój¬ czego i niszczacego jednokomórkowce.

Znane sa juz rózne antybiotyki grzybobójcze, ale wszedzie na swiecie prowadzone sa badania, których celem jest odkrycie nowych srodków grzybobójczych o lejpszych wlasciwosciach od juz znanych.

Nowy srodek grzybobójczy i przeciw jednoko¬ mórkowcom, nazwany -luknomycyna, okazal sie skuteczny w zahamowywaniu wzrostu Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis i Aspergillus niger. Jest on {równiez skuteczny przeciw Trichomonas vaginalis.

Luknomycyna ma nastejpujace wlasciwosci che¬ miczne i fizyczne: Wlasciwosci fizyczne. Wyglad zewnetrzny: pro¬ szek w kolorze zólto-oranzowym.

Analiza chemiczna (elementarna): z wyliczenia C61H90Np^ (ciezar molowy 1240): C=59,03 H=7,74 Otrzymany: C=58,92 H=7,,58 N=2,26(%) N=2,29(%) Punkt topnienia: rozklad produktu nastepuje przy 1!50°C, ale nawet (w 300°C on sie nie topi.

Rozpuszczalnosci: — rozpuszczalny iw pirydynie, dwumeitydoformami- dzie i dwumetyloacetamMzie, — niecalkowicie (nieznacznie) rozpuszczalny w al¬ koholu metylowym 60fl/o, stezonym alkoholu etylowym, alkoholu izopropylowym, — nierozpuszczalny w benzenie, acetonie, wodzie, chloroformie, bezwodnym alkoholu etylowym, cylkoheksanie, octanie etylu i eterze.

W kwasie siarkowym srodek grzybobójczy daje zabarwienie ciemnoniebieskie.

Widmo w podczerwieni: otrzymane z pastylki KBr (w cm-1) 3100(W)*** 1T15(M) 1575i(W) HaOOflW) 129ia(!W) '114(K'W) 1045|(!W) 940(W) 835(W) 2930(S) 1650 1545(W) 1350:(iW) 1250(W) lllO(M) 1010(S) 690(W) 800(W) 3400l(S)* 2860 16OO0S) 146^(W) 1325i(W) ll<85(iS) 1075(S) 995(W) 850 *) silna "abisorbcja **) abisorbcja! srednia ***) abisorbcija nieznaczna Widmo w ultrafiolecie: otrzymane przy stezeniu 1 mg/100 ml dwumetyloformamidu 344 mp, i(s =3,5 "104) 364 mu 384 mi* '(£ =8,04vlO4) 40« mji (s=6,6 -104) Skrecalnosc: (a)D='1870 iprzy 194° (C=0,3 w dwu- metyloformamidzie w 25°C) Wlasciwosci chemiczne.

— Luknomycyna zaliczona izoatala do heiptenów aromatycznych, poniewaz wytwarza ona przez 101 305101 305 zwrotna aldolizacje' N-metylo-p-amino-aceto- fenon.

— Metancliza przypisuje luknomycynie sklad ty¬ pu cukru, okreslonego iw teij samej skali co mykozamina.

— Lruknooiycyna nie zawiera wolnej grupy karbo¬ ksylowej.

Wlasciwosci biologiczne. Obraz grzybobójczy.

W srodowisku pepton — 'glukoza, zaszczepionym badanym drobnoustrojem, wprowadza sie lukno- mycyne o róznym stopniu rozcienczenia. Po 2 do dniach inkubacji w 28°C okresla Sie liczbe mikrogramów antybiotyku na jeden milimetr sro¬ dowiska, które trzeba wykorzystac w celu otrzy¬ mania calkowitego zahamowania wzrostu (MIC) badanego drobnoustroju. Dla leipszego uwidocznie¬ nia dzialania grzybobójczego iuknomycyny porów¬ nano jej dzialanie z dzialaniem innych znanych juz antybiotyków grzybobójczych (tablica 1>.

Tablica 1 Drobnoustrój Candiida albieans 11091 Asipergiilluis niiger Trichophyton mentaigrophytes Trichophyton aciuminaltuim Wifchomonas vagimalis Candida kriusei | Candida frropiiealis Srodek Luknomycyna Nystatyna AmfOiterycyna Pimarycyna Luknomycyna Nystatyna Amfotenaicyna Pimarycyna Luknomycyna Nystatyna Luknomycyna Nystatyna Luknomycyna Nystatyna Amfoterycuna B Pimarycyna Meltronidazol Luknomycyna Luknomycyna | (MIiG/pg/ ml) | 04^0,2 2,5 1,25 0,5 0,6 2,5 12,5 <0,05 >io >10: >10 0,5 0,2^0,4 oa—0,2 1 Obraz antybakteryjny. Stosowane sa takie same warunki doswiadczenia, jak idila obrazu grzybo¬ bójczego, z tym jednak wyjatkiem, ze czas inku¬ bacji w 37°C wynosi jeden dzien. Luknomycyna nie wywiera wplywu hamujacego przy stezeniu mikrogramów/ml, na nastepujace bakterie: Escherichia coli Klebsiella pneuimoniae Lactobacillus acidophilus Proteus miraibilis Pseudomonias aeruginosa Staphylococcus atureus Strepitococcus faecalis Dzialanie przeciw jednokomórkowcom. Stezenie 0,5 mikrogramów/ml antybiotyku zabija 50°/o orga¬ nizmów kultury, przy pelnym wzroscie Tricho- monas vaginalis, w przeciagu 30 minut.

Toksycznosc: (smiertelna dawka LD50 dla myszy w mg/kg: sposób wprowadzenia LD 50 dozylnie 10—20 40 45 60 do otrzewnej ...... 5—10 podskórnie >800 z U dokosci 1 tr,i >$Q0< Badania farmaceutyczne na zywych Organizmach.

Dzialanie antitrichomonas vaginalis. Badanie to prowadzono na myszach, na wrzodzie podskórnym z Triichomonas vaginalis. ED 50 oznacza od po¬ czatku wstrzykniecia podskórnego, we wrzodzie, stosujac zawiesine (albo roztwór) w^rnienionych srodków o róznych stezeniach: ; Srodek ED 50 na Trichonianfas vaginalis (w |iig/ml> Luknomycyna 12 Kandycydyna 24 Trichomycyna 43 ."- Metronidazol 250. \ •» Pimarycyna '• 720 Dzialanie anticandida : albicans w ginekologii.

Badania pochwowe u szczura (samicy) wykonano dla Candida albicans. Porównawcze badania wyko¬ nano dla dwóch srodków, jako odniesienie: Myko- statyna (zasadniczy czynnik: Nystatyna) i Kanes- ten (zasadniczy czynnik: klotrimaizol) (tablica 2).

Tablica 2 Zasadniczy czynnik (w mg/tabletke) a) luknomycyna mg b) klOtriiimazol mg c) mykostatyna 4 mg Liczba szczurów wyleczonych Liczba szczurów poddanych badaniu po 4 wpr.* 14/16 17/18 /1(1 po 8 wpr. 13/13 16/17 e/11 po 12 wjptr. 12/12 17/17 0/11 *) wjpiroiwadzenie do organizmu a) sklad zelowy stosowanych do badan tabletek Luknomycyna 5 mg Boran sodowy 50 mig Aerosil R 972* 0,8 mg Preciroil** 1 mg LSNa*** 0,8 mg Avicel pH 102**** 52 mg Laktoza FiK do uzupelnienia 200 mg *) krzemionka koloidalna **) paflmiltOHsteairyniiain gliceryny ***) laiurylo-isiarczan sodowy ****) blonnik mikrokrystaliczny b) 1/5 handlowej tabletki 100 mg klotrimazolu c) 1/5 handlowej tabletki okolo 20 mg (100.000 jednostek) mykolstatyny.

Zastosowanie lecznicze. Luknomycyna jest anty¬ biotykiem grzybobójczym i przeciw jednokomór¬ kowcom, który mozina stosowac miedzy innymi w nastepujacych przytpadkadh: — ogólnie dzialanie na candidoses i powierzchnio¬ wo na skóre (dermatologia) albo na sluzy ustne, pochwowe i jelitowe, — dzialanie na idfekcje we wzerkach, spowodo¬ wanych przez Tirichomonas vaginalis a szcze¬ gólnie zasltiosowanie w ginekologii, v101 305 6 — zastosowanie w weterynarii, jako srodek grzy¬ bobójczy, — zastosowanie w rolnictwie do walki z imykosa- imi roslinnymi, — dzialanie lecznicze przeciw przerostowi prosta- tycznemu.

Przyklady skladów tabletek stosowanych w gi¬ nekologii.

Luknomycyna 10 mg i0 Kwalsny weglan sodowy 12,65 (mg Kwaswinowy 3,65 mg Aerosil IR972 0,8 mg Precirol l1 mg LSNa 0,8 mg 15 Avicel pH102 52 mg Laktoza FK jako uzupelnienie do 200 mg albo jeszcze: Luknomycyna 10 mg Mocznik 25 mg 20 Laktoza SJD Avicel 70 mg Stearynian magnezu itp.

Przyklady skladów grzybobójczych i przeciw 25 jednokomórkowcom, stosowanyclh w dermatologii.

W podlozach mozna stosowac odpowiednie ilosci srodków przeciwzapalnych, antybiotyków (albo srodków iprzeCiwzakaznych) o szerokim zakresie dzialania i/albo srodek zapobiegajacy krwawieniu. 30 Masc tlusta Luknomycyna 500 mg Dwumetyloacetamid 10 ml Wazelina 70°/a 1 Ciekla parafina 30*/o; } uzupelnienie do 100 g 35 Krem Luknomycyna 500 mg Dwumetyloacetamid 10 g Mieszanina jedno i dwustearynianu gliceryny 12,68 g 40 CrodawaxAI22 0,55 g NipaginM* 0,114 g Niipasol** 0,045 g Tween40*** 0,5 g woda destylowana jako uzupelnienie do 100 g 45 *) ester metylowy kwasu hydroksylofoenzo- esowego **) ester propylowy kwasu hydroksylobenzo- esowego ***) 'jedinoipalmiltyniah poliksyetylenosorbitu 50 (ATLiAfS> Masa bezwodna Luknomycyna 500 mg Dwumetyloacetamid 10 g Tween40 0,5 g 55 Woskjpfezezeli 3,5 g Alkoholstearynowy 20 g Gliceryna do uzupelnieniado 100 g Zel Luknomycyna 1000 mg 60 Dwumetyloacetamid 98 g Gliceryna 98 g Kwas nordmydrogwajakolowy 0,2 g Kwascytrynowy 0,1 g Carbopol040* 2 g 65 Trójetanoloamina q.s.

Tween40 Ig *) polimer kwasu akrylowego (GOODRICH) Opis drobnoustroju. Szczep produkcyjny lukno- mycyny zostal poddany badaniu identyfikacyjne¬ mu przez Centrallbureau voor Sohimmelculitures w Baar (Holandia) i oznaczony numerem szczeipu CBS 101 74. Badanie wykazalo, ze drobnoustrój odpowiada gatunkowi Streptomyces diastatochro- mogenes (Krains) Waksmana i Henrici'ego ze wzgledu na swoje podstawowe cechy. Jedyna róz¬ nice stanowi nie zuzywanie sacharozy,, co nie jest na tyle wazne, aby decydowalo o ustanowieniu nowego gatunku. S.bottropensis Waksmana 1956.

S.phaeophaciens Maeda i wsipólpracowników 1952, jak równiez S.luteogriseus Schmitza i wspólpra¬ cowników 1964 sa równiez bardzo zblizone i mo¬ ga byc nawet rozwazane jako synonimy, juz przed¬ tem opisanych przez Hiitter'a w 1967, dla Sibot- tropensils i Snphaeophaciens.

Celem zbadania morfologii i wlasciwosci kultu¬ ry, hodowano drobnoustroje (wziete do badania eza platynowa zarodniki w wodzie destylowanej z kultur, w rurkach przy badaniach na skosach) na podlozu podanym ponizej, w czasie 10 do 14 dni w 28 ±1°C. Bezposrednio w mikroskopie op¬ tycznym obserwowano kultury dobrze zarodkowa- ne w naczynkach Petriego. Próbki do badan w mikroskopie elektronowym otrzymywano spraso- wujac ostroznie grzybnie na powleczonej siatce z miedzi. Obserwacje dotyczace wlasciwosci kul¬ tur byly równiez notowane, a mianowicie kolory grzybni powietrznej i grzybni wyjsciowej (Maers i Paul 1950) z uwzglednieniem zmian zabarwienia podloza. Kolor .(tablica 3).

Cechy mikroskopowe. Morfologia lancuchów za¬ rodków: Spdrale podzialowe. Spirale sa otwarte zlozone z 4 do 6 petli. Lancuchy zarodników dojrzalych skladaja sie od 10 do 50 zarodników. Rozgalezie¬ nia zarodników sa ulozone symtoidainlie. Zarodniki sa eliptyczne. Powierzchnia zarodników jest glad¬ ka.

Kolor kolonii: kolor masy powietrznej w serii, szary na podlozu drozdze —¦ slód, agat, maka owsiana — agar, gliceryna-asparajgina — agar i sól •— amidon — agar. Odwrotna strona kolonii: brak wyraznych barwników (brazowo-oliwkowy na diroizdizach-slddzie-agarze, brazowozóltawy dio bra¬ zowego z obrzezami zóltawymi na mace owsianej — agar i szaralwo-zólty z kilkoma jflamkaimli ciem¬ nobrazowymi na gliceryniie-aslparaginie-iagarze i soli-amidonie-agartee).

Kolor w podlozu: tworzenie barwników melano- idówych w pepiton-drozdzenzelaizo-agar i tyrozyna- -agar. Brak barwnika w drozdze-slód-agar, maka owsiana-agar, sól-dekstryna, agar i gliceryna-astpa- ragina-agar.

Cechy biochemiczne. wytwarzanie melairriiny — dodatnie rozkladtyrozyny — dodatnie wytwarzanie siarkowodoru — dodatnie proteoliza(zelatyna) — dodatnie redukcja azotanów — ujemne pobieranie wegla — arabinóza, ramnoza, glukoza,101 305 Tablica 3 Podloze 1. majka owsiana-agar 2. sole mineralne-dekstryna agar 3. asparagina-iglukoza agar 4. drozdze^slód-agar . agar Czapek 6. agar Conn 7. agar odzywczy 8. pomidor-.maka owsiana agar 9. agat Hickey Tresner . zieimniaki^agar 11. melasa^agar Obserwacje . kolor grzybni w powietrzu szaro-brumatny szary szary szary jasnoszary bialy piaskowy brunaftnóbrazowy szaro-brazowy oliwkowo zielony kolor lupka szary kolor grzybni wyjsciowej (subsltrat) jasnobrazowy bladozólty bladozólty bladozólty jasnoiszary jasnobrazowy ploiwy jasnobrazowy bursztynowy cuikru klonu ciemnobrazowy tbarwtnik rozpuszczalny brak bralk brak bralk brak brak brazowy brak brak jasnobrazowy brak | galaktoza, fruktoza, mannoza, laktoza, maltoza dekstroza (glukoza), gliceryna i sajicyna sa calko¬ wicie zuzyte; ksyloza, rafinoza, dekstryna, inozy¬ tol, manniltol i octan sodowy sa czesciowo zuzyte; sacharoza, inulina, sorbit i cytrynian sodowy nie sa zuzylte.

Luknomycyne otrzymuje sie, gdy hoduje sie drobnoustroje, badane na .podlozu odzywczym wod¬ nym w warunkach aeracji zalanej. Celem wytwo¬ rzenia okreslonej ilosci tej substancji nalezy sto¬ sowac kultury powierzchniowa lub w kolbach.

Hoduje sie drobnoustroje w podlozu odzywczym, zawierajacym zródlo wegla, na przyklad przyswa¬ jalny weglowodór oraz zródlo azotu, na przyklad przyswajalny zwiazek azotu, albo substancje pro¬ teinowe.

Jako zródlo wegla zaleca sie, bez ograniczenia, nastepujace substancje: arabinoze, ramnoze, glu¬ koze, galaktoze, fruktoze, mannoze, laktoze, mal¬ toze, dekstroze, gliceryne, salicyne, ksyloze, rafino- ze, dekstryne, inositol, mannit, octan sodowy.

Jako zródlo azotu zaleca sie, bez ograniczenia, na przyklad: siarczan amonu, roztwór z maceracji kukurydzy, pepton, wyciag ze slodu, proteine z zia¬ ren bawelny. Mozna takze z dobrym wynikiem stosowac polaczenie tych zródel wegla i azotu.

Mozna dodac do podloza. fermentacyjnego sladowe iloscL metali (cynik, magnez, mangan, kobalt, zela¬ zo i'tp.). Wiadomo, ze do przygotowania tego pod¬ loza stosuje sie wode wodociagowa, oraz surowce naturalne nie oczyszczane.

Wytwarzanie luknomycyny wykonuje sie w za¬ kresie temperatur, pozwalajacym na odipowiedni wzorst drobnoustrojów, to jest od. 20 do 32UC, a najlepiej miedzy 27 i 29°C. Optymalny czas fer¬ mentacji moze zmieniac sie od 2 do Id dni. Naj¬ lepiej, aby podloze kulturowe wykazywalo wartosc pH okolo 7,0 dla stadium poczatkowego. Koncowa wartosc pH zalezy od obecnosci mieszaniny bufo7 rowej, najlepiej, aby takze wykazywalo 7,0 w mo¬ mencie sterylizacji.

Gdy fermentacja jest prowadzona w zbiornikach o duzej pojemnosci, dobrze jest stosowac do szcze¬ pienia hodowli raczej postac wegetatywna, niz za¬ rodkowa danego drobnoustroju, dla unikniecia opóznienia w wytwarzaniu luknomycyny i lepsze¬ go wykorzystania urzadzen fermentacyjnych. Dla¬ tego zaleca sie wytwarzanie szczepionki wegeta¬ tywnej w roztworze kulturowym odzywczym przez zaszczepienie tego rotworu odpowiednia iloscia kultury z liofilizatu lub kultury skosnej. W ten sposób otrzymuje sie szczepionke mloda i aktyw¬ na, i przenosi sie ja antyseptycznie do wiekszych pojemników. Podloze, które sluzy do wytwarzania szczepionki wegetatywnej moze byc takie samo albo inne do produkcji wiekszych ilosci luknomy¬ cyny, ale musi ono zapewnic dobry wzrost drobno¬ ustrojów.

Wyniki badan analitycznych luknomycyny na- daja temu zwiazkowi wzór Ce^Hg^C^. Luiknomy- cyna jest rozpuszczalna w pirydynie, dwumetylo- formamidzie, dwuimetyloacetamidzie, jest malo- rozpuszczalna w 60% alkoholu metylowym, alko¬ holu etylowym i izopropylowym, nie rozpuszcza sie 40 w benzenie, acetonie, wodzie, chlorotformie, bez¬ wodnym alkoholu, cykloheksanie, octanie etylu i eterze.

Mozna stosowac rózne sposoby wydzielania i oczyszczania luknomycyny, na przyklad przez 45 ekstrakcje rozpuszczalnikami, chromatografie na zelu, rozdzial ciecz — ciecz w urzadzeniu Craig'a.

Do odzyskiwania w skali przemyslowej stosuje sie ekstrakcje rozpuszczalnikami, poniewaz jest ona szybka i malo uciazliwa;. 50 Najlepiej jest stosowac metody oczyszczania za pomoca Marckoger.u 500 albo Sephadex'u LJI 20.

W najodpowiedniejszym procesie odzyskiwania, odzyskuje sie luknomycyne z jej podloza kulturo- wego przez oddzielenie grzybni i cial stalych nie 55 rozpuszczalnych, w s,posób znany, na pirzyiklad przez saczenie albo odwirowanie. Nasltejpnie odzys¬ kuje sie antybiotyk z przesaczu albo cieczy odwi¬ rowanej za pomoca ekstrakcji. Po odsaczeniu i przesaczeniu (albo odwirowaniu) ekstrahuje sie grzybnie alkoholem. Steza sie ten ekstrakt i wy¬ dziela nierozpuszczalne substancje za pomoca chlo¬ roformu, eteru i heksanu celem usuniecia sladów antybiotyku pold|pe(ptydowego, nie majacego zad¬ nej wartosci. Nasitejpnlie przemywa sie substancje 65 nierozpusizczaiLna acetonem i suszy pod próznia. 6010.1 305 Dodatkowe oczyszczanie albo oczyszczanie pozosta¬ losci, zawierajacych luknomycyne mozna wykonac metoda chromatografiozna na zelu, stosujac na przyklad dwufenyloformamid jako eluent. Ekient z kolumny chromatograficznej steza sie pod próz- 5 nia w temperakirze ponizej 40°C i wyltraca sie luknomycyne mieszanina etternheksan (1:1) i od¬ dziela przez odsaczenie albo odwirowanie.

Nowy zwiazek otrzymany zgodnie z wynalaz¬ kiem moze byc stosowany przeciwko nastepuja- 10 cym drobnoustrojom: Aspergillus niger, Candida albicans, Candida krusei, Canidlida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Trichomonas vaginalis.

Jest on srednio aktywny wobec Trichophytons mentagrophytes i acuminatum. Nie dziala na na- 15 stepujace bakterie: E. coli, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus aciidophilus, Proteus mirabilis, Pse- udomonas aerugiinosa, StaphliHocoecus aureus i Stireiptococcius faecailis:- Jako ilustracje podano nastepujace przyklady 20 nie ograniczajace, ani sposobu, ani piroduktu, otrzy¬ mywanego zgodnie z wynalazkiem.

Przyklad I. Fermentacja Sfcreptomyces dia- statochroriibigenes w celu jirodukcji luknomycyny.

Stadium zarodkowania. Dodaje sie kulture Ho- 25 fiiizowana Si diasJtaitochromogenes do butli wy¬ trzasarki1 na 500 ml, zawierajacej 100 ml nastepu¬ jacego podloza sterylnego, wyciag bacto^wolowy* 3 g baidto — peptai 6g dekstroza (glukoza) 10 g wyciag z drozdzy* 15 g woda wodociagowa 1000 ml *)¦ Difco Laiboraitoriebi, Detroit, Mich. w którym reguluje sie pH na 7>2 roztworem wo- 35 dorotlenku sodowego. Butle wraz z zalwartoscia poddaje sJie inkubacji w ciagu 2 dni w 28 ±1°C na wyforzajsarce obrotowej C2S0 obrotów/min, skok 2 cale (50,8 rani).

Stadium przygotowania szczepionki. Przygoto- ^ wuje sie porcje szczepionki, w,ilosid okolo 6 litrów w nastepujacy sposób: przenosi sde po 10 ml szczepionki (jw stadium zarodkowania) do kazdej serii butelek, zawierajacych po 200 ml podloza sterylnego kazda o nastepujacym skladzie: 45 gliceryna 10 ml L-asparagina** Ig kwasny fosforan dwiuipojtasowy*** Ig wyciag z drozdzy* 0,5 g woda wodociagowa 1000 mi *> Difico Laboratories* Detroit^ Mich.

**) BDH Chemicals Dtd., Poole,. Wielka Bry¬ tania ***) J. T. Baker Chemicals C°, N. J.

Butelki z ich zawartoscia poddaje sie inkubacji w ciagu 2 dni w 28 ii?' tna /wytrzasarce obro¬ towej (250 Oibrot6w/min, skok 2 cale (50,8 mm).

Laczy sie roztwory i przenosi antyseptycznie w bu¬ telke do szczepionki steryInej.

Przenosi sie aseptycznie 6 liiitróiw' szczepionki do fermentatora na 100 litrów, zawierajacego* 60 li- ^ trów podloza sterylnego o nastepujacym skladzie: maka arachidowa 900 g deksjtroza (cerelóza) 900 g chlorekso&owy 30 g weglan wafphioiwy 6 g €5 50 55 wyciag zdrozdzy 6g Olej arachidowy 60 ml srodek przeciwjplieniacy „Rhodor- sil 410" (Rhone Poulenc, Partis, France) albo inny srodek przeciw- pieniacy 3 ml woda wodociagowa do uzupelnie¬ niado 60 litrów Przed sterylizacja reguluje sie pH na 6,9—7,0 i prowadzi sie fermentacje (aeracje) w ciagu 48 godzin (az do momentu, gdy komóifki beda stalo¬ wac 10 do 15% calkowitej objetosci) w nastepuja¬ cych warunkach: temperatura 28 ±1°C dodawanie sterylnego powietrza 60 listrów/min cisnienie 0,49 kg/cm2 na mano¬ metrze mieszanie 300 Obrottów/minute Stadium fermentacji. Przenosi sie aseptycznie porcje 30 litrów szczepionki do fermenftaitora o po¬ jemnosci 400 litrów, zawierajacego nastepujace podloze: maka 6000 g syrop z glukozy (zawierajacej 60°/o cereiozy) 9000 g chlorek sodowy " 1500 g weglan wapniowy 300 g wyciag z drozdzy 900 g olej arachidowy 8 lilfcry srodek przecdjw pienieniu (Rhodorsil410) ns litrów woda wodociagowa 300 litrów Przeprowadza sie fermeautacje w 28 ±1°C caly czas mieszajac 200 obrotów/min^z dodatkiem po¬ wietrza pod cisnieniem 0,49 kg/ciri2 na manometrze, w stosunku do 300 liltrów/min. W czasie 5 dni fermentacji pobiera sie w róznych momentach próbki roztworu fermentujacego i oznacza wytwo¬ rzony antybiotyk metoda-, sipektrofotometryczna.

Ekstrahuje .sie przemyta-.> aOkoholeim, eltylowym grzybnie i:;..okresla gestosc optyczna ekstraktu w alkoholu etylowyim przy dlugosci fali 383 m\i w kolorymetrze Bausch'a i Domb'eigo. Nanosi sie na wykres krzywa kalibracji dla czystej luknomy¬ cyny i wylicza jej zawartosc w próbkach w odnie¬ sieniu do tej krzywej. j Przyklad II. Wytwarzanie luknomycyny w róznych podlozach.

Zgodnie ze sposobem, opisanym w przykladzie I, poddaje sie procesowi zarodkowania kulture liofili¬ zowana odmliainy S. diasftaH»ichroiliogenes. Po wy¬ trzasaniu w czasie 2 dni w 28 ±1°C zbiera sie substancje komórkowa przez c«3^wirowanie miesza¬ niny fermentacyjnej w butelkach s!terymych. Od¬ mywa sie substancje stala przez odwirowanie i dwukrotnie dokonuje sie przemywania 'porcjami po 100 ml Wody destylowanej sterylizowanej, po^ tern wykonuje sie z niej zsewiielstine w 100 ml wo¬ dy destylowanej sterylizowanej. Zajwtiesirie stosu¬ je sie jako szczepionke 10% w rózinych podlozach syntetycznych dla fermentacji i wytworzenia luk¬ nomycyny. Próby fermen/tacji sa wykonywane w butelkach wytrzasalnych, a do okreslenia zaiwar^101 305 11 tosci luknomycyny stosuje stie koloryimetr, jak to opisano w przykladzie I.

Wyniki tych prób sa przedstawione w tablicy 4.

Tablica 4 12 Tablica 5 Podloze (°/o wagowe) majka arachidowa: 2% gliceryna: 1% oMorek sodowy: 0,5%: weglan wapniowy: 0,1% imaka arachidowa: 2% gliceryna: 1% chlorek sodowy: 0,5%: weglan wapniowy: 0,1% olej arachlidowy: 1%, maka sojowa: 26/o gliceryna: 1%, chlorek sodowy: &,5% weglan wapniowy: 0^1% olej arachidowy: 1% maka arachidowa: 2%; ceirelosia: 1,5% chlorek.sodowy: 0,5% weglan wapniowy: 0,1% olej arachidowy: 1% maika arachidowa: 2%; syrqp z glukozy: 3% chlorek sodowy: 0,5% weglan wapniowy: 0,1% oletj arachidowy: 1% Cizas wyitrzasania 4 4 4 4 4 Ilosc luknomy- cyuiy gramy/mol .30 91 71 160 212 | Przyklad III. Wplyw siarczanu amonu i azo¬ tu organicznego na wydajnosc procesu wytwarza¬ nia luknomycyny.

Doswiadczenia wykonywano w kolbach stozko¬ wych o pojemnosci 500 ml, zawierajacych po 100 ml podloza, którego sklad podano ponizej, uzu¬ pelnionych sKzotem Organicznym róznego rodzaju oraz siarczanu amonu do poziomu optymalnego. maka arachidowa 2 % iwagowo/ofojetosc cerelosa 1,5% wagowo/objetosc chlorek sodowy 0,5% waigowo/objejtosc wegllan waipniowy 0,1% iwagowo/objetosc Dodaje' sie. szczepionke 10% taka, jaka Opisano w przykladzie II i wytrzasa kolbkii na wytrzasar¬ ce obrotowej (250 obrotów/min o skoku 2 cale (50,8) w 28 ±1°C w czasie 72 godziny, Otrzymujac zawartosci luknomycyny podane w tablicy 5.

Przyklad IV. Ekstrakcja i oczyszczanie luk¬ nomycyny. Po fermentacji zbiera sie ' grzybnie przez odsaczenie i iiltrowanie (aftbo odwirowanie), my>je s|e ja woda, a nasltepnie ekstrahuje trzy¬ krotnie przez rozcieranie z alkoholem (etylowym albo metylowym). Stwierdzono, ze 90% wagowych antybiotyku znajduje sie w grzybni i 10% w cie¬ czy kulturowej. Mozna odzyskac antybiotyk z cie¬ czy kulturowej przez ekstrakcje z normalnym al¬ koholem butylowym.

Uwalnia sie ekstrakt antytbiotyku od rozpusz¬ czalnika w temperaturze nizszej od 50°C w ciem¬ nosci. Pozostalosc ekstraktów alkoholowych jest ekstrahowana heksanem (albo eteem naftowym), 40 45 50 55 60 65 Procent azotu wagowo/objetos c siarczan amonu 0,1% roztwór z maceracji kukurydzy 0,1% pepton 0,1% eksitrakt slodu 0,1%) proteina z ziaren bawelny 0,5% wzorzec Mikro- 1 gramy/ml lukno¬ mycyny 24 45 70 100 100 01' | a nastepnie poddana dzialaniu chloroformu, celem usuniecia substancji antyibakteryjnej. Ten antybio¬ tyk polipeptydowy okazal sie bezuzyteczny pod¬ czas poprzednich badan i jest wyrzucany.

Mozna równiez dokonyjwac oczyszczania metoda filtracji molekularnej na Merkogel'u 500 albo Setphadex'ie LH 20, stosujac jako eiluenlt dwume- tyloformamid. Eluenty sa badane badz wskazni¬ kiem uniwersalnym PYE Unical na nitkach, badz absorpcjometrem w ultrafiolecie przy 406 m\K.

Frakcje, zawierajace subisitancje ..grzybobójcza, sa stezane pod próznia CIO-1 mim Hg) w 40UC i wytracane eterem. Nastepnie odwirowuje sie csald i przemywa go trzykrotnie elterem celem usu¬ niecia sladów dwumetyloformaimidu.

Mozna równiez oczyszczac luknomycyne przez rozdzial w przeciwipradzie, stosujac uklad roz- . puszczalników objejtosciowo: pirydyna (35 cz.) — octan etylu (65 cz.) — woda (83 cz.) w urzadze¬ niu do rozdzialu w przeciwipradzie w 100 rurach CRAIG'a i poddaje sie 261 przeniesieniom. Mie¬ rzy sie gestosc optyczna . fazy dolnej i górnej.

Obserwuje sie jeden pik. Frakcje, zawierajace antybiotyk, sa laczone i odparowywane i suszone pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymania w ten sposób .pozostalosc (proszek zóltoziocasty) - jest via koniec przemywany mala iloscia goracego alko¬ holu metylowego.

Punkt topnienia: brazowieje bez topnienia w temperaturze 150°C (rozklad).

Claims (3)

Zas tirzez en i a jpafcen.it o w e

1. Sposób wytiwarzania luknomycyny, nowego antybiotyku grzybobójczego i niszczacego jedno¬ komórkowce, znamienny tym, ze hoduje sie Strep- tomyces diastatochromogenes — odmiane Krains'a o numerze szczepu CBS 101 74, w wodnym podlo¬ zu odzywczym; zawierajacym zródio przyswajalne- go wegla i zródlo przyswaijailoego azotu w wa¬ runkach aeracji zalanej, az do momentu stiwier- dzenia grzybobójczego dzialania antybiotycznego i niszczacego jednokomórkowce, sipowodowanego wytworzeniem luknomycyny i wyodrebnia sie luknomycyne ze srodowiska hodowlanego.

2. Sjposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze filtruje sie srodowisko hodowlane, sitala pozosta¬ losc ekstrahuje sie nizszym alkoholem, zateza ekstorakt, po czym dziala nan kolejno chlorofor¬ mem, eterem etylowym i heksanem.

3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze ekstrahuje sie luknomycyne nonmatLnytm alkoho¬ lem butyilowym. iLZGraf. iZ^d iNr a — iliBfl Cena 45 zl egz. 'A(4