CN102503999B - 去丙二酸单酰基阿扎霉素f衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。将阿扎霉素F与醇在酸性醇溶液中反应生成阿扎霉素F衍生物，然后再在碱性甲醇水溶液中水解脱去丙二酸单酰基，得到去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物。抗菌试验表明所得的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物对试验菌株的MIC为0.39~1.56μg/mL，活性为阿扎霉素F的4~8倍；细胞毒性试验表明其对细胞株HCT-116的细胞毒性明显小于阿扎霉素F，显示去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物具有显著的抗菌作用，且毒性较小，可用于制备抗菌药物，具有良好的开发前景。

Description

去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

阿扎霉素F为36元大环内酯，主要包括阿扎霉素F_5a和F_4a。1959年Arai最先报道链霉菌Streptomyces hygrpscopicus var. azalomyceticus产此2个化合物，它们具有抗革兰氏阳性菌、真菌和免疫抑制活性，并在临床上有一定应用。但活性有待进一步提高，且具有一定的毒性，同时结构不稳定，容易降解，难溶于水，从而限制了其在临床上的广泛应用。2011年有报道链霉菌Streptomyces sp. 211726也能代谢产此2个化合物，且还能产多种新型类似物(Yuan Ganjun, Lin Haipeng, Wang Cheng, et al. Magn Reson Chem, 2011, 49 (1): 30-37.），新型类似物中结构的不同主要是23位或25位取代基的不同，但阿扎霉素F新型类似物的抗菌活性和细胞毒性与阿扎霉素F无明显差别。同时，迄今为止，尚未见阿扎霉素F的化学结构修饰的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。

本发明的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物，其分子结构式如下：

                              式Ⅰ

其中，R₁为甲基、乙基、正丙基、正丁基或烯丙基中的任意一种；R₂为氢或甲基。

当R₁＝ CH₃，R₂＝ CH₃时，式Ⅰ为甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（1）；

当R₁＝ CH₃，R₂＝ CH₂CH₃时，式Ⅰ为乙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（2）；

当R₁＝ CH₃，R₂＝ CH₂CH₂CH₃时，式Ⅰ为正丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（3）；

当R₁＝ CH₃，R₂＝ CH₂(CH₂)₂CH₃时，式Ⅰ为正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（4）；

当R₁＝ CH₃，R₂＝ CH₂CH=CH₂时，式Ⅰ为烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（5）；

当R₁＝ H，R₂＝ CH₃时，式Ⅰ为甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（6）；

当R₁＝ H，R₂＝ CH₃CH₂时，式Ⅰ为乙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（7）；

当R₁＝ H，R₂＝ CH₃CH₂CH₂时，式Ⅰ为正丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（8）；

当R₁＝ H，R₂＝ CH₂(CH₂)₂CH₃时，式Ⅰ为正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（9）；

当R₁＝ H，R₂＝ CH₂CH=CH₂时，式Ⅰ为烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（10）。

本发明的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物的制备方法是：取3 mmol 阿扎霉素F溶于12 ml醇，加入浓度为1 M的盐酸醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相高效液相色谱（HPLC），用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含阿扎霉素F衍生物的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得阿扎霉素F衍生物。取1 mmol 阿扎霉素F衍生物，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物。

所述去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物制备方法中所用原料阿扎霉素F的分子结构式如下：

                        式Ⅱ

其中，R₂为氢或甲基；当R₂为甲基时，即为阿扎霉素F_5a；R₂为氢时，即为阿扎霉素F_4a，两化合物均可由商业购买获得，也可由商业可获得的链霉菌Streptomyces hygrpscopicus var. azalomyceticus按照已知的方法和技术，经发酵、分离制备获得，还可通过链霉菌Streptomyces sp. 211726按照文献(Yuan Ganjun, et al. Magn Reson Chem, 2011, 49 (1): 30-37.）方法经发酵、分离制备获得。

所述去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物制备方法中所用的醇为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇和烯丙醇中的一种。

本发明的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物制备的合成路线如下：

本发明是在盐酸醇溶液的反应条件下，在阿扎霉素F分子结构的17位半缩酮羟基处以缩酮的形式引入烃基，得到阿扎霉素F衍生物；然后在碱性甲醇水溶液中，将阿扎霉素F衍生物分子结构中23位的丙二酸单酰基脱去，得到去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物。一方面所得的结构修饰物活性显著增强，毒性明显减小；另一方面，消除了影响阿扎霉素F分子结构稳定性的主要基团和因素，增强了分子结构的稳定性，同时23-丙二酸单酰基的去除，减少了阿扎霉素F分子间的缔合和内盐的形成，所得结构修饰物的水溶性显著增加。经实验证明：去丙二酸单酰基基阿扎霉素F衍生物对试验菌株生长的最低抑菌浓度（MIC）为0.39~1.56 μg/mL，抗菌活性为阿扎霉素F_5a、F_4a的4~8倍，优于阳性对照药两性霉素B和苯唑西林钠；对细胞株HCT-116的细胞毒性明显比阿扎霉素F_5a、F_4a小，显示其优于修饰前的阿扎霉素F_5a、F_4a和阳性对照药的抗菌作用，且毒性较阿扎霉素F_5a、F_4a小，表明其作为抗菌药物开发的良好前景，可用于抗菌药物的制备。

具体实施方式

实施例 1 ：

甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（1）的制备：

取3.29 g (3 mmol)阿扎霉素F_5a溶于12 ml甲醇，加入浓度为1 M的盐酸甲醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含甲基阿扎霉素F_5a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得甲基阿扎霉素F_5a（1.62 g），收率48.6%。取1.11 g (1 mmol)甲基阿扎霉素F_5a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（0.70 g），收率68.4%。

甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（1）：分子式为C₅₅H₉₇N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 125.0~127.5℃，ESI-MS (m/z): 1025.4 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.2(s)、157.4(s)、145.0(d)、139.3(s)、137.0(s)、135.3(d)、132.0(d)、129.4(d)、128.6(d)、127.4(d)、127.0(d)、126.3(d)、102.1(s,-O-C-O-)、80.3(d)、76.5(d)、75.3(d)、74.8(d)、74.2(d)、72.4(d)、71.5(d)、69.0(d)、67.4(d)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、49.6(q, C₁₇-OCH₃)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.7、41.8、41.1、41.0、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、28.2、27.8、17.6、16.9、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7。

实施例 2 ：

阿扎霉素F_5a和阿扎霉素F_4a的制备：

取链霉菌Streptomyces hygrpscopicus var. azalomyceticus菌株适量，接种到ISP2平板培养基上，培养4d，取活化的菌株适量，接种到装有50 mL ISP2培养液的500 mL锥形瓶中，28℃、190 rpm条件下摇床培养72 h，获得菌株的种子培养液。将该种子培养液按10%接种量分别接种于装有500 mL生产培养液[培养基组成（g/L）：葡萄糖5 g，可溶性淀粉35 g，酵母粉5 g，干酪素5 g，氯化钠18 g，去离子水1L，pH 7.1～7.3]的3000 mL三角烧瓶中，28℃、190 rpm的条件下摇床培养10 d。重复上述操作至获得发酵混合物200 L。用离心方法将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用甲醇浸提3次，得甲醇提取液，减压浓缩至不含甲醇，冻干，得冻干粉末128.7 g。用氯仿-甲醇（1:1）混合溶剂溶解，过滤去不溶解物后，挥干溶剂，干法上样，进行硅胶柱层析（硅胶200~300目），用氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱（10:1，5:1，4:1，3:1，2:1），得5个洗脱物Fr. 1-5，其中Fr. 5（10.38 g，氯仿-甲醇2:1洗脱物）富含阿扎霉素F_5a和阿扎霉素F_4a。将Fr. 5上反相C₁₈柱色谱，用甲醇-水（60：40～80：20）梯度洗脱进行各化合物的初步分离后，再用制备HPLC纯化，最后分别过Sephadex LH-20柱层析，甲醇洗脱，得阿扎霉素F_5a（1359.6 mg）和阿扎霉素F_4a（547.3 mg）。

阿扎霉素F_5a：分子式为C₅₇H₉₇N₃O₁₇，白色无定形粉末易溶于甲醇，溶于DMSO，微溶于水，不溶于氯仿、乙酸乙酯；m.p. 130~132℃（Dec.）；UV nm（lg ε）：240（4.6），269（4.4）；IR（ cm^-1）：3385, 2964, 2936, 1701, 1636, 1597, 1378, 1243, 1089, 1056, 969；HR-ESI-MS：1096.6911 [M+H]⁺ (calcd. for C₅₇H₉₈N₃O₁₇, 1096.6896)；¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：174.0、171.6、170.1、157.3、146.2、140.3、140.2、136.2、132.5、130.3、128.6、127.6、126.7、125.1、99.7、80.7、77.2、75.7、74.8、74.2、72.3、72.3、70.7、69.7、66.0、65.5、65.4、46.6、46.1、44.6、44.5、44.4、44.2、42.1、41.8、41.7、41.2、41.1、40.8、39.3、35.1、34.5、33.6、33.6、30.7、30.7、29.8、28.4、28.4、27.9、17.6、17.2、14.8、14.3、13.3、12.9、10.4。

阿扎霉素F_4a：分子式为C₅₆H₉₅N₃O₁₇，白色无定形粉末，易溶于甲醇，溶于DMSO，微溶于水，不溶于氯仿、乙酸乙酯；m.p. 130~132℃（Dec.）；UV nm（lgε）：240（4.6），269（4.4）；IR（ cm^-1）：3385, 2964, 2936, 1701, 1638, 1597, 1378, 1243, 1089, 1056, 969；HR-ESI-MS：1082.6755 [M+H]⁺ (calcd. for C₅₆H₉₆N₃O₁₇, 1082.6740)；¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：173.9、171.6、170.1、158.3、146.1、140.2、140.1、136.2、132.5、130.3、128.6、127.6、126.8、125.2、99.8、80.7、77.1、75.7、75.0、74.2、72.3、72.2、70.7、69.7、66.1、65.5、65.4、46.5、46.1、44.6、44.6、44.5、44.1、42.1、42.0、41.7、41.2、41.0、40.5、39.2、35.1、34.6、33.6、33.6、30.8、30.8、29.8、28.4、27.9、17.6、17.1、14.8、14.3、13.3、12.9、10.5。

实施例 3：

甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（1）的制备：

按照“实施例2”路线方法制备5.27 g阿扎霉素F_5a，然后按照“实施例1” 方法合成、制备，得1.79 g甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a。

实施例 4 ：

乙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（2）的制备：

取3.29 g (3 mmol)阿扎霉素F_5a溶于12 ml乙醇，加入浓度为1 M的盐酸乙醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含乙基阿扎霉素F_5a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得乙基阿扎霉素F_5a（1.75 g），收率51.9%。取1.12 g (1 mmol)乙基阿扎霉素F_5a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得乙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（0.81 g），收率78.3%。

乙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（2）：分子式为C₅₆H₉₉N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 123.4~125.5℃，ESI-MS (m/z): 1039.4 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.3(s)、157.4 (s)、145.0(d)、139.3(s)、137.0(s)、135.3(d)、132.0(d)、129.4(d)、128.6(d)、127.4(d)、127.0(d)、126.3(d)、102.0(s,-O-C-O-)、80.3(d)、76.9(d)、75.2(d)、74.8(d)、74.3(d)、72.4(d)、71.4(d)、69.3(d)、67.6(d)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、56.3(t, C₁₇-OCH₂CH₃)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.7、41.1、41.0、40.7、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、28.2、27.8、17.6、16.9、15.9(q, C₁₇-OCH₂CH₃)、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7。

实施例 5：

正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（4）的制备：

取3.29 g (3 mmol)阿扎霉素F_5a溶于12 ml正丁醇，加入浓度为1 M的盐酸正丁醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含正丁基阿扎霉素F_5a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得正丁基阿扎霉素F_5a（1.72 g），收率49.7%。取1.15 g (1 mmol)正丁基阿扎霉素F_5a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（0.79 g），收率74.2%。

正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（4）：分子式为C₅₈H₁₀₃N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 118.7~120.4℃，ESI-MS (m/z): 1067.5 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.3(s)、157.4 (s)、145.0(d)、139.3(s)、137.0(s)、135.3(d)、132.0(d)、129.4(d)、128.6(d)、127.4(d)、127.0(d)、126.3(d)、102.5(s,-O-C-O-)、80.3(d)、77.5(d)、75.2(d)、74.8(d)、74.3(d)、72.4(d)、71.3(d)、69.4(d)、67.7(d)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、60.7(t, C₁₇-OCH₂CH₂CH₂CH₃)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.7、41.4、41.3、41.0、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.4(t, C₁₇-OCH₂ CH ₂ CH₂CH₃)、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、28.2、27.8、20.7(t, C₁₇-OCH₂CH₂ CH ₂ CH₃)、17.6、16.9、15.9(q, C₁₇-OCH₂CH₂CH₂CH₃)、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7。

实施例 6：

丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（4）的制备：

按照“实施例2”路线方法制备2.05 g阿扎霉素F_5a，然后按照“实施例5” 方法合成、制备，得0.79 g正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a。

实施例 7 ：

烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（5）的制备：

取3.29 g (3 mmol)阿扎霉素F_5a溶于12 ml烯丙醇，加入浓度为1 M的盐酸烯丙醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含烯丙基阿扎霉素F_5a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得烯丙基阿扎霉素F_5a（1.60 g），收率46.9%。取1.14 g (1 mmol) 烯丙基阿扎霉素F_5a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（0.75 g），收率71.2%。

烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_5a（5）：分子式为C₅₇H₉₉N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 120.7~121.9℃，ESI-MS (m/z): 1051.4 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.3(s)、157.4 (s)、145.0(d)、139.3(s)、137.0(s)、136.8(d, C₁₇-OCH₂CH=CH₂)、135.3(d)、132.0(d)、129.4(d)、128.6(d)、127.4(d)、127.0(d)、126.3(d)、115.7(t, C₁₇-OCH₂CH=CH₂)、102.8(s,-O-C-O-)、80.3(d)、77.0(d)、75.2(d)、74.8(d)、74.3(d)、72.4(d)、71.5(d)、69.2(d)、67.8(d)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、61.8(t, C₁₇-OCH₂CH=CH₂)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.7、41.6、41.1、41.0、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、28.2、27.8、17.6、16.9、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7。

实施例 8 ：

甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（6）的制备：

取3.25 g (3 mmol)阿扎霉素F_4a溶于12 ml甲醇，加入浓度为1 M的盐酸甲醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含甲基阿扎霉素F_4a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得甲基阿扎霉素F_4a（1.59 g），收率48.3%。取1.10 g (1 mmol)甲基阿扎霉素F_4a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（0.74 g），收率73.0%。

甲基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（6）：分子式为C₅₄H₉₅N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 125.8~127.5℃，ESI-MS (m/z): 1011.4 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.1(s)、158.3(s)、145.1(d)、139.3(s)、137.0(s)、135.2(d)、132.0(d)、129.4(d)、128.5(d)、127.4(d)、127.0(d)、126.3(d)、102.1(s,-O-C-O-)、80.3(d)、76.5(d)、75.3(d)、74.9(d)、74.1(d)、72.4(d)、71.5(d)、69.0(d)、67.4(d)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、49.6(q, C₁₇-OCH₃)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.6、41.8、41.1、41.0、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、27.9、17.6、16.9、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7。

实施例 9 ：

正丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（8）的制备：

取3.25 g (3 mmol)阿扎霉素F_4a溶于12 ml正丙醇，加入浓度为1 M的盐酸正丙醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含正丙基阿扎霉素F_4a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得正丙基阿扎霉素F_4a（1.75 g），收率51.9%。取1.12 g (1 mmol)正丙基阿扎霉素F_4a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得正丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（0.72 g），收率69.6%。

正丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（8）：分子式为C₅₆H₉₉N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 121.7~123.5℃，ESI-MS (m/z): 1039.4 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.3(s)、158.3(s)、145.0(d)、139.3(s)、137.0(s)、135.3(d)、132.0(d)、129.4(d)、128.6(d)、127.4(d)、127.0(d)、126.3(d)、102.7(s,-O-C-O-)、80.3(d)、76.6(d)、75.2(d)、74.8(d)、74.3(d)、72.4(d)、71.3(d)、69.4(d)、67.9(d)、68.4(t, C₁₇-OCH₂CH₂CH₃)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.7、41.1、40.7、41.0、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、27.9、23.6(t, C₁₇-OCH₂CH₂CH₃)、17.6、16.9、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7、10.5(q, C₁₇-OCH₂CH₂CH₃)。

实施例 10 ：

正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（9）的制备：

取3.25 g (3 mmol)阿扎霉素F_4a溶于12 ml正丁醇，加入浓度为1 M的盐酸正丁醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含正丁基阿扎霉素F_4a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得正丁基阿扎霉素F_4a（1.71 g），收率50.1%。取1.14 g (1 mmol)正丁基阿扎霉素F_4a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（0.81 g），收率76.9%。

正丁基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（9）：分子式为C₅₇H₁₀₁N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 119.3~121.9℃，ESI-MS (m/z): 1053.4 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.3(s)、158.3 (s)、145.0(d)、139.2(s)、137.1(s)、135.2(d)、132.0(d)、129.5(d)、128.6(d)、127.4(d)、127.0(d)、126.3(d)、102.5(s,-O-C-O-)、80.3(d)、77.5(d)、75.2(d)、74.8(d)、74.3(d)、72.4(d)、71.3(d)、69.4(d)、67.7(d)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、60.7(t, C₁₇-OCH₂CH₂CH₂CH₃)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.7、41.4、41.3、41.0、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.4(t, C₁₇-OCH₂ CH ₂ CH₂CH₃)、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、27.9、20.7(t, C₁₇-OCH₂CH₂ CH ₂ CH₃)、17.6、16.9、15.9(q, C₁₇-OCH₂CH₂CH₂CH₃)、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7。

实施例 11 ：

烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（10）的制备：

取3.25 g (3 mmol)阿扎霉素F_4a溶于12 ml烯丙醇，加入浓度为1 M的盐酸烯丙醇溶液12 ml，室温搅拌反应25 min，所得反应混合物经反相HPLC，用体积比为75:25的甲醇-0.01 M醋酸铵水溶液洗脱，收集富含烯丙基阿扎霉素F_4a的洗脱液，减压浓缩至干，加入8 ml热丙酮，振摇混悬，静止冷却，析出白色沉淀，抽滤、冷丙酮洗涤、减压干燥，得烯丙基阿扎霉素F_4a（1.67 g），收率49.6%。取1.12 g (1 mmol) 烯丙基阿扎霉素F_4a，溶于60 ml甲醇，加入浓度为2 M氢氧化钾的甲醇水溶液20 ml，其中甲醇与水的体积比为2:1，摇匀、室温静置20 h，然后用稀盐酸调pH为7，减压浓缩至干，残渣用少量水洗两次，最后用甲醇提取，提取液减压浓缩、干燥，得烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（0.73 g），收率70.6%。

烯丙基去丙二酸单酰基阿扎霉素F_4a（10）：分子式为C₅₆H₉₇N₃O₁₄，溶于水，易溶于甲醇、乙醇，m.p. 121.2~123.4℃，ESI-MS (m/z): 1037.4 [M+H]⁺。¹³C NMR（MeOH-d ₄, 100 MHz）δppm：169.4(s)、158.3 (s)、144.9(d)、139.3(s)、137.0(s)、136.7(d, C₁₇-OCH₂CH=CH₂)、135.3(d)、132.0(d)、129.3(d)、128.6(d)、127.5(d)、127.0(d)、126.3(d)、115.7(t, C₁₇-OCH₂CH=CH₂)、102.8(s,-O-C-O-)、80.3(d)、77.0(d)、75.2(d)、74.8(d)、74.3(d)、72.4(d)、71.5(d)、69.2(d)、67.8(d)、66.3(d)、65.8(d)、65.7(d)、61.8(t, C₁₇-OCH₂CH=CH₂)、47.7、47.1、46.1、44.7、44.2、44.1、42.8、41.6、41.1、41.0、40.6、39.3、35.0、34.5、33.5、33.2、30.3、30.1、29.7、28.2、27.9、17.6、16.9、14.8、14.0、13.3、12.8、10.7。

去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物的抗菌活性试验

1、实验材料及方法

试验菌株：白色念珠菌（Candida albicans S013）；新型隐球菌(Cryptococcus neoformans N002)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae N003) ；金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus S014）；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis S028）。

YPD培养基（真菌培养基）：

葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母粉10g，纯水1000 mL，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基（细菌培养基）：

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，纯水1000 mL，pH 7.4。

阳性对照药：两性霉素B、苯唑西林钠。

测试样品溶液的配制：分别准确称取两性霉素B、苯唑西林钠、阿扎霉素F_5a、阿扎霉素F_4a、1、2、4、5、6、8、9和10适量，加入少量DMSO溶解（小于5%），然后用纯水等倍稀释配制成浓度范围为100～0.10 μg/mL的测试溶液，供活性测试用。

上述化合物的抗菌活性均采用微量肉汤稀释法进行测试，过程如下：将试验菌悬液（孢子浓度为1.0×107 CFU/mL），经对应培养基稀释后，加到灭菌好的96孔聚苯乙烯板中，每孔加100 μL，然后将倍比稀释好的不同浓度的化合物或阳性对照药分别加到相应的孔中，每孔100 μL，每个化合物重复1行，稍振摇混匀，使第1孔至第11孔化合物的浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 μg/mL，第12孔为生长对照（不含测试化合物），盖封后置温度28℃、转速150 rpm的恒温摇床中，孵育20 h判断结果。当生长对照孔内试验菌株明显生长时，以小孔内完全抑制试验菌株生长的最低化合物浓度为该化合物对试验菌株的最低抑菌浓度（MIC）。

2、实验结果

两性霉素B、苯唑西林钠、阿扎霉素F_5a、阿扎霉素F_4a、1、2、4、5、6、8、9和10的抗菌活性试验结果见表1。

表1  去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物的抗菌活性

  ND：未测试其对试验菌株的MIC。

3 、结论

由表1可知，化合物1、2、4、5、6、8、9和10对上述试验菌株生长的抑制作用明显强于阿扎霉素F_5a、F_4a，为阿扎霉素F_5a、F_4a的4～8倍；且活性优于阳性对照药两性霉素B和苯唑西林钠。因此，本发明的式Ⅰ所示的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物具有显著的抗菌作用，且活性明显强于修饰前的阿扎霉素F_5a、F_4a，优于临床用阳性对照药两性霉素B和苯唑西林钠，故可用于抗菌药物的制备和应用。

 去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物的细胞毒性测定：

采用MTT法测定化合物对细胞株HCT-116的细胞毒性，具体过程如下：将处于对数生长期的细胞株HCT-116，用0.01％的胰酶消化，计数，以2.0×10³/孔的细胞密度接种在96孔板中，每孔100 μL，置于5% CO₂培养箱内37℃培养过夜。以阿扎霉素F_5a、F_4a为对照，每一化合物设7个浓度梯度，每一浓度设3个复孔，每一浓度分别加入到对应孔中，于5% CO₂ 37℃培养箱内培养72小时，加入5 mg·mL^-1的MTT 20 μL，37℃孵育3小时后，吸弃上清，加入100 μL/孔DMSO，混匀振荡溶解，使用Spectra MAX 340分光光度计测定每孔的吸光值OD（测定波长L1为550 nm，参考波长L2为690 nm），按下列公式分别计算化合物对细胞株HCT-116的生长抑制率：

生长抑制率＝（1－用药组平均OD值/对照组平均OD值）×100%

其中，平均OD值＝[(OD_L1－OD_L2)₁+(OD_L1－OD_L2)₂+(OD_L1－OD_L2)₃] / 3。

然后以生长抑制率对化合物的不同浓度作图，经公式拟合得化合物对细胞株HCT-116的半数抑制浓度（IC₅₀），结果见表2，以此作为该化合物细胞毒性的判断依据：IC₅₀值越小，化合物的细胞毒性越大，预示该化合物对人体细胞的毒性越大。

表2 去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物对HCT-116的细胞毒性

由表1可知：化合物1、2、4、5、6、8、9和10对细胞株HCT-116的细胞毒性均明显低于修饰前的阿扎霉素F_5a、F_4a。因此，本发明式Ⅰ所示的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物的细胞毒性明显较修饰前的阿扎霉素F_5a、F_4a小，预示其对人体细胞的毒性较小。结合上述中去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物抗菌试验的结论，更进一步显示其良好的开发和应用前景，可用于抗菌药物的制备和应用。

Claims (2)

1.一种去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物，其特征在于：其分子结构式如下：

其中，R₁为甲基、乙基、正丙基、正丁基或烯丙基中的任意一种；R₂为氢或甲基。

2.一种如权利要求1所述的去丙二酸单酰基阿扎霉素F衍生物在制备抗菌药物中的应用。