DK141556B - Fremgangsmåde til fremstilling af et antifungalt og antiprotozoelt antibioticum kaldet lucknomycin. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆ66ELSESSKRIFT 141556 ΠΑΝ MAR If (51) Int el.3 C 12 P 1/06 UAIN lYIAnlN. c 07 Q 11/00 // C 12 R 1/525 «(21) Araegning nr. 2224/76 (22) Indleveret den 20. maj 1976 (23) Lebedeg 20. maj 1976 (44) Antegningen fremtogt og o_ fremlæggeteeeekriftet offentliggjort den d\. apr. I you /

Dl REKTORATET FOR _ PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Prioritet begarat fra dm

28. maj 1975, 22242/75, GB

(71) UCB S.A., 4 chaussee de Charleroi, Saint-Gilles-lez-Bruxelles, BE.

(72) Opfinder: Vlnay Chhotalal Vora, Lucknow-226 007, U.P. Vl/1, C.S.I.R.

Staff Quarters, CSIR Colony, Nlrala Nagar, IN: Amrut Vithaldas Mody,

Bombay 26, ZC Woodlands, Peddar Road, IN.

(74) Fuldmægtig under sagene behandling;

Internationalt Patent-Bureau._ ' (64) Fremgangsmåde til fremstilling af et antlfungalt og antlprotozoelt antibiotieum kaldet lucknomycin.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antifungalt og antiprotozoelt antibiotieum kaldet lucknomycin.

Der kendes allerede forskellige antifungale antibiotica, men der foregår fortsat over hele verden et researcharbejde med henblik på at finde frem til hidtil ukendte antifungale midler med forskellige fordele sammenlignet med de allerede kendte midler.

Der er nu tilvejebragt et hidtil ukendt antifungalt middel, der er blevet betegnet lucknomycin, og som har vist sig at være effektivt mod væksten af navnlig Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis og Aspergillus niger. Det er også effektivt over for Trichomonas vaginalis.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at Streptomyces dia- 2 141556 statochromogenes var. (Krainsky) Waksman og Henrici med de identificerende karakteristika for CBS 101.74 (omtalt nedenfor) dyrkes i et vandigt næringsmedium indeholdende en kilde for assimilerbart carbon og en kilde for assimilerbart nitrogen under neddykkede aerobe betingelser, og at det således producerede lucknomycin isoleres.

Lucknomycin har følgende kemiske og fysiske egenskaber.

1. Fysiske egenskaber: 1.1 Udseende: orangegult pulver 1.2 Elementæranalyse: G61H96N2°24 (molekylvæ8t 1240): beregnet: C 59,03% H 7,74% N 2,26% fundet: 58,92% 7,58% 2,29% 1.3 Smeltepunkt:

Produktet begynder at dekomponere ved ca. 150°C, men selv ved 300°C smelter det ikke.

1.4 Opløselighed:

Opløseligt i pyridin, dimethylformamid og dimethylacetamid, mindre opløseligt i 60% methanol, koncentreret ethanol og isopropanol, uopløseligt i benzen, acetone, vand, chloroform, absolut ethanol, cyclohexan, ethylacetat og diethylether.

I svovlsyre giver det hidtil ukendte antifungale middel en intens blåfarvning.

1.5 Infrarødt absorptionsspektrum: taget fra spektret i en KBr-pille (i cm ^) 3400 (S)* 1465 (W) 1075 (S) 3100 (W)*** 1390 (W) 1045 (W) 2930 (S) 1350 (W) 1010 (S) 2860 (M)** 1325 (W) 995 (W) 1715 (M) 1295 (W) 940 (W) 1650 (M) 1250 (W) 890 (W) 1600 (S) 1185 (S) 850 (M) 1575 (W) 1140 (W) 835 (W) 1545 (W) 1110 (M) 800 (W) Båndintensiteter er angivet som henholdsvis ’’S", "H" og "W” % S = stærk absorption M = medium absorption W = svag absorption 1.6 Ultraviolet absorptionsspektrum: 141556 3 taget ved en koncentration på 1 mg/100 ml dimethylformamld 344 χομ (£ = 3,5 * 104) 364 mp (£ « 5,52 x 104) 384 αμ (£ - 8,04 χ ΙΟ4) 408 πιμ (£ = 6,6 χ ΙΟ4) 1.7 Optisk drejning: a 187 til 194° (c = 0,3% i dimethylforpamid ved 25°C).

2. Kemiske egenskaber:

Lucknomycin kan klassificeres som et aromatisk heptaen-antibioticura, fordi det ved retroaldolisationsreaktionen giver p-N-methylaminoacetophenon.

Methanolyse tilskriver lucknomycin en substituent af aminosukkertypen, identificeret med en autentisk prøve af mycosaain.

Lucknomycin indeholder ikke en titrerbar carboxylgruppe.

3. Biologiske egenskaber.

3.1 Åntifungalt spektrum.

Lucknomycin er i forskellige fortyndinger indført i et pepton-dextrose-medium inokuleret med forsøgsorganismen. Bfter inkubation i fra 2 til 5 dage ved 28°C blev det antal mikrogram antibioticum pr. milliliter medium bestemt, der skulle anvendes for at opnå fuldstændig vaksthaa-ning (MIC) af den pågældende organisme. For bedre at angive den anti-fungale virkning af lucknomycin blev det sammenlignet med virkningen af andre kendte antifungale antibiotics.

Mikroorganisme Produkt MIC (mikrogram/ml)

Candida albicans 11651 Lucknomycin 0,1 - 0,2

Nystatin 2,5

Amphotericin 1,25 Pimaricin 5

Aspergillus niger Lucknomycin 0,5

Nystatin 5

Amphotericin 0,6

Pimaricin 2,5

Trichophyton mentagrophytes Lucknomycin 25

Nystatin 25

Trichophyton acuminatum Lucknomycin 12,5

Nystatin 25

Trichomonas vaginalis Lucknomycin < 0,5

Nystatin >10

Amphotericin B >10 Pimaricin >10

Metronidazole 0,5 4 141556

Candida krusei Lucknomycin 0,2 - 0,4

Candida tropicalis Lucknomycin 0,1 - 0,2 3.2 Antibakterielt spektrum.

Forsøgsbetingelserne er de samme som ved bestemmelsen af det antifun-gale spektrum, bortset fra at inkubationstiden er én dag ved 37°C. Lucknomycin udøver ikke en hæmmende virkning, ved en koncentration på 10 mikrogram/ml, på følgende bakterier:

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Lactobacillus acidophilus Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Staphylococcus faecalis 3.3 Antiprotozoel virkning.

En koncentration på 0,5 mikrogram/ml af det antibiotiske stof dræber 50% individer af en kultur i fuld vækst af Trichomonas vaginalis inden for en periode på ca. 30 minutter.

3.4 Toxicitet.

Letal dosis LD,^ på mus i mg/kg legemsvægt:

Anvendelsesmåde ~50 intravenøst 10 - 20 intraperiotonealt 5-10 subcutant >800 oralt >800 4. Farmakologiske prøver in vivo.

4.1 Anti-trichomonas vaginalis-aktivitet.

Denne prøve foretages på mus på en subcutan Trichomonas vaginalisabsces. Subcutane injektioner på niveau med nævnte absces af en suspension (eller opløsning) af de følgende produkter i forskellige koncentrationer anvendtes til at bestemme ED,.q.

Produkt ED^-q på Trichomonas vaginalis (i mikrogram/ml)

Lucknomycin 12

Candicidin 24

Trichomycin 43

Metronidazol 250

Pimaricin 720 5 141556 4.2 Anti-Candida albicans-aktivitet inden for gynækologi.

Prøven gennemføres på hunrotter på eksperimentel Candida albicans-vaginitis. Lucknomycin blev sammenlignet med to sammenligningsprodukter: Mycostatin (aktivt princip nystatin) og Canestene (aktivt princip = clotrimazol).

^i^g/tablet)^ Antal af helbredte rotter/inficerede rotter efter 4 adm.* efter 8 ada.^ efter 12 ada.* a) lucknomycin 5 mg 14/16 13/13 12/12 b) clotrimazol 20 mg 17/18 16/16 17/17 c) nystatin 4 mg 5/11 8/11 9/11 £ adm. - administrationer.

a) galenisk .sammensætning af forsøgstabletten» lucknomycin 5 mg natriumborat 50 mg

Aerosil R 972* 0,8 mg * kollodialt siliciundloxid

Precirol** 1 mg ** glycerol-palmitat + -stearat LSNa*** 0,8 mg *** natriumlauryl-sulfat

Avicel pH 102**** 52 mg **** mikrokrystallinsk cellulose

Lactose FK til 200 mg b) 1/5 af en kommerciel tablet indeholdende 100 mg clotrimazol c) 1/5 af en kommerciel tablet indeholdende 20 mg (100.000 enheder) nystatin.

5. Terapeutiske anvendelser.

Lucknomycin er et antifungalt og antlprotozoelt antibioticum, der har følgende anvendelighed: - behandling af candidiasis, der kan være generel eller overfladisk på huden (dermatologi) eller på mundens, vaginas eller tarmens slimhinder, - behandling af infektioner af hulheder, der skyldes Trichomonas vaginalis (trichomoniasis) og navnlig den terapeutiske anvendelse Inden for gynækologi, - veterinær anvendelse ved behandling af mycotiske infektioner og - helbredende virkning over for prostata-hypertrofi.

Det kan også anvendes inden for landbruget til at bekæmpe vegetal mycosis. Lucknomycin kan anvendes oralt, lokalt eller intravaginalt. Lægen vil angive den daglige dosis. Således vil for eksempel, ved behandling af vaginitis, lucknomycin blive anvendt intravaginalt i en dosis på to vaginaltabletter pr. dag indeholdende 10 til 50 mg lucknomycin pr. tablet på 800 til 900 mg, over en periode på to til tre uger.

6 141556 6. Beskrivelse af mikroorganismen.

Den stamme, der anvendes til fremstilling af lucknomycin, har været underkastet identifikations-undersøgelser ved Centraalbureau voor Schimmelcultures of Baam (Holland) og er deponeret her under staimnenummeret CBS 101.74. Undersøgelserne viste, at denne mikroorganisme tydeligt hører til arten Streptomyces diasta-tochromogenes (Krainsky) Waksman og Henrici, for så vidt angår dens væsentligste karakteristika. Den eneste forskel, ikke-udnyttelse af sucrose, er ikke af en sådan betydning, at der foreligger bevis for en ny art. S.bottropensis Waksman 1956, S. phaeophaciens Maeda et al., 1952 og også S. luteogriseus Schmitz et al., 1964, ligger også meget nær og kan muligvis betragtes som synonyme, som tidligere angivet af Hiitter i 1967 for S. bottropensis og S. phaeophaciens.

Med henblik på at studere organismens morfologi og dyrkningskarakteristika blev organismen dyrket (sporeprøver i destilleret vand taget med en platinbøjle fra kulturer i skråkultur-prøverør) i de nedennævnte medier i fra 10 til 14 dage ved 28°C ί 1°G. Kulturer med god sporedannelse i Petriskåle blev undersøgt direkte med et optisk mikroskop. De prøver, der skulle undersøges under et elektronmikroskop, vandtes ved forsigtigt at presse kobbergitre belagt med '’farmvar” på det sporeholdige mycelium. Der blev også foretaget undersøgelser med hensyn til kulturens karakteristika, navnlig farverne af luftmycelium og af myceliet i substratet (Maers og Paul 1950), og med hensyn til enhver ændring af mediets farve.

6.1 Parve:

Medium Observationer_ farve af luft- farve af mycelium opløseligt mycelium i substrat_ pigment 1. Havremels-agar brun-grå blegbrun intet 2. Mineralsalt-stivelse-agar grå bleggul intet 3. Asparagin-dextrose-agar grå bleggul intet 4. gær-malt-agar grå blegbrun intet 5. Czapek-agar lysegrå lysegrå intet 6. Conn-agar hvid til sand- blegbrun intet farvet 7. Nærings-agar bronze-brun lysebrun brunt 8. Tomat-havremel-agar brunlig-grå blegbrun intet 9. Hickey-Tresner-agar olivengrøn ravgul intet 10. Kartoffel-agar hvid til ahornsukker lysebrunt skifergrå 11. Molasse-agar grå mørkebrun intet 6.2 Mikroskopiske karakteristika.

Morfologi af sporekæder:

Opdelingsspiraler. Spiralerne er åbne med 4 til 6 vindinger. Ved mod- 141556 7 ning har sporekæderne fra 10 til 50 sporer pr. kæde. Sporoforgrenene har en flerakset anbringelse. Sporerne er elliptiske. Sporeoverfladen er glat.

Farve af koloni: Farve af luftmasse i forskellige nuancer af gr£t på gær-malt-agar, havremel-agar, glycerol-asparagin-agar og galt-stivelse-agar.

Bagside af koloni: Ingen tydelige pigmenter (olivenbrun på gær-malt-agar, gullig-brun til brun med gul kant på havremel-agar og grålig-gul med nogle mørke plettet på glycerol-asparagin-agar og salt-ativelse-agar).

Farve i medium: Dannelse af melanoide pigmenter i pepton-gær-jern-agar og tyrosin-agar. Intet pigment i gær-malt-agar, havrenel-agar, salt-stivelse-agar og glycerol-asparagin-agar* 6.3 Biokemiske karakteristika.

Produktion af melamin : positiv dekomponering af tyrosin : positiv produktion af hydrogensulfid : positiv proteolyse (gelatine) : positiv reduktion af nitrater : negativ udnyttelse af carbon : arabinose, rhamnose, glucose, galactose, fructose, mannose, lactose, maltose, dextrose, glycerol og salicin udnyttes fuldstændigt, xylose, raffinose, stivelse, inositol, mannitol og natriumacetat udnyttes delvis, sucrose, inulin, sorbitol og natriumcitrat udnyttes ikke.

Lucknomycln vindes, når den opbyggende mikroorganisme dyrkes 1 et vandigt næringsmedium under neddykkede aerobe betingelser. Til fremstilling af begrænsede mængder af stoffet kan der anvendes overfladekulturer og flasker. Organismen dyrkes i et næringsmedium indeholdende en carbonkilde, f.eks. et assimilerbart car-bonhydrat, og en nitrogenkilde, for eksempel en assimilerbar nitrogenforbindelse eller et assimilerbart proteinmateriale. Foretrukne carbonkilder omfatter arabinose, rhamnose, glucose, galactose, fructose, mannose, lactose, maltose, dextrose, glycerol, salicin, xylose, raffinose, stivelse, inositol, mannitol og natriumacetat. Foretrukne nitrogenkilder omfatter ammoniumsulfat, majsstøbevæske, pepton, maltekstrakt og bomuldsfrøprotein. Der kan med fordel også anvendes kombinationer af disse carbon- og nitrogen-kilder. Om ønsket kån spor af metaller, f.eks. zink, magnesium,mangan,cobalt, jern og lignende, sættes til forgæringsmediet, men dette er ikke nødvendigt, da der til fremstillingen af dyrkningsmediet anvendes vandværksvand og urensede råmaterialer.

8 141556

Lucknomycin fremstilles inden for det temperaturområde, der tillader tilfredsstillende vækst af mikroorganismen, nemlig mellem 20 og 32°C, og fortrinsvis mellem 27 og 29°C* Den optimale forgæringstid kan variere fra 2 til 10 dage. Dyrkningsmediet skal fortrinsvis have en indledende ρΗ-værdi nær 7,0. Den endelige pH-værdi afhænger af tilstedeværelsen af puffere og ligger fortrinsvis også ved ca. 7,0 på det tidspunkt, hvor der foretages sterilisation.

Når forgæring gennemføres i beholdere af store dimensioner, foretrækkes det til inokulering at anvende den vegetative form i stedet for sporeformen af mikroorganismen for at undgå enhver latenstid ved produktionen af lucknomycin og for at udnytte forgæringsudstyret bedre. Af denne grund er det ønskeligt at frembringe et vegetativt inokulum i en næringskultursuppe ved at inokulere denne suppe med en jordprøve eller en prøve fra en skråkultur. Når der således er vundet et ungt og aktivt vegetativt inokulum, overføres dette aseptisk til større beholdere. Det medium, der anvendes til fremstilling af et vegetativt inokulum, kan være identisk med eller forskelligt fra det medium, der anvendes til luckno-mycin-produktionen i stor målestok, forudsat at god vækst af mikroorganismen sikres.

Der kan anvendes forskellige fremgangsmåder til at isolere og rense lucknomycin, for eksempel opløsningsmiddelekstraktion, gelchromatografi og væske-væske-fordeling i et Craig-apparat. Opløsningsmiddelekstraktions-processer foretrækkes til industriel udvinding, fordi de er hurtigere og mindre bekostelige.

Foretrukne rensningsprocesser omfatter de, der gør brug af "Merckogel" 500 (polyvinylacetatgel fra E.Merck (Darmstadt)) eller "Sephadex" LH 20 (polysaccha-rid (dextran) fra PHARMACIA AB).

Ved den foretrukne udvindingsmetode udvindes lucknomycin fra dets dyrkningsmedium ved fraskillelse af myceliet og uopløste faste stoffer på sædvanlig måde, såsom ved filtrering eller ved centrifugering. Det antibiotiske stof fjernes derefter fra den filtrerede eller centrifugerede suppe ved ekstraktion med normal butanol. Efter dræning og filtrering (eller centrifugering) bliver myceliet ekstraheret med en alkohol (ethanol eller methanol). Denne ekstrakt koncentreres, og det uopløselige materiale behandles successivt med hexan (eller petroleums-ether), chloroform og diethylether for at fjerne spor af et antibakterielt poly-peptidstof, der er uden interesse. Det uopløselige materiale vaskes derefter med acetone og tørres i vakuum. Yderligere rensning eller en rensning af resterne indeholdende lucknomycin kan gennemføres ved gelchromatografi under anvendelse af for eksempel dimethylformamid som eluent. Eluatet fra den chromatografiske søjle koncentreres i vakuum ved en temperatur på højst 40°C, og lucknomycinet udfældes med diethylether eller en l:l-blanding af diethylether og hexan og udvindes ved filtrering eller centrifugering.

9 U1556 7. Eksempler.

Opfindelsen skal beskrives nærmere gennem følgende eksempler.

Eksempel 1

Forgæring af Streptomyces diastatochromogenes til fremstilling af lucknomycin. Spiringstrin.

En lyofiliseret kultur af S. diastatochromogenes var. (Krainsky) Vaksman og Henrici CBS 101.74 blev sat til en beholder på 500 ml, der kunne rystes, og som indeholdt 100 ml af følgende sterile medium: bacto-kødekstrakt * 3 g bacto-pepton ^ 5 g dextrose 10 g gærekstrakt ί 5 g vandværksvand 1000 ml

Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A.) hvis pH-værdi var indstillet på 7,2 med en vandig opløsning af natriumhydroxid.

Beholderen og dens indhold blev inkuberet i 2 dage ved 28°C t l°c på en roterryster (250 r.p.m., vandring 50,8 mm).

Inokulumfremstillingstrin.

En charge inokulum på ca. 6 liter blev fremstillet ved følgende fremgangsmåde: 10 ml Inokulum (fra spiringstrinnet) blev overført til hver af en række beholdere, der hver indeholdt 200 ml af det følgende sterile medium: glycerol 10 ml L-asparagin ^ 1 g dikaliumhydrophosphat %%% 1 g gærekstrakt ^ 0,5 g vandværksvand 1000 ml * Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A.

^ BDH Chemicals Ltd., Poole, England.

J.T. Baker Chemicals Co., New Jersey, U.S.A.

Beholderne og deres Indhold blev inkuberet i 2 dage ved 28 ΐ 1°C på en roterryster (250 r.p.m., vandring 50,8 mm). Supperne blev samlet og overført aseptisk til en steril inokulumbeholder.

6 Liter inokulum blev overført aseptisk til en 100 liter forgæringsbeholder indeholdende 60 liter af det følgende sterile medium: jordnødmel 900 g dextrose (cerelose) 900 g natriumchlorid 30 g 1A15 5 6 ίο calciumcarbonat 6 g gærekstrakt 6 g jordnødolie 60 ml "Rhodorsil .-410" anti-skumme-roiddel (Rhone-Poulenc, Paris,

Frankrig) eller andet egnet anti-skummemiddel 3 ml vandværksvand til 60 liter pH-Værdien blev indstillet til mellem 6,9 og 7,0 forud for sterilisering, og aerob forgæring blev gennemført i 48 timer (indtil volumenet af cellerne repræsenterede ca. 10-15% af det totale volumen) under de følgende betingelser: + o

temperatur 28 - 1 C

tilgang af steril luft 60 liter/minut 2 tryk 0,49 kg/cm omrøring 300 r.p.m.

Forgæringstrin.

En charge på 30 liter inokulum blev overført aseptisk til en 400 liters forgæringsbeholder indeholdende følgende medium: mel 6000 g glucosesirup (indeholdende 60% cerelose) 9000 g natriumchlorid 1500 g calciumcarbonat 300 g gærekstrakt 300 g jordnødolie 3 liter anti-skummemiddel (Rhodorsil -410) 15 liter vandværksvand 300 liter

Forgæring blev gennemført ved 28 ΐ 1°C under omrøring ved 200 r.p.m. med 2 tilgang af atmosfærisk luft ved et tryk på 0,49 kg/cm og ved en hastighed på 300 liter pr. minut. Under forgæringsperioden på 5 dage blev der udtaget prøver på forskellige tidspunkter fra forgæringssuppen og titreret for produktion af antibioticum ved den spektrofotometriske metode. Det vaskede mycelium blev ekstraheret med ethanol, og den optiske tæthed af ethanolekstrakten blev målt ved 383ιημ med et spektrofotometer. Den kalibrerede kurve for rent lucknomycin blev optegnet, og indholdet af prøverne blev beregnet i forhold til denne kurve.

Eksempel 2

Fremstilling af lucknomycin i forskellige medier.

11 141556

Ved at anvende fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 blev en lyofiliseret kultur af S. diastatochromogenes var. (Krainsky) Waksman og Henrici CBS 101.74 underkastet spiring. Efter rystning

·(. Q

i 2 dage ved 28 - 1 C blev cellematerialet opsamlet ved centrifugering af forgæringsblandingen i en steril beholder. Det faste materiale blev vasket ved centrifugering to gange med 100 ml's portioner af sterilt destilleret vaskevand og derefter suspenderet i 100 ml sterilt destilleret vand. Suspensionen anvendtes som et 10% inokulum i forskellige syntetiske medier til forgæring og bestemmelse af produktionen af lucknomycin. Forgæringsprøveme blev gennemført i beholdere, der blev rystet, og der anvendtes den i eksempel 1 beskrevne spektrofotometriske metode til bestemmelse af lucknomycin. Resultaterne fra disse prøver er anført i den følgende tabel:

Medium (vægt%) Rystningstid (dage) Lucknomycin i mikrogram/ml jordnødmel: 2% glycerol: 1% 4 30 natriumchlorid: 0,5% calciumcarbonat: 0,17.

jordnødmel: 2% glycerol: 17.

natriumchlorid: 0,57» 4 91 calciumcarbonat: 0,1% jordnødolie: 1% sojamel: 2% glycerol: 1% natriumchlorid: 0,5% 4 71 calciumcarbonat: 0,1 % jordnødolie: 1% jordnødmel: 27. cerelose: 1,5% natriumchlorid: 0,5% 4 160 calciumcarbonat: 0,1% jordnødolie: 1% jordnødmel: 27. glucoseslrup: 3% natriumchlorid: 0,5% 4 212 calciumcarbonat: 0,17. jordnødolie: 1% 12 UT556

Eksempel 3

Indvirkning af ammoniumsulfat og organisk nitrogen på udbyttet af lucknomycin.

Der blev gennemført forsøg i 500 ml's koniske beholdere indeholdende 100 ml af det følgende medium suppleret med organiske nitrogenkilder af forskellig slags eller med ammoniumsulfat ved optimale niveauer: jordnødmel 27. vægt/volumen cerelose 1,57» vægt/volumen natriumchlorid 0,5% vægt/volumen calciumcarbonat 0,1% vægt/volumen

Et 10% inokulum som beskrevet i eksempel 2 blev tilsat, og beholderne blev rystet på en roterryster (250 r.p.m., vandring 50,8 mm) ved 28 1°C i 72 timer, og de følgende lucknomycintitre blev opnået: procent nitrogen (vægt/volumen) mikrogram/ml af lucknomycin 0,1% ammoniumsulfat 24 0,1% majsstøbevæske 45 0,1% pepton 70 0,1% maltekstrakt 100 0,5% bomuldsfrøprotein 100 kontrol 91

Eksempel 4

Ekstraktion og rensning af lucknomycin.

Efter forgæring blev myceliet udvundet ved dræning og filtrering (eller centrifugering), vasket med vand og derefter ekstraheret tre gange ved rivning med alkohol (ethanol eller methanol). Det viste sig, at 90 vægtprocent af det •antibiotiske stof var indeholdt i myceliet og 10% i væsken fra dyrkningsmediet.

Det antibiotiske stof kunne udvindes fra væsken fra dyrkningsmediet ved ekstraktion med normal butanol.

Den antibiotiske ekstrakt blev befriet for opløsningsmiddel ved en temperatur under 50°C i fravær af lys. Inddampningsresten fra de alkoholiske ekstrakter blev først ekstraheret med hexan (eller petroleumsether) og derefter behandlet med chloroform for at ekstrahere et uønsket antibakterielt polypeptidstof. Dette polypeptid-antibioticum viste sig under de forudgående undersøgelser at være uden særlig interesse, hvorfor det blev bortkastet. Resten blev derefter behandlet med diethylether og lufttørret.

Rensning kunne også gennemføres ved molekylær filtreringschromatografi på "Merckogel" 500 eller "Sephadex" LH-20 under anvendelse af dimethylformamid som eluent. Eluaterne blev undersøgt enten med en Pye Unicam universal wire detector eller med et ultraviolet absorptiometer ved 460 mg.