DE2211299C3 - Verfahren zur Isolierung eines neuen Antibiotikums mit antiprotozoaler und kanzerostatischer Wirksamkeit - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines neuen Antibiotikums mit antiprotozoaler und kanzerostatischer Wirkung.

Die meisten bekannten Antibiotika besitzen keine bedeutsame Wirkung gegen pathogene Protozoen oder sind wegen ihrer Toxizität therapeutisch nicht anwendbar. Es sind zwar einige Antibiotika bekannt (F 1 ο r e y, H. V., et al.: Antibiotics, Oxford University Press, Oxford 1949; Korzybski, T., und Kuryiow i c z. W., Antibiotica, Gustav Fischer Verlag, Jena 1961. G ο 111 i e b, D., und Shaw, P.D., Antibiotics, Springer-Verlag, Heidelberg 1967), die gegen Bakterien und Pilze wirksam sind, aber die Zahl der gegen Protozoen wirksamen Antibiotika ist äußerst gering. Dabei besteht aber ein offensichtlicher Mangel an Arzneimitteln gegen einige durch Protozoen hervorgerufene Krankheiten, wie z. B. gegen die Chagassche Krankheit, Toxoplasmosis, die Leishmania-lnfektionen und, angesichts ihrer Resistenz, auch gegen Malaria.

Fast alle bisher bekannten gegen Protozoen wirksamen Antibiotika wurden auf Grund ihrer antibakteriellen oder antifurgalen Wirkung entwickelt, und ihrer antiprotozoalen Aktivität wurde erst sekundär Aufmerksamkeit entgegengebracht. Die bisherigen Erfahrungen zeigen aber, daß Stoffe dieser Art, also Stoffe mii einem sehr breiten Wirkungsspektrum, toxisch und daher therapeutisch nicht an- wendbar sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung eines Antibiotikums zu schaffen, wobei neue Antibiotika mit einer gegen Protozoenerkrankungen spezifischen Wirkung isoliert werden, deren Isolierung nach den bisher bekannten Verfahren nicht möglich war.

Diese Aufgabe wird erlindungsgcmäß dadurch gelöst, daß der Nährboden nach der Fermentation durch den Mikroorganismus Daclylaria lutea Routin oder sein Myzel mit Äthylazetat oder einem Gemisch aus Äthylazetat und Chloroform unter Zusatz von Chlorwasserstoffsäure extrahiert wird, wobei der erhaltene Extrakt, aus dem dann das Antibiotikum in kristalliner Form isoliert wird, einen pH-Wert in den Grenzen von 2,0 bis 6,0 aufweist.

Im weiteren wird die Erfindung an einigen Beisnielen näher erläutert.

Beispiel 1

In einen 2000-ml-Fermentierkolben werden 400 ml Malzextrakt von 3,5" Bg (Balling) gegeben. Nach erfolgter Sterilisierung und anschließendem Abkühlen wird mit dem Mikroorganismus. Daclylaria lute» Routin beimpft. Die Fermentation verläuft an der Oberfläche während 280 bis 360 Stunden bei 2b bis 30-'C. Die Kulturlösung enthält dann 5 bis 8 meg wirksamer Substanz pro ml Lösung und das Myzel 2 bis 3 meg wirksame Substanz pro ml Myzelvolumen.

Beispiel 2

6 1 Nährboden werden nach erfolgter Fermentation mit 21 mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 angesäuertem Äthylazetat extrahiert. Nach Abtrennung des Extraktes wird die Extraktion noch zweimal wiederholt, jedesmal mit der Hälfte des ursprünglich verwendeten Äthylazetat-Volumens. Die vereinigten Äthylazetat-Extrakte werden dann im Vakuum auf lODO ml eingeengt. Der eingeengte gelbfarbige Extrakt wird nun mit 500 ml, durch Zusatz von gesättigter Kalilauge auf pH 9,0, alkalisiertem Wasser ausgeschüttelt, wobei die wirksame Substanz in die wäßrigealkalische Schicht übergeht und ihr eine dunkelrote Farbe erteilt. Nach Abtrennung der Schichten wird die dunkelrote wäßrige Lösung unter Zusatz von Zellulosepulver oder Kieselgur filtriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,0 bis 3,0 angesäuert und mit 300 ml Äth>lazetat extrahiert, wobei die wirksame Substanz in das Lösungsmittel übergeht und es intensiv gelb färbt. Der Äthylazetat-Extrakt wird dann im Vakuum zur Trockene abgedampft und der Rückstand an einer Kieselgelsäule (Kieselgel der Körnung 40 bis 100 μ, Aktivitätsstufc III) Chromatographien. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Äthylazetat (Volumverhältnis 1:1) eluiert, das Eluat im Vakuum zur Trockene abgedampft und der Rückstand in heißem Butanol zu einer gesättigten Lösung gelöst, die man 24 Stunden bei -)-5C kiistallieren läßt. Die abgeschiedene kristalline Substanz wird abgesaugt, mit Petroläther gewaschen und getrocknet. Ausbeute 48 mg wirksamer Substanz.

Beispiel 3

3 1 Nährboden werden nach der Fermentation durch Zusatz von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 bis 3 angesäuert und mit einem Gemisch aus 1000 ml Äthylazetat und 1000 ml Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird abgetrennt und die Extraktion noch zweimal wiederholt, jeweils mit dem halben Volumen des vorher angewendeten Äthylazetat-Chloroform-Gcmisehcs. Aus den vereinigten Extrakten wird das Antibiotikum nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren isoliert und 22 mg der wirksamen Substanz in kristalliner Form erhalten.

Beispiel 4

Das feuchte Myzel aus 8 I fermentierten! Nährboden wird mit einem Gemisch aus 400 ml Chloroform und 400 ml Äthyiazetat unier Zusatz von 2 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure am Rückflußkühler unter Sieden extrahiert. Dann wird das Myzel abfiltriert und aus dem Chloroform-Äthylazetat-Extrakt das Antibiotikum nach Beispiel 2 isoliert. Ausbeute 180 mg aktiver Substanz.

Beispiel 5

Das aus 5 i fermentierten! Nährboden erhaltene und getrocknete Myzel wird mit 400 ml Äthylazetat unter Zusatz von 1 ml ChlorwasserstofTsäure vorerst 5 Minuten in einem Mischgerät und dann 3 Stunden im Soxhlet-Extniktionsapparat extrahiert. Das Myzel wird abfiltriert und der Äthylazetat-Exlrakt wie im Beispiel 1 verarbeitet. Die Ausbeute des kristallinen Antibiotikums beträgt 12 mg.

Die so erhaltene neue Substanz mit antiprotozoaler und kanzerostatischer Wirkung weist nachstehende physikalisch-chemische Konstanten auf. Die Substanz ist eine schwache Säure der Summenformel C₁₀H₁₀O₆, Molgewicht 304; sie kristallinert (aus Butanol) in orangefarbigen Plättchen, in saurem Milieu ist ihre Lösung gelb, in basischem Milieu dunkelrot. Sie ist in Azetoji, Dime!hylsulfoxid und Älhylazetat löslich, in Wasser, Methanol und Äthanol schwächer löslich und in Petroleum, Benzol und Hexan unlöslich.

Ihr in KBr aufgenommenes Spektrum veranschaulicht folgende Tabelle:

Frequenzen (cm"¹); 3510 (sst); 3460 (sst); 2995 (schw); 2980 (st); 2930 (sst); 2860 (sst); 1645 (sst); 1630 (sst); 1583 (st); 1543 (schw); 1498 (schw); 1475 (st): 1440 (schw); 1430 (schw); 1371 (st); 1328 (sst); 1280 (st>; 1267 (st); 1230 (schw); 1200(sst); 1165 (sst): 1120 (st); 1078 (st); 1045 (st); 1020 (st); 876 (schw); 860 (st); 818 (schw): 780 (st).

In der Tabelle bedeutet:

sst — Sehr stark,
st = Stark,
schw = Schwach.

Biologische Eigenschaften: In \itro wurde bei einer

ίο Konzentration von 2,5 mcg/ml eine Wirkung gegen Lcishmania brasiliensis in 24 Stunden bei 24 C festgestellt. Bei höheren Konzentrationen wurde eine Wirkung gegen gram-positive Bakterien festgestellt, und zwar gegen Staphylococcus aureus bei einer Konzentration von 25 mcg/ml und gegen Bacillus cereus sowie Bacillus subtilis bei einer Konzentration von 50 mcg/ml innerhalb 24 Stunden bei 37⁼ C.

In einer Konzentration von 100 mcg/ml ist die Substanz unwirksam gegen: Trypanosoma cruzi, Tetrahymena pyriformis, Euglenia gracilis und Astasia chattoni. Weitere ist sie unwirksam gegen Escherichia coiie Proteus vulgaris, Candida pseudotropicalis, Candida parapsilosis, Candida albicans, Hansenula anomala, Pichia fermentans, Kloeckera corticis, Cospora lactis, Rhizopus cryzae, Aspergillus fumigatus, Aspeigillus niger und Penicillium chrysogenum.

Außerdem wurde eine kanzerostatische Wirkung

des Antibiotikums gegenüber He-La-Zellen beobachtet.

Bei einer Antibiotikum-Konzentration von 0,56 mcg/ml erfolgte 50"„ige und bei einer Antibiotikum-Konzentration von 1,25 mcg/ml 100"„ige Wachstumsinhibierung der He-La-Zellen.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung eines Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, daß der Nährboden nach der Fermentation durch den Mikroorganismus Dactylaria lütea Routin (der Mikroorganismus ist unter der Benennung Dactylaria lutea Routin im »Centraalbureau voor Schimmelcultures«, Baarn, Holland unter dem alphabetischen Verzeichnis gelagert) oder sein Myzel mit Äthylazetai oder einem Gemisch aus Äthylazetat und Chloroform unter Zusatz von Chlorwasserstoffsäure extrahiert wird, wobei der erhaltene Extrakt, aus dem dann das Antibiotikum in kristalliner Form isoliert wird, einen pH-Wert in den Grenzen von 2,0 bis 6,0 aufweist.