PL85120B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych pleuromutyliny o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupe OH3-h(CH2)t—CH=CH-^CH2)7— ^COO—, CHi(CH2)4-^CH=sCH--CH2—CH=CH— -^(CH2)7—COO—, CH8-^(CH2)9-^CH=CH--(CH2)7— —COO— lub atom wodoru.Sposobem wedlug wynalazku hoduje sie drobno¬ ustroje z gatunku Clitopilus prunulus (Scop. ex Fr.) Kummer (NRRL 3473), jak i z gatunku Cli¬ topilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss (NRRL 3474) w wodnej pozywce zawierajacej jako zródlo wegla weglowodany, a jako zródlo azotu nieorganiczne lub organiczne zwiazki azotowe, po czym pleuro¬ mutyliny wyodrebnia sie w znany sposób.Stosowane w sposobie wedlug wynalazku drobno¬ ustroje naleza do rodziny Tricholomataceae, rzedu Agricales, klasy Basidiomycetes. Zostaly one zde¬ ponowane pod wyzej podanymi numerami w Ko¬ lekcji Fermentations Division of the Northern Re- gional Research Laboratories (NRRL), Peoria, Illi¬ nois.Ponizej podaje sie charakterystyke stosowanych szczepów: NRRL 3473 wykazuje slaby wzrost na pozywce dekstrozo-agarowej Sabouraud, przy czym kolonie po 10 dniach hodowania w temperaturze 25°C po¬ siadaja srednia srednice 7 mm. Barwa wierzchniej strony kolonii jest mlecznobiala, a barwa strony spodniej smietankowa. Barwa isubstratu pozostaje 2 niezmieniona. Struktura powierzchniowa kolonii: kolonia lukowato wzniesiona o konsystenieji aksa¬ mitu o 3—4 promienistych sfaldowaniach. Brzegi kolonii gladkie. Obraz mikroskopowy: strzepki o srednicy 2—4,2 \i bez tworzenia petli i konidiów.NRRL 3474 wykazuje silny wzrost na pozywce dekstrozo-agarowej Sabouraud, przy czym kolonie po 10 dniach hodowania w temperaturze 25°C po¬ siadaja srednia srednice 37 mm. Barwa wierzch- io niej strony kolonii jest mlecznobiala, barwa spod¬ niej strony jest jaskraiwozólta. Barwa suibstratu pozostaje niezmieniona. Struktura powierzchniowa kolonii, slabo podwyzszony w centrum wzgórek w ksztalcie pólkuli, o konsystencji aksamitu, o srednicy 1,0—A,5 mm, z rozchodzacymi sie pro¬ mieniscie, ciasno ulozonymi pasmami strzepków.Brzegi kolonii slabo postrzepione. Obraz mikrosko¬ powy: strzepki o srednicy 2—3,4 \i bez petli i ko¬ nidiów.Fermentacje prowadzi sie metoda podpowierz- chniowa, chociaz mozna ja równiez prowadzic po¬ wierzchniowo. Jako zródlo wegla stosuje sie cukry, zwlaszcza glukoze, laktoze lub skrobie; jako zródlo azotu stosuje sie nieorganiczne lub organiczne zwiazki azotowe takie, jak azotan sodowy, siar¬ czan amonowy, autolizat drozdzowy lub wyciag z namoku kukurydzy. Wymienione zwiazki, w swo¬ ich nieoczyszczonych -postaciach, pokrywaja równo¬ czesnie zapotrzebowanie na zwiazki nieorganiczne.Niniejszy proces fermentacji pod wzgledem zittia- 8512085120 ny pH, pobierania tlenu, przemiany substancji od¬ zywczych oraz wytwarzania odpowiedniego pro¬ duktu, mozna porównac do przebiegu fermentacji penicyliny. Wysoka wydajnosc, przy dobrym wzro¬ scie drobnoustroju, osiaga sie w temperaturze fer¬ mentacji 25°—28°C.Wytwarzanie pleuromutylin sposobem wedlug wynalazku stymuluje dodatek oleju kukurydziane¬ go, slonecznikowego, oliwkowego, oleju olbrotowe- go lub innych olejów pochodzenia zwierzecego i ro¬ slinnego w ilosciach 0,05^5 zaleznie od warunków prowadzonej hodowli, wy¬ nosi przecietnie 3—6 dni; moze byc jednak skró¬ cony lub przedluzony. Wytwarzane produkty znaj¬ duja sie czesciowo w plynie fermentacyjnym, cze¬ sciowo nagromadzone sa w grzybni. Izolacje pro¬ wadzi sie z przesaczu hodowlanego i/lub z oddzie¬ lonej i wysuszonej grzybni.Fermentacje prowadzi sie korzystnie w ten spo¬ sób, ze drobnoustroje poddaje sie najpierw ho¬ dowli wstepnej na podlozu zawierajacym, jako zródlo wegla i azotu, wyciag slodowy, a ponadto make fasolowa, wyciag drozdzowy, agar, pepton, jak równiez sole mineralne. Otrzymana w ten spo- scb brzeczke fermentacyjna przenosi sie nastepnie w celu dalszej hodowli do roztworu fermentacyj¬ nego, zawierajacego glukoze jako zródlo wegla, a jako zródlo azotu autolizat drozdzy browarni¬ czych oraz sole mineralne. Otrzymana brzeczke fermentacyjna przenosi sie znów do plynnej po¬ zywki o skladzie wyzej podanym, dla przeprowa¬ dzenia dalszej hodowli. Po zakonczeniu hodowli otrzymane w ten sposób pleuromutyliny izoluje sie w znany sposób. Ewentualnie prowadzi sie na¬ stepnie rozdzial mieszaniny na mieszanine estrów kwasów pleuromutylinotluszczowych oraz na 14- -dezoksy-14-acetoksymutyline.Mozna równiez hodowle wstepna przeniesc do plynnej pozywki fermentacyjnej, zawierajacej glu¬ koze jako zródlo wegla i autolizat drozdzy praso¬ wanych, jako zródlo azotu oraz sole mineralne.Otrzymana w ten sposób brzeczke przenosi sie do pozywki fermentacyjnej o podanym wyzej skla¬ dzie. Po zakonczeniu hodowli otrzymana brzeczke fermentacyjna przenosi sie do plynnej pozywki fermentacyjnej, która zawiera jako zródlo wegla glukoze^ jako zródlo azotu nasiona sojowe oraz sole mineralne. Po zakonczeniu tej ostatniej ho- howli otrzymana mieszanine substancji ilozuje sie w znany sposób, po czym nastepuje przeróbka ana¬ logiczna do pierwotnie podanej metody.Budowe estru kwasu pleuromutylinotluszczowe- go potwierdza sie widmami w nadfiolecie i w pod¬ czerwieni, reakcjami odbudowy, chromatografia bibulowa, cienkowarstwowa i gazowa. Chromato¬ grafia cienkowarstwowa estrów metylowych kwa¬ sów tluszczowych, otrzymanych przez przeestryfi- kowanie estrów kwasu pleuromutylinotluszczowe- go, na plytkach pokrytych zelem krzemionkowym i impregnowanych azotanem srebra, na których mozliwy jest rozdzial róznych izomerów, wyka¬ zuje obecnosc kwasu olejowego, kwasu linolowego i kwasu gadoleinowego. Budowe 14-dezoksy-14- -acefoksyriiutyiiny potwierdza sie widmami w pod¬ czerwieni, opierajac sie na odbudowie i syntezie pleuromutyliny.Otrzymane zgodnie z wynalazkiem pleuromuty¬ liny stanowia wartosciowy antybiotyk oraz do- skonaly dodatek do pasz. Poniewaz pochodne te stanowia niewielki tylko dodatek do pasz, a po¬ nadto sa slabo resorbowane przez zwierzeta, dla¬ tego spozywanie tych zwierzat przez ludzi nie stwarza niebezpieczenstwa powstania odpornosci io wsród bakterii. Ponadto otrzymane zgodnie z wy¬ nalazkiem pleuromutyliny nie sa stosowane w lecz¬ nictwie ludzkim tak, ze antybiotyki zwykle przyj¬ mowane przez ludzi zachowuja pelna aktywnosc.Wlasciwe dawki pochodnych pleuromutyliny sto- sowane dla drobiu wynosza 2,5—90 mg na kg mie- , szaniny paszowej, dla swin 10—180 mg na kg, dla cielat i tuczników wynosza dziennie okolo 25—120 mg substancji czynnej.Otrzymane zgodnie z wynalazkiem pleuromuty- to liny wykazuja równiez korzystne dzialanie na cho¬ robotwórcze bakterie zwierzece i stad mozna je stosowac w terapii zwierzat.Nastepujace przyklady blizej wyjasniaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Grzybnie otrzymana w hodowli Clitopilus prunulus (Scop. ex Fr.) Kummer 3473) na rozdrobnionych ziarnach kukurydzy prze¬ mywa sie sterylnym roztworem fizjologicznym soli kuchennej. Do 2 kolb Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml wprowadza sie po 50 ml sterylnej plynnej pozywki hodowlanej o nastepujacym skladzie, po czym szczepi kazda kolbe 7 ml otrzymanej uprzed¬ nio zawiesiny: autolizat; drozdzy prasowanych — zródlo azotu 1,5 g/litr glukozy 30,0 g/litr dekstryna 10,0 g/litr KH2P04 4,0 g/litr (NH4)2S04 5,0 g/litr 40 woda destylowana do 1000 ml wartosc pH przed sterylizacja: 6,0 Kolby wytrzasa sie w ciagu 100 godzin na trze- sawce o skoku 40 mm i 260 obrotów na minute w temperaturze 25°C w ciagu 120 godzin, po czym 45 zawartoscia szczepi sie 4 2-litrowe kolby Erlen¬ meyera zawierajace po 500 ml tej samej sterylnej plynnej pozywki. Po 48-godzinnym wytrzasaniu w wyzej opisanych warunkach wprowadza sie otrzymana w postaci gestej zawiesiny grzybnie do w 12-litrowego fermentora szklanego, napelnionego 7,5 litra nastepujacej sterylnej pozywki wyciag z namoku kukurydzianego — zródloazotu Ifl g/litr glukoza 50,0 g/litr 55 MgS04 •7H20 0,5 g/litr KH2P04 0,5 g/litr olej olbrotowy 5,0 g/litr woda destylowana do 1000 ml wartosc pH przed (Sterylizacja 6,5 «o CaCOs (oddzielnie sterylizowany) 3,0 g/litr Po trwajacej 144 godziny fermentacji z napo¬ wietrzaniem i. mieszaniem w temperaturze 25°C otrzymuje sie grzybnie w ilosci 14,5 g suchej masy na litr. Grzybnie odsacza sie na nuczy pod cisnie- •5 niem, przemywa woda i suszy. Z otrzymanego pro-85120 6 duktu wyosabnia sie nienasycone estry kwasu pleuromiutylinotluszczowego w nastepujacy sposób. 1 kg suchej grzybni ekstrahuje sie pieciokrotnie porcjami po 5 litrów 60% metanolu, po czynu wy¬ ciag metanolowy odtluszcza sie dwukrotnie por¬ cjami po 2,5 litra eteru naftowego. Po odwodnie¬ niu i dalszym zageszczeniu fazy eteru naftowego gesta pozostalosc poddaje sie dziesieciostopniowe- mu rozdzialowi pomiedzy 95% metanol i eter naf¬ towy w stosunku 1:1. Frakcje od 3 do 8 otrzy¬ mane w wyniku tego rozdzialu zawieraja ester kwasu pleuromutyliinotluszczowego zas frakcje 9 i 10 zawieraja 14-dezoksy-14-acetoksymutyline.Frakcje 3 do 8 laczy sie, odwadnia, mocno zage¬ szcza, zadaje 10-krotna iloscia heksanu, oziebia, po czym oddziela wytracona substancje. Po dalszym zageszczeniu otrzymuje sie zólty, gesty olej, który wprowadza sie do eteru izopropylowego i zadaje weglem aktywnym w ilosci 10% wagowych. Otrzy¬ muje sie chromatograficznie czysta mieszanine róznych estrów kwasów tluszczowych pleuromuty- liny z wydajnoscia 5,3 g.Przyklad II. Postepuje sie w sposób opisa¬ ny w przykladzie I, lecz zamiast szczepu Clitopilus prunulus stosuje sie szczep Clitopilus pinsitus (Fr.) as. Romagn. Joiss. (NRRL 3474).Po fermentacji trwajacej 144 godziny otrzymuje sie grzybnie w ilosci 12,5 g suchej masy na litr.Z wysuszonej grzylbni wyodrebnia sie nienasycone estry kwasu pleuromutylinotluszczowego w wyzej opisany sposób. PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowych pochodnych pleuro- mutyliny o wzorze przedstawionym na rysunku, 15 w którym R oznacza grupe CHs-hCCH^)?—CH=CH— ^(CH2)t—CGO—, CH3-^(CH2)4^CH=CH-^CH2— —CH=CH-h(CH2)t-^COO—, CH^KCH2)9^CH= =CH—(CH2)t—COO— lub atom wodoru, znamien¬ ny tym, ze drobnoustroje z gatunku Clitopilus paui- 20 nulus (Scop. ex Fr.) Kummer (NRRL 3473), jak równiez z gatunku Clitopilus pinsitus (Fr.) ss. Romagn. Joss (NRRL 3474) hoduje sie w wodnej pozywce zawierajacej jako zródlo wegla weglo¬ wodany, a jako zródlo azotu nieorganiczne lub 25 organicznie zwiazki azotowe, po czym pleuTOmuty- liny wyodrebnia sie w znany sposób.85120 0 0-C-CH-R CH=CK UN-3 zam. 2538/76 Cena 10 zl PL PL