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PATENTANSPRUCH
Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika S 53210/A-I und S 53210/A-II, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Microellobosporia brunea nov. Spez. auf oder in einem Nährmedium züchtet und die Antibiotika aus der Fermentationsbrühe durch extraktive und/oder adsorptive Methoden isoliert und hierauf chromatographisch oder durch Gegenstromverteilung reinigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung der neuen Antibiotika S 53210/A-1 und S 53210/A-II.
Erfindungsgemäss gelangt man zu den neuen Antibiotika S 53210/A-I und S 5321 0/A-II, indem man einen Stamm von Microellobosporiabrunea nov. Spez. auf oder in einem Nährmedium züchtet und die Antibiotika aus der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise durch extraktive und/oder adsorptive Methoden isoliert und hierauf chromatographisch oder durch Gegenstromverteilung reinigt.
Der neue erfindungsgemäss verwendetet Stamm S 53210/A wurde aus Erde isoliert, die aus einem antiken, etwa 2000 Jahre alten, 1976 in Jama Coaque (Ecuador) gefundenen Tonkopf herausgekratzt worden war. Eine Probe davon wurde beim United States Departement ofAgriculture, Peoria, III., USA am 7. Juni 1977 deponiert und steht der Öffentlichkeit unter der Kulturnummer NRRL 11,122 zur Verfügung.
Da der Stamm S 5321 0/A zuerst nur Substratmycel mit seitlichen Einzel- und Doppelsporen bildetete, wurde seine Zugehörigkeit zur Gattung Micromonospora vermutet. Auf einigen Kulturmedien bildet der Stamm jedoch nach zweiwöchiger Inkubation Luftmycel und keulenförmige, 2 bis 7 um lange Sporangien, die ihrerseits ein bis sieben, kugelige bis ellipsoidische, 1,0-2,7 um grosse, unbewegliche Sporen enthalten. Es scheint, dass die Sporen durch Septierung innerhalb kurzer, keulenförmiger Seitenzweige zu entstehen beginnen; die einzelnen Sporen vergrössern sich unterschiedlich stark, reifen als kurze Kette im Sporangium und werden durch apikales Aufreissen der Sporangienhülle befreit. Lange, streptomycetenartige Sporenketten wurden keine beobachtet.
Aufgrund der oben gegebenen Beschreibung stimmt der Stamm S 5321 0/A gut überein mit der von Cross T., Lechevalier M. & Lechevalier H., 1963. A new genus of Actinomycetales: Microellobosporia gen. nov. Journ. Gen. Microbiology 31, 421 (1963), errichteten Gattung Microellobosporia. Diese Gattung umfasst bisher nur vier Arten (vgl. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8'h Edition, Seiten 843-845), wobei M. cinerea und M. violacea violette Farbtöne im vegetativen Mycel aufweisen und die Sporangien von M. grisea mit kristallinen Stachelchen überzogen sind. Der Stamm S 5321 0/A weist diese auffallenden Merkmale nicht auf.
Die vierte bisher beschriebene Art, M. flavea, hat aufgrund der Beschreibung weisses Luftmycel und bildet strohgelbe Kolonien ohne lösliche Pigmente, so dass der Stamm S 5321 0/A mit weissem Luftmycel und beige bis braunen Kolonien ohne lösliche Pigmente jener letzten Art am Nächsten kommt. Da aber zwischen M. flavea und dem neuen Stamm S 53210/A bezüglich der Kohlenstoffverwertung erhebliche Unterschiede bestehen, wurde der Stamm S 5321 0/A als neue Art der Gattung Microellobosporia aufgefasst und aufgrund des braunen, vegetativen Mycels Microellobosporia brunea, nov. Sp. genannt.
Die Wachstumseigenschaften des Stammes S 53210/A auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt: Medium Kultureigenschaften Luftmycel-Form Malz- W.: gut, beige bis braun tritt nach 16 Tagen an Hefeex- Substratmycel aufgerissen den Kolonierändern trakt- Unt.: beige bis braun auf, Rectus flexibilis Agar LM.: weiss, nur an den
Kolonierändern, * weiss B
LP.: keine Hafer- W.: mittelmässig bis gut, tritt nach 17 Tagen mehl- farblos auf, Rectus flexibilis, Agar Unt.: beige bis braun einige Spira a und
LM.: über ganze keulenförmige
Kolonieoberfläche, weiss * Sporangien
Wba
LP.: keine Stärke- W.: schlecht, farblos Rectus flexibilis und Mineral- Unt.: farblos bis braun wenige Spira a (ein bis salz- LM.: spärlich, alabaster weiss, drei Windungen) Agar * W13 ba
LP.: keine Glyce- W.: mittelmässig, farblos tritt nach 14 Tagen rin- Unt.:
farblos bis creme auf, Rectus flexibilis, Aspara- LM.: über ganze einige Spira a und gin-Agar Kolonieoberfläche, keulenförmige
Austernweiss, * Wb Sporangien
LP.: keine W.: = Wachstum Unt.: = Unterseits LM.: = Luftmycel LP.: = Lösliche Pigmente * Referenz mit Bezug auf das Color-wheels System , Bachus & BR< Tresner, 1957.
Physiologische Eigenschaften des Stammes S 53210/A Nitrat-reduktion negativ Stärke-hydrolyse schwach positiv Celluloseabbau negativ Tyrosin-Reaktion negativ Milch-koagulation negativ Milch-peptonisierung negativ Gelatineverflüssigung positiv Melaninbildung negativ Kohlenstoffverwertung des Stammes S 5321O/A Wachstum Kohlenstoffquellen +++ L(+)Rhamnose, D(-)Melibiose, D(+)Mannose, D( + )Maltose + + D( + )Glucose, D( + )Galactose, D( - )Arabinose,
Glycerin, Stärke, D( + )Xylose, D( - )Fructose, D(-)Mannit + D( + )Lactose, D( - )Ribose, D( - )Sorbit, Dextrin + D(-)Salicin, meso-Inosit, L(-)Arabinose,
D( + )Melizitose,
D( + )Raffinose,
D( + )Saccharose + + + = Wachstum und Verwertung gut + + = Wachstum und Verwertung mittelmässig + = Wachstum und Verwertung schlecht + = Wachstum und Verwertung unsicher
Die Züchtung des Stammes 55321 0/A erfolgt durch Anwendung an sich bekannter Methoden und besteht im wesentlichen darin, den genannten Stamm auf oder in einem geeigneten
Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschliessend die im Laufe der Züchtung gebildeten Antibiotika S 53210/A-I und S 53210/A-II zu isolieren.
Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,5 und 7,5 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur kann zwischen 25 und 35 " C liegen. Die Belüftung der Züchtung kann in weiten Grenzwerten schwanken. Die maximale Ausbeute an Antibiotika S 53210/A-I und S 53210/ A-II wird nach 4- bis 7tägier Züchtung erhalten. Für die Beimpfung der Fermentationsmedien wird eine sporulierende Kultur verwendet. Die Fermentationsmedien sollen hauptsächlich eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und gegebenenfalls Mineralsalze und Wachstumfaktoren enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.
Weiterhin eignen sich organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen wie Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Aminosäuren usw.
als Stickstoffquelle. Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum des Organismus, der zur Produktion der Antibiotika S 53210/A-I und S 53210/A-II verwendet wird, erforderlich sind, sollen ebenfalls in dem Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die für den Wachstumsbedarf des erfindungsgemäss verwendeten Stammes S 53210/A genügen.
Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge der Metabolite S 53210/A-I und S 53210/A-II produziert worden ist, was z. B. durch die Aktivität gegen Staphylococcus aureus festgestellt werden kann, wird das Mycel aus der Kulturbrühe abgetrennt und extrahiert. Die im Kulturfiltrat vorhandene Menge der Metabolite kann durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat, Butylacetat, n-Butanol, gewonnen werden. Eine andere Ausführungsform besteht darin, dass man den Mycelanteil in der Kulturbrühe homogenisiert, z. B. mit einem Ultraturrax, und die Metabolite durch Extraktion mit den erwähnten Lösungsmitteln gewinnt.
Eine vorzugsweise Ausführungsform besteht darin, dass die Kulturbrühe durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren in Mycel und Kulturfiltrat getrennt wird. Das Mycel wird danach mit Methanol oder mit Aceton unter Homogenisieren mit einem Turrax extrahiert, das Zellmaterial abzentrifugiert und die organische Phase unter Wasserzugabe konzentriert.
Danach wirdt mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. n-Butanol, oder Äthylacetat, extrahiert und die Extrakte im Vakuum bei niederer Temperatur, vorzugsweise 40 bis 50 " C, im Vakuum eingedampft. Der im Kulturfiltrat verbleibende Anteil an aktiven Metaboliten kann mit den oben erwähnten Lösungsmitteln extrahiert werden. Aus den so erhaltenen Rohextrakten können die Antibiotika S 53210/A-I und S 53210/A-II durch an sich bekannte chromatographische Methoden isoliert und rein dargestellt werden. Vorteilhaft hat sich als erste Operation eine Filtration über Kieselgel erwiesen, wobei bei der Elution mit Methylenchlorid und Methylenchlorid unter Zusatz von 3 bis 5% Methanol zuerst lipophile Begleitstoffe entfernt werden können.
Nachfolgende Elution mit Methylenchlorid-Methanol (88:11:1) und Methylenchlorid-Methanol (1:1) liefert angereicherte Fraktionen mit den neuen Metaboliten. Diese Fraktionen ergeben nach einer Gelfiltration an Sephadex LH 20 mit Methanol und wiederholter Chromatographie an Kieselgel mit z. B. Methylenchlorid Aceton (1:1) bzw. Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) eine Mischfraktion der beiden Metabolite S 53210/A-I und S 53210/A-II. Zur Trennung dieser nahe verwandten Stoffe ist eine Chromatographie an der 1000fachen Menge Kieselgel Merck (Korngrösse 0,04-0,063 mm) notwendig, wobei Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) als Elutionsmittel verwendet werden kann.
Zur weiteren Reinigung der beiden Metabolite kann eine Ausfällung mit Methanol vorgenommen werden. S 53210/A-I und S 53210/A-II werden als gelbes amorphes Pulver erhalten. Beide Reinsubstanzen zeigen nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur einen Smp. > 320 (Zers.).
Die neuen Antibiotika 53210/A-I und S 53210/A-II zeigen folgende Eigenschaften: S 53210/A-I
Gelbes amorphes Pulver. Smp. > 320 (Zers.); [a]20 = + 104,5 (c = 0,637 in Chloroform).
Analyse: Gef. C 48,8 H 4,1 N 12,4 0 19,5 S 13,7%. UV Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 1. IR-Spektrum in KBr, vgl.
Fig. 2. 'H-NMR-Spektrum in DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner Standard, vgl. Fig. 3.
Bei der Aminosäureanalyse wurde neben unbekannten Aminosäuren eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retenti-.
onszeit wie Threonin aufweist.
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ, Cl2-Benzidin grün.
Farbreaktion mit Cl2-Benzidin: Die Dünnschichtplatte wird mit der Fixierlösung besprüht und 7 Minuten in eine mit Chlor gesätttigte Kammer gestellt. Nach der Entfernung des überschüssigen Chlors wird mit der Färbelösung besprüht.
Fixierlösung: 200 ml Äthanol-Aceton (1:1) + 20 Tropfen Essigsäure.
Färbelösung: 0,05molare KJ-Lösung in Wasser (1 Teil) + 0,5%ige Benzidin-Lösung in 20%-iger Essigsäure (4 Teile).
Löslichkeit: S 53210/A-I ist leicht löslich in Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, schwerlöslich in Chloroform, Methanol, Äthanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
S 53210/A-II
Gelbes amporphes Pulver. Smp. > 320 (Zers.); [a]D = + 107,0 (c = 0,622 in Chloroform).
Analyse: Gef. C48,8 H 4,3 Null,9 O19,5 S12,5%.UV- Spektrum in Acetonitril, vgl. Fig. 4. IR-Spektrum in KBr, vgl.
Fig. 5. 'H-NMR-Spektrum im DMSO, 90 MHz mit Tetramethylsilan als interner Standard, vgl. Fig. 6.
Bei derAminosäureanalyse wurde neben unbekannten Aminosäuren eine Aminosäure gefunden, die die gleiche Retentionszeit wie Threonin aufweist.
Farbreaktionen: Ninhydrin negativ, Cl2-Benzidin grün.
Löslichkeit: S 53210/A-II ist leicht löslich in Chlorform, Dimethylformamid, Acetonitril, Dioxan, Dimethylsulfoxid, schwerlöslich in Methanol, Äthanol und unlöslich in Wasser und Hexan.
In der Tabelle 1 sind die Rf-Werte von S 5321 0/A-I und S 53210/A-II im Dünnschichtchromatogramm angegeben (Laufstrecke 14 cm).
Tabelle 1 Rf-Werte Kieselgel Merck 60 Schichtdicke 0,25 mm Fliessmittel: S 53210/A-l S 53210/A-II Methylenchlorid-Methanol- 0,36 0,39 Wasser (80:17,5:2) Methylenchlorid-Methanol- 0,37 0,42 Wasser + 1% Eisessig (80:17,5:2) Polygramm-Platten SILG/UV254 Macherey-Nagel Fliessmittel: Methylenchlorid-Methanol- 0,50 0,60 Wasser + 1% Triäthylamin (80:17,5:2)
Als Nachweisreagens kann Jod verwendet werden. Beim Ansprühen mit einer 0,2%igen Ce(SO4)-Lösung in 50%iger Schwefelsäure und Erwärmen auf 1300 geben S 53210/A-I und S 53210/A-II eine graue bis braune Anfärbung.
Die Metabolite S 53210/A-I und S 53210/A-II sind antimikrobiell wirksam; insbesondere hemmen sie vorwiegend das Wachstum von grampositiven Bakterien. Beide Metabolite zeigen eine sehr breit Aktivität gegen grampositive Bakterien, aber keine Wirkung gegen Hefen und Pilze.
Die Wirkung erstreckt sich auch auf die pathogenen Vertreter der grampositiven Bakterien, wie Staphylococcen, Streptokokken, Corynebakterien, Mycobakterien. Auch gegen Mycoplasmen und Neisserien sind die neuen Antibiotika wirksam.
Im Reihenverdünnungstest wurden folgende Mindesthemmkonzentrationen erhalten (mcg/ml): Organismus MIC MIC
S 53210/A-l S 53210/A-II Staphylococcus aureus 0,01 0,01 S. aureus res. Penicillin 0,01 0,01 S. aureus res. Tetracyclin 0,01 0,01 S. aureus res. Rifamycin 0,01 0,01 S. aureus 6538 P 1,0 0,3 Streptococcus faecalis res. 0,01 0,01 Aminoglykoside Streptococcus pyogenes 0,01 0,1 Streptococcus faecalis 0,1 0,3 Streptococcus haemolyticus 0,01 0,01 Diplococcus pneumoniae 0,1 0,1 Corynebacterium equi 0,03 0,1 Sarcinaluteares.
Erythromycin 0,01 0,01 Bacillus subtilis 0,3 0,1 Clostridium sphenoides 1,0 0,3 Clostridium pasteurianum 0,1 0,1 Mycobacterium thamnophesos 0,03 0,03 Mycobacterium smegmatis 0,01 0,03 Mycoplasma laidlawii 0,1 0,1 Mycoplasma gallisepticum 1,0 1,0 Neisseria catharalis 0,1 0,3 Neisseria pharyngis 0,01 0,01
Medium Brain Heart Infusion Broth, Inoculumdichte 105
Keime/ml Inkubationstemperatur 37 , Inkubationszeit 24 Stunden.
Die neuen Antibiotika S 53210/A-I und S 53210/A-II können fürhumanmedizinische Zwecke als Arzneimittel allein, und zwar in reiner Form oder in den entsprechenden Arzneiformen fürtopicale, enterale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1: Züchtung des Stammes S 53210/A in einer Schüttelkultur a) Agar-Ausgangskultur
Die als Ausgangsmaterial verwendete Agarkultur des Stammes S 53210/A erhält man, indem man ein Kulturmedium (I) folgender Zusammensetzung g/Liter Cerelose (Glucose) 4,0 Malz-Extrakt 10,0 Hefe-Extrakt 4,0 Agar (Bacto) 20,0 destilliertes Wasser 1 Liter mit einer auf an sich bekannte Weise hergestellten Sporensuspension des ursprünglich isolierten Stammes S 53210/A beimpft. Das Medium wird vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 8,3 bis 8,6 eingestellt und beträgt nach der Sterilisation (20 Minuten bei 1200) 6,9 bis 7,3.
b) Sporensuspenison
Eine gut sporulierende Agar-Ausgangskultur des Stammes S 53210/A wird mit 5 ml steriler, 0,9%Der Kochsalzlösung versetzt, was eine dichte Sporen- und Mycelsuspension ergibt.
c) Vorkulturen
Von dieser Sporensuspension wird 1 ml zur Beimpfung eines 200 ml Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml des folgenden Vorkulturmediums (II) enthält: g/Liter Dextrin 10,0 Glucose 10,0 Pepton 5,0 Hefeextrakt 5,0 CaC03 1,0 destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Vorkulturmedium wird in einem Autoklaven bei 1200 während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
Die so angesetzte Vorkultur wird während 3 Tagen bei 27 auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) aerob inkubiert und wird zur Beimpfung einer zweiten Vorkultur verwendet, indem 5 ml der ersten Vorkultur in einem 500 ml Erlenmeyer Kolben mit 100 ml des folgenden Mediums (III) geimpft werden: g/Liter Fleischextrakt 3,0 Trypton 5,0 Glucose 1,0 Stärke löslich 24,0 Hefeextrakt 5,0 CaCO3 2,0 destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,2 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 1200 während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt.
d) Hauptkultur
Die zweite Vorkultur wird während 3 Tagen bei 27 auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) aerob inkubiert und wird dann direkt zur Beimpfung einer Hauptkultur verwendet, indem 5 ml der zweiten Vorkultur in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml des folgenden Mediums (IV) geimpft werden: g/Liter Malzextrakt 30,0 Blutpepton 7,5 destilliertes Wasser 1 Liter
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,0 eingestellt und das Medium in einem Autoklaven bei 1200 während 20 Minuten sterilisiert, worauf der pH-Wert 6,8 bis 7,0 beträgt. Die so angesetzte Hauptkultur wird während 5 Tagen bei 27 auf einer Rundschüttelmaschine (220 U/Min.) inkubiert.
Beispiel 2: Züchtung des Stammes S 53210/A in in einem Fermenter
Die Ausgangskultur für die Züchtung eines 500-Liter-Fer mentationsansatzes ist eine Schrägagarkultur des ursprünglich isolierten Stammen S 53210/A, welche 14 Tage bei 27 auf einem Kulturmedium (I) bebrütet wird. Mit 60 ml Sporen- und Mycelsuspension aus 3 Schrägagarkulturen werden 6 2-L-Erlenmeyerkolben mitje 1 Liter Kulturmedium (II) angeimpft. Diese Vorkultur wird 7 Tage auf einer Rundschüttelmaschine bei 27 mit 180 UPM inkubiert. Die Zwischenkultur im 75-Liter-Stahlfermenter (50 Liter Gärvolumen) wird mit den Kulturen aus den 6 Erlenmeyerkolben angeimpft. Das Medium dieser Kulturstufe enthält Kulturmedium (III). Die Inkubation erfolgt 3 Tage bei 27 mit einer Luftrate von 0,7 L V/V/Min. bei 0,5 bar Druck und einer Rührerdrehzahl von 200 UPM.
Die Hauptstufen-Fermentation im 750-Liter-Gärtank (500 Liter Gärvolumen) erfolgt dann wiederum bei 27 mit einer Nährlösung folgender Zusammensetzung pro Liter: 30 g Malzextrakt, 7,5 g Blutpepton, 1 mg FeSO4 7H2O, 1 mg MnC124 H20, 1 mg ZnSO4 zu 7 H20 und entmineralisiertes Was- ser. Die Inkubation dauert 6 Tage bei einer Rührerdrehzahl von 130 UPM, einer Luftrate von 0,7 L V/V/Min. und bei 0,5 bar Druck. Der pH-Endwert liegt bei 8,7-8,9.
Beispiel 3: Isolierung von S 53210/A-I und S 53210/A-II
420 Liter Fermentationsbrühe werden mit 20proz. Schwefelsäure auf pH 7 gestellt und mit einem Westfalia Klärseparator aufgetrennt, wobei 400 Liter Kulturfiltrat und 15 kg Mycel anfallen. Das Kulturfiltrat wird dreimal mtije 300 Liter n- Butanol extrahiert. Nach dem Waschen der Extrakte mit 100 Liter Wasser wird die organische Phase bei 20-50 Konzentrattemperatur zur Trockene eingedampft, wobei 315 g Roheextrakt anfallen.
Das Mycel wird dreimal mit je 60 Liter Methanol während 30 Minuten turraxiert. Die methanolischen Extrakte, die man durch Abnutschen des Feststoffes erhielt, werden vereinigt und unter Wasserzugabe am Umlaufverdampfer auf ca. 40 Liter konzentriert. Diese wässerige Phase wird danach viermal mit je 40 Liter n-Butanol extrahiert und die Extrakte mit 20 Liter Wasser gewaschen. Die vereinigten Extrakte werden wie oben zur Trokkene eingedampft (77 g Rohextrakt).
392 g vereinigte Butanol-Extrakte aus Kulturfiltrat und Mycel werden anschliessend in 500 ml Wasser gelöst und dreimal mitje 1 Liter Methylenchlorid-Isopropanol (7:3) extrahiert.
Die organischen Phasen werden vereinigt und liefern nach Eindampfen bei 40 im Vakuum 188 g Material. Dieses wird in Methylenchlorid-Methanol (1:1) gelöst mit 400 g Kieselgel vermischt und nach Abdampfen des Lösungsmittels das Pulver auf eine mit Methylenchlorid bereitete Säule von 1 kg Kieselgel (Merck, Korngrösse 0,063-0,2 mm) aufgebracht. Die Elution erfolgt zuerst mit Methylenchlorid und Methylenchlorid unter Zusatz von 3 bis 5% Methanol, dann mit Methylenchlorid Methanol-Wasser (88:11:1). Zuletzt wird mit Methylenchlorid Methanol (1:1) ausgewaschen. Man erhält 65,5 g Fraktionen, die die aktiven Metabolite S 53210/A-I und S 53210/A-II als Gemisch mit Nebenproduktion enthalten.
Dieses Material wird in Methanol gelöst und die Lösung auf eine mit Methanol beretiete Säule von 1,5 kg Sephadex LH 20 gebracht. Die Elution mit Methanol liefert 6,9 g Fraktionen mit Aktivität gegen Staphylococcus aureus. Die nachfolgende Chromatographie dieses Materials an einer mit Methylenchlorid Aceton (2 :1) bereiteten Säule von 50 g Kieselgel und Elution zuerst mit Methylenchlorid-Aceton (2:1), dann mit Methylen chlorid-Methanol (1 liefert eine angereicherte Fraktion von S 53210/A-I und S 53210/A-II. Die Fraktion wird an einer mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser(88:l 1:1) bereiteten Säule von 400 g Kieselgel (Merck, Korngrösse 0,040-0,063 mm) nochmals chromatographiert.
Die durchgehende Elution mit Methylenchlorid-Methanol-Wasser (88:11:1) liefert 963 mg aktives Material, das in 35 ml Methylenchlorid gelöst wird. Nach Zugabe von 35 ml Methanol und Einengen auf ca. l/2 Volumen tritt eine Fällung ein, wobei ein Gemisch von S 53210/A-I und S 53210/A-II als amorphes Pulver erhalten wird. Zur Trennung der beiden antibiotisch aktiven Metabolite wird das Gemisch, analog wie oben beschrieben, an 400 g Kieselgel chromatographiert, wobei zurst S 53210/A-II, dann S 53210/A-I eluiert wird.
Die Fraktionen, welche S 53210/A-II enthalten, werden in Methylenchlorid-Methanol (1:1) gelöst, wonach nach Einengen der Metabolit S 53210/A-II als amorphes gelbes Pulver ausfällt.
Simp. > 320 nach 15 Stunden Trocknen im Hochvakuum bei Raumtemperatur. Die Fraktionen mit S 53210/A-I liefern nach analog durchgeführter Fällungsoperation aus Methylenchlorid Methanol :1)S 53210/A-I alsgelbes amorphes Pulver. Smp. > 320 nach 15 Stunden Trochnen im Hochvakuum bei Raumtemperatur. Die Reinheitprüfung der Chromatographiefraktionen erfolgt dünnschichtchromatographisch auf Kieselgelplatten mit dem Fliessmittel Methylenchlorid-Methanol-Wasser (80:17,5:2). Die Prüfung auf die aktiven Inhaltstoffe kann gegen Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis erfolgen.
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PATENT CLAIM
Process for the preparation of the new antibiotics S 53210 / A-I and S 53210 / A-II, characterized in that a strain of Microellobosporia brunea nov. Specially grown on or in a nutrient medium and the antibiotics isolated from the fermentation broth by extractive and / or adsorptive methods and then purified chromatographically or by countercurrent distribution.
The present invention relates to processes for the preparation of the new antibiotics S 53210 / A-1 and S 53210 / A-II.
According to the invention, the new antibiotics S 53210 / A-I and S 5321 0 / A-II are obtained by using a strain of Microellobosporiabrunea nov. Cultivates specifically on or in a nutrient medium and isolates the antibiotics from the fermentation broth in a manner known per se by extractive and / or adsorptive methods and then cleans them chromatographically or by countercurrent distribution.
The new strain S 53210 / A used according to the invention was isolated from earth which had been scraped out of an antique clay head, found in Jama Coaque (Ecuador) in 1976, about 2000 years old. A sample of this was deposited at the United States Department of Agriculture, Peoria, III., USA on June 7, 1977 and is available to the public under culture number NRRL 11,122.
Since the strain S 5321 0 / A initially only formed substrate mycelium with lateral single and double spores, it was assumed that it belongs to the Micromonospora genus. On some culture media, however, after two weeks of incubation, the strain forms aerial mycelium and club-shaped, 2 to 7 µm long sporangia, which in turn contain one to seven, spherical to ellipsoidal, 1.0-2.7 µm large, immobile spores. It appears that the spores begin to form within short, club-shaped side branches by septation; the individual spores enlarge to different extents, mature as a short chain in the sporangium and are released by apical tearing of the sporangial covering. Long, streptomycete-like spore chains were not observed.
Based on the description given above, the strain S 5321 0 / A agrees well with that of Cross T., Lechevalier M. & Lechevalier H., 1963. A new genus of Actinomycetales: Microellobosporia gen. Nov. Journ. Gene. Microbiology 31, 421 (1963), established the genus Microellobosporia. So far, this genus only includes four species (see Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8'h Edition, pages 843-845), whereby M. cinerea and M. violacea have violet shades in vegetative mycelium and the sporangia of M. grisea with crystalline ones Spikes are covered. The strain S 5321 0 / A does not have these striking features.
The fourth species described so far, M. flavea, has white aerial mycelium due to the description and forms straw-yellow colonies without soluble pigments, so that strain S 5321 0 / A with white aerial mycelium and beige to brown colonies without soluble pigments comes closest to the last species . However, since there are significant differences between M. flavea and the new strain S 53210 / A with regard to carbon utilization, the strain S 5321 0 / A was conceived as a new species in the Microellobosporia genus and due to the brown, vegetative mycelium Microellobosporia brunea, nov. Sp.
The growth properties of the S 53210 / A strain on normal biological media and its carbon assimilation are listed in the following tables: medium cultural properties aerial mycelium form malt - W .: good, beige to brown occurs after 16 days on Hefeex - substrate mycelium torn open the edges of the colonizing tract - Lower: beige to brown on, rectus flexibilis agar LM .: white, only on the
Colonial borders, * white B
LP .: no oats W .: medium to good, appears colorless after 17 days, rectus flexibilis, agar lower: beige to brown some spira a and
LM .: over whole club-shaped
Colony surface, white * sporangia
Wba
LP .: no starch- W .: bad, colorless rectus flexibilis and mineral- Unt: colorless to brown few spira a (one to salt- LM .: sparse, alabaster white, three turns) agar * W13 ba
LP .: no Glyce- W .: medium, colorless occurs after 14 days.
colorless to cream on, rectus flexibilis, Aspara-LM .: whole over a few spira a and gin-agar colony surface, club-shaped
Oyster white, * Wb sporangia
LP .: no w .: = growth bottom .: = underside LM .: = aerial mycelium LP .: = soluble pigments * Reference with reference to the color-wheels system, Bachus & BR <Tresner, 1957.
Physiological properties of strain S 53210 / A nitrate reduction negative starch hydrolysis weak positive cellulose degradation negative tyrosine reaction negative milk coagulation negative milk peptonization negative gelatin liquefaction positive melanin formation negative carbon utilization of strain S 5321O / A growth of carbon sources +++ L (+ ) Rhamnose, D (-) melibiose, D (+) mannose, D (+) maltose + + D (+) glucose, D (+) galactose, D (-) arabinose,
Glycerin, starch, D (+) xylose, D (-) fructose, D (-) mannitol + D (+) lactose, D (-) ribose, D (-) sorbitol, dextrin + D (-) salicin, meso- Inositol, L (-) arabinose,
D (+) melicosis,
D (+) raffinose,
D (+) sucrose + + + = growth and recovery good + + = growth and recovery moderate + = growth and recovery poor + = growth and recovery uncertain
The strain 55321 0 / A is cultivated by using methods known per se and essentially consists in the strain mentioned on or in a suitable one
Medium and under suitable conditions and then isolate the antibiotics S 53210 / A-I and S 53210 / A-II formed in the course of the cultivation.
At the beginning of cultivation, the pH of the fermentation medium should be between 6.5 and 7.5. The optimal temperature for breeding can be between 25 and 35 "C. The ventilation of the breeding can fluctuate within wide limits. The maximum yield of antibiotics S 53210 / AI and S 53210 / A-II is obtained after 4 to 7 days of breeding the fermentation media are inoculated with a sporulative culture, and the fermentation media are said to contain primarily an assimilable carbon source, an assimilable nitrogen source and, where appropriate, mineral salts and growth factors, all of which are in the form of well-defined products or complex mixtures such as those found in biological products Encountered origin, can be fed.
Organic and inorganic nitrogen-containing compounds such as peptone, yeast or meat extracts, ammonium nitrate, ammonium sulfate, amino acids, etc. are also suitable.
as a nitrogen source. Trace elements that are required for optimal growth of the organism used for the production of the antibiotics S 53210 / A-I and S 53210 / A-II should also be contained in the culture medium. Such trace elements usually occur as impurities in the other constituents of the medium in amounts which are sufficient for the growth requirement of the strain S 53210 / A used according to the invention.
As soon as a maximum amount of the metabolites S 53210 / A-I and S 53210 / A-II has been produced during cultivation, which, for. B. can be determined by the activity against Staphylococcus aureus, the mycelium is separated from the culture broth and extracted. The amount of the metabolites present in the culture filtrate can be extracted by extraction with a water-immiscible organic solvent, such as. B. ethyl acetate, butyl acetate, n-butanol can be obtained. Another embodiment is to homogenize the mycelium in the culture broth, e.g. B. with an Ultraturrax, and the metabolites by extraction with the solvents mentioned.
A preferred embodiment consists in that the culture broth is separated into mycelium and culture filtrate by centrifuging and / or filtering. The mycelium is then extracted with methanol or with acetone with homogenization using a Turrax, the cell material is centrifuged off and the organic phase is concentrated with the addition of water.
Thereafter, with a water-immiscible organic solvent, such as. B. n-butanol, or ethyl acetate, extracted and the extracts in vacuo at low temperature, preferably 40 to 50 "C, evaporated in vacuo. The remaining active metabolites in the culture filtrate can be extracted with the solvents mentioned above. From the so obtained crude extracts, the antibiotics S 53210 / AI and S 53210 / A-II can be isolated and presented pure by chromatographic methods known per se Filtration over silica gel has proven to be advantageous as the first operation, with elution with methylene chloride and methylene chloride with addition from 3 to 5% methanol, lipophilic accompanying substances can be removed first.
Subsequent elution with methylene chloride-methanol (88: 11: 1) and methylene chloride-methanol (1: 1) provides enriched fractions with the new metabolites. After gel filtration on Sephadex LH 20 with methanol and repeated chromatography on silica gel with z. B. methylene chloride acetone (1: 1) or methylene chloride-methanol-water (88: 11: 1) a mixed fraction of the two metabolites S 53210 / A-I and S 53210 / A-II. To separate these closely related substances, chromatography on 1000 times the amount of silica gel Merck (particle size 0.04-0.063 mm) is necessary, whereby methylene chloride-methanol-water (88: 11: 1) can be used as the eluent.
To further purify the two metabolites, it can be precipitated with methanol. S 53210 / A-I and S 53210 / A-II are obtained as a yellow amorphous powder. After 15 hours of drying in a high vacuum at room temperature, both pure substances show a mp.> 320 (decomp.).
The new antibiotics 53210 / A-I and S 53210 / A-II have the following properties: S 53210 / A-I
Yellow amorphous powder. Mp> 320 (dec.); [a] 20 = + 104.5 (c = 0.637 in chloroform).
Analysis: Found C 48.8 H 4.1 N 12.4 0 19.5 S 13.7%. UV spectrum in acetonitrile, cf. Fig. 1. IR spectrum in KBr, cf.
Fig. 2. 'H-NMR spectrum in DMSO, 90 MHz with tetramethylsilane as internal standard, cf. Fig. 3.
In addition to unknown amino acids, an amino acid was found in amino acid analysis that has the same retenti.
time like threonine.
Color reactions: ninhydrin negative, Cl2-benzidine green.
Color reaction with Cl2-benzidine: The thin-layer plate is sprayed with the fixing solution and placed in a chamber saturated with chlorine for 7 minutes. After the excess chlorine has been removed, it is sprayed with the coloring solution.
Fixing solution: 200 ml ethanol-acetone (1: 1) + 20 drops acetic acid.
Staining solution: 0.05 molar KJ solution in water (1 part) + 0.5% benzidine solution in 20% acetic acid (4 parts).
Solubility: S 53210 / A-I is easily soluble in dimethylformamide, acetonitrile, dioxane, dimethyl sulfoxide, poorly soluble in chloroform, methanol, ethanol and insoluble in water and hexane.
S 53210 / A-II
Yellow amorphous powder. Mp> 320 (dec.); [a] D = + 107.0 (c = 0.622 in chloroform).
Analysis: Found C48.8 H 4.3 zero, 9 O19.5 S12.5%. UV spectrum in acetonitrile, cf. Fig. 4. IR spectrum in KBr, cf.
Fig. 5. 'H-NMR spectrum in DMSO, 90 MHz with tetramethylsilane as internal standard, cf. Fig. 6.
In addition to unknown amino acids, amino acid analysis found an amino acid with the same retention time as threonine.
Color reactions: ninhydrin negative, Cl2-benzidine green.
Solubility: S 53210 / A-II is easily soluble in chlorine, dimethylformamide, acetonitrile, dioxane, dimethyl sulfoxide, poorly soluble in methanol, ethanol and insoluble in water and hexane.
Table 1 shows the Rf values of S 5321 0 / A-I and S 53210 / A-II in the thin-layer chromatogram (running distance 14 cm).
Table 1 Rf values silica gel Merck 60 layer thickness 0.25 mm superplasticizer: S 53210 / Al S 53210 / A-II methylene chloride-methanol-0.36 0.39 water (80: 17.5: 2) methylene chloride-methanol-0 , 37 0.42 water + 1% glacial acetic acid (80: 17.5: 2) polygram plates SILG / UV254 Macherey-Nagel flow agent: methylene chloride-methanol - 0.50 0.60 water + 1% triethylamine (80:17, 5: 2)
Iodine can be used as a detection reagent. When sprayed with a 0.2% Ce (SO4) solution in 50% sulfuric acid and warmed to 1300, S 53210 / A-I and S 53210 / A-II give a gray to brown color.
The metabolites S 53210 / A-I and S 53210 / A-II are antimicrobial; in particular, they mainly inhibit the growth of gram-positive bacteria. Both metabolites show a very broad activity against gram-positive bacteria, but no activity against yeasts and fungi.
The effect also extends to the pathogenic representatives of the gram-positive bacteria, such as staphylococci, streptococci, corynebacteria, mycobacteria. The new antibiotics are also effective against mycoplasmas and Neisseries.
The following minimum inhibitory concentrations were obtained in the serial dilution test (mcg / ml): Organism MIC MIC
S 53210 / A-l S 53210 / A-II Staphylococcus aureus 0.01 0.01 S. aureus res. Penicillin 0.01 0.01 S. aureus res. Tetracycline 0.01 0.01 S. aureus res. Rifamycin 0.01 0.01 S. aureus 6538 P 1.0 0.3 Streptococcus faecalis res. 0.01 0.01 aminoglycosides Streptococcus pyogenes 0.01 0.1 Streptococcus faecalis 0.1 0.3 Streptococcus haemolyticus 0.01 0.01 Diplococcus pneumoniae 0.1 0.1 Corynebacterium equi 0.03 0.1 Sarcinaluteares.
Erythromycin 0.01 0.01 Bacillus subtilis 0.3 0.1 Clostridium sphenoides 1.0 0.3 Clostridium pasteurianum 0.1 0.1 Mycobacterium thamnophesos 0.03 0.03 Mycobacterium smegmatis 0.01 0.03 Mycoplasma laidlawii 0 .1 0.1 Mycoplasma gallisepticum 1.0 1.0 Neisseria catharalis 0.1 0.3 Neisseria pharyngis 0.01 0.01
Medium brain heart infusion broth, inoculum density 105
Germs / ml incubation temperature 37, incubation time 24 hours.
The new antibiotics S 53210 / A-I and S 53210 / A-II can be used as medicinal products for human medicine purposes alone, in pure form or in the corresponding pharmaceutical forms for topical, enteral or parenteral administration.
In the following examples, which explain the implementation of the method but are not intended to restrict the scope of the invention in any way, all the temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1: Cultivation of the strain S 53210 / A in a shake culture a) starting agar culture
The agar culture of the strain S 53210 / A used as the starting material is obtained by using a culture medium (I) of the following composition g / liter cerelose (glucose) 4.0 malt extract 10.0 yeast extract 4.0 agar (Bacto) 20 Inoculated distilled water 1 liter with a spore suspension of the originally isolated strain S 53210 / A, which is prepared in a manner known per se. The medium is adjusted to pH 8.3 to 8.6 before the sterilization with NaOH and is 6.9 to 7.3 after the sterilization (20 minutes at 1200).
b) Spore suspensions
A well sporulating starting culture of the strain S 53210 / A is mixed with 5 ml of sterile, 0.9% of the saline solution, which results in a dense spore and mycelium suspension.
c) pre-cultures
1 ml of this spore suspension is used to inoculate a 200 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of the following preculture medium (II): g / liter dextrin 10.0 glucose 10.0 peptone 5.0 yeast extract 5.0 CaC03 1.0 distilled water 1 liter
The pH is adjusted to 7.2 with NaOH. The preculture medium is sterilized in an autoclave at 1200 for 20 minutes, after which the pH is 7.0 to 7.2.
The pre-culture thus prepared is aerobically incubated for 3 days at 27 on a rotary shaker (220 rpm) and is used to inoculate a second pre-culture by mixing 5 ml of the first pre-culture in a 500 ml Erlenmeyer flask with 100 ml of the following medium ( III) be vaccinated: g / liter meat extract 3.0 tryptone 5.0 glucose 1.0 starch soluble 24.0 yeast extract 5.0 CaCO3 2.0 distilled water 1 liter
The pH is adjusted to 7.2 with NaOH and the medium is sterilized in an autoclave at 1200 for 20 minutes, after which the pH is 7.0 to 7.2.
d) main culture
The second preculture is aerobically incubated for 3 days at 27 on a rotary shaker (220 rpm) and is then used directly to inoculate a main culture by placing 5 ml of the second preculture in a 500 ml Erlenmeyer flask with 100 ml of the following medium (IV) be vaccinated: g / liter malt extract 30.0 blood peptone 7.5 distilled water 1 liter
The pH is adjusted to 7.0 with NaOH and the medium is sterilized in an autoclave at 1200 for 20 minutes, after which the pH is 6.8 to 7.0. The main culture prepared in this way is incubated for 5 days at 27 on a rotary shaker (220 rpm).
Example 2: Cultivation of the S 53210 / A strain in a fermenter
The starting culture for the cultivation of a 500 liter fermentation batch is a slant agar culture of the originally isolated strain S 53210 / A, which is incubated for 14 days at 27 on a culture medium (I). 6 2-L Erlenmeyer flasks with 1 liter of culture medium (II) are inoculated with 60 ml spore and mycelium suspension from 3 inclined agar cultures. This preculture is incubated for 7 days on a rotary shaker at 27 at 180 rpm. The intermediate culture in the 75 liter steel fermenter (50 liter fermentation volume) is inoculated with the cultures from the 6 Erlenmeyer flasks. The medium of this culture level contains culture medium (III). The incubation takes place for 3 days at 27 with an air rate of 0.7 L V / V / min. at a pressure of 0.5 bar and a stirrer speed of 200 rpm.
The main stage fermentation in the 750 liter fermentation tank (500 liter fermentation volume) is then carried out again at 27 with a nutrient solution of the following composition per liter: 30 g malt extract, 7.5 g blood peptone, 1 mg FeSO4 7H2O, 1 mg MnC124 H20, 1 mg ZnSO4 to 7 H20 and demineralized water. The incubation lasts 6 days at a stirrer speed of 130 rpm, an air rate of 0.7 L V / V / min. and at 0.5 bar pressure. The final pH is 8.7-8.9.
Example 3: Isolation of S 53210 / A-I and S 53210 / A-II
420 liters of fermentation broth with 20 percent. Adjust the sulfuric acid to pH 7 and separate it with a Westfalia clarifier, whereby 400 liters of culture filtrate and 15 kg of mycelium are obtained. The culture filtrate is extracted three times with 300 liters of n-butanol. After washing the extracts with 100 liters of water, the organic phase is evaporated to dryness at 20-50 concentrate temperature, 315 g of crude extract being obtained.
The mycelium is turraxed three times with 60 liters of methanol each for 30 minutes. The methanolic extracts obtained by filtering off the solid are combined and concentrated to about 40 liters with the addition of water on a circulation evaporator. This aqueous phase is then extracted four times with 40 liters of n-butanol and the extracts washed with 20 liters of water. The combined extracts are evaporated to dryness as above (77 g crude extract).
392 g of combined butanol extracts from culture filtrate and mycelium are then dissolved in 500 ml of water and extracted three times with 1 liter of methylene chloride-isopropanol (7: 3).
The organic phases are combined and, after evaporation at 40 in vacuo, give 188 g of material. This is dissolved in methylene chloride-methanol (1: 1), mixed with 400 g of silica gel and, after evaporating off the solvent, the powder is applied to a column of 1 kg of silica gel (Merck, particle size 0.063-0.2 mm) prepared with methylene chloride. Elution is carried out first with methylene chloride and methylene chloride with the addition of 3 to 5% methanol, then with methylene chloride methanol-water (88: 11: 1). Finally, methanol (1: 1) is washed out with methylene chloride. 65.5 g of fractions are obtained which contain the active metabolites S 53210 / A-I and S 53210 / A-II as a mixture with secondary production.
This material is dissolved in methanol and the solution is placed on a column of 1.5 kg of Sephadex LH 20 which has been treated with methanol. Elution with methanol gives 6.9 g fractions with activity against Staphylococcus aureus. The subsequent chromatography of this material on a column of 50 g of silica gel prepared with methylene chloride acetone (2: 1) and elution first with methylene chloride acetone (2: 1), then with methylene chloride-methanol (1 gives an enriched fraction of S 53210 / AI and S 53210 / A-II. The fraction is again chromatographed on a column of 400 g of silica gel (Merck, particle size 0.040-0.063 mm) prepared with methylene chloride-methanol-water (88: 1 1: 1).
Continuous elution with methylene chloride-methanol-water (88: 11: 1) provides 963 mg of active material, which is dissolved in 35 ml of methylene chloride. After adding 35 ml of methanol and concentrating to about 1/2 volume, precipitation occurs, a mixture of S 53210 / A-I and S 53210 / A-II being obtained as an amorphous powder. To separate the two antibiotically active metabolites, the mixture is chromatographed on 400 g of silica gel, analogously to that described above, first eluting with S 53210 / A-II and then S 53210 / A-I.
The fractions containing S 53210 / A-II are dissolved in methylene chloride-methanol (1: 1), after which the metabolite S 53210 / A-II precipitates as an amorphous yellow powder.
Simp. > 320 after 15 hours of drying in a high vacuum at room temperature. The fractions with S 53210 / A-I provide methanol from methylene chloride after a precipitation operation carried out analogously: 1) S 53210 / A-I as a yellow amorphous powder. Mp> 320 after drying for 15 hours in a high vacuum at room temperature. The purity of the chromatography fractions is carried out by thin layer chromatography on silica gel plates using the eluent methylene chloride-methanol-water (80: 17.5: 2). The active ingredients can be tested against Staphylococcus aureus and Streptococcus faecalis.