KR20130070880A - 다크리오피낙스 종 ｆｂ ｋｃｃｍ １１０８４ｐ 균주 및 이를 포함하는 항진균 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항진균 물질을 생산하는 신규 미생물 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체 추출물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 균주의 배양체 추출물을 유효성분으로 포함하는 진균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 세정제 또는 보존제에 관한 것이다.
본 발명의 신규 미생물 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주생산 항진균 물질은 다양한 곰팡이균 대하여 강한 생장 저해 활성을 보여, 항진균 제제로 약품, 식품 및 농약 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

다크리오피낙스 종 ＦＢ ＫＣＣＭ １１０８４Ｐ 균주 및 이를 포함하는 항진균 조성물 {Dacryopinax sp. FB KCCM 11084P and an antifungal composition comprising the same}
본 발명은 항진균 활성을 가지는 신규 미생물 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
기후변화로 인해 곰팡이와 곰팡이로부터 발생되는 곰팡이 독소의 생산량이 증가하고 있다(Holmquist et al., 1983; Magan et al., 2011). 진균류 곰팡이는 인간의 면역이 약해지거나 약물에 대한 저항력이 생겼을 때 다양한 진균증을 야기시킨다. 대표적인 진균증에는 칸디다증, 아스퍼길루스증, 효모균증, 접합균증 등이 있다. 또한, 곰팡이는 식물 병해를 일으키고, 곰팡이가 발생되면 옥수수, 밀, 보리와 같은 작물의 생산량이 감소하며 일부 경제적 손실을 발생시킨다(Wu, 2006; Bandyopadhyay et al., 2007; Fotso et al., 2002; Thrane et al., 2004; CAST, 2003). 곰팡이는 동물 및 인간의 간장, 신장, 신경 등에 장애를 일으키는 곰팡이독소를 생성한다. 곰팡이독소는 진균류에 속하는 Aspergillus 또는 Penicillium과 불완전균류 곰팡이에 의해 생산되는 2차 대사산물로써 아플라톡신, 오크라톡신, 푸모니신, 제랄레논, 파튤린, 시트리닌 등의 다양한 곰팡이 독소가 이에 해당된다(Liu et al., 2010; Anthony, 2007; Wu et al., 2011).. 곰팡이독소는 질병과 사망의 원인이 되므로 이에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다.
현재 곰팡이에 의한 피해를 감소시키기 위해 항진균 물질이 식품, 약품, 농약 등에 사용되고 있다. 식품보존료 중 안식향산나트륨은 유통기간을 늘리고자 사용하는 대표적인 보존료로 효모와 박테리아를 제어하는데 효과적이며 곰팡이의 성장과 곰팡이 독소의 생산을 저하시킨다. 광범위하게 사용되는 폴리엔 계열의 암포테리신 B는 곰팡이 세포를 죽이는 치료 약물로 침투성 곰팡이 감염을 치료하기 위해 사용된다. 또한, 아졸 계열의 트리아졸, 플루코나졸, 이트라코나졸과 같은 치료 약물은 칸디다증과 크립토콕쿠스 수막염을 치료하는데 사용된다. 다양한 항진균 물질이 식품 및 의약품 등의 여러 산업에 적용되고 있지만 이에 따른 부작용이 문제가 되고 있다. 예를 들어, 안식향산나트륨은 과량 섭취 시 만성 독성이 보고되고 있으며 치료 약물로 사용되는 암포테리신 B, 플루코나졸과 케토코나졸 등은 완치율이 낮고 내성이 높을 뿐 아니라 치료 후에도 재발률이 높고 신독성과 같은 부작용을 포함하고 있다. 이러한 문제점으로 인해 항진균 물질의 사용에 어려움이 있다. 최근 발견된 카스포펀진은 미국 FDA로부터 뛰어난 항진균력과 낮은 독성이 입증되었지만 경구투여 시 낮은 생물학적 이용성을 보인다는 문제점이 있다(Boucher et al., 2004).
현재 사용되고 있는 대부분의 항진균 물질은 합성물질로 소비자들 사이에서는 거부감이 확산되고 있으며 기존의 카스포펀진과 달리, 낮은 독성과 내성을 가지는 천연 유래의 새로운 항진균제의 발견이 필요하다(De Pauw, 2000; Masia and Gutierrez, 2002). 최근 전 세계적으로 각종 곰팡이성 감염 및 질병에 대한 천연성분의 효과규명에 많은 연구가 진행되고 있고 국내에서도 국가적 차원에서 식물, 곤충과 같은 천연성분의 약물 효과에 관해서 다양한 연구가 진행 중에 있다.
이에 본 발명자들은 한국에서 채집된 다양한 곰팡이로 항진균 활성을 확인하던 중, 항진균 활성을 보이는 신규 미생물 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주를 분리하였고, 액체배지와 고체배지에서 최적 성장조건을 확립하였다. 또한, 신규 미생물 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균사체의 추출물의 다양한 미생물에 대한 항진균 활성 및 안정성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
국내특허출원번호 : 10-2001-0065631
본 발명의 목적은 항진균 활성을 가지는 신규한 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 배양체 추출물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 배양체 추출물을 유효성분으로 포함하는 진균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 세정제 또는 보존제를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항진균 활성을 가지고, 수탁번호 KCCM 11084P로 기탁된 것을 특징으로 하는 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 진균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 세정제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 보존제를 제공한다.
본 발명의 신규 미생물 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주가 생산하는 항진균 물질은 다양한 곰팡이균 대하여 강한 생장 저해 활성을 보여, 항진균 제제로 약품, 식품 및 농약 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주의 계통수를 분석한 그림이다.
도 2는 최적 배양 조건을 찾기 위한 실험에 이용된 배지의 조성을 나타낸 것이다.
도 3은 액체 배지의 종류에 따른 성장률을 비교한 것이다.
도 4는 액체 배지의 종류에 따른 pH의 변화를 비교한 것이다.
도 5는 액체 배지의 종류에 따른 항진균력을 비교한 것이다.
도 6은 고체 배지의 종류에 따른 성장률을 비교한 것이다.
도 7은 고체 배지의 종류에 따른 항진균력을 비교한 것이다.
도 8은 추출 용매의 종류에 따른 항진균력을 비교한 것이다.
도 9는 항균 스펙트럼을 확인하기 위해 이용된 균주의 정보이다.
도 10은 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주생산 항진균 물질의 항진균 활성 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 암포테리신 B의 항진균 활성 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12는 안식향산나트륨의 항진균 활성 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 물을 보관 용매로 이용하였을 때, 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주생산 항진균 물질의 안정성을 나타낸 것이다.
도 14는 메탄올을 보관 용매로 이용하였을 때, 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주생산 항진균 물질의 안정성을 나타낸 것이다.
도 15는 TLC를 통해 항진균 물질을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항진균 활성을 가지고, 수탁번호 KCCM 11084P로 기탁된 것을 특징으로 하는 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주를 제공한다. 상기 KCCM 11084P 균주는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 “항진균”이란, 유해성을 가지는 모든 미생물의 생장 또는 성장을 억제하는 것을 말하며, “진균”이란 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 푸사리움 (Fusarium)을 포함한 진균문에 속하는 모든 균을 의미하여, 이에 제한되지는 않으나, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 푸사리움 모니리포르메 (Fusarium moniliforme), 푸사리움 라터리티움 (Fusarium lateritium), 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 레펜스 (Aspergillus repens), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 카와치 (Aspergillus kawachi), 아스퍼질러스 오크라세우스 (Aspergillus ochraceus), 리조푸스 오리제 (Rhizopus oryzae), 뮤코 라세모수스 (Mucor racemosus), 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei), 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum), 페니실륨 코트리눔 (Penicillium cotrinum), 트레멜라 포시폴미스 (Tremella fuciformis), 헤리시움 에리나세움 (Hericium erinaceum), 아우리쿨라리아 아우리쿨라-주다 (Auricularia auricula - judae) 및 트레멜라 아우란티아 (Tremella aurantia)를 포함할 수 있다.
푸사리움(Fusarium)은 식물 병원균으로 벼 키다리병, 보리의 붉은 곰팡이병, 시들음병의 원인균이다. 푸모니신(Fumonisin), 데옥시니발레놀(Deoxynivalenol), 제랄레논(Zearalenone)과 같은 독소를 생성하며 돼지의 폐수종, 말의 뇌백질연화증을 일으키며 인간에 대해서 발암물질로 분류되고 있다.
푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 는 각종 채소류, 화훼류, 밭작물 등에 피해를 주는 균으로 종자 및 어린 모종의 부패를 일으킬 뿐만 아니라 뿌리 및 땅가줄기에 썩음병을 일으키고 지하부에도 썩음병을 일으킨다.
푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)는 목재, 섬유, 플라스틱을 분해하여 변형을 일으키는 작용이 있으며 알루미늄을 부식하거나 주택의 내장재에서 아주 왕성하게 번식한다. 알레르기성 질환, 천식의 한 원인이 된다.
푸사리움 라터리티움(Fusarium lateritium)은 땅콩 헤이즐럿과 같은 견과류 괴사의 원인이 된다.
아스퍼질러스(Aspergillus)는 자연계에 있어서 가장 대중적인 곰팡이의 일종으로 녹색, 갈색, 흑색, 백색, 청록 등 균종에 따라 색상은 여러 가지가 있으며, 주요 발생 장소로는 빵, 만두, 케이크류 외에 곡류나 식품, 먼지, 토양 등이며 발암성의 곰팡이 독을 생산한다.
아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger)는 공업 재료를 변형하거나 부식하는 작용이 있다.
리조푸스(Rhizopus)는 생육이 아주 빠르고 포복지를 가진 것이 특징인 균주이다. 과일, 곡류, 빵 등에 잘 발생하며 각종 채소의 저장시 썩음병을 일으키고 과실의 무름병을 일으키는 원인균으로 알려져 있다.
뮤코(Mucor)는 회백색 솜털 모양의 군락을 형성하며 발육이 빨라 식품에 단시간에 증식한다. 주로 토양, 과일, 전분, 야채 등 부패물에 넓게 분포하고 장시간 저온 보관한 식품 등에서 발생하며 알레르기성 질병을 야기한다.
트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei)는 토양균의 대표균으로써, 농작물의 병원균이다. 녹색 포자는 공중에서 흩어지기 쉬워 천식을 유발하기도 하고, 플라스틱 공업재료를 열화 시키기도 한다. 최근 연구에 의하면 영하 30℃의 저온 냉동고에도 번식하는 것이 발견되고 있다.
알터나리아(Alternaria)는 토마토, 가지, 피망, 오이, 배추 등의 농작물 병원균으로 알려져 있다. 식물 병원균뿐만 아니라 주택, 가공식품, 곡물, 청과물에 번식하고 곰팡이독을 생산하는 유해균이다. 농업용 폴리염화비닐의 표면이 회색으로 되는 부분에서 발견되어 쉽게 분리된다. 플라스틱 부식에 밀접한 관계가 있다.
클라도스포리움(Cladosporium)은 흑색선균과에 속하는 진균으로 작물에서 점무늬 증상을 일으키고 오이의 검은별무늬병을 일으키는 원인균이다. 에어컨 필터 속이나 벽 속에서 잘 번식하는 곰팡이로 우리 몸에서 흑색진균증을 일으키거나 알레르기를 유발하고 천식을 촉진시키기도 한다.
페니실륨 (Penicillium)은 떡, 감귤류, 청량 음료수, 유제품, 소시지 등에 잘 번식하여 이들을 변패시키는 균주이다. 생육 적온은 20~25℃이며, 낮은 온도에서 영양분이 적어도 잘 자란다. 황변미의 원인이 되는 균으로서, 신장장애를 유발하는 황색 유독색소인 시트리닌(citrinin)을 생성한다. 또한 파튤린과 같은 곰팡이 독소를 생산하며 인체에 알레르기성 질환을 유발할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “항진균용 조성물”이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 진균 및 세균의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 항진균 조성물은 항진균 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 병원성 진균의 감염에 의한 질병의 예방 또는 치료용 조성물 또는 상기 병원성 진균의 감염에 의한 질병을 완화하기 위한 목적의 세정용 조성물을 포함한 화장료 조성물의 유효성분, 상기 병원성 미생물에 의한 부패를 방지하기 위한 식품 보존제, 화장품 보존제, 사료 보존제 또는 의약품 보존제를 포함한 보존제의 용도, 상기 병원성 미생물에 의한 사료의 부패를 방지하기 위한 동물 사료용 첨가제의 용도 또는 농작물용 살균제를 포함한 농약의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, “보존제”란 보존 대상 물질이 박테리아나 미생물에 의해 부패되거나 공기 중에 노출되어 산화되는 것을 방지하는 등 식품, 사료, 화장품 및 의약품 등의 보존 대상 물질의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하고, 보존 대상 물질의 기능성 및 신선도를 유지시키기 위하여 사용하는 것을 의미한다. 좁은 의미로는 세균, 곰팡이 또는 효모 등의 위해 미생물 또는 부패 미생물의 발육저지 또는 살균작용을 통해 주로 곡물을 포함한 식품, 사료, 식품 원재료, 가공 식품, 화장품 또는 의약품 등의 장기 보관을 가능케 하기 위해 사용 되는 것을 의미한다.
상기 균사체의 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 핵산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매를 이용하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이며, 보다 바람직하게는 메탄올이다. 본 발명의 일 실시예에서는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획하여 불순물을 제거한 뒤, 메탄올, 에탄올 또는 물을 이용하여 균사체의 추출물을 수득하였다.
또한 본 발명은 상기 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 진균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 진균 감염이란 진균 자체 또는 진균이 분비하는 곰팡이독(Mycotoxin)에 의한 감염 질환을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 KCCM 11084P 균주 배양체 추출물 이외에 제형 및 사용방법에 따라 약리학적으로 사용 가능한 담체나 부형제를 부가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 조성물 단독으로 또는 항진균 활성 또는 진균의 감염에 의한 질환의 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다. 이 경우 상기 진균 감염의 치료 또는 예방용 조성물 내 유효성분의 함량은 0.001 내지 99 중량%일 수 있다. 조성물 내 유효성분의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우 효과적인 효능을 위해선 다량의 투여가 필요할 수 있으며, 99 중량% 초과하는 경우 사용량에 비해 효능이 일정할 수 있어 비경제적일 수 있다. 또한, 사용방법 및 사용목적에 따라 상기 진균 감염의 치료 또는 예방용 조성물은 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 진균 감염의 치료 또는 예방용 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 이의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으므로 하기 기술한 바에 한정되는 것은 아니다.
상기 진균 감염의 치료 또는 예방용 조성물의 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 주사제(INJECTIONS), 캅셀제(CAPSULES) 및 환제(PILLS) 등이 있다. 더 나아가 상기 진균 감염의 치료 또는 예방용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
상기 약리학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제는 제형에 따라 통상의 물질을 사용할 수 있으며, 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제를 사용할 수 있다. 대표적인 희석제 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르, 리퀴드 파라틴 및 생리식염수가 있다. 구체적으로는 제형에 따라 경구 투여의 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있고, 비경구 투여의 경우, 멸균된 수용액, 비수성용제 또는 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등을 사용할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁제는 일 예로 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등일 수 있으며, 상기 좌제는 일 예로 위텝솔, 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지 또는 글리세로제라틴 등일 수 있다.
또한, 추가로 본원발명의 진균 감염의 치료 또는 예방용 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 담체와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 진균 감염의 치료 또는 예방용 조성물의 예방 또는 치료용 조성물의 투여량 또는 사용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 바람직하며, 예컨대 1일 유효 투여량은 통상적으로 성인(70 kg)의 경우, 10 내지 5000 mg/kg 또는 100 내지 3000 mg/kg이고, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있으며, 바람직하게는 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 투여 횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품용 조성물, 바람직하게는 식품 첨가제용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함할 수 있다. 따라서 본 발명은 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물를 유효성분으로 포함하는 식품 방부제를 제공할 수 있다.
본 발명의 항진균 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임 식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 상기 항진균 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품은 진균독을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으며, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 항진균 조성물을 유효성분으로 포함하는 진균독의 예방 또는 개선용 식품에 있어서, 상기 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 10 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 세정제를 제공한다. 상기 세정제는 의류용 세제, 식기 세척제, 식품 세정제, 가전제품 세척제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 세정제 조성물은 피부 또는 구강에 적용하거나 손톱 또는 발톱에 적용될 수 있다.
상기 세정제 조성물은 상기 유효성분 이외에 그 제조에 통상적으로 사용하는 물질, 일 예로 계면활성제, 세정보조기제, pH 조정제, 천연보습성분 및 천연 식물성 오일 등의 보습제, 산화방지제, 금속이온봉쇄제, 방부제, 용제, 착향료 및 색소 등을 더욱 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항진균 효과를 유지하고, 인체에 자극을 주지 아니하는 범위 내에서 추가적인 항진균 물질을 더욱 포함할 수 있다.
상기 세정제 중 유효성분의 사용량은 사용목적과 적용형태, 적용부위, 적용대상물품 등에 따라 적절히 사용될 수 있으며, 예를 들면 전체 조성물 기준으로 0.001 내지 99 중량부를 포함할 수 있으나, 상기 항균 조성물의 함량은 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 계면활성제는 음이온 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및 양쪽성 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 음이온 계면활성제는 일 예로 암모늄 라우릴 술포숙시네이트, 암모늄 라우릴 설페이트, 소디움 코코일 이세시오네이트, 소디움 라우릴 이세시오네이트, 소디움 라우릴 설페이트, 트리에탄올아민 라우릴 설페이트 또는 소디움 라우릴 에테르 설페이트 등일 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 일 예로 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌, 폴리솔베이트 80, 경화 피마자유 유도체, 지방산 디에탄올아미드, 글리세릴스테아레이트 등일 수 있다. 상기 양이온성 계면활성제는 일 예로 3급 지방족 아민염, 알킬트리메칠암모늄클로라이드 또는 디알칼디메칠암모늄클로라이드 등일 수 있다. 상기 양쪽성 계면활성제는 일예로 베타인, 아미드베타인형, 설포베타인형 또는 스테아르트리모늄클로라이드 등일 수 있다.
상기 pH 조정제는 일 예로 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 말산, 푸마르산, 말레산, 글리콜산 등의 유기산, 염산, 황산, 인산, 질산 등이거나 이들 산의 나트륨염, 칼륨염 또는 암모늄염 등을 조합한 것일 수 있으며, 트리에탄올아민, 소듐클로라이드, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 등일 수 있다.
상기 보습제는 보습용도로 사용되는 통상의 오일, 일 예로 식물성 오일 또는 유동파라핀이나, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 솔비톨, 콜라겐 등일 수 있다. 상기 보습제의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량부 함유될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방부제는 일 예로 벤조산, 파라옥시안식향산에스테르, 메틸클로로이소치아졸리논의 혼합물, 페녹시에탄올, 디엠디엠히단토인, 메틸파라벤, 에틸파라벤 또는 프로필파라벤 등일 수 있다.
상기 용제는 일 예로 정제수, 에탄올, 트윈 20, 사이클로메치콘, 미네랄오일 또는 디메치콘일 수 있고, 상기 착항제 및 색소는 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적의 선택할 수 있는 일반적인 세정제 조성물에 사용되는 성분을 사용할 수 있다.
또한 상기 세정제 조성물은 액상, 고형의 비누 또는 분말로 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 세정제 조성물은 화장료 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 크림, 로션, 겔, 팩, 리퀴드, 스프레이, 수 분산액, 파우더 또는 오일의 제형으로 제조될 수 있다. 상기 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 상기 유효성분의 효과를 유지할 수 있는 범위 내에서 당업자에게 용이하게 선정될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리타, 탈크 또는 산화아연 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더를 추가로 포함할 수 있고, 특히 상기 제형이 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오르히드록카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 용매, 용해화제 또는 유탁화제를 포함할 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물, 에탄올, 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 추가로 포함 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 보존제를 제공한다. 상기 보존제는 식품, 곡물을 포함한 저장식품, 화장품 및/또는 의약품의 보존을 목적으로 사용될 수 있다. 상기 보존제는 식품 첨가제, 화장품 첨가제 또는 의약품 첨가제로 응용될 수 있다.
상기 보존제에는 상기 유효성분이 식품, 화장품 또는 의약품과 같은 보존 대상 물질이 의도하고자 하는 효과를 변화시키지 않고, 해당 보존 대상 물질의 품질에 영향을 미치지 아니하는 범위에서 사용될 수 있으며, 일 예로 보존 대상 물질을 기준으로 0.001 내지 10 중량부의 함량으로 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 보존제에는 상기 보존제의 사용목적에 따라 상기 유효성분 이외에 아밀갈레이트, 토코페롤, 부틸히드로퀴논 등과 같은 산화방지제 등이 더욱 포함될 수 있으며, 상기 추가로 포함되는 성분은 상기 유효성분의 목적 즉, 항진균 목적을 저해하지 않는 범위의 함량으로 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 보존제가 식품에 사용되는 경우에는 식품 보존료라고도 하며, 상기 식품 보존제의 경우에는 상기 유효성분 이외에 추가로 부패세균의 발육을 억제하는 방부제나 곰팡이의 발육을 억제시키는 방미제가 함께 사용될 수 있다. 상기 방부제로는 일 예로, 소빈산류, 디하이드로아세트산 등이 사용될 수 있고, 상기 방미제로는 파라하이드록시벤조산에스테르류, 프로피온산염 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 보존제는 곡류 등의 식품 저장 과정에 사용될 수 있다. 일 예로, 곡류에 일정량이 살포되는 형식을 통하여 진균에 의한 곡류의 부패 및 오염을 방지할 수 있다. 상기 목적으로 응용되는 경우 본 발명은 상기 유효성분을 포함하는 방부제 또는 방미제로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 보존제는 사료용 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
상기 사료용 조성물은 상기 유효성분에 곡물, 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료, 당분 또는 유제품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 곡물은 구체적으로는 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀일 수 있고, 상기 식물성 단백질 사료는 구체적으로는 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것일 수 있으며, 상기 동물성 단백질 사료는 구체적으로는 혈분, 육분, 골분 및 생선분일 수 있고, 상기 당분 또는 유제품은 구체적으로는 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분일 수 있다. 상기 동물 사료용 조성물은 추가로 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 또는 질병 예방제와 같은 성분을 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 사료용 조성물에 포함되는 유효성분은 사료의 사용목적 및 사용조건에 따라 달라질 수 있으며, 일 예로 최종 생산된 사료 1kg을 기준으로 상기 유효성분이 0.001g 내지 100g 포함될 수 있다.
또한, 상기 사료용 조성물은 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질로 제조될 수 있으며, 상기 조성물은 메시(mesh)로 공급되거나 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성시킬 수 있으며, 저장을 위해 펠렛화, 팽창화 또는 압출 공정을 거칠 수 있으며, 저장의 용이성을 위해 바람직하게는 과잉의 물을 건조 제거될 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양한 배양체를 용매에 녹인 후 추출하는 단계; 및
(c) 상기 추출물을 제제화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진균성 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 (b) 단계에서 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 핵산, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매를 이용하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이며, 보다 바람직하게는 메탄올이다. 본 발명의 일 실시예에서는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획하여 불순물을 제거한 뒤, 메탄올, 에탄올 또는 물을 이용하여 균사체의 추출물을 수득하였다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 제제예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항진균 활성을 나타내는 균주의 분리 및 동정
곰팡이의 분리에는 APDA(pH 3.5) 배지가 사용되었다. 곰팡이 포자는 APDA plate에 spread법으로 접종하여 25℃의 암실에서 2주간 배양하였다. 곰팡이 군락은 PDA에 옮기고 25℃에서 3주간 배양하고, -70℃에서 저장되었다(Song et al., 2008).
상기 과정을 통해 분리된 곰팡이 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)의 일반적인 배양은 Lee et . al.의 방법에 따라 PDA에서 수행되었다. 먼저 25℃에서 3주간 배양한 후, 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)의 균사를 PDB배지로 옮기고 25℃에서 2주간 150 rpm으로 배양하였다. 균사체의 잔해를 제거하기 위해 포자는 무균성의 멸균된 필터페이퍼를 이용해 준비하였다. 1 × 105의 포자현탁액은 20 ml의 고체배지와 100 ml의 액체배지 (150 rpm)에서 2주 동안 배양되었다.
상기 곰팡이 균주의 유전자 분석을 통해 계통수를 확인하였으며 (도 1), 다크리오피낙스 종 (Dacryopinax sp.)으로 분류되었다. 상기 신규 균주를 Dacryopinax sp. FB란 이름으로 한국미생물보존센터에 2010년 5월 20일 기탁하였으며, 이 균주의 수탁번호는 KCCM 11084P이다.
실시예 2. KCCM 11084P 균주의 배양 조건 최적화
곰팡이 균주 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)의 항진균 물질 생산을 위한 배양 조건을 최적화 하기 위하여, MCM, YM, GY, GP, PD, GYMP, FDM 배지에 대해 액체와 고체배지로 나누어 실험하였다. 상기 배지의 구성은 도 2에 나타내었다 (MCM1 ) : Mushroom complete media, YM2 ) : Yeast extract-Malt extract, GY3 ) : Glucose-Yeast extract, GP4) : Glucose-Peptone, PD5 ) : Patato Dextrose, GYMP6 ) : Glucose-Yeast-Malt-Peptone, FDM7 ) : Fusarium defined media)
액체배지 조건을 확인하기 위하여, 여과 된 포자 현탁액은 20 ml의 고체배지, 100 ml의 액체배지에 접종하였다. 접종된 액체배지는 25℃에서 150 rpm으로 교반하며 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28일 동안 배양하였다. 건조된 균사체의 무게, pH는 일차별 균사 추출물의 항진균력과 함께 측정하였다. 또한, 고체배지 조건을 확인하기 위하여, 포자현탁액 (1 × 104)을 고체배지에 접종하고, 25℃에서 0, 1, 2, 3, 4, 5주 동안 배양하였다. 균사 추출물의 항진균력은 PDA에 pour법으로 Fusarium oxysporum KCTC16909를 접종한 후, paper disc diffusion방법을 통해 성장 저해 능력을 측정하였으며, 항진균 활성은 저해환의 지름으로 나타내었다.
2-1. 액체 배지에서의 실험결과
액체 배지에서의 실험 결과, 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)는 GYMP 배지에서 최고의 성장률을 보였고 그 다음으로 GY, MCM 배지에서 성장률이 높았다 (도 3). 일반적으로 Fusarium속을 배양할 때 이용되는 FDM 배지는 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)에 대한 적절한 배양배지가 아닌 것으로 확인되었으며, 최고 수준의 균사체 성장률은 GP, GY, FD, YM, PD, GYMP, MCM 액체배지에서 접종 후 28일, 24일, 28일, 28일, 24일 12일, 20일 차에 각각 나타났다. 또한, 액체배지에서 총 28일의 배양기간 동안 나타나는 pH의 변화를 도 4에 나타내었다. GY, FDM 액체배지에서 pH 4.0으로 감소했고, GP, PD 액체배지에서 최종 6.0의 pH를 나타내었다. YM, GYMP, MCM 액체배지에서는 배양기간 동안 유사한 pH변화를 보였다. YM, GYMP, MCM에서는 2주 동안 pH 5.0으로 점점 감소했고 그 후, 각각 pH 7.0, 7.0, 6.5로 빠르게 증가했다.
또한, 7가지 액체 배지에서 배양되는 동안 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균사 추출물의 항진균력을 측정하였다 (도 5). 균사체의 메탄올 추출물은 배양기간 동안 4일마다 준비하였고 같은 양 (100ml)으로 추출하여 각각 항진균력을 측정하였다. 액체배양 시 항진균 물질은 균사체에 남으며 균사체 외 분비는 관찰되지 않았다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 항진균 물질은 매우 빠르게 균사체를 형성하는 GYMP 액체 배지에서 가장 많이 생산되었고, 그 생산률은 접종한 뒤 12일 차에 가장 높았다. 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)는 균사체의 성장에 따라 항진균력이 증가하였으며, 이러한 패턴은 배양이 끝날 때까지 유지되었다.
2-2. 고체 배지에서의 실험결과
고체 배지에서의 실험 결과, 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)는 배지의 종류에 상관없이 배양기간 동안 일정한 성장을 보여주었다 (도 6). 특히, FDM 고체 배지에서의 성장률은 FDM 액체 배지와 다른 양상을 보였다. 접종 5주 후에 균사체는 각 배지에서 3-5cm의 직경을 나타내었고 YM 배지에서 최대 성장량 (약 5cm)을 보였다.
또한, 7가지 고체 배지에서 배양되는 동안 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균사 추출물의 항진균력을 측정하였다 (도 7). 매주마다 균사체의 메탄올 추출물을 준비하여, 각각 항진균력을 측정하였다. 그 결과, 최대 성장량을 보이는 YM 배지와 달리 GYMP 배지에서 배양 5주차에 3.5cm의 저해환을 보였다. 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균사 추출물의 항진균 활성은 도 6에서 보여주는 균사체 성장률과 유사한 패턴으로 일정하게 증가하였다. 또한, 배양기간과 비교하였을 때, 항진균 물질의 생산량은 3주 차에 저해환이 약 3cm로 가장 적합하게 나타났으며, 이후 항진균 물질 생산률은 점차 감소하였다. 반면, FDM 배지는 액체 배지와 마찬가지로 균사체 성장과 항진균 물질 생산량에 있어서 적합하지 않은 것으로 확인되었다.
실시예 3. KCCM 11084P 균주 추출물의 항진균 활성 분석
3-1. 항진균 물질 추출
액체와 고체에서 배양한 곰팡이 균사체를 모아서, 동결 건조시켰다. 액체배양으로부터 얻은 균사체는 Whatman paper No. 4로 걸러서 수확하였다. 각각 배양된 균사체를 0.5 × 0.5 ㎝ 크기로 균질화시켜 2 L의 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올 순으로 순차 분획하여, 추출물을 수득하였다. 각각의 추출물은 25℃, 150 rpm으로 1일 동안 교반하고, 상기 추출물을 농축한 후, 50% 메탄올에 녹여 10 ㎎/ml의 농도로 만들었다.
3-2. 추출 용매에 따른 항진균 활성 비교
핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 에탄올, 메탄올 및 물 추출물의 Fusarium oxysporum KCTC16909에 대한 항진균 활성을 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. 실험 결과, 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 추출물은 700 ㎍ 이하에서는 항진균 활성이 나타나지 않았으나, 에탄올, 메탄올, 물 추출물은 Fusarium oxysporum KCTC16909의 성장을 저해하는 것으로 나타났다. 특히 에탄올과 메탄올 추출물은 70 ㎍에서 높은 저해활성을 보였으며 저해환의 크기는 약 1.5 cm 이상으로 확인되었다. 에탄올과 메탄올 추출물의 최소 저해 농도 (MIC) 범위는 0-70 ㎍ 이었으며 물 추출물의 경우 상대적으로 낮은 70-210 ㎍으로 나타났다. 상기 실험 결과를 통해 본 발명의 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P)가 생산하는 항진균 물질을 추출하기 위한 추출용매로 에탄올 또는 메탄올이 가장 적합함을 알 수 있었다.
3-3. 항진균 스펙트럼 분석
다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 추출물의 항진균 스펙트럼을 확인하기 위하여 27종의 곰팡이, 효모, 박테리아에 대해 paper disc diffusion 방법을 수행하였다. 상기 균주의 정보는 도 9에 나타내었다. 여러 가지 농도의 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 메탄올 추출물 (0 ㎎/ml, 1 ㎎/ml, 3 ㎎/ml, 5 ㎎/ml and 10 ㎎/ml)을 disc에 적용하였고, disc는 plate에 올렸다. 순수한 메탄올도 함께 disc에 올려 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 2회 반복으로 수행하였다.
총 27종의 곰팡이, 효모, 박테리아에 대한 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 메탄올 추출물의 항진균 활성 스펙트럼을 도 10에 나타내었다. 실험 결과, 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 메탄올 추출물은 실험에 사용한 19종의 곰팡이 모두와 효모의 일종인 Zygosaccharomyces bailii KCCM50165에 대해 생장 저해 활성을 보였다. 그 중, Fusarium lateritium , Mucor racemosus KCCM12352, Trichoderma reesei KCCM35516, Alternaria mali KCCM11230, Cladosporium cucumerinum KCCM11419, Hericium erinaceum, Auricularia auricula - judae, Tremella aurantia, Zygosaccharomyces bailii KCCM50165의 MIC 범위는 0-70 ㎍로 나타났으며, Fusarium sp., Aspergillus sp., Rhizopus oryzae KCCM11272, Tremella fuciformis의 MIC 범위는 70-210 ㎍로 나타났다. 특히 Mucor racemosus KCCM12352, Trichoderma reesei KCCM35516, Alternaria mali KCCM11230 및 Cladosporium cucumerinum KCCM11419에 대해서 비교적 더 큰 직경의 저해환이 관찰되었다. 그러나 6종의 박테리아에 대한 항균 활성은 확인되지 않았다.
표준물질로 현재 항진균 물질로 이용되고 있는 암포테리신 B와 안식향산나트륨 (sodium benzonate)을 이용하였다. 암포테리신 B는 DMSO (dimethyl-sulfoxide)에 녹여 이용하였으며, Fusarium oxysporum KCTC16909, Mucor racemosus KCCM12352, Trichoderma reesei KCCM35516, Alternaria mali KCCM11230 및 Cladosporium cucumerinum KCCM11419 등 5종의 곰팡이에 대한 항진균 활성 스펙트럼을 확인한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, Fusarium oxysporum KCTC16909 와 Trichoderma reesei KCCM35516의 MIC 범위는 10-100 ㎍ 이었으며 Mucor racemosus KCCM12352, Alternaria mali KCCM11230, Cladosporium cucumerinum KCCM11419의 MIC 범위는 0-1 ㎍으로 나타났다. 또한, 동일 균주에 대하여 안식향산나트륨의 항진균 활성 스펙트럼을 확인하였다. 안식향산나트륨은 증류수에 녹여 이용하였으며, 실험 결과 도 12에 나타낸 바와 같이, Fusarium oxysporum KCTC16909, Trichoderma reesei KCCM35516, Alternaria mali KCCM11230, Cladosporium cucumerinum KCCM11419에 대해 1-25 ㎎에서 저해활성이 관찰되었지만 Mucor racemosus KCCM12352에 대한 항진균 활성은 나타나지 않았다.
상기 실험 결과를 통해, 본 발명의 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주생산 항진균 물질이 현재 항진균 물질로 이용되고 있는 암포테리신 B 또는 안식향산나트륨과 유사한 수준의 항진균 스펙트럼을 보임을 알 수 있었으며, 뛰어난 항진균 활성을 가지는 항진균제제로 이용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. KCCM 11084P 균주생산 항진균 물질의 안정성 분석
다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 생산 항진균 물질의 안정성을 분석하기 위하여, 상기 균주의 메탄올 추출물을 물 또는 메탄올에 용해시킨 후, -20, 5, 25, 50℃에서 180일 동안 보관하였다. 모든 시료의 항진균력은 Fusarium oxysporum KCTC16909에 대하여 측정하였으며, 처음 30일 동안은 5일 주기로 측정하였고, 그 후 120일과 180일에 각각 측정하였다.
실험 결과, 물을 저장용매로 이용한 경우 저해환의 크기가 초기 2.2 cm에서 1.9 cm로 조금 감소하였다 (도 13). 또한, 메탄올을 저장용매로 이용한 경우 저해환의 크기는 2.0-2.3 cm로 나타났다 (도 14). 이를 통해 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균사 추출물은 저장 용매와 온도에 크게 영향을 받지 않으며, 오랜 기간 동안 보관하여도 항진균 물질이 안정함을 확인하였다.
실시예 5. KCCM 11084P 균주 생산 항진균 물질의 TLC 분석
TLC 분석을 통해 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주에서 추출된 항진균 물질을 검출하였다. TLC 전개는 다음 4가지 용매조건으로 수행되었다 (메탄올 : 에틸아세테이트 (7 : 3 v/v), 메탄올 : 에틸아세테이트 (5 : 5 v/v), 메탄올 : 클로로포름 (7 : 3 v/v), and 메탄올 : 클로로포름 (5 : 5 v/v)). 전개가 되면 Plate를 건조시킨 후에 메탄올 : 황산 (90 : 10) 용액을 뿌렸다. 항진균 성분을 나타내는 스팟은 90℃에서 30초간 가열하여 발색시켰다.
실험 결과, 4가지 용매 조성에 따라 스팟의 위치가 다른 것을 확인하였으며, 그 중 메탄올 : 에틸아세테이트 (7 : 3 v/v) 용매조성으로 전개시켜 건조한 후, 10% H2SO4를 분무, 발색하였을 때 가장 뚜렷한 담자색 스팟이 관찰되었고 Rf 값은 0.5-0.6이었다 (도 15).
한국미생물보존센터(국외) KCCM11084P 20100520
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Dacryopinax sp. FB KCCM 11084P and an antifungal composition comprising the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 542 <212> DNA <213> Dacryopinax sp. <400> 1 tgcggaggga tcattaccga gtttacaaac tccctaaccc ctgtgaacat acctatcgtt 60 gcttcggcgg atcgccccgg tgccatcgcg gcccggaacc aggcgcccgc cggggacccc 120 aaacccttga attagtgaag tatcttctga gtaaacaagc aaataaatta aaactttcaa 180 caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg 240 aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccg ccagtattct 300 ggcgggcatg cctgttcgag cgtcatttca accctcaagc ccccgggctt ggtgttgggg 360 ctcggcccgt ccctcgcggc gcgccgtccc cgaaatctag tggcggtctc gctgcagcct 420 cccctgcgta gtagctaaca ctcgcaacgg gacctgcgcg gggccacgcc gttaaacccc 480 caactttctg atggttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca 540 at 542

Claims (9)

  1. 항진균 활성을 가지고, 수탁번호 KCCM 11084P로 기탁된 것을 특징으로 하는 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주.
  3. 제 1항에 있어서 상기 진균은 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 푸사리움 모니리포르메 (Fusarium moniliforme), 푸사리움 라터리티움 (Fusarium lateritium), 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 레펜스 (Aspergillus repens), 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 카와치 (Aspergillus kawachi), 아스퍼질러스 오크라세우스 (Aspergillus ochraceus), 리조푸스 오리제 (Rhizopus oryzae), 뮤코 라세모수스 (Mucor racemosus), 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei), 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 클라도스포리움 쿠쿠메리눔 (Cladosporium cucumerinum), 페니실륨 코트리눔 (Penicillium cotrinum), 트레멜라 포시폴미스 (Tremella fuciformis), 헤리시움 에리나세움 (Hericium erinaceum), 아우리쿨라리아 아우리쿨라-주다 (Auricularia auricula - judae) 및 트레멜라 아우란티아 (Tremella aurantia)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주.
  4. 제 1항의 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 추출물은 에탄올, 메탄올 및 물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항의 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 진균 감염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 1항의 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 세정제.
  8. 제 1항의 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주 배양체의 추출물을 유효성분으로 포함하는 보존제.
  9. (a) 다크리오피낙스 종 FB (Dacryopinax sp. FB) (수탁번호: KCCM 11084P) 균주를 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양한 배양체를 용매에 녹인 후 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 추출물을 제제화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진균성 조성물의 제조방법.
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