CN101218348B - 具有提高的同源重组效率的丝状真菌突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种方法，用于提高多核苷酸定位整合到偏好NHR的丝状真菌细胞基因组的预定位点上的效率，其中，所述多核苷酸具有与所述预定位点同源的区域，所述方法包括操作针对HR的整合途径。本发明还提供了一种丝状真菌突变体，其来自亲本细胞，所述突变体较之所述亲本细胞在同样条件下的HR和/或NHR途径效率和/或NHR/HR比例，具有效率升高的HR途径和/或效率降低的NHR途径和/或效率减小的NHR/HR比例。

Description

具有提高的同源重组效率的丝状真菌突变体
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及提高核酸直接整合进丝状真菌基因组的效率的方法及其用途。
发明背景
真核细胞是用来(重组)生产多肽和次级代谢产物的优选生物。当构建(例如，蛋白质生产菌株)时，编码待生产蛋白的目标基因的整合位点对于对被整合的目标基因的转录和/或表达的调控来说是很关键的。因为在大多数真核生物中，DNA向基因组中的随机整合以高频率发生，通过重组DNA技术来构建蛋白生产菌株，通常导致包含待生产的蛋白编码基因的表达盒违背人们意愿的随机整合。表达盒的这种不可控“随机多种整合”可能是危险的过程，其可能导致对宿主基因组的不想要的修饰。因此，人们高度需要能够通过确保表达盒高效正确定位来构建蛋白生产菌株。
此外，既然越来越多的生物的完整基因组序列已可获得，因此也就有机会构建基因组扩展(spanning)过量表达和缺失文库。此类文库有效构建的一个重要条件是，该目标生物可被有效转化，而且将核酸直接定位整合(targeted integration)到基因组中所需要的必要同源性相对较短。
真核细胞具有至少两条(一条通过同源重组HR，一条通过非同源重组NHR)单独的途径可将核酸(当然，特别是DNA)整合进宿主基因组。酵母Saccharomyces cerevisiae是偏向同源重组(HR)的生物。该生物的非同源和同源重组的比例(NHR/HR)可在大约0.07至0.007之间变动。
WO02/052026公开了Saccharomyces cerevisiae的突变体，其具有增加的DNA序列向其基因组定位(targeting)效率。此类突变菌株缺失NHR中涉及的基因(KU70)。
与Saccharomyces cerevisiae相反，大多数较高级的真核生物，例如，丝状真菌细胞直至哺乳动物细胞，具有针对NHR的偏好。在丝状真菌中，NHR/HR比例在1到超过100的范围内。此类生物中，定位整合频率相当低。为提高该频率，将整合到此类生物基因组中的多核苷酸序列侧翼的同源区域必须相对较长，例如，至少2000bp用于打断(disrupt)单基因，以及至少500bp用于筛选可能的转化子。此类侧翼序列的必需性，对克隆包含所述多核苷酸的DNA构建体和用其转化生物的过程都造成了很重的负担。此外，转化之后，重组过程期间，这些侧翼区域的邻接基因容易被打断，因此引起不想要的和意外的副作用。
缺失KU70的哺乳动物细胞已被分离出来(Pierce et al，Genes andDevelopment，(2001)，15：3237-3242)。这些突变体具有六倍高的针对同源性的修复频率，但是针对同源性的定位整合的效率却没有提高。这表明，用偏好HR的生物(Saccharomyces cerevisiae)获得的结果不能应用到偏好NHR的生物上。
出人意料地，我们发现，在丝状真菌中操作针对HR的核酸整合途径，获得了将核酸定位整合到丝状真菌基因组中的提高的效率。
附图说明
图1描述了用于使Aspergillus niger(A.niger)中hdfA基因失活的置换型载体pDEL-HDFA。该置换型载体包含hdfA侧翼区域、amdS标记和E.coli DNA。在转化A.niger菌株之前，用限制性酶AscI和NotI进行消化，去除E.coli DNA。
图2描述了用于使A.niger中hdfB基因失活的置换型载体pDEL-HDFB。该置换型载体包含hdfB侧翼区域、amdS标记和E.coli DNA。在转化A.niger菌株之前，用限制性酶AscI和NotI进行消化，去除E.coliDNA。
图3描述了用于使A.niger的hdfA基因缺失的策略。所用的DNA构建体包含amdS选择标记，其侧翼有hdfA基因的同源区域(5’和3’)(1)。该构建体通过双同源重组(X)整合到基因组hdfA基因座上(2)，并且置换基因组hd基因拷贝(3)。随后，在正向重复(U)上的重组去除了标记，从而获得了对hdfA基因的精确切割(4)。
图4描述了用于使A.niger的hd基因缺失的策略。所用的构建体包含amdS选择标记，其侧翼有hdfB基因的同源区域(5’和3’)(1)。该构建体通过双同源重组(X)整合到基因组hdfB基因座上(2)，并且置换基因组hdfB基因拷贝(3)。随后，在正向重复(U)上的重组去除了amdS标记，从而获得了对hdfB基因的精确切割(4)。
图5描述了用于通过单同源重组将DNA构建体整合进A.niger基因组的策略示意图。表达载体包含选择性amdS标记和目标基因，其侧翼有glaA基因座的同源区域(分别为3’glaA和3”glaA)，以直接在基因组glaA基因座上整合。
发明详述
本文提到的所有专利文献和出版物，包括此类专利文献和出版物中公开的所有的序列和方法，都通过引用并入木文。这些专利文献和出版物包括：EP357127B、EP635574B、WO97/06261、WO98/46772。
提高多核苷酸向丝状真菌细胞基因组中定位整合的效率的方法
本发明提供了一种方法，用于提高多核苷酸向偏好NHR的丝状真菌细胞基因组中预定位点定位整合的效率，其中，所述多核苷酸与所述预定位点具有同源区域，所述方法包含，操作(steer)针对HR的整合途径。本发明通过如下方式来达成上述的操作，所述方式包括：提高HR途径的效率和/或降低(意为减小)NHR途径的效率和/或减小NHR/HR的比例。
在本发明的上下文中，HR途径被定义为：对多核苷酸向宿主定位整合的控制过程中所涉及的所有基因和元件，所述多核苷酸与宿主基因组中某些预定位点具有一定的同源性，其中，整合是定位的。NHR途径被定义为：对多核苷酸向宿主定位整合的控制过程中所涉及的所有基因和元件，不考虑所述多核苷酸与宿主基因组序列之间同源性的程度。
根据一种优选的实施方式，操作包括：提供亲本丝状真菌细胞突变体，其中，下述检验中，该突变体中NHR/HR比例较之所述亲本生物的所述比例降低至少5％。更优选地，较之所述亲本生物的NHR/HR比例，NHR/HR比例在突变体中减少至少10％，进一步更优选地，至少50％，最优选地，至少100％。
根据另一种优选的实施方式，下文所述的检验进行测量时，本发明的丝状真菌细胞具有的NHR/HR比例为至少200，至少50，至少10。优选地，丝状真菌细胞的该比例为至少1，更优选地，至少0.5，进一步更优选地，至少0.1，更优选地，至少0.05，进一步更优选地，至少0.01，进一步更优选地，至少0.005，进一步更优选地，至少0.001，进一步更优选地，至少0.0005，进一步更优选地，至少0.0001，最优选地，至少0.00001。
根据一种更为优选的实施方式，下文所述的检验进行测量时，本发明的丝状真菌细胞具有的NHR/HR比例为小于200，优选小于50，小于10。进一步更优选地，丝状真菌细胞的该比例为小于1，进一步更优选地，小于0.5，进一步更优选地，小于0.1，更优选地，小于0.05，进一步更优选地，小于0.01，进一步更优选地，小于0.005，进一步更优选地，小于0.001，进一步更优选地，小于0.0005，进一步更优选地，至小于0.0001，最优选地，小于0.00001。
NHR/HR比例优选通过WO02/052026(第23页表2)所述的检验来测量。根据一种优选的实施方式中，亲本生物是在宿主细胞一节中所定义的丝状真菌细胞之一。根据另一种优选的实施方式，本发明的丝状真菌细胞来自宿主细胞一节中所定义的物种。
或者，根据另一种较少优选的实施方式，使用本领域技术人员已知的技术来监测丝状真菌的NHR/HR比例，例如，对此类途径中涉及的下述组分中至少一种进行转录情况检测和/或northern杂交印记和/或western杂交印记，所述组分包括：KU70、KU80、MRE11、RAD50、RAD51、RAD52、XRS2、SIR4、LIG4。
在本发明的上下文中，“同源区域”指“至少一处”同源区域。本文中预定位点被定义为：宿主细胞含有的遗传物质内部、与该位点具有同源性的多核苷酸通过本发明的方法整合上去的位点。
在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种方法，用于提高多核苷酸向偏好NHR的丝状真菌细胞基因组中预定位点定位整合的效率，其中，所述多核苷酸与所述预定位点具有同源区域，所述方法包含，操作针对HR的整合途径，这通过如下方式来进行：提供丝状真菌，其中相对于同样条件下该丝状真菌的来源的NHR途径的效率和/或NHR/HR比例而言，其NHR途径的效率已被降低和/或NHR/HR比例已被降低。根据一种优选的实施方式，亲本生物是如宿主细胞一节中定义的丝状真菌之一。
优选地，通过WO02/052026(第23页表2)所述的检验来测量NHR途径的效率。
或者，根据另一种较少优选的实施方式，使用本领域技术人员已知的技术来监测丝状真菌NHR途径的效率，例如，对此类途径中涉及的组分进行转录情况检测和/或northern杂交印记和/或western杂交印记。更优选地，下述组分中至少一种的表达水平被监测：KU70、KU80、MRE11、RAD50、RAD51、RAD52、XRS2、SIR4、LIG4。进一步更优选地，KU复合体的同源组分的水平被监测。最优选地，同源KU70和/或KU80的表达水平被监测。
降低的NHR效率指，至少低于获得细胞的来源的亲本细胞。优选地，降低意味着降低2倍，更优选地，降低10倍，进一步更优选地，降低100倍，最优选地，降低1000倍，进一步最优选地，用nothern或western杂交印记、阵列技术或表型筛选不可探测到。
可使用的典型表型筛选包括如下步骤：用表达盒转化可能的NHR突变体，所述表达盒包含选择标记基因，其侧翼有预定基因座的同源序列。用于该表型筛选中的选择标记基因可从大量有用于转化丝状真菌的标记基因中选出。举例而言，这些标记包括但不限于，显性及双向选择标记基因，例如乙酰胺酶(amdS)基因(EP635574B或WO97/06261)，营养缺陷型标记基因，例如，argB、trpC或pyrG和抗生素抗性基因，其提供对例如腐草霉素(ble基因编码的产物，赋予对腐草霉素的抗性)、潮霉素B或G418的抗性。一种优选的选择标记基因是ble基因，其编码赋予对腐草霉素抗性的蛋白。可能的NHR突变体已在该预定基因组位点上含有双向选择标记基因，例如amdS基因、硝酸盐还原酶基因(niaD)、硫酸盐透性酶(Sut B)基因或PyrG基因。niaD基因已在别处被描述过(Gouka RJ，van Hartingsveldt W，Bovenberg RA，van den Hondel CA，vanGorcom RF.Cloning of the nitrate-nitrite reductase gene cluster of Penicilliumchrysogenum and use of the niaD gene as a homologous selection marker.JBiotechnol.1991Sep；20(2)：189-99)。niaD基因能在含有氯酸盐的平板上对转化子直接选择，因为细胞会变得对氯酸盐有抗性。sutB基因已被描述于别处(van de Kamp M，Pizzinini E，Vos A，van der Lende TR，Schuurs TA，Newbert RW，Tumer G，Konings WN，Driessen AJ.Sulfate transport inPenicillium chrysogenum：cloning and characterization of the sutA and sutBgenes.J.Bacteriol.1999Dec；181(23)：7228-34)。一种优选的选择标记基因是与A.nidulans gpdA启动子融合的A.nidulans amdS编码序列(EP635574)。来自其它丝状真菌的AmdS基因也可以使用(WO97/06261)。在表型筛选的优选形式中，amdS基因存在于预定的基因组位点上，ble基因被用作为定位到预定位点的基因。在HR未被提高的突变体中，ble盒将在基因组中随机整合，这使得很多转化子能在具有乙酰胺和腐草霉索的双选择性培养基上生长；相对较少的转化子在氟乙酰胺-腐草霉素平板上生长。在具有提高的HR的突变体中，能在乙酰胺-腐草霉素双选择性培养基上生长的转化子的数量是有限的，因为amdS盒已被ble盒有效替代。在这种情况下，更多的突变体将出现于氟乙酰胺-腐草霉素双选择性平板上。
根据另一种优选的实施方式，具有降低的NHR效率和/或降低的NHR/HR比例的丝状真菌是其中NHR涉及的组分受到抑制的丝状真菌。在上下文中，未特意指出数目时意味着“至少一个/一种”：在给定的丝状真菌中，NHR涉及的至少一种组分受到抑制。抑制可以通过下述方法获得：对NHR涉及的基因的表达水平加以负调控，或使编码NHR涉及的组分的基因失活，和/或对NHR涉及的组分的表达水平加以负调控(downregulating)，和/或(暂时)降低NHR涉及的组分(蛋白)的活性，以及上述可能方法的组合。
优选地，获得的丝状真菌中，NHR涉及的基因的表达较之所述基因在其来源的亲本丝状真菌细胞中于同样条件下的表达而言被负调节。根据一种优选的实施方式，亲本丝状真菌是宿主细胞一节中所定义的丝状真菌之一。
用northern或western杂交印记或“omics”技术(例如转录组学或蛋白质组学)进行检验时，当基因或DNA序列在获得的丝状真菌中的表达水平低于同样的基因或DNA序列在其来源的亲本丝状真菌中的表达水平时，该特定基因或DNA序列的表达水平就是被负调节的，优选地，降低3倍，更优选地，降低4倍，最优选地，降低4倍以上，进一步最优选地，探测不到。
对DNA序列表达水平的负和/或正调节可以通过下述方法来监测：例如，通过northern杂交印记来对细胞中存在的相应mRNA加以定量(Molecular Cloning：A laboratory Manual，Sambrook et al.，New York：ColdSpring Harbour Press，1989)，和/或，例如，通过western杂交印记对细胞中存在的相应蛋白质加以定量。mRNA含量的差别还可以通过DNA阵列分析来定量(Eisen，M.B.and Brown，P.O.DNA arrays for analysis ofgeneexpression.Methods Enzymol.1999：303：179-205)。
对至少一种基因或DNA的表达水平的负调节可以通过下述方法获得：通过下述技术中的一种或其组合来进行遗传操纵(geneticmanipulation)：
a.采用重组遗传操纵技术，
b.对丝状真菌进行诱变。
代替性地，或与上述技术组合，根据另一种优选的实施方式，可以通过将抑制性化合物/组合物应用到丝状真菌上，来获得对至少一种基因或DNA序列表达水平的负调节。
随后通过对所述基因或DNA序列的表达水平加以监测来对获得的丝状真菌加以选择。可选地，随后通过对丝状真菌的NHR和/或HR途径的效率和/或其NHR/HR比例加以测量，来对丝状真菌进行选择。在本发明的上下文中，可以通过给定多核苷酸序列利用给定同源区域向丝状真菌基因组中预定位点的定位整合的效率来测量丝状真菌HR途径的效率。在本发明的上下文中，可以通过对给定多核苷酸序列在不考虑任何同源区域的情况下向丝状真菌基因组中非定位整合的效率，来测量丝状真菌NHR途径的效率。
更优选地，对至少一种DNA序列的表达的负调节是用下述方法得到的：用重组遗传操纵技术，例如，步骤a中所定义的获得重组丝状真菌的技术。最优选地，步骤a包含对DNA序列进行缺失，最优选地，被缺失的DNA序列被其非功能性变异体所置换，进一步最优选地，缺失和置换是通过基因置换技术进行的，优选地，如EP357127B中所述。
在对选用的丝状真菌的至少一种DNA序列进行缺失或置换的时候，必须将合适的DNA序列引入到目标基因座上。这种情况下，目标基因座是将被缺失或置换的NHR途径所涉及的DNA序列。优选地，合适的DNA序列存在于克隆载体中。合适的克隆载体是能在所用的丝状真菌宿主细胞染色体中预定目标基因座上整合的那些。优选的整合克隆载体包含DNA片段，其与将被缺失或置换的DNA序列同源，用于将克隆载体定位整合到该预定基因座上。为促进定位整合，优选在转化宿主细胞之前对克隆载体进行线性化处理。优选地，线性化进行至如下程度：使得克隆载体的至少一端，但优选地，任意一端侧翼有与将被缺失或置换的DNA序列同源的序列。
在将被缺失或置换的DNA序列侧翼的同源序列的长度优选小于2kb，进一步优选小于1kb，进一步更优选小于0.5kb，进一步更优选小于0.2kg，进一步更优选小于0.1kb，进一步最优选小于50bp，最优选小于30bp。
克隆载体中的选择标记基因可以从大量有用于转化丝状真菌的标记基因中选出。举例而言，这些标记包括但不限于，显性及双向选择标记基因，例如乙酰胺酶(amdS)基因(EP635574B或WO97/06261)，营养缺陷型标记基因，例如，argB、trpC或pyrG和抗生素抗性基因，其提供对例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性。一种优选的选择标记基因是与A.nidulans gpdA启动子融合的A.nidulans amdS编码基因(EP635574B)。来自其它丝状真菌的AmdS基因也可以使用(WO97/06261)。amdS选择标记基因具有如下优点：其能在同一菌株中多次使用，以置换和/或缺失不同的DNA序列。
如EP635574B所述，在氟乙酰胺平板上进行反向筛选，得到的菌株是不含标记的，其可被用于进一步的基因修饰。
用于对给定DNA序列的表达进行负调节的一种优选策略包含：缺失野生型DNA序列和/或用经修饰的、表达产物为非功能性的DNA序列去置换它。缺失和置换优选通过EP0357127B1所述的基因置换方法来进行。对基因的特异性缺失优选用amdS基因作为选择标记基因按照EP635574B所述来进行。
代替性地，或与其它已提到过的技术组合，可以使用基于在E.coli中进行粘粒体内重组的技术，其被描述于：A rapid method for efficient genereplacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans(2000)Chaveroche，M-K1.，Ghico，J-M.and d’Enfert C；Nucleic acids Research，vol28，no22。该技术适用于其它丝状真菌，例如A.niger。
对DNA序列表达的负调节还可以通过使用反义核酸或通过UV或化学诱变来获得(Mattem，I.E.，van Noort J.M.，van den Berg，P.，Archer，D.B.Roberts，I.N.and van den Hondel，C.A.，Isolation and characterization of mutantof Aspergillus niger deficient in extracellular protease.Mol Gen Genet.1992Aug；234(2)：332-6)。
优选地，NHR途径中引入的缺陷是可诱导的一种。这可以通过下述方法来达成：用新的调控区域去置换编码NHR涉及的组分的基因的内源调控区域，优选地，用可遏制或可调控的启动子，更优选地，用可被开关的启动子(葡萄糖遏制或氨遏制或pH遏制)去置换。葡萄糖遏制的启动子是Penicillium chrysogenum pcbAB启动子(Martin JF，Casqueiro J，Kosalkova K，Marcos AT，Gutierrez S.Penicillin and cephalosporinbiosynthesis：mechanism of carbon catabolite regulation of penicillin production.antonie Van Leeuwenhoek.1999Jan-Feb；75(1-2)：21-31.Review.)或Aspergillus niger葡糖淀粉酶启动子。可开关启动子的例子被描述于下述文献中：
-An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulatedgene expression in budding yeast：Belli et al，(1998)Nucl.Acid Research.vol26，n.4：942-947，
-A light-switchable gene promoter system：Shimizu-Sato_et al，(2002)Nat.Biotech.Vol20，no10：1041-1044.
根据一种优选的实施方式，丝状真菌中，与NHR途径所涉及的下述酵母基因同源的内源基因中的至少一种是缺陷的，所述酵母基因是KU70、KU80、RAD50、MRE11、XRS2和SIR4(van den Bosch et al(2002)：DNA double-strand break repair by homologous recombination.Biol.Chem.Vol.383：873-892和Allen et al，(2003)：Interactive competition betweenhomologous recombination and non-homologous end joining.Mol.Cancer Res.，vol l：913-920)。
具有至少一种下述组分的所有种类的突变体都是本发明所包括的突变体，所述组分是NHR所涉及的，并且其不再能或至少明显不太能执行其在NHR过程中的功能。优选地，NHR所涉及的组分被抑制至如下程度：使得在前文所述的检验中，获得的突变体中NHR途径的效率比同样功能条件下其来源的亲本细胞的活性的90％要低，进一步优选地，低于85％，更优选地，低于80％，进一步更优选地，低于70％，最优选地，低于50％。
根据一种优选的实施方式，亲本丝状真菌是宿主细胞一节中所定义的丝状真菌之一。
优选地，丝状真菌细胞下述基因中的至少一种是缺陷的
-SEQ ID NO：2或19所定义的hdfA或其同源体，或
-SEQ ID NO：5或22所定义的hdfB或其同源体，或
或两者都缺陷。
根据另一种优选的实施方式，丝状真菌具有一定量的、诱导时被降低的由基因hdfA和hdfB编码的蛋白中的至少一种。
根据另一种优选的实施方式，对至少一种基因或DNA序列表达水平的负调节可以通过对丝状真菌进行诱变的基因修饰来获得。可对丝状真菌细胞进行随机诱变，随后进行选择检验，以从多个突变体群中分离出具有提高的HR的突变体。
根据本发明的一种优选的实施方式，宿主细胞一节中所定义的丝状真菌之一被用作为起始菌株来进行诱变。
例如，对起始菌株进行UV照射，使得存活百分比为0.001％至60％之间。优选地，存活百分比在0.01％至50％的范围之间。本领域技术人员公知，分生孢子是用于通过物理或化学方法诱变丝状真菌的优选材料。但是，突变体也可从菌丝体细胞获得。此外，除UV之外，也可采用其它诱变处理，例如使用化学试剂(例如NTG)。本文所述的选择方法可被用于筛选从分生孢子或菌丝体细胞获得的突变体。
优选地，对分生孢子实施诱变。优选地，UV照射被应用不同的时间，例如，7.5、15和30分钟，以获得：细胞中温和、中度和强烈的突变比例水平。突变的样品可以直接孢子化，也可在诱导孢子形成之前在富营养的培养基(例如YNB或YEPD，见实施例9中的定义)中培养一段延长的恢复时期(例如实施例9所述)。
然后，可针对其基因定位的效率，对形成孢子的批次加以检验。这可以通过下述方法来检验。可以用至少一种，优选两种或多种，携带功能性选择标记表达盒的DNA片段来转化原生质体。表达盒中的选择标记基因可从大量有用于转化丝状真菌的标记基因中选出。举例而言，这些标记包括但不限于，显性及双向选择标记基因，例如乙酰胺酶(amdS)基因(EP635574B或WO97/06261)，营养缺陷型标记基因，例如，argB、trpC或pyrG和抗生素抗性基因，其提供对例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性。优选地，所用的选择标记是ble和amdS基因。所用的amdS盒是与A.nidulans gpdA启动子融合的A.nidulans amdS编码序列(EP635574B)。来自其它丝状真菌的AmdS基因也可以使用(WO97/06261)。
基因ble编码能赋予对腐草霉素的抗性的蛋白。基因amdS编码能使细胞在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的蛋白(如EP635574B)。用于将DNA转化到丝状真菌原生质体的技术是本领域公知的，其见于很多参考文献中，包括Finkelstein and Ball(eds.)，biotechnology of filamentous fungi，technology and products，Butterworth-Heinemann(1992)；Bennett ad Lasure(eds.)More Gene Manipulations in fungi，Academic Press(1991)；Tumer，in：Pühler(ed)，Biotechnology，second completely revised edition，VHC(1992)。按照EP635574B所述来进行Ca-PEG介导的原生质体转化。
为对这两种表达盒向丝状真菌基因组中两处不同特异性基因座的定位整合加以筛选，可加入DNA的短同源小片断(stretch)，例如，通过PCR加入到DNA片段的两侧。可制造若干种类型的构建体，以提高选出具有提高的定位效率的突变体的机会：DNA的同源小片断典型地可在30bp至1000bp之间变动，优选地，30bp至700bp，更优选地，30bp至500bp，进一步更优选地，30bp至300bp，更优选地，30bp至200bp，进一步更优选地，30bp至100bp，最优选地，30bp。理论上，丝状真菌基因组中所有基因座都可被选用与表达盒的定位整合。优选地，将发生定位的基因座是下述基因座：当该基因座上存在的野生型基因被表达盒中所包含的基因置换时，所获得的突变体将展示出能被给定的检测探测到的变化。优选地，该基因座是niaD基因座，因此会干扰硝酸盐还原酶基因(Gouka RJ，van Hartingsveldt W，Bovenberg RA，van den Hondel CA，vanGorcom RF.Cloning of the nitrate-nitrite reductase gene cluster of Penicilliumchrysogenum and use of the niaD gene as a homologous selection marker.JBiotechnol.1991Sep；20(2)：189-99)，使得能在含有氯酸盐的平板上直接选择转化子，因为，细胞会变得对氯酸盐有抗性。另一优选的基因座是sutB基因座，由此会干扰硫酸盐透性酶基因(van de Kamp M，Pizzinini E，VosA，van der Lende TR，Schuurs TA，Newbert RW，Turner G，Konings WN，Driessen AJ.Sulfate transport in Penicillium chrysogenum：cloning andcharacterization of the sutA and sutB genes.J.Bacteriol.1999Dec；181(23)：7228-34)，使得能在含有硒酸盐的平板上直接选择转化子。存在这两种选择标记、并且具有整合基因座上存在的基因失活导致的这两种变化的突变体是具有改进的定位整合的菌株。
根据另一种优选的实施方式，具有降低的NHR途径效率，或降低的NHR/HR比例和/或提高的HR途径效率的突变丝状真菌是通过降低，更优选地，通过部分抑制，或最优选地，通过完全抑制NHR所涉及的组分来获得的。
对NHR所涉及的组分的部分或完全抑制可通过不同方法获得，例如，通过针对此类组分的抗体或化学抑制剂或蛋白抑制剂或物理抑制剂(Tour O.et al，(2003)Nat.Biotech：Genetically targeted chromophore-assistedlight inactivation.Vol.21.no.12：1505-1508)或肽抑制剂或反义分子或RNAi分子(R.S.Kamath et al，(2003)Nature：Systematic functional analysis of theCaenortiabditis elegans genome using RNAi.vol.421，231-237)。不管(部分或更优选地完全)抑制的种类如何，重要的是，如前文所定义，NHR所涉及的组分不再能或至少明显不太能执行其在NHR过程中的功能。
NHR所涉及的组分包含酵母KU70、RAD50、MREII、XRS2、LIG4、SIR4、KU80、LIFL或NEIL或相关组分的丝状真菌同源物。因为不同生物中基因的命名是不同的，因此，本文定义的能执行(功能上，非数量上)酵母基因KU70、RAD50、MREII、XRS2、LIG4、SIR4、KU80、LIFL或NEIL的至少一种功能的所有功能等同物或功能性的和/或其功能性片段也包括在本发明中。通过暂时(部分或更优选地，完全)抑制NHR所涉及的组分，将核酸整合到任何目标位置，无须永久修饰NHR所涉及的组分，也无须预防对经修饰的此类NHR所涉及的组分永久存在所导致的不想要的副作用。
除上述技术之外，或者作为替代，还可以通过抑制NHR中所涉及的蛋白的活性来获得降低的NHR效率，或通过替代性信号序列(Ramon deLucas，J.，Martinez O，Perez P.，Isabel Lopez，M.，Valenciano，S.and Laborda，F.The Aspergillus nidulans carnitine carrier encoded by the acuH gene isexclusively located in the mitochondria.FEMS Microbiol Lett.2001JuI24；201(2)：193-8)或驻留信号(Derkx，P.M.andMadrid，S.M.The foldaseCYPB is a component of the secretory pathway of Aspergillus niger andcontains the endoplasmic reticulum retention signal HEEL.Mol.Genet.Genomics.2001Dec；266(4)：537-45.)来重新定位(re-localize)NHR所涉及的蛋白。
替代性地，或与上述技术组合，对蛋白活性的抑制还可以通过UV或化学诱变(Mattern，I.E.，van Noort J.M.，van den Berg，P.，Archer，D.B.，Roberts，I.N.and van den Hondel，C.A.，Isolation and characterization ofmutants of Aspergillus niger deficient in extracellular proteases.Mol Gen Genet.1992Aug；234(2)：332-6)或使用抑制剂，例如亲和性的蛋白酶抑制剂(clasto-lactacystin-β-lactone，Affinity Research Products Ltd.，CW8405-Z02185)来获得。
根据另一种优选的实施方式，针对HR的操作包含：加入过量的、能结合并因此抑制将被整合的多核苷酸附近的NHR组分表达的小双链多核苷酸(Agrawal N.et al，：RNA interference：biology，mechanism andapplications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.，vol.67，no.4：657-685)。
在一种优选的实施方式中，本发明提供了一种方法，用于提高多核苷酸向偏好NHR的丝状真菌预定位点定位整合的效率，其中，所述多核苷酸与所述预定位点或其周围具有同源性，所述方法包括操作针对HR的整合途径，这是通过下述方法来进行的：提供丝状真菌细胞，其中，HR途径的效率较之其来源的亲本丝状真菌在相同条件下的效率而言已被提高。优选通过与用于测定NHR/HR比例的检验相同的方法来检验HR途径的效率。根据一种优选的实施方式，亲本生物是宿主细胞一节中所定义的丝状真菌之一。
提高意味着至少高于获得的细胞来源的亲本细胞中的水平。优选地，提高意味着：用northern或western杂交印记或阵列技术或表型筛选时，两倍高，更优选地，三倍高，进一步更优选地，四倍高，最优选地，比四倍高更高。
根据另一种优选的实时方式，丝状真菌具有如下性质：HR所涉及的至少一种基因的表达水平相对相同基因在其来源的丝状真菌细胞中的表达水平被正调节。这可以通过下述方法获得：增加编码HR所涉及的组分的基因的表达水平和/或增加HR所涉及的组分的表达水平和/或(暂时)增加HR所涉及的组分的活性。
优选地，由此获得的丝状真菌具有如下性质：HR所涉及的基因的表达水平相对所述基因在其来源的丝状真菌细胞中的表达被正调节。
用northern或western杂交印记或阵列技术进行检验，当特定DNA序列在获得的丝状真菌中的表达水平高于相同的DNA序列在其来源的亲本丝状真菌中的表达水平时，该DNA序列表达水平就是被正调节的，优选地，三倍高，更优选地，四倍高，最优选地，比四倍高更高。根据一种优选的实施方式，亲本生物是宿主细胞一节中定义的丝状真菌之一。
对至少一种DNA序列的表达水平的正调节可以通过下述技术中的一种或其组合进行遗传操纵来获得：
c.使用重组遗传操纵技术，
d.对丝状真菌进行诱变，
替换性地，或与上述技术组合，根据另一种优选的实施方式，对至少一种基因或DNA序列的正调节可以通过对丝状真菌应用激活化合物/组合物来获得。
随后可以通过对所述DNA序列的表达水平，以及可选地，丝状真菌HR途径的效率加以监测，来对丝状真菌进行选择。可以通过给定多核苷酸序列利用给定同源区域定位整合到丝状真菌基因组中预定位点上的效率来测量丝状真菌的HR效率。
优选地，对至少一种DNA序列表达的正正调节是用重组遗传操纵技术来获得的，例如，步骤a中所定义的用于获得重组丝状真菌的技术。优选地，步骤a包括用包含下述DNA序列的DNA构建体转化丝状真菌，所述DNA序列优选是可操作连接到高度表达基因的启动子上的。选用的启动子可以比将被过量表达的DNA序列内源启动子更强。用于表达DNA序列的启动子优选来自高度表达的真菌基因。
大量优选的高度表达的真菌基因的例子是：来自Aspergilli或Trichoderm的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脱氢酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脱氢酶或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)基因。用于这些目的的最优选的高度表达的基因是Aspergillusniger葡糖淀粉酶基因、Aspergillus oryzaeTAKA-淀粉酶基因、Aspergillus nidulans gpdA基因或Trichoderma reesei纤维二糖水解酶基因。葡糖淀粉酶启动子是最优选使用的启动子。这些高度表达的基因既适合用作为用于整合克隆载体的目标基因座，还适合用作高度表达的真菌基因的来源。
根据另一种优选的实施方式，步骤a包括：增加DNA序列向丝状真菌细胞中的拷贝数，优选地，通过将DNA序列的拷贝整合进其基因组来实现，更优选地，通过将DNA序列定位整合进高度表达的基因座，优选是葡糖淀粉酶基因座。
对DNA序列表达的正调节可以通过下述方法来达成：通过将DNA序列的至少一个拷贝引入到丝状真菌中，或通过更换更强的启动子，或更换具有更好的动力学和/或寿命的蛋白编码基因，来增加DNA序列的拷贝数。DNA序列可以存在于质粒中，或被整合进基因组。技术人员可以在下述两种替代性可能方案中加以选择：
-对HR途径所涉及的至少一种丝状真菌内源DNA序列进行过量表达。在这种情况下，所述丝状真菌包含其内源DNA序列的多个拷贝。
-对HR所涉及的至少一种异源DNA进行过量表达。在这种情况下，除了HR所涉及的异源DNA序列的至少一个拷贝之外，所述丝状真菌还将具有其HR所涉及的内源DNA序列。该异源DNA序列是其相应内源DNA序列的同源物。
可以用DNA序列的一个或多个拷贝来转化丝状真菌(还可见Tilburnet al，1983，Gene，26：205-221)。DNA序列可以稳定整合进丝状真菌的基因组，或作为能自主复制的DNA分子的一部分被引入细胞。DNA序列优选存在于克隆载体上。任何能转化丝状真菌宿主细胞的克隆载体都适合用于本发明。用于本发明的克隆载体因此包含整合型(integrative)克隆载体，其在丝状真菌宿主的染色体中随机整合或在预定目标位点整合；以及自主保持的(autonomously maintained)克隆载体，例如，包含AMA1序列的载体。在本发明的一种优选的实施方式中，整合型克隆载体包含下述DNA片段，该片段与用于将克隆载体整合到预定基因座上的丝状真菌宿主细胞基因作中该预定目标基因座中的DNA序列同源。为促进定位整合，优选在转化宿主细胞之前对克隆载体进行线性化。线性化优选进行至如下程度：使得克隆载体的至少一端，但优选地，任意一端侧翼有与目标基因座同源的序列。目标基因座侧翼的同源序列的长度优选为至少30bp，优选地，至少50bp，优选地，至少0.1kb，进一步优选地，至少0.2kb，更优选地，至少0.5kb，进一步更优选地，至少1kb，最优选地，至少2kb。
优选地，克隆载体中与目标基因座同源的DNA序列是从高度表达的基因座获得的，这意味着，其是从能在丝状真菌宿主细胞中高水平表达的基因获得的。能高水平表达的基因，即，能高度表达的基因，在本文中被定义为：例如，在诱导条件下的mRNA占细胞总mRNA的至少0.5％(w/w)的基因，或者基因产物占细胞总蛋白的至少1％(w/w)的基因，或者，在分泌出的基因产物的情况下，可分泌至至少0.1g/l的水平(如EP357127B1所述)。
为使将要过量表达的DNA序列的拷贝数进一步增加，可以使用WO98/46772所述的基因转变技术。
技术人员将理解用于定位的同源DNA序列和启动子序列可以统一为一段DNA序列。上文给出的高度表达的基因的列表也适合作为目标基因座。
自主保持的克隆载体的例子是包含AMA1序列的克隆载体。AMA1是从Aspergillus nidulans中分离出来的6.0kb的基因组DNA片段，其能自主保持于Aspergillus中(见，例如，Aleksenko and Clutterbuck(1997)，FungalGenet.Biol.21：373-397)。
根据本发明的方法的另一种实施方式，步骤a包括：用包含选择标记基因的DNA构建体区转化丝状真菌。克隆载体中的选择标记基因可从大量有用于转化丝状真菌的标记基因中选出。举例而言，这些标记包括但不限于，显性及双向选择标记基因，例如乙酰胺酶(amdS)基因(EP635574或WO97/06261)，营养缺陷型标记基因，例如，argB、trpC或pyrG和抗生素抗性基因，其提供对例如腐草霉素、潮霉素B或G418的抗性。使用显性及双向选择标记基因是优选的。优选地，使用amdS基因，更优选地，来自Aspergillus nidulans或Aspergillus niger的amdS基因。最优选的选择标记基因是是与A.nidulans gpdA启动子融合的A.nidulans amdS编码序列(EP635574)。来自其它丝状真菌的AmdS基因也可以使用(WO97/06261)。amdS选择标记基因具有如下优点：其能在同一菌株中多次使用，以引入、过量表达和/或缺失不同的DNA序列。如EP635574所述，通过在氟乙酰胺平板上进行反向筛选，得到的菌株是不含标记的，其可被用于进一步的基因修饰。
替代性地，或与上述技术组合，对DNA序列表达的正调节还可以用UV或化学诱变来达成(Mattem，I.E.，van Noort J.M.，van den Berg，P.，Archer，D.B.Roberts，I.N.and van den Hondel，C.A.，Isolation andcharacterization of mutant of Aspergillus niger deficient in extracellular protease.Mol Gen Genet.1992Aug；234(2)：332-6)。
除对HR所涉及的DNA序列表达的正调节之外，或与其组合，还可以通过用UV或化学诱变增加HR所涉及的蛋白活性来获得提高的HR效率(Mattem，I.E.，van Noort J.M.，van den Berg，P.，Archer，D.B.Roberts，I.N.and van den Hondel，C.A.，Isolation and characterization of mutant ofAspergillus niger deficient in extracellular protease.Mol Gen Genet.1992Aug；234(2)：332-6)。
技术人员将理解，为获得对DNA序列表达的正调节，可以单独或组合使用上述技术中的每一种。
技术人员还将理解，为获得具有提高的HR/NHR比例，和/或降低的NHR效率和/或升高的HR效率的丝状真菌，可以使用针对分别对丝状真菌中给定基因进行负调节和正调节所描述的每种方法中的至少一种。优选地，使用显性及双向选择标记基因，优选地，amdS基因，更优选地，来自Aspergillus nidulans或Aspergillus niger的amdS基因，来开展在丝状真菌上进行用于获得具有降低的NHR效率和升高的HR效率的重组丝状真菌的所有技术。随后可使用例如northern和/或western杂交印记和/或阵列和/或表型筛选，按照前文所述，通过监测所述DNA序列的表达水平，对获得的丝状真菌加以选择。可选地，监测细胞的NHR和/或HR途径的效率。可按照前文所定义，对丝状真菌上述途径的效率加以监测。
优选地，HR途径中引入的修饰是可诱导的一种。这可以通过下述方法来达成：用可诱导的调控区域，优选地，用可诱导的启动子去置换编码HR涉及的组分的基因的内源调控区域。可诱导的启动子的例子是Aspergillus niger葡糖淀粉酶启动子、Aspergillus oryzae TAKA-淀粉酶启动子、paf启动子(Marx，F.，Haas.H.，Reindl.M.，Stoffler.G.，Lottspeich.F.andRedl.B.Cloning，structural organization and regulation of expression of thePenicillium chrysogenum paf gene encoding an abundantly secreted protein withantifungal activity Gene167(1-2)，167-171(1995))或Penicilliumchrysogenum的pcbC启动子(Martin JF，Casqueiro J，Kosalkova K，MarcosAT，Gutierrez S.Penicillin and cephalosporin biosynthesis：mechanism ofcarbon catabolite regulation of penicillin production.Antonie Van Leeuwenhoek.1999Jan-Feb；75(1-2)：21-31.Review.)或前文中针对对NHR所涉及的基因表达负调节时提到的开关型体系。
根据一种优选的实施方式，被修饰的HR途径所涉及的基因是下述基因或其同源物：RAD51、RAD52。
具有HR所涉及的至少一种组分、并且该组分更加能够或至少明显更能在HR过程中执行其功能的所有突变体都包括在本发明中。优选地，HR所涉及的组分的活性被修饰，使得在前文定义的检测中，HR途径的效率比其来源的亲本细胞在同样条件下的效率的110％要高，更优选地，高于200％，最优选地，高于500％。根据一种优选的实施方式，亲本生物是宿主细胞一节中定义的丝状真菌之一。根据本发明的方法(如上文广泛讨论的，非限制性的)，可用于多种应用。此类具体应用在下文中有所描述。
宿主细胞
因此，本发明还涉及丝状真菌本身，其优选用于本发明的方法，用于提高多核苷酸向所述丝状真菌基因组预定位点定位整合的效率，所述丝状真菌是具有对NHR的偏好的，并且，其中，所述多核苷酸具有与所述预定位点同源的区域，所述方法包括操作针对HR的整合途径。可用于本发明方法的丝状真菌的特征已在前文有所定义。优选用于本发明的方法中的丝状真菌是从亲本细胞获得的突变体，其中，相对于同样条件下所述亲木生物的下述比例和下述效率而言，所述突变体细胞中NHR/HR比例已被降低和/或NHR途径的效率已被降低和/或HR途径的效率已被提高。用于测定NHR/HR比例和/或NHR途径效率和/HR途径效率的检测方法在前文中已有描述。
本发明的宿主细胞是能被克隆载体转化的丝状真菌。对于试验过的大多数丝状真菌而言，已发现，可以用针对Aspergillus开发的转化方案对它们进行转化(可从Tilburn etal.1983，Gene26：205-221获得)。技术人员将知道，对丝状真菌宿主菌种的成功转化不受本文特别示例的载体、选择标记系统、启动子和转化方案的限制。
本文中，丝状真菌被定义为：以有丝形式存在的Eumycotina亚门的真核生物，即，其营养生长是通过菌丝延长发生的。优选的丝状真菌宿主细胞选自由Aspergillus、Trichoderma、Fusarium、Penicillium和Acremonium属构成的组。在本发明一种更为优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞选自由A.nidulans、A.oryzae、A.sojae、A.niger组的Aspergilli、Trichodermareesei和Penicillium的种构成的组。优选地，Penicillium是Penicilliumchrysogenum或Penicillium citrinum种所构成的组。
A.niger组在本文中根据Raper and Fennell(1965，In：The GenusAspergillus，The Williams&Wilkins Company，Baltimore，pp293-344)定义，其包含由上述作者包括进去的所有(黑)Aspergilli。最优选的丝状真菌宿主细胞选自由A.niger组的Aspergilli、A.oryzae、Trichoderma reesei和Penicillium chrysogenum所构成的组。
根据一种优选的实施方式，亲本菌株是被保藏的丝状真菌细胞：Aspergillus nigerCBS513.88，Aspergillus oryzae ATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892，Penicillium chrysogenum CBS455.95或Penicillium citrinumATCC38065，Penicillium chrysogenum P2，Acremonium chrysogenumATCC36225或ATCC48272，Trichoderma reesei ATCC26921或ATCC56765或ATCC26921，Aspergillussojae ATCC11906，Chrysosporiumlucknowense ATCC44006，Claviceps paspali CBS110.22，Clavicepspurpurea CBS164.59，Penicillium brevicompactum ATCC9056，Aspergillusterreus ATCC20542，Aspergillus nidulans ATCC28901及其衍生物。
根据另一种优选的实施方式，用下文所述的检验进行测量时，本发明的丝状真菌细胞具有至少200，至少50，至少10的NHR/HR比例。优选地，丝状真菌细胞的该比例为至少1，更优选地，至少0.5，进一步更优选地，至少0.1，进一步更优选地，至少0.05，进一步更优选地，至少0.01，进一步更优选地，至少0.005，进一步更优选地，至少0.001，进一步更优选地，至少0.0005，进一步更优选地，至少0.0001，最优选地，至少0.00001。
根据一种更为优选的实施方式，用下文所述的检验进行测量时，本发明的丝状真菌细胞具有的NHR/HR比例为小于200，进一步更优选小于50，小于10。进一步更优选地，丝状真菌细胞的该比例为小于1，进一步更优选地，小于0.5，进一步更优选地，小于0.1，更优选地，小于0.05，进一步更优选地，小于0.01，进一步更优选地，小于0.005，进一步更优选地，小于0.001，进一步更优选地，小于0.0005，进一步更优选地，至小于0.0001，最优选地，小于0.00001。
NHR/HR比例优选通过WO02/052026(第23页表2)所述的检验来测量。
优选地，丝状真菌细胞的编码NHR所涉及的组分的基因有缺陷，和/或NHR所涉及的组分的水平被降低。进一步更优选地，丝状真菌细胞下述基因中的至少一种有缺陷：hdfA或其同源物，如SEQ ID NO：2或19所示出，hdfB或其同源物，如SEQ ID NO：5或22所示，或两种都有缺陷，并且/或者优选地，上述基因编码的蛋白中的至少一种含量下降。最优选地，丝状真菌细胞下述基因中的至少一种被可诱导地缺陷：hdfA或其同源物，如SEQ ID NO：2或19所示，hdfB或其同源物，如SEQ ID NO：5或22所示，或两种都有缺陷，并且/或者优选地，可诱导地，上述基因编码的蛋白中的至少一种含量下降。
根据另一种优选的实施方式，丝状真菌细胞是：其基因组中NHR涉及的基因已被非功能性基因或被选择标记或另一种基因置换。
根据另一种优选的实施方式，突变体具有提高的HR涉及组分的水平。
根据本发明的丝状真菌可以通过分子生物学技术获得。通过遗传工程方法获得的丝状真菌被定义为重组丝状真菌。但是，本发明上下文中，重组丝状真菌可能是在早些时候被应用了诱变技术，以达到想要的其它效果的。根据一种最为优选的实施方式，获得的丝状真菌是重组丝状真菌。
本发明的宿主细胞的用途
根据一种优选的实施方式，本发明提供了一种方法，其中至少包括将目标多核苷酸引入本发明丝状真菌，例如，通过转化或电穿孔，以及将所述多核苷酸整合进所述细胞的遗传物质。整合是复杂的过程，其中，核酸序列变成为宿主细胞遗传物质的一部分。核酸整合的一个步骤是重组；通过重组，核酸序列被交换或插入，引入的核酸成为宿主细胞遗传物质的一部分。理论上，可能有两种不同的重组方法：同源的以及不正规的(illegitimate)或NHR。虽然用于进行此过程的必要蛋白质是可获得的，大多数(高等)真核生物不进行或至少不明显进行同源重组。该现象的一个原因是，(高等)真核生物中同源重组的频繁使用会导致不想要的染色体重排，这是由于重复核酸序列的存在造成的。为通过木发明的方法来进行HR，重要的是提供与预定位点具有同源性的多核苷酸。本领域普通技术人员清楚，同源区域的同源性百分比和长度在同源重组过程中扮演重要角色。同源性百分比优选接近100％。本领域技术人员知道如下事实：较低百分比的同源性也被用于同源重组领域，尽管可能导致HR效率较低(这取决于，例如，同源性的区域以及其整体分布)，但仍可使用，并因此被包括进本发明。此外，(近乎)同源的区域的长度为大约3kb，其足够进行同源重组。对重组来说，需要至少一处同源区域，但是更优选地，目标核酸侧翼的两处同源区域被用于定位整合。本领域研究人员知道如何选泽合适的同源性百分比、同源长度以及同源区域的数量。通过提供此类同源性，核酸可整合到宿主细胞遗传物质中每一处目标位置上。本领域技术人员清楚，本文所公开的本发明可用于将任何核酸(优选地，DNA)定位到任何预定位点，只要同源长度和同源性百分比高到足够支持HR或使得HR能进行。
在本发明出现之前，多核苷酸不能总是容易地被整合进给定丝状真菌基因组的每处目标位置。根据本发明的方法被用来，例如，以多种方式影响基因功能，不仅是完全失活，还可以介导表达水平或表达调控的变化，蛋白活性的变化或编码蛋白的亚细胞定位。完全失活是例如反义技术或RNAi技术的现有方法通常无法完成的(R，Willmitzer L，Sonnewald U.Analysis of the expression of potato uridinediphosphate-glucosepyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA.Planta.(1993)；190(2)：247-52)，完全失活用于，例如，使控制代谢途径的不想要的侧支的基因失活，例如，用于增加特定次级代谢产物，例如(beta-内酰胺)抗生素或类胡萝卜素的产量。完全失活还可用于降低毒性或不想要的化合物的产生(Penicillium的黄青霉素、Aspergillus的黄曲霉索：MacDonald KD et al，：heterokaryon studies and the genetic control of penicillinand chrysogenin production in Penicillium chrysogenum.J Gen Microbiol.(1963)33：375-83)。完全失活还可用于改变生物的形态，这是通过能改进发酵过程和下游加工的方式来实现的。
本发明允许用替代性调控序列来置换本来的调控序列，以改变内源基因的表达(例如，应答于特定诱导剂的表达)。
本发明的一方面涉及：根据本发明的方法，用无活性的基因去置换活性基因。完全失活是例如反义技术或RNAi技术的现有方法通常无法完成的，其用于，例如，使控制代谢途径的不想要的侧支的基因失活，例如，用于提高产物(例如淀粉)的质量，或用于增加特定次级代谢产物的产量或用于抑制不想要的代谢产物的形成。
本发明的另一方面涉及对丝状真菌细胞进行广泛的代谢重构(reprogramming)或功能改造。将全新的途径引入和/或对不想要的途径的修饰将能获得被特异性地改造过的细胞，用于生产特定化合物，例如蛋白质或代谢产物。
本发明的另一方面涉及用活性基因去置换无活性或被改变的基因。例如，在经典诱变连续多轮之后，通常会发生：选出的丝状真菌菌株在随机诱变过程中有一些内源基因被改变或者甚至被失活。
在本发明的又一方面，提供了一种方法，用于将赋予抗生素物质抗性的物质引入到丝状真菌细胞中。在本发明的还一个方面，提供了一种方法，用于向丝状真菌细胞赋予想要的性质。在一种优选的实施方式中，基因运送工具(delivery vehicle)被用于将想要的多核苷酸运送到预定位点。基因运送工具是本领域公知的，在说明书前文中已有过描述。
根据本发明的另一方面的另一种优选的实施方式是使编码新产物的转基因完成预期表达，例如，用用于想要的新产物的那些序列去置换能给出理想表达状况的现有编码序列，由此来进行。根据一种更为优选的实施方式，本发明提供的丝状真菌进一步包含DNA构建体，其中包含编码将被生产的目标蛋白的目标基因。
优选地，编码将被生产的目标蛋白的目标基因被插入到表达载体中，其随后被用于转化获得的宿主细胞。在表达载体中，DNA序列可以与合适的表达信号可操作地连接，例如启动子，可选的是信号序列和终止子，它们能指导蛋白质在宿主生物中的表达和合成。
更优选地，目标基因与启动子和分泌信号可操作地连接。可被用于表达目标基因的策略与对DNA的表达进行正调节的部分所述的策略(其表达产物是HR中涉及的)相同：增加拷贝数、定位整合、使用高度表达基因的启动子、选择标记基因的选择以及其组合。
目标蛋白优选是酶。如果蛋白质不是天然分泌的，可以根据本领域已知的技术对编码该蛋白的多核苷酸进行修饰，使其具有信号序列。分泌的蛋白可以是天然就会表达的内源蛋白，也可以是异源的。异源意味着，编码该蛋白的基因在天然条件下在野生型丝状真菌中并不会产生。可被本发明的丝状真菌生产的酶的例子是：碳水化合物酶，例如，纤维素酶，例如内葡聚糖酶，β-葡聚糖酶，纤维二糖水解酶或β-普糖苷酶，半纤维索酶或胶质水解(pectinolytic)酶，例如，木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、半乳糖苷酶、鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳糖醛酸酶，裂解酶或淀粉水解酶；磷酸酶，例如，植酸酶，酯酶，例如脂肪酶，蛋白水解酶，氧化还原酶，例如氧化酶，转移酶或异构酶。更优选地，目标基因编码植酸酶(肌醇六磷酸酶)。
另举一个例子，对现有的编码序列加以修饰，使得编码的蛋白具有优化性质，例如，用于制造具有改进的热性质和/或改进的动力学性质(Km，Kcat)和/或改进的酶稳定性和/或扩展的底物范围和/或增加的寿命时期等的酶。
本发明还涉及本发明的丝状真菌用于生产目标多核苷酸的用途。或者，获得的丝状真菌可用于生产次级代谢产物。优选的次级代谢产物是类胡萝卜素化合物、beta-内酰胺化合物、药物、抗肿瘤化合物等。
优选地，本发明获得的丝状真菌被用于生产目标蛋白，这是通过下述方法来实现的：在能使编码目标蛋白的DNA序列表达的条件下培养经过转化的宿主细胞，回收目标蛋白.例如下述参考文献所述：
-Li，Z.J.，Shukla，V.，Fordyce，A.P.，Pedersen，A.G.，Wenger，K.S.，Marten，M.R.Fungal morphology and fragmentation behavior in a fed-batchAspergillus oryzae fermentation at the production scale.
Biotechnol Bioeng.2000Nov5；70(3)：300-12
-Withers，J.M.，Swift，R.J.，Wiebe，M.G.，Robson，G.D.，Punt，P.J.，vanden Hondel，C.A.Optimization and stability of glucoamylase production byrecombinant strains of Aspergillus niger in chemostat culture.
Biotechnol Bioeng.1998Aug20；59(4)：407-18.
-Amanullah，A.，Christensen，L.H.，Hansen，K.，Nienow，A.W.，Thomas，R.C.Dependence of morphology on agitation intensity in fed-batch cultures ofAspergillus oryzae and its implications for recombinant protein production.
Biotechnol Bioeng.2002Mar30；77(7)：815-26.
DNA序列和这些DNA序列编码的多肽
根据本发明的另一方面，提供了下述经过分离的cDNA序列：
来自A.niger的SEQ ID NO：2hdfA，
来自Penicillium chrysogenum的SEQ ID NO：19hdfA
来自A.niger的SEQ ID NO：5hdfB
来自Penicillium chrysogenum的SEQ ID NO：22hdfB
及其同源物。
SEQ ID NO：1，18，4和21每种分别对应于与上面给出的每条cDNA序列相关的基因组DNA序列。
SEQ ID NO：3，20，6和23每种分别对应于与上面给出的每条cDNA序列编码的蛋白质序列。
本文提供的序列信息不应被狭义地理解为需要包括进鉴定错误的碱基。本文公开的特定序列可容易地用于从丝状真菌(特别是A.niger和Penicillium chrysogenum)中分离出完整基因，接着还可以进行进一步序列分析由此鉴定出序列错误。
除非另有指明，本文中通过对DNA分子测序测得的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪测得的，本文中，测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过对上文测定的DNA序列进行翻译推断出来的。因此，如本领域技术人员所已知，通过该自动方法测得的任何DNA序列，本文测定的任何核苷酸序列可能含有一些错误。典型地，通过自动方法测定的核苷酸序列与被测序的DNA的实际核苷酸序列至少大约90％相同，更典型地，至少大约95％至至少大约99.9％相同。可以通过其它方法，包括本领域公知的动DNA测序方法对实际序列进行更为精确的测定。本领域还已知，相对于实际序列，测得的核苷酸序列中的单个插入或缺失将导致对核苷酸序列的翻译中出现读码框位移，这会使得测得的核苷酸序列编码的预期氨基酸序列从上述插入或缺失的点开始就完全不同于被测序的DNA序列实际编码的氨基酸序列。
本领域技术人员能鉴定出此类被错误鉴定的碱基，并且知道如何更正此类错误。
下文中对“同源的”进行了定义。同源的可被理解为：从其它丝状真菌而非Aspergillus niger和Penicillium chrysogenum获得的。
可以用典型的方法，使用从其它生物(例如，丝状真菌，特别是Aspegillus或Penicillium的种)构建的cDNA或基因组DNA文库，通过对它们的筛选，来获得来自其它生物的全长DNA。
本发明还包括hdfA和/或hdfB的同形异种基因(paralogue)。在本发明的上下文中，同形异种基因指，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：21同源并且分别来自A.niger或Penicillium chrysogenum的DNA序列。
例如，可通过Northern杂交印记分析，针对同源hdfA和/或hdfB多核苷酸，对Aspergillus或Penicillium菌株加以筛选。为探测与根据木发明的多核苷酸同源的转录子，可使用本领域技术人员公知的标准方法从分离白合适菌株的RNA来构建cDNA文库。或者，可以用能与根据本发明的hdfA和/或hdfB多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA序列加以筛选。
同源基因序列可被分离，例如，通过用基于本文教导的核苷酸序列设计的两套简并寡核苷酸引物库进行PCR来实现。
用于反应的模板可以是通过对下述mRNA进行反转录获得的cDNA，所述mRNA是从已知能表达或怀疑能表达根据本发明的多核苷酸的菌株制备的。PCR产物可被亚克隆和测序，以确保扩增的片段代表新的hdfA和/或hdfB核酸序列的序列或其功能等同物。
然后可通过多种不同的已知方法用PCR片段去分离全长cDNA克隆。例如，扩增片段可被标记，用于筛选细菌噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，标记的片段可被用于筛选基因组文库。
PCR技术还可以被用于从其它生物分离全长cDNA序列。例如，可以用标准方法从合适的细胞或组织来源分离RNA。可以在RNA上进行反转录反应，其中使用特异于扩增片段最5’端的寡核苷酸引物，用于引导第一链合成。
可以用标准的末端转移酶反应，给得到的RNA/DNA杂交体“加上尾巴”(例如，用鸟嘌呤)，然后可用RNase H来消化杂交体，然后可以引导(例如，用Poly-C引物)第二链合成。因此，可以容易地分离扩增片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述，参见，例如，上面的Sambrook et al.和下面的Ausubel et al.。
“同源的”还可被理解为功能等同物。
术语“功能等同物”和“功能变异体”在本文中可以互换使用。hdfA和/或hdfBDNA的功能等同物是编码展示出hdfA和/或hdfB特定功能的多肽的经过分离的DNA片段。根据本发明的hdfA和/或hdfB多肽的功能等同物是展示出作为NHR复合物的一部分的至少一种功能的多肽。功能等同物因此包含具有生物活性的片段。
蛋白质和多肽功能等同物可以仅含有发生于具有SEQ ID NO：3或6或20或23的氨基酸序列中一条或多条上的保守取代，或者对非关键氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非关键氨基酸是这样的残基：在这些序列之一中其可被改变，而不会对生物功能产生实质性影响。例如，木发明的hdfA和/或hdfB蛋白中保守的氨基酸残基被预计为特别不适于改变。此外，在根据本发明的hdfA和/或hdfB蛋白中保守的氨基酸可能不适于被改变。
术语“保守取代”被用于表示，用具有相近侧链的氨基酸去置换氨基酸残基。这些家族是本领域已知的，其包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带beta-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
典型地，核酸功能等同物可以含有沉默突变，或不会影响到被编码的多肽生物功能的突变。因此，本发明提供了编码hdfA和/或hdfB蛋白的核酸分子，其含有对于特定生物活性来说不关键的氨基酸残基改变。此类hdfA和/或hdfB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：3或6或20或23不同，但是仍保留其生物活性的至少一种。在一种实施方式中，经过分离的核酸分子包含编码下述蛋白的核苷酸序列，其中，所述蛋白包含与SEQID NO：3或6或20或23所示的氨基酸序列至少大约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的高度同源的氨基酸序列。例如，Bowie，J.U.et al.，Science247：13065-1310(1990)提供了关于如何制造表型沉默氨基酸取代的指导，其中，作者指出，有两条主要的途径用于研究氨基酸序列对改变的忍耐性。第一种方法依赖于进化过程，其中，通过天然选择接受或拒绝突变。第二种途径利用遗传工程，在克隆基因的特定位置引入氨基酸改变，进行选择或筛选，以鉴定出保留功能性的序列。如作者所指出的，这些研究揭示，令人惊奇地，蛋白能忍耐氨基酸序列取代。作者还指出，在蛋白的某些位置，改变可能是允许的。例如，大多数隐藏的(buried)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的特征却通常很少保守。其它此类表型沉默取代被描述于Bowie et al.及其中引用的参考文献中。
编码与根据SEQ ID NO：3或6或20或23的蛋白同源的hdfA和/或hdfB蛋白的经过分离的核酸分子可以通过下述方法来制造：将一种或多种核苷酸取代、添加和缺失引入到根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：22的编码核苷酸序列中，使得被编码的蛋白中被引入一处或多处氨基酸取代、缺失或插入。此类突变可通过标准技术引入，例如定点诱变或PCR介导的诱变。
术语“功能等同物”还包括A.niger hdfA和/或hdfB蛋白的直向同源物。A.nigerhdfA和/或hdfB蛋白的直向同源物是可从其它菌株或物种中分离出来的、具有相似或相同生物活性的蛋白。此类直向同源物可被容易地鉴定为：包含与SEQ ID NO：3或6或20或23实质上同源的氨基酸序列。
“同源的”还可被理解为“实质上同源的”。
术语“实质上同源的”指下述第一条氨基酸或核苷酸序列，其含有足够或满足最小数量的与第二条氨基酸或核苷酸序列的氨基酸或核苷酸相同或等同(例如，具有相似的侧链)的氨基酸或核苷酸，使得第一条和第二条氨基酸或核苷酸序列具有共有结构域。例如，在本文中，含有具有大约45％，优选大约50％，优选大约60％，优选大约65％，更优选大约70％，进一步更优选大约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性或更高相同性的共有结构域的氨基酸或核苷酸序列被定义为足够相同。
此外，编码hdfA和/或hdfB蛋白家族其它成员，并且具有与SEQ IDNO：2或5或19或22不同的核苷酸序列的核酸分子也在本发明的范围内。此外，编码来自不同物种的hdfA和/或hdfB蛋白，由此具有与SEQID NO：2或5或19或22不同的核苷酸序列的核酸分子也在本发明的范围内。
相应于本发明hdfA和/或hdfB DNA的变异体(例如天然等位基因变异体)和同源物的核酸分子可被分离，这是基于其与本文公开的hdfA和/或hdfB核酸的同源性，使用本文公开的cDNA或其合适的片段作为探针，按照标准杂交方法，优选在高严谨杂交条件下进行来实现的。
本领域技术人员可以很容易地确定杂交反应的“严谨度”，通常这是基于探针长度、洗涤温度和盐浓度经过经验计算得到的。通常，较长的探针需要较高的温度用于正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于：互补链存在于低于其熔解温度的环境下时变性DNA重新退火的能力。探针和杂交序列之间的想要的同源性程度越高，就可以使用更高的相对温度。作为结果，更高的相对温度将导致反应条件更为严谨，而更低的温度则相反。
关于杂交反应严谨度的其它细节和解释，参见，Ausubel et al，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley lntersciences Publishers，(1995)。
本文中定义的“严谨条件”或“高严谨条件”可以是如下条件：(1)用低离子强度和高温用于洗涤，例如，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃进行；(2)在杂交期间用变性剂，例如甲酰胺，例如具有0.1％牛血清清蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficdl/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)于42℃进行；或(3)用50％甲酰胺、5xSSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt’s溶液、超声处理过的鲑鱼精DNA(50Rg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃进行，用0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)在42℃洗涤，以及50％甲酰胺在55℃进行洗涤，接着用含有EDTA的0.1x SSC在55℃进行高严谨洗涤。
“中等严谨条件”可参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989所述，其包括使用比上述那些条件较不严谨的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％SDS)。中等严谨条件的例子是在下述溶液中于37℃进行过夜孵育，所述溶液包括：20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml被修剪过的变性鲑鱼精DNA，接着是在1x SSC中于大约37-50°洗涤过滤器。技术人员将知道如何调节温度、离子强度等，以适应探针长度等因子的要求，或者可以通过使用适于确定序列相似性的算法来进行。
还可以用“序列比较算法”来确定同源(相近或相同)序列。用于比较的序列最优比对可以例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法(WisconsinGenetics Software Package的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575Science Dr.，Madison，WI)的计算机化执行，或者通过眼睛观察来进行。适于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法，其被描述于：Altschul，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。
用于进行BLAST分析的软件是公众可通过National CenterforBiotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的。该算法包括：首先确定高分数序列对(HSPs)，这是通过确定查询序列中长度为W的下述短字段(word)来实现的，当与数据库序列中同样长度的字段进行比对时，所述短字段能够匹配或满足某为正值的阈值分数T。这些最初的邻近字段击中(neighborhood hits)作为起始的点，以发现含有它们的更长HSPs。只要累积比对分数能够增加，字段击中就会沿着被比较的两条序列的每一条以两个方向延伸。当出现以下情形时，字段击中的延伸就会终止，所述情形是：累积比对分数从获得的最大值下降了为X的量；累积分数到达零或以下；或达到了序列的任意末端。
BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的缺省参数为：字段长(W)为11，BLOSUM62分数矩阵(见，Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝4以及对两条链进行比较。
BLAST算法还可以对两条序列间的相似性进行统计分析(见，例如Karlin&Altschul，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的对相似性进行测量的一种方法是最小和概率(P(N))，其提供了对两条核苷酸或氨基酸序列间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果待测氨基酸序列与一种蛋白(例如蛋白酶氨基酸序列)的比较中最小和概率小于大约0.1，更优选小于大约0.01，最优选小于大约0.001时，该氨基酸序列就被认为与该蛋白(例如蛋白酶)相似。优选地，相似性为：与具有SEQ ID NO：2、5、19和22的DNA序列之一具有至少40％的同源性。更优选地，相似性为：至少50％，更优选地，至少60％，更优选地，至少70％，更优选地，至少80％，更优选地，至少90％。
除天然存在的hdfA和/或hdfB序列的等位基因变异体之外，技术人员知道可以通过突变向SEQ ID NO：2、5、19和22的核苷酸序列中引入变化，由此获得hdfA和/或hdfB蛋白氨基酸序列的改变，而不会改变hdfA和/或hdfB蛋白的功能。
在本发明的另一方面，提供了被劣化的(deteriorated)hdfA和/或hdfB蛋白。被损坏的hdfA和/或hdfB蛋白是其中至少一种生物功能被减小的蛋白。此类蛋白可以通过下述方法来获得：沿着hdfA和/或hdfB编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，得到的突变体可以重组表达，并可针对生物活性对它们进行筛选。例如，本领域提供了用于测量它们酶活的标准检验方法，由此可以容易地选出被劣化的蛋白。优选地，所述检验是以前描述过的(见，例如WO02/052026的第23页或表型筛选检验)。
在一种优选的实施方式中，hdfA和/或hdfB蛋白具有根据SEQ IDNO：3或6或20或23的氨基酸序列。在另一种实施方式中，hdfA和/或hdfB多肽与根据NO：3或6或20或23的氨基酸序列实质上同源，并且保留根据NO：3或6或20或23的氨基酸序列的至少一种生物活性，但由于天然的变异或上述诱变导致氨基酸序列有所不同。
在另一种优选的实施方式中，hdfA和/或hdfB蛋白具有下述氨基酸序列，所述序列是能与根据SEQ ID NO：2或5或19或22的核酸杂交(优选地，在高严谨杂交条件下)的经过分离的核酸片段所编码的。
因此，hdfA和/或hdfB蛋白是包含下述氨基酸序列的蛋白，所述序列与SEQ ID NO：3或6或20或23示出的氨基酸序列至少大约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源，并保留根据SEQ ID NO：3或6或20或23的多肽的至少一种功能活性。
还可通过，例如，针对给定的活性，对本发明蛋白的突变体(例如截短突变体)的组合文库加以筛选，来鉴定出根据本发明的蛋白的功能等同物。在一种实施方式中，通过在核酸水平上进行组合诱变，产生变异体的杂斑(variegated)文库。变异体的杂斑文库可以通过下述方法来制造：例如，用酶将合成寡核苷酸的混合物连接到基因序列上，使得可能的蛋白序列的简并组可作为个体多肽表达，或者，作为一组更大的融合蛋白表达(例如，用于噬菌体展示)。有多种方法可被用于从简并寡核苷酸序列产生本发明多肽可能的变异体的文库。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(见，例如，Narang(1983)Tetrahedron39：3；ltakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；ltakura et al.(1984)Science198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。
此外，本发明多肽编码序列片段的文库可用于产生多肽的杂斑群(population)，用于筛选随后选出的变异体。例如，编码序列片段的文库可以通过如下方法产生：在刻痕(nicking)仅在每个分子上发生大约一次的条件下，用核酸酶去处理目标编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性，形成可包括来自不同刻痕产物的正义/反义对的双链DNA，用S1核酸酶进行处理，从重新形成的二体上除去单链的部分，将得到的片段文库与表达载体相连。通过这种方法，可以获得编码目标蛋白不同尺寸的N-末端和内部片段的表达文库。
本领域内已知多种技术可用于筛选通过对截短进行点突变制得的组合文库的基因产物，以及用于针对具有选定属性的基因产物对cDNA文库进行筛选。适用于高通量分析的、用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术典型地包括：将基因文库克隆进可复制的表达载体，用得到的载体文库转化合适的细胞，以及在下述条件下表达组合基因，所述条件是，对目标活性的探测有助于编码对其产物进行探测的基因的载体被分离出来。递归总体诱变(Recursive Ensemble Mutagenesis，REM)是能增加文库中功能突变体频率的技术，其可与用于鉴定本发明蛋白质变异体的筛选检验组合使用(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering6(3)：327-331)。
除SEQ ID NO：2和5和19和22所示出的hdfA和/或hdfB基因序列之外，本领域技术人员明显知道，可能导致hdfA和/或hdfB蛋白氨基酸序列改变的DNA序列多态性可能存在于给定的群中。此类遗传多态性可能存在于来自不同群的细胞中，或由于天然等位基因变异体导致存在于群内。等位基因变异体还可以包括功能等同物。
根据本发明的多核苷酸的片段还可以包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可以作为探针或用于PCR反应的引物发挥作用。
无论是编码功能性还是非功能性多肽，根据本发明的核酸都可用作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)的引物。除此之外，不编码具有hdfA和/或hdfB活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括，(1)从cDNA文库，例如，来自除A.niger或Penicillium chrysogenum之外的其它生物的文库中分离出编码hdfA和/或hdfB蛋白的基因或其等位基因变异体；(2)如Verma et al.，Human Chromosomes：a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)所述，与分裂中期染色体伸长(spreads)原位杂交(例如FISH)，以提供hdfA和/或hdfB基因的精确染色体定位；(3)进行Northern杂交印记分析，用于探测hdfA和/或hdfBmRNA在特定组织和/或细胞中的表达，以及(4)用作为探针和引物，其可用作为诊断工具，用于分析给定的生物(例如，组织)样品中是否存在能与hdfA和/或hdfB探针杂交的核酸。
本发明还包括获得hdfA和/或hdfB基因或cDNA的功能等同物的方法。此类方法需要：获得经过标记的探针，其包括经过分离的核酸，所述核酸编码根据SEQ ID NO：2或5或19或22的序列或其变异体的全部或一部分；用经过标记的探针在允许探针与文库中核酸片段杂交的条件下，对核酸片段文库进行筛选，由此形成核酸二体，以及从任何被标记的二体中的核酸片段来制备全长基因序列，以获得与hdfA和/或hdfB基因相关的基因。
在一种实施方式中，本发明的hdfA和/或hdfB核酸与SEQ ID NO：1或2或4或5或18或19或21或22所示的核酸序列至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高地同源。
在另一种优选的实施方式中，本发明的hdfA和/或hdfB多肽与SEQID NO：3或6或20或23所示的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高地同源。
本发明涉及具有SEQ ID NO：1或2或4或5或18或19或21或22本身的DNA序列以及上文定义的其同源物。与这些DNA序列相关，并通过遗传密码简并获得的DNA序列也是本发明的一部分。与DNA SEQ ID)NO：2、5、19和22相关、并通过杂交(见前文段落)获得的DNA序列也是本发明的一部分。这些DNA序列或上文定义的其同源物编码的经过分离的多肽也是本发明的一部分。多核苷酸hdfA和/或hdfB具有NHR所涉及的功能。所有这些多肽都可用于本发明的方法，以获得可能具有改进的定位效率的丝状真菌。
下述实施例用于更详细地阐述本发明。此类实施例不限制本发明的范围。
实施例
实施例1鉴定hdfA和/或hdfB基因以及构建缺失载体
对Aspergillus niger菌株CBS513.88的基因组DNA进行测序和分析。翻译的蛋白质被注解为与KU70和KU80同源的两条基因被鉴定出来，并分别被命名为hdfA和hdfB。序列表1和4示出了hdfA和hdfB基因座的序列，其中包含开放读码框(ORF)(具有内含子)和大约1000bp的基因5’和3’区域。按照已知的原理来设计hd和/或的基因置换载体，根据常规克隆方法来构建它们(见图1和2)。重要地，这些载体包含大约1000bp的hdfORFs的侧翼区域，用于在预定的基因组基因座上进行同源重组。此外，它们含有A.nidulans双向amdS选择标记，所述标记在正向重复内部或之间。对这些缺失载体的常见设计被描述于EP635574B和WO98/46772中。
实施例2对Aspergillus niger中hdfA基因的失活
分离出缺失载体pDEL-HDFA(图1)的线性DNA，使用以前描述过的方法(Biotechnology of Filamentous fungi：Technology and Products.(1992)Reed Publishing(USA)；Chapter6：Transformation第113—156页)，用其转化Aspergillus niger CBS513.88。该线性DNA可整合进基因组的hdfA基因座上，由此用amdS基因置换hdfA基因，如图3所示。在乙酰胺培养基上对转化子加以选择，根据EP635574B所述的标准方法来纯化菌落。将孢子涂布到氟乙酰胺培养基上，选出丢失了amdS标记的菌株。通过PCR针对在hdfA基因座上的整合对生长中的菌落进行诊断，用Southern分析针对hdfA基因的缺失来检测候选菌株。通过大约2.2kb大小的DNA片段减少，可探测到hdfA基因的缺失，该片段覆盖了整个基因座，可与合适的探针杂交。大约400个初始转化子的库中，有大约8个菌株显示出基因组hdfA基因被除去。
菌株dHDFA被选作为hdfA基因失活的代表菌株。
实施例3对Aspergillus niger中hdfB基因的失活
分离出缺失载体pDEL-HDFB(图2)的线性DNA，用其转化Aspergillus niger CBS513.88。该线性DNA可整合进基因组的hdfB基因座上，由此用amdS基因置换hdfB基因(图4)。采用与实施例2中所述相同的基因置换技术。在乙酰胺培养基上对转化子加以选择，根据标准方法来纯化菌落。将孢子涂布到氟乙酰胺培养基上，选出丢失了amdS标记的菌株(EP635574B)。通过PCR针对在hdfB基因座上的整合对生长中的菌落进行诊断，用Southern分析针对hdfB基因的缺失来检测候选菌株。通过大约2.6kb大小的DNA片段减少，可探测到hdfB基因的缺失，该片段覆盖了整个基因座，可与合适的探针杂交。大约370个初始转化子的库中，有大约7个菌株显示出基因组hdfB基因被除去。
菌株dHDFB被选作为hdfB基因失活的代表菌株。
实施例4对Aspergillus niger中hdfA和hdfB基因的失活
分离出缺失载体pDEL-HDFB(图2)的线性DNA，用其转化实施例2中获得的菌株dHDFA。该线性DNA可整合进基因组的hdfB基因座上，由此用amdS基因置换hdfB基因(图4)。采用与实施例2中所述相同的基因置换技术。在乙酰胺培养基上对转化子加以选择，根据标准方法来纯化菌落。将孢子涂布到氟乙酰胺培养基上，选出丢失了amdS标记的菌株(EP635574B)。通过PCR针对在hdfB基因座上的整合对生长中的菌落进行诊断，用Southern分析针对hdfB基因的缺失来检测候选菌株。通过大约2.6kb大小的DNA片段减少，可探测到hdfB基因的缺失，该片段覆盖了整个基因座，可与合适的探针杂交。大约380个初始转化子的库中，有大约15个菌株显示：基因组hdfB基因被除去。
菌株dHDFAB被选作为hdfA和hdfB基因都失活的代表菌株。
实施例5针对单同源重组事件的改进的定位
DNA可整合进Aspergillus niger基因组中预定基因座的一种机制是通过单同源重组来进行的。同源DNA通过重组对齐并整合到基因组位置上(见图5)。两种载体被用于检测实施例2、3和4中所获得的Aspergillusniger菌株通过单同源重组的定位效率。这两种载体包含与葡糖淀粉酶(glaA)基因座同源的区域，以指导重组和得到的整合(图5)。
为此类同源整合涉及的第一种载体以前已在WO02/45524中被描述过(pGBFIN11-EPO)。该载体含有编码脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因。
第二种载体(pGBFIN11-PLA)含有编码来自A.oryzae的磷脂酶A1(PLA1)的基因。编码该酶的基因已被公开(Watanabe I，et al，Biosci.Biotechnol.Biochem.(1999)，Vol63，numero5，第820—826页)。使用与WO02/045524中用于在pGBFIN11-EPO中克隆脯氨酸特异性内切蛋白酶基因相同的技术，将该基因克隆进pGBFIN11中。
根据前文实施例2中所述的转化技术，用pGBFIN11-EPO或pGBFIN11-PLA质粒转化菌株CBS513.88、dHDFA、dHDFB和dHDFAB。获得的结果与使用两种质粒时相同。我们发现，分别有5％、10％、10％和10％的带质粒转化子被整合到目标基因座上。因此，我们得到结论，对Aspergillus niger中至少一种hdf基因的失活导致这些菌株通过单同源重组事件的定位效率明显提高。
实施例6在若干不同基因座上双同源重组事件的提高的定位
通过用缺失载体转化dHDFA菌株，进一步检测定位效率，所述载体是针对对大量来自基因组的淀粉酶编码基因的失活而设计的。基木按照实施例1中所述，克隆基因侧翼区域，对得到的载体进行线性化，用其转化CBS513.88和dHDFA菌株的原生质体。通过PCR分析和基于活性的平板检验(指示相应基因的失活)来检测定位频率。后者是通过下述方法来进行的：在补充有0.4％琼脂的PDA平板上繁殖转化子，随后用碘/碘化钾溶液进行染色(Lugol，Sigma L6146)。如下表1所示，PCR分析和/或基于活性的平板检验(指示相应基因的失活)所判定的定位频率明显较用CBS513.88菌株观察到的有所提高。
表1.较之菌株CBS513.88，dHDFA菌株中若干种缺失载体的定位频率
这些发现对于我们的结论(对Aspergillus niger中至少一种hdf基因的失活导致用于通过双同源重组事件整合的载体定位效率明显提高。)提供了进一步的支持。
实施例7amyBII基因同源侧翼区域尺寸减小对于定位频率的影响
在一系列单独的实验中，对侧翼区域长度对于通过双同源重组的定位频率和转化效率的影响进行了进一步研究。用包含A.nidulans amdS标记(侧翼有不同长度的amyBII侧翼区域)的PCR片段去转化菌株CBS513.88和dHDFA的原生质体。表2中的数据清楚显示，除被增强的总体转化效率之外，dHDFA中整合型盒的定位也被很大程度提高。
表2.不同长度的amyBII PCR缺失盒在dHDFA菌株和菌株CBS513.88中的定位频率和转化效率
a，不能测定
b，三种测试变异体的组合％
实施例8表型分析和多肽生产
dHDFA、dHDFB或dHDFAB菌株在固体培养基或摇瓶上生长期间，观察不到表型区别。按照下述方法进行测定，用质粒pGBFIN11-EPO或pBGFIN-PLA转化的菌株dHDFA、dHDFB或dHDFAB全都向培养基中分泌活性酶。
固体培养基是土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基(Difco，POTATODEXTROSE AGAR，培养基，目录编号213400，1996-1997年)。
如EP635574B所述，使用500ml带挡板摇瓶在培养摇床上，于37℃和170rpm下，100ml培养基中进行摇瓶实验。四天的发酵之后，取样品来测定脯氨酸特异性内切蛋白酶活性或磷脂酶活性。
使用Z-Gly(甘氨酸)-Pro(脯氨酸)-pNA作为底物，于pH5和大约37℃下，及时对脯氨酸特异性内切蛋白酶的蛋白水解活性进行分光光度测量。1U脯氨酸特异性内切蛋白酶被定义为在pH5和大约37℃每分钟转化1微摩尔Z-Gly(甘氨酸)-Pro(脯氨酸)-pNA的酶的量。
为通过分光光度方法测定来自Aspergillusniger的PLA1活性(PLA1)，使用人工底物：1，2-二硫二辛酰磷脂酰胆碱(diC8，底物)。PLA1在A1位置水解硫键，裂解硫辛酸(thio-octanoc acid)。硫辛酸与4，4-二硫吡啶(着色剂，4DTDP)反应，形成4-硫吡啶酮。4-硫吡啶酮与4-巯基吡啶处于互变异构平衡状态，其吸收波长为334nm的辐射。在该波长的消光变化被测量。一个单位是，在37℃和pH4.0时每分钟从1，2-二硫二辛酰磷脂酰胆碱释放出1nmol硫辛酸的量。
通过将1g diC8晶体溶解于每66ml乙醇中制备底物溶液，加入264ml乙酸缓冲液。乙酸缓冲液包含pH3.85的0.1M乙酸缓冲液，其含有0.2％Triton-X100。着色剂为11mM的4，4-二硫吡啶。其是通过在2mleppendorf样品杯中称量5.0mg4，4-二硫吡啶和溶于1.00ml乙醇中来制备的。加入1.00ml milli-Q水。
有趣的是，从dHDFA、dHDFB或dHDFAB菌株获得的转化子较之从CBS513.88获得的转化子发生形态变化，例如，颜色或菌落外观产生差异的频率更小。这可能是由于随机整合(NHR)的减少，从而防止了不被期望的表型变化出现。
实施例9分离具有提高的诱变同源重组效率的Penicillum突变体
为分离具有提高的基因定位效率的突变体，应用经典诱变和分子生物学的组合。从在YEPD(2％酵母提取物，来自Difco，1％蛋白胨，来自Difco，2％葡萄糖)上形成孢子的菌落来获得Penicillium chrysogenum(CBS455.95)孢子。在灭菌自来水中洗这些孢子，对10ml每ml含有108个粉生孢子的悬浮液进行254nm的UV照射(Sylvania，15WattsBlack Light Blue管，FT15T8/BLB型号)。UV照射应用7.5、15或30分钟，其间悬浮液被缓慢摇晃。这些不同的照射时间被选用来获得细胞中温和、中度和强烈的突变比例水平。在黑暗中恢复1小时后，来自这三种时间点的细胞被分别相等的两份。第一份样品按照先前的描述(Hersbach，GJM，Van der Beek，CP and Van Dijck，PWM.The Penicillins：properties，biosynthesis and fermentation.In：Vandamme EJ(ed)Biotechnology ofIndustrial Antibiotics(pp45-140)Marcel Dkker，New York)直接用于孢子再形成，另一份样品在用于诱导孢子形成之前在YNB培养基(0.67％w/v含有氨基酸的Yeast Nitrogen Base(Difco)，2.0％w/v葡萄糖)中孵育一段延长的恢复期，在25℃下进行4小时。
通过使野生型孢子在YNB中过夜发芽，接着在灭菌自来水中经历两个洗涤步骤以及重新悬浮于灭菌自来水中，获得第三份诱变样品。然后应用7.5、15和30分钟的UV照射，其间对悬浮液进行缓慢摇晃。黑暗中1小时的恢复之后，这些样品直接用于孢子再形成(如上文所示)。
为从这些经过诱变的群中选出想要的突变体，将经过诱变的群接种到YEPD培养基上。发芽之后，接着用标准光学显微镜方法来进行细胞发育。当培养物平均菌丝很好地发育，收获细胞，与裂解酶一起孵育，获得原生质体。用携带有功能选择标记(ble和amdS)表达盒的两种DNA片段去转化原生质体。基因ble编码能赋予对腐草霉素抗性的蛋白(Kolar M，Punt PJ，van den Hondel CA，Schwab H.Transformation of Penicilliumchrysogenum using dominant selection markers and expression of anEscherichia coli lacZ fusion gene.Gene.1988；62(1)：127-34)。基因amdS编码能使细胞在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的蛋白(如EP635574B所述)。用于将DNA转移到P.chrysogenum原生质体中的技术是本领域公知的，其被描述于多份参考文献中，包括Finkelstein and Ball(eds.)，Biotechnology of filamentous fungi，technology and products，Butterworth-Heinemann(1992)、Bennett and Lasure(eds.)More Gene Manipulations infungi，Academic Press(1991)、Turner的Pühler(ed)，Biotechnology，secondcompletely revised edition，VHC(1992)。按照EP635574所述来进行Ca-PEG介导的原生质体转化。
为选出这些表达盒向Penicillium基因组中特定基因座的定位整合，通过PCR向DNA片段的两端加上短的同源DNA片断。制备三种类型的构建体：第一种类型含有30bp的DNA同源片断，第二种50bp，第三种100bp。对转化突变体进行选择，所述突变体来自具有30、50或100bp同源片断的两种DNA构建体(ble和amdS)的九批孢子形成产物，这定义出了27份不同批次。ble基因被定位到niaD基因座上，由此干扰了硝酸盐还原酶基因(Gouka RJ，van Hartingsveldt W，Bovenberg RA，van denHondel CA，van Gorcom RF.Cloning of the nitrate-nitrite reductase genecluster of Penicillium chrysogenum and use of the niaD gene as a homologousselection marker.J Biotechnol.1991Sep；20(2)：189-99)，使得可在含有氯酸盐的平板上对转化子进行直接选择，因为细胞变得能抗氯酸盐了。amdS基因定位到sutB基因座上，由此干扰了硫酸盐透性酶基因(van de KampM，Pizzinini E，Vos A，van der Lende TR，Schuurs TA，Newbert RW，Turner G，Konings WN，Driessen AJ.Sulfate transport in Penicillium chrysogenum：cloning and characterization of the sutA and sutB genes.J.Bacterid.1999Dec；181(23)：7228-34)，使得可在含有硒酸盐的平板上对转化子进行直接筛选。首先在氯酸盐上筛选转化子，然后针对硒酸盐进行检测。此外，在含有乙酰胺作为唯一氮源的平板(EP635574B)以及随后在含有腐草霉索的平板上的生长，显示出选择标记的存在。作为对照，野生型P.chrysogenum CBS455.95也被同样的DNA片段转化。两种选择标记都存在并能抗氯酸盐和硒酸盐的突变体是具有提高的定位整合的菌株。

Claims (14)

1.用于提高多核苷酸向偏好NHR的丝状真菌基因组中与预定位点定位整合效率的方法，其中，所述多核苷酸与所述预定位点具有同源区域，所述方法包括：提供亲本丝状真菌细胞的突变体，其中，在相同条件下测量时所述突变体的NHR/HR比例较之所述亲本生物中所述比例减小，其中，所述突变体中编码NHR所涉及的组分的基因是缺陷的，其中所述组分选自酵母KU80、KU70的丝状真菌同源物构成的组，和/或其中NHR所涉及的所述组分的水平降低；其中所述酵母KU80、KU70的丝状真菌同源物是能执行酵母基因KU80、KU70的至少一种功能的酵母KU80、KU70的功能等同物；其中所述丝状真菌是Aspergillus或Penicillium种。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述突变体是下述基因中至少一种缺陷的：hdfA或hdfB，或两者都缺陷，并且/或者，所述突变体中被这些基因编码的蛋白质中的至少一种的含量被降低。
3.如权利要求1所述的方法，其中，编码所述NHR所涉及的组分的基因被非功能性变异体置换。
4.如权利要求1所述的方法，使用NHR/HR比例小于50的丝状真菌。
5.亲本丝状真菌细胞的突变体，所述亲本生物具有对NHR的偏好，其中，在同样条件下进行测量时，所述突变体中所述NHR/HR比例较之所述亲本生物中所述比例被降低，其中所述突变体中编码NHR所涉及的组分的基因是缺陷的，其中所述组分选自酵母KU80、KU70的丝状真菌同源物构成的组，和/或其中NHR所涉及的所述组分的水平降低；其中所述酵母KU80、KU70的丝状真菌同源物是能执行酵母基因KU80、KU70的至少一种功能的酵母KU80、KU70的功能等同物；其中所述丝状真菌是Aspergillus或Penicillium种。
6.如权利要求5所述的突变体，所述突变体是下述基因中至少一种缺陷的：hdfA或hdfB，或两者都缺陷，并且/或者，所述突变体中被这些基因编码的蛋白质中的至少一种的含量被降低。
7.如权利要求5所述的突变体，其中，所述生物基因组中，编码所述NHR所涉及的组分的基因被非功能性变异体置换。
8.如权利要求5所述的突变体，其中，所述突变体是重组突变体。
9.如权利要求5所述的突变体，是用下述DNA构建体转化的，所述构建体包含含有编码目标多肽的目标基因的DNA序列。
10.如权利要求5所述的突变体，其中，所述Aspergillus是Aspergillusniger或Aspergillus oryzae种。
11.权利要求5所述的突变体，其中，所述Penicillium是Penicilliumchrysogenum或Penicillium citrinum种。
12.生产目标多肽的方法，其中，使用如权利要求5至11中任意一项所述的突变体。
13.生产代谢产物的方法，其中，使用如权利要求5至11中任意一项所述的突变体。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述代谢产物是类胡萝卜素化合物或beta-内酰胺化合物。
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