JPH09511911A

JPH09511911A - インビボ遺伝子発現システム

Info

Publication number: JPH09511911A
Application number: JP7527227A
Authority: JP
Inventors: アトキンス，デイビッド; アンディト，グレゴリー・マーティン; アイザント，ジョナサン・ゴルダー
Original assignee: ジーン・シアーズ・プロプライエタリー・リミテッド
Priority date: 1994-04-20
Filing date: 1995-04-20
Publication date: 1997-12-02
Also published as: AUPM516994A0; DE69527951T2; EP0756634A1; US5932435A; ATE222959T1; WO1995029254A1; IL113430A0; FI964172A0; IL113430A; DE69527951D1; EP0756634B1; NO964427D0; ZA953208B; EP0756634A4; FI964172A; CA2185550A1

Abstract

(57)【要約】本発明は包括的には遺伝子発現のためのインビボシステムに関し、より特定的には、このシステムを利用して、ターゲットとするヌクレオチド配列の発現または遺伝子生成物の活性を阻害、低減、変更またはさもなければ調整することができる分子をスクリーニングすることに関する。本発明のインビボシステムは排他的にではないが特に、ターゲットとする遺伝子あるいはターゲットとする遺伝子配列の発現、または医療、農業および産業分野のように商業的に重要性を有するターゲット遺伝子生成物の活性を阻害、低減、変更またはさもなければ調整することができる、アンチセンス、センスまたはリボザイム構造物またはトランス形優勢のポリペプチド、小ペプチドまたはその他の化合物をスクリーニングするのに有用性がある。

Description

【発明の詳細な説明】インビボ遺伝子発現システム本発明は包括的には遺伝子発現のためのインビボシステムに関し、より特定的にはこのシステムを利用してターゲットとするヌクレオチド配列の発現または遺伝子生成物の活性を阻害、低減、変更またはさもなければ調節することのできる分子をスクリーニングすることに関する。本発明のインビボシステムは、ターゲットとする遺伝子あるいはターゲットとする遺伝子配列の発現または医療、農業、および産業分野などにおいて商業上の重要性を有するターゲットとする遺伝子生成物の活性を阻害、低減、変更またはさもなければ調節することのできる、アンチセンス、センスあるいはリボザイム構造物あるいはトランス形優勢のポリペプチド、小ペプチドあるいはその他の化合物のスクリーニングに対して独占的にではないが特に有用である。本明細書において引用されるヌクレオチド配列に対する配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）は、請求の範囲の直前に規定されている。この明細書を通して、文脈上違う理解が要求されるのでない限り、“包含する ”という語は記述された要素あるいは完全体、またはそれらの群を含むが、一方、記述されないその他の要素あるいは完全体またはそれらの群を排除するものではないことを意味している。急速に複雑化する組換えＤＮＡ技術は、医学、農業、園芸および醗酵の分野を含む多くの商業上重要な産業において有効性を多大に促進している。組換えＤＮＡ技術において重要な手段は、アンチセンス分子、センス分子、リボザイムおよびその他の遺伝子配列および／またはペプチドあるいは化学物質などの非ヌクレオチド分子を使用して遺伝子配列の発現に影響を与えることである。リボザイムは非常に特定的なエンドリボヌクレアーゼ活性を備えるＲＮＡ分子である。特に、これは、ヌクレオチド配列においてターゲットＲＮＡの少なくとも一部分に対して相補的であるハイブリッド形成領域、およびターゲットＲＮＡを切断するようにされた触媒領域を含む。リボザイムは、Nature３３４：５８６ −５９１、１９８８においてハザロフ J.(Haseloff J.)、およびガーラック W(G erlach W)により、ならびに国際特許出願番号第ＷＯ89/05852号において詳細に述べられている。アンチセンス分子は、一般にはヌクレオチド配列においてターゲットｍＲＮＡに相補的な遺伝子構造物である。アンチセンス分子の活性の正確な態様は不明であるが、これがターゲットｍＲＮＡの全体または一部と２本鎖を形成し結果としてｍＲＮＡの転写に干渉効果をもたらすことが可能である。センスヌクレオチド構造物は共同サプレッションにおいて用いられ、たとえば植物遺伝子の発現を低減するのに効果的であることがわかっている。ターゲット遺伝子配列の発現またはそれによりコードされる生成物の活性を調節する上で可能性のあるエフェクタ分子としての、アンチセンス、センスおよびリボザイム構造物、トランス形優勢のポリペプチド、小ペプチドならびにその他の化合物などの分子を迅速に評価するための効果的な方策を開発することが必要である。以前には微生物は、たとえばその生存能力または増殖能力に影響する化合物をテストするのに好都合なインビボモデルシステムであると考えられてきた。微生物は分子および遺伝子分析において利点のある実験宿主である。その長所は、世代時間が短いこと、多数の細胞の増殖および分析のための方法が利用しやすいこと、ならびにこれらの細胞から核酸を導入および回収することが比較的容易なことである。安価な栄養源で１０¹¹を上回る微生物を容易に増殖させることができるのに対し、哺乳動物の細胞の生成は１０⁸でさえ時間も費用もかかる。しかしながら、細菌の細胞は遺伝子発現の多くの基本的な局面の解明において使用されているが、真核生物のＲＮＡ生理学の基礎的な特徴の多くが欠けている。細菌細胞では、核の仕切りがなく、完全に識別できるＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質の数が減じられており、スプライシングされたｍＲＮＡが僅かであるかまたは全くなく、イントロン除去のためのスプライセオソームの機構を備えず、タンパク質翻訳の開始については異なるシステムを利用する。他方、酵母細胞は、植物および動物などの高等な真核生物の細胞の基本的な特徴すべてを備えており、かつ世代時間は細菌を連想させるため、実験モデルとしては非常に有利である。こうした細胞において核酸の導入、分析および回収を行ない遺伝学的および生化学的研究に適するものとするのに利用できる分子および遺伝子技術のセットは数多くある。遺伝子の完全な分析を容易にするのに十分大きく複雑な酵母細胞の個体群を生成することが可能である。しかしながら、多くの研究所は出芽酵母サッカロミセス・セルビシエ(Sacchar omyces cerevisiae)においてアンチセンスおよびリボザイム技術を使用することを試みているが不成功に終わっている。この酵母は如何なるその他の真核生物の微生物よりも徹底して研究されており、現在広範囲にわたる遺伝子および分子の手段が利用できる。現在まで、動物および植物細胞においてうまく作用するターゲットシステムを用いたとしても、アンチセンスおよび／またはリボザイム構造物を使用してS．cerevisiae における遺伝子発現のサプレッションに完全な成功を収めたという報告はなされていない。たとえばアンチセンスおよびリボザイムの阻害に対してS．cerevisiae が明らかにそれほど扱いにくいものであることは驚くべきことである。分子遺伝学研究に利用できる、哺乳類の細胞、ショウジョウバエ、植物、および粘菌ジクチオステリウム・ジスコイディウム(Dictyosteli um discoidium)など実質的にその他すべての真核生物システムにおいて、人工的なアンチセンス方策の開発に成功している。シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（分裂酵母）もまた、非常に特徴的な遺伝システムを有している。クロマチンの構造および挙動、イントロンの分布、ならびに小さな核のリボヌクレオプロテイン粒子ＲＮＡおよびタンパク質を含め、S．pombeにはS．cerevisiae よりもこれらの細胞を人間およびその他の高等な真核生物の細胞にもっと似せる多数の特徴がある。さらに、 S．pombe細胞の分裂周期は高等な真核生物のものに非常に似ている。このことにより、S．pombeは、動物および哺乳類（たとえばヒト）の遺伝子、昆虫の遺伝子ならびに植物の遺伝子を含め高等な真核生物の遺伝子発現の研究にとって、潜在的に価値のあるモデルとなっている。本発明につながる研究において、発明者達はS．pombeをターゲット遺伝子の変更された発現の調査について可能性あるモデルとして評価しようとした。発明者達は、ある遺伝構造物がS．pombeにおいて発現され、ターゲット遺伝子のサプレッションを含む発現の変更調整につながることを発見した。したがって本発明は、真核生物、原核生物、またはウィルスに由来するターゲット遺伝子の発現を調節することができる、またはそのような遺伝子の生成物の活性を調節することができる潜在的に効果的な物質としての、アンチセンス、センスおよびリボザイム構造物などの遺伝子構造物、ならびにトランス形優勢のポリペプチド、小ペプチド、およびその他の化合物を効率的にスクリーニングすることに適した遺伝子発現の微生物モデルを初めて提供する。本発明はたとえば、遺伝子発現のエフェクタのための配列をコードした新規のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについてのバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリのスクリーニングにおいて有用である。本発明は特に、医療および動物健康産業、ならびに植物および収穫産業のための各種農薬化合物における、可能性のある診断および治療用分子のスクリーニングについて有用性がある。したがって、本発明のある局面では、ターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子生成物の活性を阻害、低減またはさもなければ調節することができる分子を同定するための方法が意図されており、この方法は、このターゲット遺伝子を発現することができるシゾサッカロミセス・ポンベの株を生成することと、テストされるその分子の効果的な量をS．pombeの株に導入することと、ターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子の生成物の活性に対しこの分子が有する効果を判断することとを包含している。分子は好ましくは、ターゲット遺伝子に関連するアンチセンス、センスヌクレオチド配列あるいはリボザイム等の遺伝子構造物、または、オリゴヌクレオチド、ランダムなヌクレオチド配列あるいはインビトロ切断のために選択されたヌクレオチド配列などのその他のヌクレオチド配列である。しかしながら本発明は、トランス形優勢のポリペプチド、小ペプチド、および化学物質などの非ヌクレオチド分子、ならびに合成ヌクレオチド分子またはヌクレオチド類似分子にも及んでいる。「発現を調節する」という語およびその他同様の表現は、ターゲット配列の生成物の活性のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを含む。したがって、このように発現または活性を調節する分子は、アゴニストであったりアンタゴニストであってもよい。さらに、本発明は、スイッチメカニズムを含む細胞性因子および細胞間アドレス信号により活性が調整される、たとえばリボザイム、アンチセンスおよびセンスヌクレオチド分子などの物質を同定することに及ぶ。加えて、発現についての効果のレベルが、アンチセンス、センスまたはリボザイム分子などの分子を調節するレベルを引き上げることにより高められる場合もある。本発明の方法を、インビトロ評価実験と関連づけて、または組合せて、または補助的に利用して、対象となるターゲット分子を同定してもよい。したがって、本発明の方法をランダムに、かつ合理的なドラッグデザインとして利用してもよい。このことはたとえば、インビトロで効果的なリボザイムのさらなる評価にとって特に有用性がある。１つの具体例では、ヌクレオチド配列をリボザイムに添加し、たとえばリボザイムを特定の配列に向けることや、細胞の浸透を促進し、あるいはその活性を促進する。「遺伝子」という用語は、最も広範囲な意味で用いられ、典型的なゲノム遺伝子、ならびに遺伝子のコード部分（すなわちエキソン）のみを包含する遺伝子配列、およびｍＲＮＡ転写に相当するｃＤＮＡ配列を含む。本明細書において意図される「遺伝子」特にターゲット遺伝子に関連しては、自然に発生する遺伝子、部分的な遺伝子、合成の遺伝子、およびターゲット遺伝子と別の遺伝子または遺伝子配列とが融合したものを含む。したがって本明細書では「遺伝子」は何らかのターゲットヌクレオチド配列を含むものと考えられ、その源は真核生物、原核生物、またはウィルスでもよい。好ましくは、ターゲット遺伝子は、S．pombeに対して「外因性」または「非自生的」であり、形質転換、接合、電気穿孔法またはその他の手段によって酵母細胞に導入された異種構造の遺伝子であることを意味する。しかしながら、ターゲット遺伝子はそれに代わって「内因性」のものでもよい。特に好ましい内因性のまたは相同的な（本明細書では「自生的」とも称される）S．pombe遺伝子は、細胞周期タンパク質をコードし、細胞周期を調節し、および／またはプログラムされた細胞死に巻き込まれるものである。このような遺伝子および特に本発明に従って同定されたそのアンタゴニストは、人間のような哺乳動物の癌の治療において有用である。その他の重要な内因性の遺伝子は、哺乳動物（たとえばヒト）の遺伝子に相同的なS．pombeである。本発明のこの局面に従う特に有用性のある酵母は、哺乳動物（たとえばヒト）の相同染色体で置換される、または相同的な動物、哺乳動物、あるいは植物の遺伝子を包含する、または動物、哺乳動物または植物の遺伝子に相同的な機能を有する、S．pombe遺伝子を有する。このような酵母の一例は、動物、哺乳動物、または植物の遺伝子の相同染色体によって機能的に補足されるかそうでなければ置換される突然変異を有する酵母である。本発明の特に好ましい局面では、ターゲット遺伝子構造物は、リポータ分子をコードするヌクレオチド配列に融合されるかさもなければ作動的に結合されるターゲット配列、またはターゲット配列の一部のいずれかを包含する。その代わりに、リポータ遺伝子を、異種の（たとえば哺乳動物の）遺伝子のS．pombe相同染色体などのS．pombe遺伝子に近接する作動可能な場所に挿入してもよい。このような遺伝構造物はS．pombeにおいて発現されると、ターゲット遺伝子コード部分およびリポータ分子部分を有する融合ポリペプチドの合成をある形式で導くだろう。本発明のこの局面に従えば、遺伝子配列などの分子は、リポータ遺伝子配列の発現またはリポータ分子の活性を照合することにより、ターゲット遺伝子の発現を変更する能力についてテストされる。本発明のこの局面に従って、ターゲット遺伝子の発現を阻害、低減、またはさもなければ調節することができる遺伝子配列を同定する方法が提供され、この方法は、遺伝子構造物においてこのターゲット遺伝子を発現することができ、同定可能な信号を与えることができるリポータ遺伝子をさらに包含するS．p ombeの株を生成することと、テストされる遺伝子構造物の有効量をこのS．pombe の株に導入することと、このリポータ遺伝子の発現の阻止、低減、またはダウンレギュレーションについて検定することとを包含する。アップレギュレーションもテストされる検定もある。代替的な具体例では、トランス形優勢のポリペプチド、小ペプチド、またはその他の化合物を含む化学物質の調節の能力についてテストが行なわれる。この方法の理論的根拠は、ターゲット遺伝子生成物またはその一部およびリポータ分子双方をコードする単一のｍＲＮＡ転写を酵母細胞において発生させることである。一般に、リポータ分子はターゲット遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列の下流に設けられるヌクレオチド配列によりコードされる。次に遺伝子配列が、検出可能なリポータ分子における変化を照合することによりテストされる。好ましい具体例では、テストされる遺伝子配列は、５つ以上のヌクレオチド、リボザイム、三重螺旋、ＲＮＡ、あるいはタンパク質のおとり、センスまたは共同サプレッションに用いるためのセンス分子、トランス形優勢の突然変異ヌクレオチド、欠陥のある干渉ＲＮＡあるいはＤＮＡ、または自然に発生あるいは合成の化合物といったタンパク質などを包含するアンチセンス分子である。最も好ましい具体例では、テストされる遺伝子配列はアンチセンス分子、センス分子またはリボザイムである。リポータ分子は、同定可能な信号を与えることができる何らかの分子でもよく、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼおよび西洋わさびパーオキシダーゼ）でもよく、抗生物質の耐性を付与するものや、非抗生物質の化合物の耐性を付与するものでもよく、蛍光原基質、螢光タンパク質、化学発光化合物、ビオチノール化化合物、必須成長因子、細胞周期タンパク質でもよく、または大きさ、色および細胞表面の表現型（たとえば粗いまたは滑らかなエッジ、凹型または凸型のコロニー）などが規定された表現型を細胞に与えることができる分子でもよい。β −ガラクトシダーゼ遺伝子は特に有用なリポータ分子である。リポータ分子は、上記のリポータ分子間のまたはS．pombe相同的なまたは異種の遺伝子間の融合リポータ分子でもよい。特に、有用性のあるリポータ分子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（Cell ５３：６５９−６６７、１９８８ジョーンズ(Jones)など）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）(Mol．Gen． Genet．２２２０：３１４−３１６、１９９０、ポブジェッキー(Pobjecky)など) 、蛍のルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、フレオマイシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）(Nucl ．Acids．Res.２０：３３８３−３３９０、１９９２、プレンティス(Prentice) およびキングストン(Kingston))、緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ）(Science ２６３：８０２−８０５、１９４４、シャルフィ(Chalfie) など)、Ｇ４１８に耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）(Mol．Gen．Genet．２２０：９５−１０１、１９８９、グムンダ(Gmunder )およびコーリ(Kohli))、ならびに、S．pombe ura4遺伝子およびその融合誘導体（たとえばCurrent Genetics ２７：２４３−２４８、１９９５、マイヤーズ (Myers)などを参照）である。別の適切なリポータ分子はアデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）である。融合ターゲット遺伝子構造物を含むターゲット遺伝子を、内因性のプロモータまたは外因性のプロモータの制御の下でS．pombeの染色体に組込んでもよく、または染色体外の、複製成分として存在してもよい。ＳＶ４０プロモータなどの外因性プロモータを何個使用してもよい。適切な内因性プロモータは調整されたS ．pombe adhlプロモータである。テストされる遺伝子配列（たとえばアンチセンスまたはセンス分子またはリボザイム構造物）を、とりわけ形質転換、接合、電気穿孔法を含むいくつかの手段によって酵母細胞に導入することができる。遺伝子配列は、内因性または外因性プロモータのもとで発現されることができ、またはプロモータなしで導入されることができる。本発明により、ターゲット遺伝子の発現に効果のある遺伝子配列を迅速にスクリーニングすることができる。ターゲット遺伝子は真核生物、原核生物およびウィルス遺伝子を含む。真核生物遺伝子の例は、哺乳動物の成長因子およびサイトカインおよびそれらの受容体、ならびにガン特異的遺伝子および植物遺伝子を含む。原核生物遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼおよび病原体特異的遺伝子を含む。ウィルス遺伝子の例は、ＨＩＶおよび肝炎遺伝子を含む。本発明は、ウィルス、癌および異常な「自己」遺伝子をターゲットとする有用な遺伝子配列をスクリーニングするのに適した疾病のモデルシステムの開発に特に適している。本発明の方法はまた、薬物スクリーニング試薬としても有用であろう。たとえば、受容体遺伝子はリポータ遺伝子に依存する態様で処理および発現される。調節された酵母が次に、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストに対する処理量の高いアッセイにおいて用いられる。本発明はS．pombeをインビボモデルとして使用し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をターゲットおよびリポータ分子双方として使用して例示されているが、本発明は明らかに、その他適切な真核生物およびその他のリポータ分子にまで範囲を広げるものであり、かつそれらを含み入れるものである。本発明のその他の局面は、ターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子生成物の活性を阻害、低減またはさもなければ調節することができる分子をスクリーニングするためのインビボモデルシステムを含み、このインビボモデルシステムは、このターゲット遺伝子を発現することができるS．pombeの株を包含し、テストされる分子はこのS．p ombeに導入され、ターゲット遺伝子の阻害、低減またはダウンレギュレーションに対するスクリーニングが行なわれる。本発明は以下の図面および例によってさらに説明されるが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。図面について：図１（ｉ）（ii）は、S．pombe β−ガラクトシダーゼ株の遺伝子型分析を表わす。β２−１^*ura4／β−ガラクトシダーゼ遺伝子座を用いてＫＣ４−６を構成した。図２（ｉ）（ii）は、S．pombeにおいて調整された遺伝子発現を表わす。図３は、β−ガラクトシダーゼアンチセンスおよびコントロールセンスオリエンテーション遺伝子を示す図である。図４は、アンチセンスＲＮＡがS．pombeにおいて遺伝子の発現を阻害していることを示す図である。図５は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子サプレッションは転写に依存することを示す図である。図６（ｉ）（ii）（iii）は、単一のハンマーヘッド切断領域を備える長いアームのおよび短いアームのｌａｃＺリボザイムを示す図である。図７（ｉ）（ii）は、アームの短いｌａｃＺリボザイムによるインビトロの切断を示す。図８は、S．pombe形質転換細胞におけるアームの長いおよび短いｌａｃＺリボザイムの発現を写真で示すものである。ｌａｃＺリボザイム遺伝子を含むプラスミドで形質転換された細胞は、比較できる定常状態のレベルでそれぞれのリボザイムの発現を示した。図９は、アームの長いおよび短いｌａｃＺリボザイムのインビボアッセイをグラフで示すものである。短い５′のｌａｃＺアンチセンスＲＮＡにハンマーヘッドリボザイムを含めることにより、アンチセンスＲＮＡ仲介サプレッションを差別的に排除することになった。アームの短いｌａｃＺリボザイムはβ−ガラクトシダーゼの活性を大きく低減させなかった。図１０は、アンチセンスＲＮＡがS．pombeの株ＲＢ３−２における遺伝子発現を阻害することをグラフで示している。図１１は、adhlプロモータ−β−ガラクトシダーゼ−ura4の３′発現カセットを含む株ＲＢ３−２におけるura4遺伝子座を示す図である。図１２（ｉ）（ii）は、ｌａｃＺターゲット遺伝子およびアンチセンスおよびコントロールプラスミドの模型図である。図１３Ａは、図１２に示す発現ベクター各々で形質転換されたＫＣ４−６細胞から分離した全ＲＮＡのノーザンブロットを写真で示す。図１３Ｂは、４μＭチアミンの存在（プラス）および不在（マイナス）において増殖される株ＫＤ４−６（ＧＴ２、ＧＴ２−２およびＧＴ２−３）の独立したｐＧＴ２形質転換細胞から分離した全ＲＮＡのノーザンブロットを写真で示す。図１４は、ｌａｃＺアンチセンス形質転換細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の低減をグラフで示す。図１５は、長いｌａｃＺアンチセンスＲＮＡによるβ−ガラクトシダーゼ活性の低減は、転写に依存することをグラフで示す。中央のパネルは実験デザインをまとめて示す。ｐＲＥＰ１およびｐＧＴ２の３つの独立した形質転換細胞からの単一のコロニーが分けられ、（Ａ）ＥＭＭ＋Ｕ（ｎｍｔ１プロモータＯＮ）または（Ｂ）ＥＭＭ＋ＴＪＩ＋Ｕ（ｎｍｔ１プロモータＯＦＦ）に筋状に塗布された。実験の第２段階で、（Ｃ）ＥＭＭ＋Ｕにおける各形質転換細胞の細胞は、ＥＭＭ＋ＴＨＩ＋Ｕ（ｎｍｔ１プロモータＯＦＦ）に筋状に塗布され、（Ｄ）ＥＭＭ＋ＴＨＩ＋Ｕで増殖する各形質転換細胞の細胞はＥＭＭ＋Ｕ（ｎｍｔ１プロモータＯＮ）に筋状に塗布された。ヒストグラムにおける各サンプルは、３つの独立した形質転換細胞の平均を表わし、標準偏差がエラーバーによって示される［（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）］。図１６は、ＲＢ３−２におけるｌａｃＺ遺伝子のサプレッションについてのアンチセンスＲＮＡレベルの役割をグラフで示す。例１ｐＲＥＰ１の構成プラスミドｐＲＥＰ１は、J．Biol．Chem．265：10857-10864、1990、モンドレル、Ｋ.（Maundrell，K.）に従い構築された。例２ β−ガラクトシダーゼ発現の阻害本発明は、E．coli からのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をターゲットとして用いて好都合に例示される。この遺伝子の利点は、うまく特徴づけられかつ容易に検出される細胞の表現型を有することである。β−ガラクトシダーゼを発現する細胞は、適切な基質類似体でインキュベートされると青に変わるか蛍光性となる。このことにより、迅速な視覚による同定または蛍光で活性化される細胞の選別、および遺伝子を発現する細胞の定量化が可能になる。さらに、細胞群の抽出物を利用したβ−ガラクトシダーゼ発現の正確な定量評価を可能なものにする非常に感度の高い溶液酵素アッセイがある。β−ガラクトシダーゼは、分子生物学実験の数多くのシステムでリポータ遺伝子として用いられており、遺伝子融合のための優れたブロック材である。β−ガラクトシダーゼを用いて広範囲にわたる細胞またはウィルス遺伝子の標識付けを行ない、かつその発現および生理学をモニタすることができる。本発明の例示の具体例に従って、β−ガラクトシダーゼ遺伝子がＳＶ４０初期プロモータに制御されている。これはS．pombeのura4遺伝子座に組込まれ、β−ガラクトシダーゼを発現する酵母の安定した構成株であるＫＣ４−６を生成する。図１（ｉ）上図において野生型ura4遺伝子座を示す。図１（ｉ）下図は、組込まれたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を表わし、図１（ii）は、染色体β−ガラクトシダーゼ遺伝子がβ２−１（ＫＣ４−６を誘導するのに用いられる株）およびその他類似する株に組込まれていることを立証するサザンブロットを示す。明らかに、その他のターゲット遺伝子をura4またはその他の遺伝子座に挿入してもよい。さらに、ターゲット遺伝子は染色体外のエピソームまたはプラスミドから発現してもよい。アンチセンス遺伝子の調整された発現は、条件プロモータを有するエピソーマルベクターを利用して行なわれる。図２（ｉ）は、ｎｍｔ（チアミンにメッセージのない）プロモータを含むベクターｐＲＥＰ１の構造を示す。このプロモータの下流にクローニングされた配列が、チアミンがない状態で増殖させたときには非常に高レベルで発現される。チアミンが存在すると転写はほとんど検出できない。図２（ii）は、チアミンが不在である（「−」レーン）場合のアンチセンス β−ガラクトシダーゼＲＮＡの高レベルの発現を立証する２本鎖のβ−ガラクトシダーゼプローブを用いて調べた典型的なＲＮＡブロットを示す。チアミンが存在する（「＋」レーン）場合、ターゲットの、センスオリエンテーションβ−ガラクトシダーゼ転写のみが検出される。他の発現システムを用いてもよい。図３は、この開示において用いられるアンチセンス遺伝子構造物の図解である。タンパク質コード領域（長い）を囲むアンチセンスまたはリバースオリエンテーションのフラグメント、遺伝子の５′末端および遺伝子の３′末端は各々、ｐＲＥＰ１発現プラスミドにおいてｎｍｔプロモータの後ろでクローニングされた。１組のプラスミドが遺伝子発現のパターン、細胞増殖またはβ−ガラクトシダーゼレベルへの潜在的非特定的効果に対する対照として構築された。これらはコード領域（長い）、５′末端および３′末端からのβ−ガラクトシダーゼのセンスオリエンテーションフラグメント、および関連のないリポータ遺伝子ルシフェラーゼからのセンスオリエンテーションフラグメントを含んでいた。フレームシフト変異が長いセンスコントロール遺伝子に挿入されてさらなる疑似のβ−ガラクトシダーゼが生成されることを阻止した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の他のフラグメントまたはその他のリポータおよびターゲット遺伝子をこのシステムにおいて用いてもよい。アンチセンス遺伝子発現ベクターは電気穿孔法によりβ−ガラクトシダーゼ発現ターゲット株に導入されるが、他の遺伝子導入方法を用いることも可能である。細胞はチアミンフリー媒体で増殖され、アンチセンス遺伝子の発現を促進する。一定の細胞密度の対数増殖期細胞が、溶液アッセイおよび発色団基質Ｏ−ニトロフェノール β−Ｄ−ガラクトピラノサイド（ＯＮＰＧ）を用いて、β−ガラクトシダーゼの活性について検定される。リポータ酵素レベルは、３０分後にＯＤ４２０ｎｍを観察することによって決定される。多数の独立した形質転換細胞が３回検定され、いくつかの実験の結果が図４にまとめられている。左側の概略図は、実験のためのプロトコルについて示しており、ヒストグラムはアンチセンス構造物各々によって形質転換された細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの活性の平均レベルを示す。エラーバーは、個体群の標準偏差を示す。親のｐＲＥＰ１プラスミドおよびセンスオリエンテーション遺伝子フラグメント（標識づけられたコントロール）を有するすべてのプラスミドは、このシステムの実験上の誤差範囲内に同じレベルのβ−ガラクトシダーゼの活性を有する。長いアンチセンスプラスミドを含むS．pombe細胞は、β−ガラクトシダーゼレベルの４５％の低減を再現性をもって示し、一方５′および３′のアンチセンス細胞は、それぞれ２０％および１０％の低減を示している。この実験は酵母細胞におけるアンチセンス遺伝子サプレッションを初めて裏付けるものであり、人工遺伝子調整に対する長い、５′の、および３′のフラグメントの相対的な活性を示すものである。観察された阻害はアンチセンスβ−ガラクトシダーゼＲＮＡの発現が原因であることを確認するために、図５に書面化されている一連の実験が行なわれた。長いアンチセンス株とコントロールｐＲＥＰ１株が並行して交互にチアミンを含む培地で培養されてアンチセンスの生成を阻害し、次にチアミンを含まない培地で培養されてアンチセンスの発現を“ on”させた（図５の中央の図の右側）。チアミンを含まない培地で培養し次にチアミンを含む培地で培養するという相反的な実験が行なわれた（図５の中央の図の左側）。並んでいるヒストグラムに示されるように、チアミンがない場合にβ −ガラクトシダーゼを多大に阻害することを示した細胞は、チアミンにおいて成長させたとき阻害を示さない（図５の左側の２つのヒストグラム）のに対し、チアミンにおいて成長させたときにはβ−ガラクトシダーゼの阻害を示さない細胞はチアミンのないところで成長させたとき（アンチセンスＲＮＡの転写を“on” させる条件）約５５％の阻害を示した（図５の右側の２つのヒストグラム）。こうしたon−off ／off −onの実験は、長いβ−ガラクトシダーゼのプラスミドは、転写依存性のかつ配列に特異的なアンチセンスのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子サプレッションを、S．pombeのＫＣ４−６型のリポータ遺伝子の株において生じさせることを示している。このシステムは人為的な遺伝子調整技術の遺伝学的および生化学的探究について価値あるものである。このことより、遺伝子失活方法を開発および利用してS．pombeにおける遺伝子の活性を阻害することを当業者が今やできるようになったことは明らかである。この実例は、アンチセンスＲＮＡ転写の有用性を示しているが、その他の遺伝子、合成アンチセンスおよびリボザイムオリゴヌクレオチド、三重螺旋、ＲＮＡおよびタンパク質のおとり、センス共同サプレッション、トランス形優勢突然変異方策、欠陥のある干渉ＲＮＡおよびＤＮＡなどにも応用できることが当業者によって認識されるであろう。このシステムはまた、小分子化合物での治療および製剤の同定および開発にも応用できる。さらに、疾病モデルシステムに応用することが可能である。必要なのは、単純な遺伝子構築および遺伝子の活性への効果についてのアッセイテストの立証である。この技術の一つの応用例は、大規模な遺伝子失活方策およびそれらの組合せの迅速かつ信頼性の高いスクリーニングであり、人間、医学、動物、植物および醗酵応用分野における遺伝子処理および遺伝子操作を通した応用において効果的な構造物を決定するものである。例３株ＫＣ４−６と比較してより高い定常レベルでターゲットｌａｃＺ遺伝子を発現するS．pombe株の構築 β−ガラクトシダーゼ遺伝子はS．pombe adhlプロモータおよびS．pombe ur a4 ３′プロセッシング領域の制御下に置かれた。このadhlプロモータ−β−ガラクトシダーゼ−ura4 ３′発現カセットは、S．pombeのura4遺伝子座で組込まれ株５９９−２を生成した。図６は、株５９９−２におけるura4の遺伝子座で組込まれたカセットを示す。この株はleu^- S．pombe株に交差して子嚢胞子分離集団ＲＢ３−２を生成した。この株はまた、図１１に示すようにura4の遺伝子座で組込まれたadhlプロモータ−β−ガラクトシダーゼ−ura4 ３′発現カセットを含み、ＫＣ４−６に対しβ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡ発現において２０倍の増加を示した。株ＲＢ３−２は図３（例２）に示すアンチセンスおよびコントロールプラスミドのセットで形質転換され、β−ガラクトシダーゼの活性について検定された。多数の独立した形質転換細胞が３回検定され、これらの実験の結果は図１０にまとめられている。この検定についてのプロトコルは図４（例２）と同様である。長いアンチセンスＲＮＡを発現するS．pombeの細胞は、β− ガラクトシダーゼの活性において５５％の低減を示し、一方短い５′アンチセンスＲＮＡおよび短い３′アンチセンスＲＮＡ発現細胞は、それぞれ２２％および４％の低減を示す。このように、コントロールプラスミド形質転換細胞は、ｐＲＥＰ１形質転換細胞と同様のβ−ガラクトシダーゼの活性のレベルを示した。アンチセンスまたはコントロールプラスミドを含むすべてのＲＢ３−２形質転換細胞は予期された、プラスミド誘導ＲＮＡを発現することを示している。ＫＣ４− ６に対するＲＢ３−２の主要な利点は、ＲＢ３−２の単一のコロニーがＸ−ｇａ１培地において青に変わることである。これはＫＣ４−６と比較した場合にＲＢ３−２においてはより高いレベルのβ−ガラクトシダーゼの発現が見られることを反映している。例４ S．pombe株ＲＢ３−２における遺伝子発現の阻害例３で説明した酵母株ＲＢ３−２はβ−ガラクトシダーゼのアンチセンス阻害についてテストされた。その結果は図１０に示されている。長いおよび５′のアンチセンス分子は、３′アンチセンス分子よりもβ−ガラクトシダーゼ発現の阻害においてより効果的であった。ＲＢ３−２におけるターゲット遺伝子は図１１において図式的に示される。例５生化学的活性検定と表現型リーダとの関係ｌａｃＺ発現の分析は、Ｘｇａ１を含む培地における形質転換細胞のインキュベーションによって完了できる。Ｘｇａ１は酵素β−ガラクトシダーゼの色素産生基質であり、加水分解されるとコロニーに青い表現型を与える。図１０に示すＲＢ３−２形質転換細胞は５０，１００，１５０および２００μｇ／ｍｌのＸｇａ１を含む培地に置かれた。５日間増殖させた後、全長および５′のアンチセンスを発現する株の青色の輝度が明らかに減じていることが、コントロールの変換株と比較した際に検出できた。この結果は、ｌａｃＺの発現と表現型との関係を示し、遺伝子スクリーニングにおいてどのようにしてS．pombe株ＲＢ３−２を利用して、加水分解に際しターゲットｌａｃＺ発現酵母株の発現を減じる遺伝子配列をランダムな遺伝子配列をコードするライブラリから同定することができるかを証明している。フェニル−β−ｄ−ガラクトロピラノサイドは、このような自滅基質のための化合物として候補に挙がっており、現在研究中である。例６ S．pombeにおけるｌａｃＺ発現のアンチセンス仲介調整酵母株および培地シゾサッカロミセス・ポンベ株９７２（ｈ−）が大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の組込みおよび発現のための宿主として用いられた。株ＮＣＹＣ１９１３（ｈ−、ｌｅｕ１−３２）およびＮＣＹＣ１９１４（ｈ＋、ｌｅｕ１−３２）は、酵母培養ナショナルコレクション(National Collection of Yeast Cultures)（食物研究ＡＦＲＣ協会(AFRC Institute of Food Research)、英国、ノーウィッチ(Norw ich)）から入手した。酵母接合は、標準的な手順に従って行なわれた（アルファ (Alfa)らによる、分裂酵母を用いた実験：実験室コースマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリプレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９９３）。エピソーマルプラスミドＤＮＡまたは線形のプラスミドＤＮＡを用いたS．pombe細胞の形質転換は、電気穿孔法を用いて行なわれた（プレンティス，Ｈ．Ｌ．（Prentice，H． L．）Nucleic Acids Res.２０：６２１、１９９２）。S．pombeにおけるura4の遺伝子座での遺伝子置換はグリム(Grimm)らによりMol．Gen．Genet ２１５：８１−８６、１９８８において述べられるようにして達成された。酵母細胞は、標準的なＹＥＳ培地(BIO 101 Inc.，Vista，CA)または生物学的補足を含む合成デキストロース（ＳＤ）培地において増殖させた（ローズ（Rose ）など、酵母遺伝子学の方法(Methods in yeast genetics)：実験室コースマニュアル、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1990）。チアミンを含まないＥＭＭ培地(BIO 101 Inc.，Vista，CA )を利用して、酵母形質転換細胞におけるプロモータからの最大の発現を得た。このプロモータからの転写の抑制は、４μＭという最終的な濃度でチアミン(Sig ma)をＥＭＭ培地に添加することによって達成された(モンドレル，Ｋ．（Maundr ell，K.）、J．Biol．Chem．265: 10857-10864，1990)。S．pombe細胞の抱合および胞子形成は栄養素欠失ＭＥ寒天培地(BIO 101 Inc.，Vista，CA)を用いて行なわれた(モレノ(Moreno)など、Meth．Enzymol．194: 795-823，1991)。E，coli ｌａｃＺ遺伝子を発現する酵母構成要素の青いコロニーの色を調べるために、リン酸カリウム（ｐＨ７．０まで）で緩衝され５０ないし２００μｇ／ｍｌにまたがる最終的な濃度でＸｇａ１を含むＳＤまたはＥＭＭ培地に細胞が置かれた（ローズなど、酵母遺伝学の方法：実験室コースマニュアル、コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1990）。プラスミドおよび酵母株構造すべての標準的なＤＮＡ操作は、サムブルック（Sambrook）などによる、１９８９、分子クローニング（Molecular Cloning）：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリプレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、において述べられるように実行された。ＳＶ４０初期プロモータおよび３ ′プロセッシング信号の制御下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子は、ura4フランキングＤＮＡ配列および野生型ura4遺伝子座での相同的な組換えを用いてS．pombeゲノムに組込まれた。ura4転写ユニットをフランキングするura4ＤＮＡ配列は、ｐＣＧ５（Ｊ．コーリ（J．Kohli）、ベルン大学（University of Bern）、ベルン（Bern）、スイス）から、１．８ｋｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして分離された(グリムなど、Mol．Gen．Genet．215: 81-86，1988)。このフラグメントは、ＤＮＡ重複酵素のクレノウフラグメントを用いて調整され、ブラント末端断片としてｐＮＥＢ１９４［ｐＮＥＢ１９３の変形］のＨｉｎｄＩＩ部位にサブクローニングされ（ニューイングランドバイオラブズ社(New England Bio labs Inc.,)、ベバリー(Beverly)、ＭＡ）、ここからポリリンカーにおけるＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位間の領域が削除されてｐＮＥＢ１９５を生成した。ＳＶ４０初期プロモータ、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子およびＳＶ４０初期遺伝子３′プロセッシング配列を含むｌａｃＺ発現カセットは、プラスミドｐＳＶβからサブクローニングされた（クロンテックラボラトリーズ社(Clontech Laboratories Inc.,)、パロアルト(Palo Alto)、ＣＡ）。ｐＳＶＢにおけるＳＶ４０プロモータへのＥｃｏＲＩ部位は調節されて、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩアダプタを挿入することによりＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んだ。次に上記のカセットがｐＮＥＢ１９５におけるura4Ｌの５′および３′の配列間でＨｉｎｄＩＩＩ断片としてサブクローニングされ、ＳＶ４０初期プロモータがura4の３′の断片に近接して位置する方向でプラスミドｐＮＥＢＤ２を生成した。ＰａｃＩ−Ｐｍｅ１の二重消化は、ura4配列によっていずれかの端部でフランキングされたｌａｃＺ発現カセットを放出した。この断片を用いてS．pombe株９７２（ｈ−）を形質転換し、５−ＦＯＡ耐性を利用してura4の遺伝子座の分断を行なった酵母形質転換細胞を同定した。推定構成要素は、ura4の遺伝子座の構造およびＳＶ４０初期プロモータにより駆動されるｌａｃＺ遺伝子の発現に関して特徴づけられた。S．pombeゲノムの染色体ＩＩＩにおけるura4の遺伝子座での組込まれたｌａｃＺ発現カセットの構造は、図１２の模型図（ｉ）（ii）に示されている。プラスミドｐＲＥＰ１（モンドレル、１９９０）が、ｌａｃＺアンチセンス遺伝子を含むプラスミドの構築のための発現ベクター、およびセンスコントロールとして用いられた。使用されたすべての断片は、独自のＢａｍＨＩ部位でｐＲＥＰ１にサブクローニングされ、図１２で図式的にそれを示した。長いｌａｃＺＢａｍＨＩ断片は、ＳＶ４０初期プロモータにより駆動されるｌａｃＺ発現カセットの−５６ないし＋３４１９の位置にまたがる。長いセンスコントロールプラスミドを構成するために、フレームシフト突然変異がｌａｃＺＢａｍＨＩ断片におけるベース＋９０９に導入された。この断片はＣｌａＩで線形化され、調整され、再び連結された。フレームシフトは、ＤＮＡ配列、およびｎｍｔ１プロモータに関しセンスオリエンテーションでｐＲＥＰ１にサブクローニングされたｌａｃＺＢａｍＨＩ断片によって確認された。このプラスミドはｐＧＴ６２を指定し、アンチセンスオリエンテーションにおいて長いｌａｃＺＢａｍＨＩ断片を含むｐＧＴ２に対するコントロールの役割を果たした。短い５′および３′のｌａｃＺの断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）そして鋳型としてｐＮＥＢＤ２プラスミドＤＮＡを用いて発生させた。短い５′の断片の増幅に対して使用されるプライマは、以下のとおりである。短い３′のＤＮＡ断片に対するこれらの配列は以下のとおりとなる。各場合において、ＢｇｌＩＩ制限部位が、増幅されたＤＮＡの断片の５′および３′末端双方に加えられた。短い５′の断片は−２９９ないし＋９１２の位置にまたがるのに対し、短い３′のＤＮＡはｌａｃＺ遺伝子のＴＡＡ停止コドンを＋３１４１として＋３０９３と＋３４５４との間に位置した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、ｐＳＰ７２（プロメガ社（Promega Corp.,）、マディソン(Madison)、ＷＩ）におけるＢｇｌＩＩ部位にクローニングされ、センスおよびアンチセンスオリエンテーション双方においてｐＲＥＰ１のＢａｍＨＩ部位にＢｇｌＩＩ断片としてサブクローニングされた。プラスミドの指定は以下のようになる。すなわちｐＧＴ５８（短い５′センス）、ｐＧＴ５９（短い５′アンチセンス）、ｐＧＴ６０（短い３′センス）、およびｐＧＴ６１（短い３′アンチセンス）となる。ルシフェラーゼ遺伝子を含む配列に特異的でないプラスミドコントロールｐＧＴ６８は、ｐＧＥＭ−ｌｕｃ（プロメガ社、マディソン、ＷＩ）のＳｔｕＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＲＥＰ１に連結するリンカーによって構築された。ＤＮＡ：ＲＮＡ分離およびハイブリッド形成全ゲノムＤＮＡは、ホフマン(Hoffman)およびウィンストン(Winston)により、 Gene 53: 659-667（1987）において述べられているように、ガラスビーズを用いてS．pombe 細胞から分離された。これらのＤＮＡサンプルは、染色体ＤＮＡのサザン分析およびプラスミドのコピー番号分析に用いられた。酵母の全ＲＮＡは標準的な手順を用いて精製された。核酸の電気泳動およびハイブリッド形成は、高速ハイブリッド形成溶液（クロンテックラボラトリーズ社(Clontech Laboratories Inc.,) 、パロアルト(Palo Alto)、ＣＡ）を用いてハイブリッド形成されたノーザンブロットを例外とし、サムブルック（Sambrook）などによる分子クローニング(Mol ecular Cloning)：実験室マニュアル、（コールドスプリングハーバーラボラトリプレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989）、において述べられているとおりである。プローブとして用いられたＤＮＡは、長いｌａｃＺＢａｍＨＩ断片およびｐＲＥＰ１におけるｎｍｔ１３′配列からの４０５ｂｐＢａｍＨＩ−ＰａｃＩ断片を含んでいた。ハイブリッド形成に用いられたすべてのＤＮＡプローブは、メガプライムラベリングキット（アマーシャムインターナショナル（Amersham International）、アマーシャム、ＵＫ）を用いて³²ｐ−標識づけされたものであった。放射性ハイブリッド形成信号がオートラジオグラフィーによって検出され、ホスホリマーガ（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリーズ（Blo- Rad Laboratories）、ハーキュール(Hercules)、ＣＡ）を用いて定量化された。 β−ガラクトシダーゼエンザイムアッセイ大腸菌ｌａｃＺ遺伝子コード化生成物、β−ガラクトシダーゼの酵素活性は、細胞透過法を用いて検定された（オースベル(Ausubel)など、分子生物学における現在のプロトコール（Current protocols in molecular biology）、グリーンパブリッシングアソシエートアンドウィリー−インターサイエンス（Green Publ ishing Associates and Wiley-Interscience）、ニューヨーク、1987）。S．pom be株９７２およびＮＣＹＣ１９１３に対し、１×１０⁸の細胞が、ＥＭＭまたは１０×１０⁷細胞／ｍｌの細胞密度までチアミンを含むＥＭＭ培地における酵母形質転換細胞の増殖に従ってβ−ガラクトシダーゼの活性について検定された。オースベルらによる、分子生物学における現在のプロトコル（グリーンパブリッシングアソシエートアンドウィリー−インターサイエンス、ニューヨーク、19 87）において述べられている式に従って計算された、各々の形質転換細胞および β−ガラクトシダーゼユニットについて３回検定が行なわれた。結果アンチセンスＲＮＡで仲介される遺伝子調整の分析に対し分裂酵母をモデルシステムとすることの適性を調べるために、大腸菌ｌａｃＺリポータ遺伝子がターゲットとして選択された。この遺伝子は、遺伝子生成物β−ガラクトシダーゼについての迅速で感度の高い溶液酵素アッセイが利用可能であるという利点をもたらし（オーステルなど、分子生物学における現在のプロトコール、グリーンパブリッシングアソシエートアンドウィリー−インターサイエンス、ニューヨーク、1987）、色素産生基質Ｘｇａ１を含む培地におけるS．pombeに青いコロニーの色を与える（クドラ(Kudla) 、Nucleic Acids Res．16: 8603-8617，1988）。大腸菌ｌａｃＺ遺伝子は、ＳＶ４０初期プロモータおよび３′プロセッシング配列の制御の下で、S．pombeにおいて低い構成レベルで発現された。この哺乳動物のウィルスのプロモータは、転写を哺乳動物の細胞で用いられた正確な部位から開始し、S．pombeにおいて効果的に機能することがわかっている（ジョーンズなど、Cell 53: 659-667，1988）。ｌａｃＺ遺伝子発現カセットはS．pombe染色体ＩＩＩに組込まれて安定したβ −ガラクトシダーゼ発現株を生成した。組込みは、ura4遺伝子座におけるＤＮＡ配列をura4でフランキングされたｌａｃＺ発現カセットと置換え、５−ＦＯＡ選択を用いて安定な構成要素を同定することによって行なわれた（図１２）。染色体が組込まれた１本鎖のコピープラスミドＤＮＡの組込みは、株β２−１から分離されたゲノムＤＮＡ（ｈ−，ura4：：ＳＶ４０−ｌａｃＺ）についてのサザン分析によって確認され、この株のura4遺伝子座の染色体構造は図１２に示されている。このｌａｃＺ遺伝子を含む株についての発現の分析によって、この株がｌａｃＺｍＲＮＡを発現し、検定された１×１０⁸の細胞につき平均１．８ユニットのβ−ガラクトシダーゼを生成したことが明らかにされた。エピソーム性の発現ベクターを用いて形質転換を容易にするために、ｌｅｕ１突然変異がＮＣＹＣ１９１４（ｈ＋，ｌｅｕ１−３２）と交差させることによってβ２−１に導入され、ランダムな子嚢胞子分離体ＫＣ４−６（ura4：：ＳＶ４０−ｌａｃＺ，ｌｅｕ１−３２）が同定された。この株は親の株β２−１と同様なレベルでβ−ガラクトシダーゼを発現することが示された。すべてのｌａｃＺアンチセンス遺伝子は、エピソーマルプラスミドｐＲＥＰ１（モンドレル、K．J．Biol．Chem．265: 10857-10864，1990)から、条件的なｎｍｔ１プロモータを用いて発現された。このプロモータは、０．５μＭを上回る濃度でチアミンが存在するところで抑制され、外因性のチアミンがないところで最大に抑制解除された(モンドレル，Ｋ．J．Biol．Chem．265: 10857-10864，19 90)。１組のアンチセンス遺伝子が構築されて、ターゲットメッセージの異なる領域に相補的な大きさの異なるアンチセンスＲＮＡを生成した（図１２）。長いｌａｃＺアンチセンス遺伝子は、５′の翻訳されていない配列の５６の塩基、ターゲットｍＲＮＡのコード領域全体、および３′の翻訳されていない領域の２８８の塩基に相補的であるアンチセンスＲＮＡを生成するように設計された。短いアンチセンス遺伝子は、ｌａｃＺｍＲＮＡの５′または３′末端のいずれかに相補的となるＲＮＡを生成するように設計された。コントロール発現プラスミドは、高レベルのｎｍｔ１プロモータにより駆動される転写のβ−ガラクトシダーゼ酵素レベルに対する非特異的な効果を調べるために構築された（図１２）。こうしたコントロールはアンチセンス遺伝子の各々に対するセンスオリエンテーション断片、およびセンスオリエンテーションにおける螢のルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた。長いｌａｃＺセンスコントロールプラスミドが、フレームシフト突然変異をｌａｃＺ遺伝子に導入して結果生じる何らかの遺伝子生成物のβ−ガラクトシダーゼ活性を排除することにより作られた。株ＮＣＹＣ１９１３（ｈ−，ｌｅｕ１−３２）のｐＧＴ６２プラスミド形質転換細胞についてのβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセイは、長いセンスコントロール遺伝子から生じた転写は活性β−ガラクトシダーゼに翻訳されていないことを確認した。ターゲット株ＫＣ４−６は、上記のプラスミド構造物各々で形質転換され、３つの独立した形質転換細胞が分析されてプラスミドに由来する遺伝子から発現されたＲＮＡ転写を検出した。ｎｍｔ１３′プロセッシング領域ＤＮＡ断片をプローブとして用いてノーザン分析が完了した。ｐＲＥＰ１についてのｎｍｔ１プロモータから生じたすべてのＲＮＡは、３′末端でｎｍｔ１メッセージの１４４の塩基を含む。図１３Ａは、各形質転換細胞が予期される大きさのＲＮＡ種を生成したことを示す。染色体がコードされたｎｍｔ１ｍＲＮＡに関する各々のＲＮＡ種の分析は、これらＲＮＡすべての発現レベルが類似することを示した。図１３Ｂは、ｌａｃＺアンチセンスＲＮＡの発現が条件的にはチアミンに依存し、長いｌａｃＺアンチセンスＲＮＡの発現レベルは、すべてのアンチセンスＲＮＡについてターゲットｌａｃＺｍＲＮＡの２０倍であることを示す。 β−ガラクトシダーゼ酵素アッセイを利用して、アンチセンスＲＮＡ合成の、ターゲットｌａｃＺ遺伝子発現に対する効果をモニタした（オースベルなど、分子生物学における現在のプロトコール、グリーンパブリッシングアソシエートアンドウィリー−インターサイエンス、ニューヨーク、1987）。各々のプラスミド構造物に対する３つの独立した形質転換細胞が、チアミンを含まない培地で増殖されてｎｍｔ１プロモータの抑制解除を行なった（図１４）。長いｌａｃＺアンチセンスＲＮＡを発現するS．pombeの細胞は、β−ガラクトシダーゼの活性において４５％の低減を示し、一方短い５′または短い３′の相補的な転写を発現する細胞は、それぞれ２０％および１０％少ないβ−ガラクトシダーゼの活性をもたらした。対照的に、センスオリエンテーション遺伝子断片を有するプラスミドを含むすべての形質転換細胞は、ｐＲＥＰ１形質転換細胞に匹敵するβ−ガラクトシダーゼの活性のレベルを示した。このことは、観察されたβ−ガラクトシダーゼの活性における減少は、ｌａｃＺアンチセンスＲＮＡが存在するためであり、遺伝子発現または細胞生理学に非特異的な干渉が起こるためではないことを示唆している。観察されたβ−ガラクトシダーゼの活性の低減はｌａｃＺアンチセンスＲＮＡ転写に依存することを確認するために、β−ガラクトシダーゼの活性を検定する前に、ｎｍｔ１プロモータを抑制または抑制解除する条件下で酵母形質転換細胞が増殖された。コントロールプラスミドｐＲＥＰ１または長いｌａｃＺアンチセンスプラスミドｐＧＴ２のいずれかを含む独立した形質転換細胞が、はじめにチアミンを含まない培地で増殖されてアンチセンスＲＮＡの発現をもたらし（ＯＮ；図１５）、チアミンを含む培地で増殖されてアンチセンスＲＮＡの生成を阻害した（ＯＦＦ；図１５）。チアミンのないところで増殖されたｌａｃＺアンチセンスプラスミドｐＧＴ２を含む細胞は、ｐＲＥＰ１形質転換細胞よりも４０％少ないβ−ガラクトシダーゼを生成した（図１５（Ａ））。チアミンがあるところで増殖された同じ培養からの細胞は、β−ガラクトシダーゼの活性のコントロールレベルを示した（図１５（Ｂ））。アンチセンスＲＮＡ調整の可逆性は、細胞を、チアミンを含まない培地（ＯＮ）からチアミンを含む培地（ＯＦＦ）へと移し、細胞を、チアミンを含む培地（ＯＦＦ）からチアミンを含まない培地（ＯＮ）へ移すことによって立証された。チアミンがない場合に４０％の低減を示したｐＧＴ２形質転換細胞は、チアミンが存在するところでβ−ガラクトシダーゼの活性の阻害を行なわないことを示した（図１５（Ｃ））。このことは、ｌａｃＺアンチセンスＲＮＡ転写を抑制することにより、ターゲット遺伝子の発現をコントロールｐＲＥＰ１形質転換細胞において観察されたのと同じレベルに戻すことが可能になることを示している。対照的に、チアミンが存在するところで増殖されたとき通常レベルのβ−ガラクトシダーゼを示したｐＧＴ２形質転換細胞は、チアミンを含まない培地で増殖されたときβ−ガラクトシダーゼの活性において５５％減少することが明らかになった（図１５（Ｄ））。この実験は、ｌａｃＺ遺伝子発現における減少は、ｌａｃＺアンチセンス遺伝子の転写に依存し、観察された可逆性によりターゲット遺伝子の再配置のようにさらなる遺伝的効果の組込みを排除することを確認した。このシステムにおけるアンチセンスＲＮＡ調整の効果をさらに評価するために、β−ガラクトシダーゼの活性の部分的な阻害が長いｌａｃＺアンチセンスＲＮＡによって調べられて、S．pombeにおけるｌａｃＺ遺伝子の発現に随伴する青いコロニーの色の表現型を調節することができるかどうかを判断した。ｌａｃＺアンチセンスプラスミドを含む細胞または適切なコントロールベクターが、各種濃度のＸｇａ１を含むチアミンの含まれていない培地に置かれた。３０℃での長期にわたるインキュベーションの後、長いｌａｃＺアンチセンスＲＮＡ発現細胞によって示される青色の表現型と、コントロールＲＮＡを発現するものとの間には質的な差は検出できなかった。結論として、S．pombeにおけるβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の５５％の低減では、目に見える細胞の表現型を変更するのには不十分である。しかしながら、スクリーニングプロセスにおいて表現型を読出すことはなおも重要なパラメータである。これは例５によって示された。例７ S．pombe株ＲＢ３−２のｌａｃＺ遺伝子のアンチセンスサプレッションはアンチセンスＲＮＡレベルに依存する株ＲＢ３−２は表１に示されるプラスミドの組合せで形質転換され、アンチセンスＲＮＡの予期される比率が各形質転換について示されている。各プラスミドの組合せに対する３つの独立した形質転換細胞は前述のように３回検定された。このデータは図１６にまとめられている。このデータは、ｌａｃＺターゲット遺伝子に対し、サプレッションのレベルはアンチセンスＲＮＡのレベルに依存することを示す。たとえば、およそ６５％という最高レベルのサプレッションが、２つのアンチセンスコードプラスミドでＲＢ３−２が形質転換されたときに生じている。プラスミドｐＲＥＰ４２およびｐＲＥＰ８２は、ｎｍｔ１プロモータの誘電体をコードし、そこで突然変異が導入された結果、転写のレベルが弱くなる。この明細書において述べられている発明は、具体的に述べられているもの以外の変形および修正形にも適用できることが当業者には認識されよう。本発明はこうしたすべての変形および修正形を含むことが理解されるべきである。本発明はまたこの明細書において個々にまたは集合的に引用されまたは示されたステップ、特徴、組成および化合物のすべて、ならびにこのステップまたは特徴２つ以上の組合せのすべてを含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アンディト，グレゴリー・マーティンオーストラリア、2021 ニュー・サウス・ウェールズ州、パディントン、ハンプドン・ストリート、６・ディ／８ (72)発明者アイザント，ジョナサン・ゴルダーオーストラリア、2063 ニュー・サウス・ウェールズ州、ノースブリッジ、ビオラ・クレセント、11

Claims

【特許請求の範囲】１．ターゲットとする遺伝子の発現またはターゲットとする遺伝子生成物の活性を阻害、低減またはさもなければ調整することができる分子を同定する方法であって、前記方法は、前記ターゲットとする遺伝子を発現することができるシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)の株を発生するステップと、S．pombeの前記株にテストされる前記分子の有効量を導入するステップと、前記ターゲットとする遺伝子の発現またはターゲットとする遺伝子の生成物の活性に対する前記分子の効果を判断するステップとを包含する、分子を同定する方法。２．テストされる分子は遺伝子配列である、請求項１に記載の方法。３．テストされる分子はペプチド、ポリペプチド、または化合物である、請求項１に記載の方法。４．遺伝子配列はターゲットとする遺伝子の全部または一部に関連するアンチセンス分子である、請求項２に記載の方法。５．遺伝子配列はターゲットとする遺伝子の全部または一部に関連するセンス分子である、請求項２に記載の方法。６．遺伝子配列はリボザイムである、請求項２に記載の方法。７．ターゲットとする遺伝子は、真核生物、原核生物またはウィルスを源とする外因性の遺伝子である、請求項１に記載の方法。８．ターゲットとする遺伝子は、真核生物、原核生物またはウィルスを源とする外因性の遺伝子のS．pombe相同物である、請求項１に記載の方法。９．真核生物の遺伝子は哺乳動物の遺伝子である、請求項７または８に記載の方法。１０．哺乳動物の遺伝子は、成長因子の全部または一部、サイトカイン、成長因子またはサイトカイン受容体または癌特異的遺伝子をコードする、請求項９に記載の方法。１１．真核生物の遺伝子は植物遺伝子である、請求項７または８に記載の方法。１２．ウィルスの遺伝子はＨＩＶまたは肝炎を源とするものである、請求項７または８に記載の方法。１３．ターゲットとする遺伝子またはその一部分は同定可能な信号を与えることができるリポータ分子をコードする遺伝子配列に融合される、請求項１に記載の方法。１４．リポータ分子は酵素であり、抗生物質耐性を付与し、化合物、蛍光原基質、蛍光タンパク質、化学発光化合物、ビオチノール化化合物、必須成長因子、細胞サイトカインタンパク質または細胞に規定の表現型を与える分子への耐性を付与する、請求項１３に記載の方法。１５．リポータ分子はアデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ、Ｎｅｏ、ＧＵＳ、ＣＡＴ、ＬＵＸあるいはＧＦＰまたはそれらの機能部分である、請求項１３に記載の方法。１６．リポータ分子はS．pombe相同物と異種遺伝子との融合リポータ分子である、請求項１３に記載の方法。１７．ターゲットとする遺伝子は内因性のS．pombeプロモータによって制御される、請求項１に記載の方法。１８．内因性のプロモータはS．pombe adhlプロモータである、請求項１７に記載の方法。１９．ターゲットとする遺伝子は外因性プロモータによって制御される、請求項１に記載の方法。２０．外因性プロモータはＳＶ４０プロモータである、請求項１９に記載の方法。２１．ターゲットとする遺伝子の発現を阻害、低減またはさもなければ調整することができる遺伝子配列を同定する方法であって、前記方法は、同定可能な信号を与えることができるリポータ遺伝子をさらに包含する遺伝子構造物において前記ターゲットとする遺伝子を発現することができるS．pombeの株を発生するステップと、S．pombeの前記株にテストされる遺伝子配列の有効量を導入するステップと、前記リポータ遺伝子の発現の阻害、低減またはその他の調整について検定するステップとを包含する、遺伝子配列を同定する方法。２２．テストされる遺伝子配列はターゲットとする遺伝子に関連するアンチセンス分子であり、５つ以上のヌクレオチドを包含する、請求項２１に記載の方法。２３．テストされる遺伝子配列は、リボザイム、三重螺旋、ＲＮＡ、トランス形優勢の突然変異ヌクレオチド、欠陥のある干渉ＲＮＡあるいはＤＮＡ、またはターゲットとする遺伝子に関連するセンス構造物である、請求項２１に記載の方法。２４．ターゲットへとする遺伝子は哺乳動物の遺伝子または哺乳動物の遺伝子の S．pombe相同物である、請求項２１に記載の方法。２５．哺乳動物の遺伝子は成長因子、サイトカイン、成長因子またはサイトカイン受容体の全部または一部をコードし、または癌特異的遺伝子である、請求項２４に記載の方法。２６．ターゲットとする遺伝子は植物を源とするものである、請求項２１に記載の方法。２７．ターゲットとする遺伝子はウィルスを源とする、請求項２１に記載の方法。２８．ウィルスはＨＩＶまたは肝炎のウィルスである、請求項２７に記載の方法。２９．リポータ遺伝子は酵素をコードし、抗生物質の耐性を付与し、化合物、蛍光原基質、蛍光タンパク質、化学発光化合物、ビオチノール化化合物、必須成長因子、細胞サイトカインタンパク質または細胞に規定の表現型を与える分子への耐性を付与する、請求項２１に記載の方法。３０．リポータ遺伝子はアデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードし、またはＮｅｏ、ＧＵＳ、ＣＡＴ、ＬＵＸあるいはＧＦＰであり、またはその機能部分である、請求項２１に記載の方法。３１．リポータ遺伝子はS．pombe相同物と異種遺伝子との融合リポータ分子である、請求項２１に記載の方法。３２．ターゲットとする遺伝子は内因性のS．pombeプロモータにより制御される、請求項２１に記載の方法。３３．内因性のプロモータはS．pombe adhlプロモータである、請求項２１に記載の方法。３４．ターゲットとする遺伝子は外因性プロモータにより制御される、請求項１に記載の方法。３５．外因性のプロモータはＳＶ４０プロモータである、請求項１９に記載の方法。３６．ターゲットとする遺伝子の発現またはターゲットとする遺伝子生成物の活性を阻害、低減またはさもなければ調整することができる分子のスクリーニングのためのインビボモデルシステムであって、前記インビボモデルシステムは、前記ターゲットとする遺伝子を発現することができるS．pombeの株を包含し、テストされる分子は前記S．pombeに導入され、前記ターゲットとする遺伝子の阻害、低減またはその他の調整についてスクリーニングされる、インビボモデルシステム。３７．テストされる分子は遺伝子配列である、請求項３６に記載のインビボモデルシステム。３８．テストされる分子はペプチド、ポリペプチドまたは化合物である、請求項３６に記載のインビボモデルシステム。３９．遺伝子配列はターゲットとする遺伝子の全部または一部に関連するアンチセンス分子である、請求項３７に記載のインビボモデルシステム。４０．遺伝子配列はターゲットとする遺伝子の全部または一部に関連するセンス分子である、請求項３７に記載のインビボモデルシステム。４１．遺伝子配列はリボザイムである、請求項３７に記載のインビボモデルシステム。４２．ターゲットとする遺伝子は、真核生物、原核生物またはウィルスを源とする外因性遺伝子である、請求項３６に記載のインビボモデルシステム。４３．ターゲットとする遺伝子は、真核生物、原核生物またはウィルスを源とする外因性遺伝子のS．pombe相同物である、請求項３６に記載のインビボモデルシステム。４４．真核生物遺伝子は哺乳動物の遺伝子である、請求項４２または４３に記載のインビボモデルシステム。４５．哺乳動物の遺伝子は、成長因子、サイトカイン、成長因子またはサイトカイン受容体または癌特異的遺伝子をコードする、請求項４４に記載のインビボモデルシステム。４６．真核生物遺伝子は植物遺伝子である、請求項４２または４３に記載のインビボモデルシステム。４７．ウィルス遺伝子はＨＩＶまたは肝炎を源とする、請求項４２または４３に記載のインビボモデルシステム。４８．ターゲットとする遺伝子またはその一部は、同定可能な信号を与えることができるリポータ分子をコードする遺伝子配列に融合される、請求項３６記載のインビボモデルシステム。４９．リポータ分子は酵素であり、抗生物質耐性を付与し、化合物、蛍光原基質、蛍光タンパク質、化学発光化合物、ビオチノール化化合物、必須成長因子、細胞サイトカインタンパク質または細胞に規定の表現型を与える分子への耐性を付与する、請求項４８に記載のインビボモデルシステム。５０．リポータ分子はアデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ、Ｎｅｏ、ＧＵＳ、ＣＡＴ、ＬＵＸあるいはＧＦＰ、またはその機能部分である、請求項４８に記載のインビボモデルシステム。５１．リポータ分子はS．pombe相同物と異種遺伝子との融合リポータ分子である、請求項４８に記載のインビボモデルシステム。５２．ターゲットとする遺伝子は内因性S．pombeプロモータより制御される、請求項３６に記載のインビボモデルシステム。５３．内因性プロモータはS．pombe adhlプロモータである、請求項５２に記載のインビボモデルシステム。５４．ターゲットとする遺伝子は外因性プロモータにより制御される、請求項３６に記載のインビボモデルシステム。５５．外因性プロモータはＳＶ４０プロモータである、請求項５４に記載のインビボモデルシステム。