DE10210284A1

DE10210284A1 - Verfahren zum Identifizieren von spezifischen RNA-Inhibitoren

Info

Publication number: DE10210284A1
Application number: DE2002110284
Authority: DE
Inventors: Martin Funk; Martin Rohrbach
Original assignee: Medigene AG
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2003-10-02
Also published as: WO2003076668A2; AU2003214103A1; AU2003214103A8; WO2003076668A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die geeignet sind, spezifisch die Expression eines Proteins oder die Wirkung einer Nukleinsäure zu inhibieren. Ferner betrifft die Erfindung eine für ein Toxin und ein Zielprotein oder eine Zielnukleinsäure kodierende RNA sowie deren Verwendung zur Identifizierung von spezifischen RNA-Inhibitoren.

Description

Substanzen, die geeignet sind, spezifisch die Expression eines Proteins ausgehend von einer RNA (meist einer mRNA) zu inhibieren oder die geeignet sind, spezifisch die Wirkung von RNAs zu inhibieren (spezifische RNA-Inhibitoren), können unmittelbar als Therapeutika eingesetzt werden. Die Wirkung derartiger spezifischer RNA-Inhibitoren beruht auf der sequenzspezifischen Interaktion mit der für das Protein oder die Nukleinsäure kodierenden RNA. Dadurch wird die Struktur und/oder die Funktion von kodierenden RNA-Sequenzen so verändert, dass die Expression des von der RNA ursprünglich kodierten Proteins oder die Wirkung der RNA gehemmt oder vollständig unterbunden wird. Ferner führt die sequenzspezifische Interaktion meist zu einem enzymatischen Abbau der RNA (Branch AD: A hitchhikers guide to antisense and non-antisense biochemical pathways. Hepatology 1996; 24: 1517-1529). Da die mRNA im Cytosol der Zelle im allgemeinen frei zugänglich ist, ist eine Inhibition der mRNA leichter als eine Blockierung der für die mRNA kodierenden DNA im Zellkern.

Im Stand der Technik bekannte spezifische RNA-Inhibitoren schließen beispielsweise Antisense Oligonukleotide, Ribozyme oder dsRNAs ein.

Unter "Antisense-Oligonukleotiden" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung kurzkettige Oligonukleotide, die über komplementäre Basenpaarung an entsprechenden Sequenzen der RNA binden und dadurch die Expression von Proteinen oder Nukleinsäuren inhibieren. Das Antisense-Oligonukleotid kann eine DNA, eine RNA oder eine modifizierte Nukleinsäure sein. Antisense- Oligonukleotide können intrazellulär exprimiert, oder aber auch synthetisch hergestellt und so modifiziert werden, daß eine ausreichende Stabilität gegenüber abbauenden Enzymen gewährleistet ist. Die wichtigste dieser Modifikationen ist die sogenannte Phosphorothioat-Modifikation. Dabei wird ein Sauerstoffatom im Phosphat durch ein Schwefelatom ersetzt. Darüber hinaus ist aber zum Beispiel auch eine Methoxy-Modifikation oder eine 2'-5'-Phosphatverknüpfung möglich (Usmann N. and Blatt L. M.; J. Clin. Invest. 2000 Nov; 106 (10): 1197-202).

Die theoretische Ermittlung der optimalen Nukleotidfolge und der Länge der Antisense-Oligonukleotide ist derzeit nicht möglich. Dies liegt u. a. an den vielfältigen, nicht vorhersagbaren Interaktionen der Oligonukleotide mit zellulären Proteinen und den nicht vorhersagbaren dreidimensionalen Überstrukturen der RNA- Moleküle (Campbell TB, McDonald CK, Hagen M; Nucleic Acids Res 1997; 25: 4985-4993; Dreyfuss G, Maturis JJ, Pinol-Roma S, Burd CG; Annu Rev Biochem 1993; 62: 289-321). Im Stand der Technik ist daher eine Vielzahl von Selektionssystemen beschrieben, mit denen basierend auf empirisch gewonnenen Daten Antisense-Oligonukleotide für einen bestimmten Zweck ausgewählt werden sollen. Derartige Selektionssysteme beruhen zumeist auf computergestützter RNA-Modellierung (Toschi N; Methods 2000; 22: 261-269) oder auf empirischen Analysen in vitro (Sriram B, Banerjea AC; Biochem J 2000; 352: 667-673) bzw. in Zellextrakten (Scherr M, Reed M, Huang CF, Riggs AD, Rossi JJ; Mol Ther 2000; 2: 26-38). Bei späteren Tests in Zellkultursystemen ergibt sich jedoch immer wieder, dass ein Großteil der ermittelten Antisense-Oligonuleotide unwirksam ist. Somit haben all diese im Stand der Technik bekannten Selektionssysteme gemein, dass mit ihnen wirksame Antisense-Oligonukleotide nicht befriedigend ermittelt werden können.

Doppelsträngige RNA (dsRNA) kann ebenfalls als RNA-Inhibitor eingesetzt werden. Der Begriff "dsRNAs" bezeichnet natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte doppelsträngige RNA-Sequenzen, die eine Interaktion mit zellulären RNA-Sequenzen initiieren und schließlich deren Degradation bewirken. Dabei muss ein Strang der dsRNA komplementär zu der Sequenz der zu inhibierenden RNA sein. Die Wirkung der dsRNA beruht wahrscheinlich darauf, dass die dsRNA zusammen mit der zu inhibierenden RNA eine Tripelhelix bildet, die dann in der Zelle abgebaut wird.

Die Identifizierung von dsRNA, die in Säugerzellen spezifisch wirksam ist, ist mit im Stand der Technik bekannten Verfahren nicht möglich (Elbashir et al. Nature 2001; 411: 494-498). Dies liegt unter anderem daran, dass es in Säugerzellen mindestens zwei Wirkungsmechanismen von dsRNA gibt, einen Sequenzspezifischen und einen unspezifischen. Kurze dsRNA führt in der Säugetierzelle zu sequenzspezifischer RNA-interference, die dazu führt, dass nur die zu inhibierende RNA abgebaut wird. Hingegen bewirkt längere dsRNA (mindestens 30 bp) generell die unspezifische Degradation sämtlicher RNA und die Inhibition der Proteinsynthese (Hunter et al. 1975, J Biol Chem 250; 409-417).

Somit beschreibt der Ausdruck "sequenzspezifische RNA-interference" einen Prozess, bei dem durch das Einbringen doppelsträngiger RNA-Sequenzen in eine Zelle eine sequenzspezifische Inhibition der Genexpression bewirkt wird. Dabei wird die dsRNA zunächst in kurze Sequenzen von 21-23 bp zerlegt, sogenannte siRNAs (short interference RNAs). Diese siRNAs lösen dann mit Hilfe zellulärer Enzyme den Abbau der mRNA aus, die homolog zu der jeweiligen siRNA ist.

Bei der Suche nach wirksamen kurzen dsRNA-Molekülen wird häufig die sequenzspezifische RNA-interference durch die unspezifische RNA-Degradation überdeckt, was eine Identifizierung wirksamer, spezifischer dsRNA-Moleküle stark erschwert oder unmöglich macht.

Ferner sind aus Ribonukleinsäuren (RNAs) aufgebaute Ribozyme bekannt, die in der Lage sind, Phosphodiesterbindungen spezifisch katalytisch zu spalten und zu verknüpfen. Damit können Ribozyme verwendet werden, um spezifisch RNA (meist mRNA) durch komplementäre Basenpaarung zu binden und anschließend mittels ihrer katalytischen Aktivität zu spalten. Somit wird die Translation der (m)RNA in das entsprechende Protein verhindert oder die Wirkung der RNA inhibiert.

Die Wirksamkeit von Ribozymen kann allerdings ebenfalls nicht vorhergesagt werden. Daher besteht in gleicher Weise die Notwendigkeit, neu synthetisierte Ribozyme auf ihre Wirksamkeit zu testen. Bisher sind jedoch auch für Ribozyme lediglich in vitro-Assays beschrieben worden (Lehman and Joyce; Curr Biol 1993; 3 (11): 723-34; Chapman and Szostak; Curr Opin Struct Biol 1994; 4: 618-22).

In der WO 95/29254 wird ein in vivo Verfahren in der Hefe Schizosaccharomyces pombe zum Screening nach wirksamen Antisense-Oligonukleotiden beschrieben, welche die Expression von Target-Proteinen inhibieren sollen. Dabei wird u. a. das für das Target-Protein kodierende Gen mit einem Reportergen fusioniert. Als mögliche Fusionspartner werden Antibiotika-Resistenzgene, Resistenzgene gegen chemische Substanzen, Fluoreszenzproteine, essentielle Wachstumsfaktoren und andere Reportergene genannt. Ziel ist es, Antisense-Oligonukleotide zu identifizieren, welche die Expression des Target-Proteins und damit des Reportergens inhibieren sollen. Sämtliche in der WO 95/29254 offenbarten Reportergene verschaffen der Zelle jedoch einen Vorteil (z. B. eine Antibiotikaresistenz) oder ermöglichen die Identifizierung der Zelle (z. B. durch Bildung eines fluoreszierenden Proteins). Dies führt dazu, dass Zellen, die ein wirksames Antisense- Oligonukleotid enthalten, entweder absterben oder nicht identifizierbar sind, mit dem Nachteil, dass aus diesen Zellen keine RNA mehr isoliert werden kann.

Das erfolgreiche Auffinden von RNA-Inhibitoren führt demnach in dem in der WO 95/29254 beschriebenen Verfahren zu einem negativen Ergebnis. Ein derartiger Negativnachweis ist jedoch für die verlässliche Identifizierung von Inhibitoren ungeeignet, da häufig die Empfindlichkeit des Testsystems zur Unterscheidung zwischen positiven und negativen Ergebnissen nicht ausreicht. Wird beispielsweise ein Reportergen ohnehin nur schwach exprimiert, so sind nach Inhibitorzugabe - und somit einer noch weiter abnehmenden Expression - häufig keine eindeutigen Aussagen über eine erfolgreiche Inhibition möglich.

Ein weiterer Nachteil dieses Screening-Systems ist, dass der Verlust der Expression eines Reportergens nicht nur auf die Wirkung des RNA-Inhibitors zurückzuführen sein könnte. Ursache könnte auch die Beeinflussung anderer zellulärer Prozesse sein, wie beispielsweise eine Wirkung des potentiellen Inhibitors auf Proteine, die an der Translation, Translokation und Proteinprozessierung beteiligt sind. Diese Wirkung könnte mittelbar auch die Expression des Reporterproteins beeinflussen. Gleichzeitig kann der Inhibitor auch auf Replikationsmechanismen und den Zellzyklus direkt wirken und somit das Wachstum der Zelle hemmen oder generell eine cytotoxische Wirkung aufweisen. Zusammengefasst weist somit ein Nachweisverfahrens, das auf einem Negativnachweis beruht, aufgrund des unklaren Wirkungsorts des Inhibitors grundsätzlich eine mangelnde Spezifität auf.

Das in der WO 9529254 beschriebene Verfahren, das im übrigen lediglich ein für die Hefe Schizosaccharomyces pombe spezifisches Verfahren darstellt, ist damit für die effektive Identifizierung von Antisense-Oligonukleotiden nicht geeignet.

Damit sind im Stand der Technik keine befriedigenden Verfahren bekannt, mit denen spezifische RNA-Inhibitoren verlässlich identifiziert werden können. Derartige Verfahren sind jedoch unabdingbare Voraussetzung für das Auffinden spezifischer RNA-Inhibitoren.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem spezifische RNA-Inhibitoren effizient identifiziert werden können. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Substanzen bereitzustellen, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können.

Gemäß eines Gegenstandes der Erfindung wird die Aufgabe durch ein Verfahren zum Identifizieren von spezifischen RNA-Inhibitoren gelöst, gekennzeichnet durch die Schritte:

a) Einbringen mindestens eines Typs einer für mindestens ein Toxin und für mindestens ein Zielprotein, eine Zielnukleinsäure oder für Teile mindestens eines Zielproteins oder mindestens einer Zielnukleinsäure kodierenden Nukleinsäure (Fusionsgen) in eine Zelle, wobei ausgehend von dem Fusionsgen eine RNA gebildet werden kann, die sowohl für das Toxin als auch für das Zielprotein oder die Zielnukleinsäure oder Teile davon kodiert (mRNA1);
b) Einbringen eines oder mehrerer spezifischer RNA-Inhibitoren in die Zelle, wobei die Schritte a) und b) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden können;
c) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, die
- a) die Bildung der mRNA1 ermöglichen und
- b) die zur Expression des Toxins ausgehend von der mRNA1 geeignet sind;
d) Bestimmen der Vitalität der Zelle, wobei die Vitalität der Zelle ein Maß für die Toxinbildung darstellt, die durch den spezifischen RNA-Inhibitor inhibierbar ist.

Die vorliegende Erfindung stellt damit erstmals ein Verfahren bereit, bei dem die Wirksamkeit potentieller RNA-Inhibitoren anhand ihrer Fähigkeit bestimmt wird, die Expression eines mit dem kodierenden Bereich des Zielproteins oder der Zielnukleinsäure fusionierten Toxins zu inhibieren. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht somit auf dem Prinzip der positiven Selektion: In Zellen, die wirksame RNA-Inhibitoren enthalten, kann das Toxin seine Wirkung nicht entfalten, da diese die Expression des Toxins inhibieren. Diese Zellen können überleben und wachsen, wohingegen Zellen, die keine wirksamen RNA-Inhibitoren enthalten, absterben oder drastisch in ihrem Wachstum gehemmt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass die beteiligten Moleküle in gleicher Form, d. h. mit korrekter Faltung und gleicher Modifikation und oder Interaktion mit zellulären Faktoren, wie in der später zu therapierenden Säugetierzelle vorliegen und dass somit die in vivo Situation des Einsatzes von spezifischen RNA- Inhibitoren korrekt wiedergespiegelt wird.

Somit ermöglicht es die vorliegende Erfindung, wirksame RNA-Inhibitoren, insbesondere Antisense-Oligonukleotide, Ribozyme oder dsRNAs in einem universellen in vivo-Verfahren gezielt zu identifizieren. Besonders vorteilhaft ist dabei, dass auch mehrere Substanzen für ein grobes Screening zunächst gleichzeitig getestet werden können, bevor einzelne geeignete Moleküle identifiziert werden. Außerdem kann das Verfahren aufgrund des positiven Selektionsprinzips auch in einem Multiplex-Setup für mehrere Targets durchgeführt werden. Ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass die Isolierung der aktiven RNA-Inhibitoren aus den Zellen möglich ist.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in Abb. 1 dargestellt.

Unter dem Begriff "spezifische RNA-Inhibitoren" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung Substanzen, welche die Struktur und/oder Funktion von kodierenden RNA-Sequenzen so verändern, dass die Expression des von der RNA kodierten Proteins oder die Wirkung der RNA gehemmt oder vollständig unterbunden wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die spezifischen RNA-Inhibitoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antisense- Oligonukleotiden, Ribozymen und dsRNA. Erfindungsgemäß können auch Moleküle, die Antisense-Oligonukleotide fusioniert mit Ribozymen oder tRNA fusioniert mit Ribozymen umfassen, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens getestet werden.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird mindestens ein Typ einer Nukleinsäure in eine Zelle eingebracht, die für mindestens ein Toxin und mindestens ein Zielprotein oder eine Zielnukleinsäure oder Teile davon kodiert. Diese Nukleinsäure wird im folgenden als Fusionsgen bezeichnet.

Bevorzugt werden 1 bis 5 unterschiedliche, besonders bevorzugt 1 bis 3, und ganz besonders bevorzugt 1 Fusionsgen in die Zelle eingebracht.

Bevorzugt kodiert das Fusionsgen für 1 bis 5 Toxine, bevorzugt für 1 bis 3 Toxine und ganz besonders bevorzugt für 1 Toxin.

Bevorzugt kodiert das Fusionsgen für 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3, Zielproteine, Zielnukleinsäuren oder für Teile von 1 bis 5, insbesondere 1 bis 3, Zielproteinen oder Zielnukleinsäuren.

Ganz besonders bevorzugt kodiert das Fusionsgen für ein Zielprotein, eine Zielnukleinsäure oder für Teile eines Zielproteins oder einer Zielnukleinsäure.

Das durch das Fusionsgen kodierte Toxin schließt erfindungsgemäß jegliches Toxin ein, das in der Lage ist, eine Funktion der Zelle zu inhibieren oder abzuschwächen. Derartige Funktionen schließen beispielsweise die Zellproliferation, das Zellwachstum, oder die chemische Umsetzung von Molekülen wie Spaltung von Molekülen ein.

Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Toxinen bekannt, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können, wie beispielsweise Diphterietoxin, Choleratoxin, Pertussistoxin, Enterotoxin, Botulinustoxin C2, Botulinustoxin C3, Shigatoxin, Verotoxine, Tetanustoxin, RNase T1, RNase III.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform inhibiert oder schwächt das Toxin die Zellproliferation. Dabei sind auch jene Toxine eingeschlossen, welche die Zellen abtöten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kodiert das Fusionsgen für ein reversibles Toxin. Erfindungsgemäß bezeichnet der Ausdruck "reversibles Toxin" oder "Toxin mit reversibler Wirkung" ein Toxin, das effizient und langfristig die Proliferation von Zellen hemmt, ohne die Zelle abzutöten oder schwer zu schädigen. Die Wirkung des Toxins kann also wieder aufgehoben werden, so dass nach Wegfall der Expression des Toxins die Zellen wieder rasch zu proliferieren beginnen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das reversible, durch das Fusionsgen kodierte Toxin mindestens zwei Nukleasen.

Im Rahmen der Erfindung bezeichnen "Nukleasen" Proteine mit Nukleaseaktivität, und zwar sowohl Exonukleasen als auch Endonukleasen, insbesondere Restriktionsendonukleasen. Natürlich vorkommende Nukleasen, die sich für eine erfindungsgemäße Verwendung als reversibles Toxin eignen, sind beispielsweise aus Bakterien, Pilzen und Säugetieren bekannt. Zu diesen Nukleasen zählen DNAsel, EcoRI, RNAse T1 RNAse III (Wang X. et al. Nucleic Acids Res. (2001) 29, 1643-1950; Barnes G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 1354-8; Fujii, T. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. (1995) 59, 1869-74).

Der Begriff "Nuklease" schließt auch funktionelle Varianten natürlich vorkommender Nukleasen ein, die ebenfalls eine Nukleaseaktivität zeigen. Dies kann beispielsweise ein Protein mit einer Proteinsequenz sein, die zu derjenigen von natürlichen, in Bakterien, Pilzen und Säugetieren vorkommenden Nukleasen homolog ist, wobei die Homologie auf Aminosäureebene mindestens zirka 30%, bevorzugt mindestens zirka 50%, mindestens zirka 60%, mindestens zirka 70% oder mindestens zirka 80% beträgt und besonders bevorzugt mindestens zirka 90% beträgt. Desweiteren umfasst der Begriff "Nukleasen" auch funktionelle Varianten mit Nukleaseaktivität, die im Vergleich zu natürlich vorkommenden Nukleasen eine oder mehrere Mutationen, Insertionen und/oder Deletion einzelner oder mehrerer Aminosäuren enthalten. Erfindungsgemäße Deletionen umfassen dabei bevorzugt 1-50 Aminosäuren, insbesondere 1-20 Aminosäuren und besonders bevorzugt 1-10 Aminosäuren. Die Eignung einer Nuklease zur Verwendung im Rahmen eines reversiblen Toxins läßt sich ohne weiteres durch die Expression der Nuklease unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors bestimmen. Für den Test des reversiblen Toxins eignet sich beispielsweise bei Verwendung von S. cerevisiae der MET25- oder GAL1-Promotor und bei Verwendung von Säugetierzellen ein Tetrazyklin induzierbarer Promotor. Eine geeignete funktionelle Variante einer Nuklease zeigt beispielsweise bei Expression unter Kontrolle eines geeigneten induzierbaren Promotors mindestens zirka 20%, mindestens zirka 50%, mindestens zirka 100% und besonders bevorzugt mindestens zirka 200% der Inhibition des Zellwachstums der natürlichen Nuklease, von der sie abgeleitet ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die mindestens zwei Nukleasen kovalent oder nicht-kovalent miteinander verbunden. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass durch die Verbindung mindestens zweier Nukleasen eine noch bessere Unterdrückung der Proliferation als lediglich durch deren gleichzeitige Expression erzielt werden kann. Dabei kann die Verbindung erfindungsgemäß über jeden Aminosäurerest der Nukleasen erfolgen. Besonders bevorzugt ist hierbei eine Verknüpfung von N- und N-Terminus, C- und N- Terminus und/oder C- und C-Terminus der jeweiligen RNasen. Beispiele für kovalente oder nicht-kovalente Verknüpfung von Proteinen sind dem Fachmann bekannt (Holst H. U. et al., Eur. J. Hum. Genet. 2001 Nov; 9 (11): 815-22; Akgul, C. et al., FEBS Lett. 2000 Jul 28; 478 (1-2): 72-6; Katz B. Z. et al., Biotechniques 1998 Aug.; 25 (2): 298-302, 304; Chan F. K. et al., Cytometry 2001 Aug. 1; 44 (4): 361-8).

Erfindungsgemäß können die Nukleasen direkt oder über einen Linker miteinander verbunden sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleasen über einen Linker kovalent aneinander gebunden. Dabei umfasst gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein derartiger Linker eine Aminosäurekette von ca. 1 bis ca. 50 Aminosäure Länge. Ein derartiger Linker hat beispielsweise die Aufgabe, die Nukleasen räumlich zu trennen oder die korrekte Faltung des Fusionsproteins aus den mindestens zwei Nukleasen zu ermöglichen. Deshalb umfasst der Linker in einer bevorzugten Ausführungsform in erster Linie Alaninreste, wodurch eine große Flexibilität der zwischen den Fusionsproteinen bestehenden Linkerverbindung gewährleistet wird.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen enthält das reversible Toxin mindestens zwei DNAsen, mindestens zwei RNAsen oder mindestens eine DNAse und mindestens eine RNAse.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das reversible Toxin als Nukleasen ausschließlich DNAsen oder RNAsen.

In einer besonderen Ausführungsform enthält das reversible Toxin RNase T1 und RNase III (Nicholson, A. W., supra) und/oder funktionelle Varianten davon, wobei die RNase T1 (Fujii, T. et al., supra) vorzugsweise aus Aspergillus oryzae und die RNase III vorzugsweise aus Escherichia coli stammt.

Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass ein reversibles Toxin, das die RNAse T1 und/oder funktionelle Varianten davon N-terminal und die RNAse III und/oder funktionelle Varianten davon C-terminal enthält, besonders effizient das Wachstum von Zellen hemmen kann. Die Erfindung betrifft daher vorzugsweise ein reversibles Toxin, bei dem die RNAase T1 und/oder funktionelle Varianten davon N-terminal und die RNAse III und/oder funktionelle Varianten davon C- terminal auf einem Polypeptid angeordnet sind.

In einer weiteren Ausführungsform enthält das reversible Toxin als eine weitere Komponente ein Protein ohne Nukleaseaktivität, insbesondere Proteine wie Proteasen, porenbildende Enzyme, und/oder modifizierende Enzyme (wie z. B. ADP- ribosylierende Enzyme (z. B. Pertussis- oder Choleratoxin), glykosylierende und/oder phosphorylierende Enzyme).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das reversible Toxin als weitere Komponente eine Substanz, welche die Sensitivität von Zellen gegenüber der Nuklease-Aktivität, insbesondere der RNAse Aktivität, erhöht. Dies ist insbesondere in Fällen vorteilhaft, in denen die Nuklease-Wirkung nur schwach ist.

Erfindungsgemäß kodiert das Fusionsgen für ein Zielprotein und/oder eine Zielnukleinsäure oder für Teile davon.

Unter dem Begriff "Zielprotein" ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Protein zu verstehen, dessen Expression durch die Wirkung des spezifischen RNA-Inhibitors gehemmt werden soll. Unter dem Begriff "Zielnukleinsäure" ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine RNA zu verstehen, deren Wirkung durch die Wirkung des spezifischen RNA-Inhibitors inhibiert werden soll.

Erfindungsgemäß ist ebenfalls eingeschlossen, dass das Fusionsgen für Teile des Zielproteins oder der Zielnukleinsäure kodiert. Dabei hat der Teil des Zielproteins eine Länge von mindestens 5 Aminosäuren, bevorzugt 10 Aminosäuren und besonders bevorzugt 15 Aminosäuren. Der Teil der Zielnukleinsäure hat eine Länge von mindestens 15 Nukleinsäuren, bevorzugt 30 Nukleinsäuren und besonders bevorzugt 45 Nukleinsäuren.

Erfindungsgemäß können in dem Fusionsgen die für das Toxin und die für das Zielprotein oder/und die Zielnukleinsäure kodierenden Nukleinsäureabschnitte beliebig angeordnet sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure kodierend für das Zielprotein und/oder die Zielnukleinsäure N-terminal und die Nukleinsäure kodierend für das Toxin C-terminal auf dem Fusionsgen angeordnet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Fusionsgen zusätzlich ein Reportergen. Dies bietet den Vorteil, dass die Wirkung potentieller spezifischer RNA-Inhibitoren zusätzlich anhand des Fehlens des Reportergen- Signals untersucht werden kann. Ferner kann anhand des Reportergens sichergestellt werden, dass die Zellen das Toxin exprimieren. Dabei wird unter einem Reportergen ein Gen verstanden, das für ein Protein kodiert, dessen Expression durch geeignete Tests oder auf andere Weise nachgewiesen werden kann. Ein Beispiel dafür ist ein fluoreszierendes Protein (z. B. GFP) (Chalfie, M., et al., Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression" Science, 263: 802 (1994); von Roessel, P. et al., Nat. Cell. Biol. 2002 Jan; 4 suppl 1:E15-20; Haseloff, J. et al., Methods Mol. Biol. 1999; 122: 241-59; Matus A.; Trends Cell Biol. 2001 May; 11 (5): 183; Hadjantonakis, A. K. et al., Histochem. Cell. Biol. 2001 Jan; 115 (1): 49-58)

Geeignete Reportergene schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf BFP, CFP, GFP, YFP, His3, CAT, GUS LacZ oder Luciferase (Welsh S. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 1997 Oct; 8) 5): 617-22; Naylor L. H., Biochem. Pharmacol. 1999 Sept 1; 58 (5): 749-57; Schenborn E. et al., Mol. Biotechnol. 1999 Nov; 13 (1): 29-44).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Fusionsgen Bestandteil eines Vektors. Dabei wird unter Vektor jegliche DNA (gegebenenfalls kombiniert mit anderen Substanzen wie Proteinen) verstanden, in die das Fusionsgen ligiert werden kann und die dem Einschleusen und/oder der Vermehrung der DNA in einer Zelle dient.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor ein Plasmid oder ein Virus, insbesondere ein rekombinantes Adenovirus. Geeignete Plasmide und Vektoren sind dem Fachmann bekannt (Altschuh et al., Current Protokols in Molecular Biology; Molecular Cell Biology, Lodish H. et al., Fourth Edition W. H. Freeman; Presutti C. and Santoro B.; Ann Ist Super Sanity 1991; 27 (1): 105-14; Benihoud K. et al.,; Curr. Opion. Biotechnol. 1999 Oct; 10 (5): 440-7; Kovesdi I. et al.; Curr. Opion. Biotechnol. 1997 Oct; 8 (5): 583-9).

Erfindungsgemäß wird das Fusionsgen in eine Zelle eingebracht. Als Zelle ist jegliche eukaryotische Zelle geeignet, in der ausgehend von dem Fusionsgen eine RNA gebildet werden kann, die sowohl für das Toxin als auch für das Zielprotein oder die Zielnukleinsäure oder Teile davon kodiert (mRNA1) und in der das Toxin exprimiert werden kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Hefezelle, bevorzugt S. cerevisae, gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt die Zelle aus einer immortalisierten Zelllinie, insbesondere einer Säugerzelllinie. Die Zelle kann aber auch aus einer Primärkultur eukaryotischer Zellen, insbesondere Säugerzellen stammen. Geeignete Hefezellen, eukaryotische Zellen oder immortalisierte Zelllinien sind dem Fachmann bekannt. (Molecular Biology of the Cell, 3^rd edn., 1994, Alberts at al.)

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Herzzelle. Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die Zelle aus einer Zelllinie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HELA-Zellen, COS-Zellen, CHO-Zellen, 3T3-Zellen, L-Zellen, Jurkat-Zellen, BHK-Zellen und HEK-Zellen (American Type Culture Collection (ATTC)-Katalog, Manassas, VA, USA).

Das Fusionsgen kann, ob in einen Vektor eingebaut oder nicht, auf jede dem Fachmann bekannte Art in die Zelle eingebracht werden (Altschuh et al., supra). Derartige Verfahren schließen beispielsweise Lipofektion, Elektroporation, oder Calciumphosphat-vermittelte Transfektion ein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der spezifische RNA-Inhibitor dadurch in die Zelle eingebracht, dass eine für ihn kodierende Nukleinsäure in die Zelle eingebracht wird. Diese Nukleinsäure kann erfindungsgemäß eine DNA oder eine RNA sein, bevorzugt ist sie eine DNA. Bezüglich der Verfahren, mit denen die Nukleinsäure in die Zelle eingebracht werden kann, wird auf die oben aufgeführten Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen verwiesen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die für den spezifischen RNA-Inhibitor kodierende Nukleinsäure Bestandteil eines Vektors. Bezüglich der Definition des Vektors wird auf die oben aufgeführten Ausführungen zu Vektoren verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor, der die für den spezifischen RNA-Inhibitor kodierende Nukleinsäure enthält, zusätzlich ein Reportergen. Bezüglich des Reportergens wird auf die obigen Ausführungen zu Reportergenen verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Reportergen, das in dem das Fusionsgen enthaltenden Vektor enthalten ist, verschieden von dem Reportergen, das in dem Vektor enthalten ist, der die für den spezifischen RNA- Inhibitor kodierende Nukleinsäure enthält. Dies ermöglicht eine Kontrolle der Expression des spezifischen RNA-Inhibitors unabhängig von der Bildung der mRNA1 und der Expression des Toxins.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Schritte a) und b) erfindungsgemäß gleichzeitig ausgeführt werden, d. h. das Fusionsgen und die potentiellen spezifischen RNA-Inhibitoren und/oder die dafür kodierenden Nukleinsäuren werden gleichzeitig in die Zelle eingebracht. Dadurch wird gewährleistet, dass die spezifischen RNA-Inhibitoren ihre Wirkung bereits entfalten können, bevor das Toxin überhaupt exprimiert wird, so dass im Falle wirksamer spezifischer RNA-Inhibitoren eine Schädigung von vorneherein vermieden wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform wird insbesondere verhindert, dass die Zelle durch die Expression des Toxins geschädigt wird, bevor die spezifischen RNA- Inhibitoren wirksam werden können.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt. Diese Ausführungsform ist insbesondere dann bevorzugt, wenn als Toxin ein Toxin mit reversibler Wirkung eingesetzt wird und wenn beabsichtigt ist, viele potentielle spezifische RNA-Inhibitoren gleichzeitig zu testen. Diese Ausführungsform ermöglicht es, ein Testsystem vorzubereiten, welches das Fusionsgen enthaltende Zellen umfasst, in die dann die einzelnen potentiellen spezifischen RNA-Inhibitoren eingebracht werden können.

Erfindungsgemäß wird die Zelle unter Bedingungen kultiviert, welche die Bildung der mRNA1 ermöglichen und die zur Expression des Toxins ausgehend von der mRNA1 geeignet sind. Derartige Bedingungen hängen jeweils von dem bestimmten Fusionsgen ab und sind dem Fachmann bekannt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Bildung der mRNA1 durch konstitutive oder regulierbare Promotoren kontrolliert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Expression des spezifischen RNA-Inhibitors durch konstitutive oder regulierbare Promotoren kontrolliert.

Dabei kann die Kontrolle der Bildung der mRNA1 und die Kontrolle der Expression des spezifischen RNA-Inhibitors gemeinsam oder unabhängig voneinander erfolgen. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt und können mittels dem Fachmann bekannten Techniken in die jeweiligen Vektoren eingebracht werden (Altschuh et al., supra).

Gemäß besonders bevorzugter Ausführungsformen wird die Bildung der mRNA1 und die Expression des spezifischen RNA-Inhibitors durch einen regulierbaren Promotor gesteuert und kann durch einen Transkriptionsfaktor induziert werden. Dabei sind induzierbare Promotoren sowie die dazugehörenden Transkriptionsfaktoren dem Fachmann bekannt (Harvey D. M. and Caskey C. T.; Curr. Opin. Chem. Biol. 1998 Aug; 2 (4): 512-8)

Diese Induktion geschieht vorzugsweise derart, dass die Nukleinsäure kodierend für den Transkriptionsfaktor in die Zelle eingebracht wird und die Zelle unter Bedingungen inkubiert wird, die zur Expression des Transkriptionsfaktors führen. Derartige Bedingungen sind dem Fachmann bekannt (Mumberg et al. 1994; Nucleic Acids Res. 22; 5767; Mumberg et al. 1995; Gene 156; 119; Rönicke et al. 1997; Methods Enzymol. 283; 313; Laugwitz et al. 1999; Circulation 99; 925-933; Schöneberg et al. 1997; J. Clin. Invest. 100 (6): 1547-1556; Hajjar et al. 1997; Circulation Research 81: 145-153). Bezüglich der Verfahren, mit denen die Nukleinsäure in die Zelle eingebracht werden kann, wird auf die oben aufgeführten Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen verwiesen.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die für den Transkriptionsfaktor kodierende Nukleinsäure Bestandteil eines Vektors. Bezüglich der Definition des Vektors sowie der besonders bevorzugten Vektoren wird auf die oben aufgeführten Ausführungsformen zu Vektoren verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Der Vektor, der die Nukleinsäure kodierend für den Transkriptionsfaktor enthält, kann zusätzlich ein Reportergen enthalten, wobei dieses Reportergen vorzugsweise nicht das gleiche ist wie das Reportergen, das in den anderen Vektoren enthalten ist. Dadurch ist es möglich, die Expression des Transkriptionsfaktors anhand eines spezifischen Reportergen-Signals zu evaluieren. Bezüglich des Reportergens wird auf die obigen Ausführungsformen verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt und im Anschluß an Schritt b) wird die Bildung der mRNA1 induziert. Durch die kontrollierte Induktion der Expression des Nukleinsäurekonstrukts wird verhindert, dass die Zelle vor Einwirkung der potentiellen spezifischen RNA-Inhibitoren durch das Toxin geschädigt wird.

Erfindungsgemäß wird die Wirksamkeit des spezifischen RNA-Inhibitiors anhand der Vitalität der Zelle bestimmt. Unter "Vitalität" wird erfindungsgemäß die Fähigkeit der Zelle zum Überleben und zum Wachsen und Proliferieren verstanden. Verfahren zum Bestimmen der Vitalität sind dem Fachmann bekannt (Saraste A. and Pulkki K.; Cardiovasc. Res. 2000 Feb; 45 (3): 528-37; Loo D. T, and Rillema J. R.; Methods Cell. Biol. 1998; 57: 251-64; Witte S.; Dtsch Med. Wochenschr. 1967 Sept 29; 92 (39): 1777-81; Darzynkiewicz Z. et al.; Semin. Hematol. 2001 Apr.; 38 (2): 179-93). Bei Hefezellen wir häufig eine Messung der optischen Dichte durchgeführt.

Eine Zelle, die einen wirksamen spezifischen RNA-Inhibitor enthält, zeigt erfindungsgemäß eine höhere Vitalität als Zellen, die keinen wirksamen oder einen weniger wirksamen RNA-Inhibitor enthalten. Alternativ kann auch eine Gruppe von Zellen mit einem bereits bekannten, wirksamen RNA-Inhibitor als Standard herangezogen werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Proliferationsrate der Zellen als Maß für die Vitalität genommen. Verfahren zum Messen der Proliferationsrate sind dem Fachmann bekannt (Saraste A. and Pulkki K.; Cardiovasc. Res. 2000 Feb; 45 (3): 528-37; Loo D. T, and Rillema J. R.; Methods Cell. Biol. 1998; 57: 251-64; Witte S.; Dtsch Med. Wochenschr. 1967 Sept 29; 92 (39): 1777-81; Darzynkiewicz Z. et al.; Semin. Hematol. 2001 Apr.; 38 (2): 179-93).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure kodierend für ein Toxin und ein Zielprotein oder eine Zielnukleinsäure. Diese Nukleinsäure wird im folgenden als Fusionsgen bezeichnet und ist insbesondere im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbar.

Bezüglich der Definitionen wird auf die Ausführungen zu dem Fusionsgen im Rahmen der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Fusionsgen ferner einen konstitutiven oder regulierbaren Promoter. Bezüglich der Definitionen hinsichtlich des Promotors wird auf die Ausführungen im Rahmen der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Fusionsgen ferner zusätzlich ein Reportergen. Bezüglich der Definitionen hinsichtlich des Reportergens wird auf die Ausführungen im Rahmen der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Fusionsgen Bestandteil eines Vektors. Bezüglich der Definitionen hinsichtlich des Vektors wird auf die Ausführungen im Rahmen der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das erfindungsgemäße Fusionsgen für ein Toxin mit reversibler Wirkung. Bezüglich der Definitionen hinsichtlich des reversiblen Toxins wird auf die Ausführungen im Rahmen der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwiesen. Die bevorzugten Ausführungsformen sind wie oben definiert.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Zelle enthaltend das erfindungsgemäße Fusionsgen. Dabei sind die bevorzugten Ausführungsformen der Zelle wie oben im Rahmen der Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren definiert.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Testsystem enthaltend die erfindungsgemäße Zelle. Dabei ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform das Testsystem derart gestaltet, dass es das parallele Testen einer Vielzahl von potentiellen spezifischen RNA-Inhibitoren ermöglicht.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die im Testsystem enthaltene Zelle eine Hefezelle.

Gemäß einer besonders bevorzugen Ausführungsform des Testsystems ist die Expression des Toxins durch einen regulierbaren Promotor (s. o.) regulierbar. Mit Hilfe des Testsystems kann beispielsweise eine Antisense-Genbank (z. B. shotgun library) getestet werden. Vorzugsweise liegt das Testsystem in Mikrotiterplatten vor.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure zum Auffinden spezifischer RNA-Inhibitoren. Dabei sind die bevorzugten Ausführungsformen wie oben definiert.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, enthaltend eine für ein Toxin kodierende Nukleinsäure und mindestens eine zur Klonierung geeigneten Restriktionsschnittstelle, insbesondere eine multiple Klonierungsstelle oder eine Rekombinationskassette, zum Auffinden spezifischer RNA-Inhibitoren. Bezüglich des Toxins und der spezifischen RNA- Inhibitoren sind die bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendung wie oben im Rahmen der Ausführungen zu dem erfindungsgemäßen Verfahren definiert.

Unter einer "zur Klonierung geeigneten Restriktionsschnittstelle" ist im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Restriktionsschnittstelle zu verstehen, die sich an einer geeigneten Stelle des Nukleinsäurekonstrukts befindet. Unter einer "geeigneten Stelle" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Stelle in der Sequenz des Nukleinsäurekonstrukts, an der die Nukleinsäuresequenz kodierend für das Zielprotein oder die Zielnukleinsäure (zu den Definitionen s. oben) derart eingebracht werden kann, dass die Expression des so entstandenen Fusionsgens gewährleistet ist. Bevorzugt sind die Restriktionsschnittstellen 5' von dem Startcodon oder 3' von dem Stopcodon der für das Toxin kodierenden Nukleinsäure.

Unter einer "Rekombinationskassette" ist im Sinne der Erfindung ein Bereich zu verstehen, der eine homologe Rekombination mit der Nukleinsäure kodierend für das Zielprotein und die Zielnukleinsäure (oder Teilen davon) ermöglicht (z. B. Gateway-system; Walhout J. et al., Methods Enzymol, 2000, 328: 575-92).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Nukleinsäurekonstrukt eine multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site). Derartige Klonierungsstellen sind dem Fachmann bekannt (Altschuh et al., supra; Molecular Cell Biology, Lodish H. et al.; Fourth Edition W. H. Freeman).

Somit werden durch die vorliegende Erfindung erstmals Verfahren und Mittel bereitgestellt, die ein schnelles und effizientes Screening nach potentiellen spezifischen RNA-Inhibitoren ermöglichen. Damit leistet die vorliegende Erfindung einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung von spezifischen RNA-Inhibitoren und damit zur Entwicklung von Medikamenten, deren Wirkung auf der Unterdrückung der Expression eines Proteins basiert.

Die Erfindung wird im folgenden durch Abbildungen sowie ein Beispiel erläutert.

Kurze Erläuterung der Abbildungen

Abb. 1 bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens

a) Neben der Verwendung eines Fusionsgens aus einem Target und einem Toxin kann dasselbe Target zusätzlich mit jeweils ein oder mehreren anderen Toxinen fusioniert werden.
b) Auch zwei oder mehrere verschiedene Targets können jeweils mit demselben oder einem oder mehreren verschiedenen Toxinen fusioniert werden.
c) Es kann auch ein Fusionsgen aus mehreren Targets und ein oder mehreren Toxinen verwendet werden.

Möglichkeit c) hat den Vorteil, dass die Expression des Toxins verhindert wird, sobald eine passende RNA-modifizierende Substanz zu einem der verwendeten Targets wirksam wird; während in der Ausführungsform b) getestet wird, ob zu allen verwendeten Targets auch wirksame RNA-modifizierende Substanzen in die Zelle eingebracht wurden.

Abbildung2 Schema zur Rekombination und Amplifikation des Adenovirus "Antisense"
Konst. Pro: konstitutiver Promotor (CMV)
PA: Polyadenylierungssignal
AV: rekombinantes Adenovirus
Antisense DNA: zu "DCMAG I, 1. Bindedomäne" komplementärer DNA-Bereich

Abb. 3 Schema zur Rekombination und Amplifikation des Adenovirus "Tox-Fusion"
Ind. Pro: induzierbarer Promotorbereich
K: Kozak-Sequenz
CFP: Cyan-fluoreszierendes Protein
PA: Polyadenylierungssignal
AV: rekombinantes Adenovirus
Toxin: RNase Fusionsprotein
Tatget DNA: "DCMAG I, 1. Bindedomäne"

Abb. 4 Schema zur adenoviralen Infektion von Herzmuskelzellen
AV: rekombinantes Adenovirus

Abb. 5 Schema zur Antisense Selektion in Herzmuskelzellen

Eine effektive Antisense-RNA unterbindet durch Anlagern an die m-RNA des Zielproteins eine Expression des toxischen Fusionsproteins, die Zelle kann überleben. Findet keine Duplexbildung von Antisense-Konstrukt und mRNA statt, wird das toxische Fusionsprotein gebildet, welches das Absterben der Zelle induziert.

Abb. 6 Analyse effizienter Antisensekonstrukte am Fluoreszenzmikroskop

Eine effektive Antisense-RNA kann im Fluoreszenzmikroskop anhand schwach fluoreszierender, vitaler Zellen nachgewiesen werden. Ineffektive Antisense-Konstrukte werden anhand stark fluoreszierender, absterbender Zellen detektiert.

Beispiel 1. Material

Rekombinantes Adenovirus, deletiert in early genes E1, E3:

Das rekombinante Adenovirus wurde gemäß dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt (Mizugischi, H. et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2001 Nov. 19; 52 (3): 165-76; Danthinne X. and Imperiale M. J.; Gene Ther. 2000 Oct.; 7 (20): 1707-14.

Induzierbarer Promotor:

siehe z. B. Harvey und Caskey 1998, Curr Opin Chem Biol 2: 512-518

cDNAs für TOX-Gen, Sense- und Antisense-Konstrukte:

Klonierung der Sense-Fragmente aus Herz cDNA Libraries mittels geeigneter Primer; ebenso die Klonierung der Antisense-Fragmente; allerdings wurden diese in umgekehrter Orientierung kloniert. 5' oder 3'-gelegene Ribozyme wurden mit Hilfe von Primern eingeführt. Die Sequenzen der Antisensen wurden "per Auge" ausgewählt. Beim Ribozymdesign wurde darauf geachtet, dass in den Zielsequenzen ein GUC lokalisiert ist (cleavage site)

Neonatale Herzmuskelzellen: MediGene AG, Martiensried, Germany

Kardiomyozyten Isolations Kit: Worthington, Freehold, NJ, USA

Human Embryonic Kidney (HEK)-Zellen: MediGene AG

Medien für Zellkultur: Invitrogen, Karlsruhe, Germany

Zellkulturplastikmaterialien: Greiner, Frickenhausen, Germany

Lipofectamin: Invitrogen

AV Reinigungssäulen: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany

Restriktionsenzyme: BioLabs, Beverly, MA, USA

PCR Reagenzien: Qiagen, Hilden, Germany

Mikroskop: Zeiss, Oberkochen, Germany

PCR Maschinen: Perkin Elmer, Shelton, CT, USA

Zentrifugen: Sigma, Deisenhofen; Sorvall, Hanau, Germany; Hettich, Tuttlingen, Germany

Laborchemikalien: Sigma

2. Methoden Klonierung von rekombinanten Adenovirusvektoren

Die cDNA, gegen die ein Antisense-Konstrukt getestet werden soll, wird mittels Ligation in zwei Restriktionsstellen des Adenovirusplasmids insertiert. Anschließend wird eine Elektroporation von 25 µl ElectroMax DH10B E. coli Zellen mit DNA des Ligationsansatzes (2.5 kV, 25 µF, 200 Ω, 0.2 cm Elektroporationsküvette) durchgeführt. Die Zellen werden in 1 ml SOC Medium 2 h bei 37°C schüttelnd inkubiert, bevor die Bakteriensuspension auf Agarplatten (Ampicillin 100 µg/ml) ausplattiert wird. Nach 14 h wird eine Einzelkolonie gepickt und nach erfolgreicher Kontroll-PCR wird eine DNA Midi-Präparation des Klons durchgeführt.

Lipofektion von Adenovirusplasmiden

4 µg AV Plasmid (PacI verdaut) werden mit 240 µl Optimem vermischt. 20 ml Lipofectamin werden mit 240 µl Optimem versetzt. Beide Ansätze werden gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der DNA-Liposomen Ansatz wird anschließend auf eine HEK-Zellkultur (25 cm² Flasche, 50% konfluent, in 2.5 ml Optimem) gegeben. Nach Inkubation über Nacht (37°C, 5% CO₂) wird das Medium abgesaugt und 5 ml frisches Medium (DMEM, 10% FCS, Antibiotikum/Antimykotikum) zugesetzt. Die erfolgreiche Lipofektion kann durch Fluoreszenzmikroskopie (YFP/CFP Emission der transfizierten Zellen) kontrolliert werden.

Nach 10-14 d ist die Verpackung der Adenoviren abgeschlossen, die HEK Zellen zeigen einen zytopathischen Effekt (abrundende Zellen mit starker YFP/CFP Fluoreszenz). Die Zellen werden pelletiert (500 × g), in 2 ml Sucrosepuffer suspendiert und das Virus durch drei anschließende Gefrier/Auftau-Zyklen (N₂ 1,37°C Wasserbad) freigesetzt. Zelldebris wird nachfolgend bei 500 × g pelletiert und der Virusüberstand in Kryoröhrchen bei -80°C gelagert.

Amplifikation von Adenoviren in HEK Zellen

500 µl der Suspension der ersten Virusverpackung werden auf eine HEK- Zellkultur (75 cm², 70% konfluent) gegeben. Nach 4-6 d Inkubation (37°C, 5% CO₂) zeigen die infizierten Zellen einen zytopathischen Effekt und die Viren werden wie oben (siehe: Lipofektion von Adenovirusplasmiden) aufbereitet. Zur weiteren Amplifikation werden weitere HEK-Zellkulturen (3 × 182 cm², 70% konfluent) mit dem Adenovirus infiziert. Nach ca. 2 d werden die Viren wie beschrieben in 2 ml Sucrosepuffer aufgearbeitet und in Kryoröhrchen bei -80°C gelagert.

Aufreinigung von Adenoviren

Zur Aufreinigung der Virussuspension wird eine NAP25 Säule mit 25 ml Sucrosepuffer äquilibriert. 2 ml Virussuspension werden auf die Säule gegeben und mit 2 ml Puffer ins Säulenbett einlaufen gelassen. Mit weiteren 2 ml Puffer wird das gereinigte Virus in Kryoröhrchen eluiert. Die Lagerung erfolgt bei -80°C.

Titerbestimmung von Adenoviren

Der Titer der rekombinanten Adenoviren wird mittels halblogarithmischer Verdünnungsreihen in HEK-Zellen durchgeführt. Pro Verdünnungsgrad werden 10 wells einer 96 well Platte (10⁴ HEK-Zellen pro well) mit aufgereinigtem Virus infiziert. Nach 3 d Inkubation (37°C, 5% CO₂) werden die infizierten wells (YFP/CFP Fluoreszenz) ausgezählt. Abschließend wird der TCID50 Wert (= Volumen, das mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% ein Viruspartikel enthält) berechnet.

Preparation von neonatalen Rattenherzmuskelzellen

Herzen werden aus neonatalen Ratten (Wistar Ratten, 1-3 d) isoliert, mittels Skalpell zerkleinert und über Nacht bei 4°C trypsiniert. Der Trypsinverdau wird inhibiert und die Zellen 35 min bei 37°C mit Collagenase verdaut. Die Zellen werden anschließend über ein Sieb gereinigt und nach Zentrifugation in serumhaltigem Medium (DMEM/M-199 4/1, Pferdeserum, fötales Kälberserum, Na-Pyruvat, Antibiotikum, Antmykotikum) aufgenommen.

Infektion von Herzmuskelzellen

Neonatale Herzmuskelzellen (Wistar Ratten, 1-3 d) werden in einer Zelldichte von 25 × 10⁴ Zellen/cm² auf Polystyrol-Zellkulturschalen ausgesät. Nach 24 h Inkubation (37°C, 5% CO₂) wird das serumhaltige Medium gegen serumfreies Medium (DMEM/M-199 1/4, Na-Pyruvat, Antibiotikum, Antimykotikum) ausgetauscht. Die Zellen werden anschließend mit rekombinantem Adenovirus, 4facher TCID50 für Virus "Antisense" und Adenovirus "Tox-Fusion", infiziert. Erfolgreiche Infektion kann nach > 24 h mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden.

Analyse der Herzmuskelzellen

Die infizierten Herzmuskelzellen werden 48-60 h nach Infektion mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Als Parameter können Zellmorphologie/Zellvitalität und Fluoreszenzstärke des CFP gekoppelten Fusionsproteins analysiert werden.

3. Durchführung

Im dargestellten Versuch werden nach adenoviraler Infektion eine zu inhibierende Fusions-RNA (Target-RNA + Toxin-RNA + Cyan-Fluorescent-Protein-RNA) und eine komplementäre Antisense-RNA in Herzmuskelzellen transkribiert. Die Effektivität des Antisense-Nukleotids wird durch die Verringerung der Expression des Fusionsproteins bestimmt. Als zu analysierende Parameter einer wirksamen Antisense-RNA dienen die erhöhte Zellvitalität sowie ein verringertes Fluoreszenzsignal des Cyan Fluorescent Proteins (CFP).

Adenovirusproduktion

Die in Herzzellen zu transkribierenden cDNAs werden mittels Ligation in zwei rekombinante Adenovirusplasmide eingefügt:

- Adenovirus "Antisense" dient der konstitutiven Expression der Antisense- RNA (Abb. 2). Als Antisense-Nukleotide stehen Konstrukte gegen die Nterminale Bindedomäne der cDNA "DCMAG I" (MediGene, Dr. Rohrbach) zur Verfügung.
- Adenovirus "Tox-Fusion" wird zur induzierbaren Expression der Fusions- RNA (Target-RNA + Toxin-RNA + Cyan-Fluorescent-Protein-RNA) eingesetzt (Abb. 3). Als Target-Gen für die Antisense wird die Nterminale Bindedomäne der cDNA "DCMAG I" (MediGene) eingesetzt, als Toxin wird ein RNase Fusionsprotein aus der RNase T1M (aus Aspergillus oryzae) und der RNase III (aus Escherichia coli) verwendet.

Die Adenovirusplasmide werden in E. coli amplifiziert und aufgereinigt (Midi Preparation). Die linearisierte DNA wird anschließend in HEK Zellen zu rekombinanten Adenoviren verpackt und in weiteren Passagen amplifiziert. Hierbei ist zu beachten, dass Adenovirus "Tox-Fusion" nur im nicht induzierten Zustand amplifiziert werden kann, da eine Expression des Toxins die HEK Zellen schädigt. Die zwei Viruskonstrukte werden schließlich säulengereinigt und titriert.

Antisense-Selektion in Herzmuskelzellen

Neonatale Herzmuskelzellen werden mit den zwei Adenoviren infiziert (Abb. 4). Die Transkription des Fusionsproteins des Adenovirus "Tox-Fusion" wird durch Induktion des regulierbaren Promotors erreicht. Nach ca. 24 h wird die Infektion der Zellen am Fluoreszenzmikrokop überprüft (CFP Signal für Expression des Fusionsproteins).

Die konstitutiv transkribierte Antisense-RNA kann sich nun mit dem Target- Bereich der Fusions-RNA zu einem Doppelstrang anlagern (Abb. 5, rechts). Eine effiziente Antisense-RNA unterbindet so die Expression des Fusionsproteins, so dass in der Zelle kein oder nur sehr wenig Toxin produziert wird. Gleichzeitig nimmt das CFP Fluoreszenzsignal in der Zelle ab.

Eine unwirksame Antisense-RNA hingegen kann die Expression des Fusionsproteins nicht inhibieren, die Zellen zeigen zunächst ein erhöhtes CFP Signal und sterben nachfolgend auf Grund der Toxineinwirkung ab (Abb. 5, links). Das Screening nach effektiven Antisense-RNAs kann somit leicht am Fluoreszenzmikroskop oder mit Hilfe eines Laser Scanning Xytometers (LSC) durchgeführt werden (Abb. 6).

Die im Screening als wirksam identifizierten Antisense-Konstrukte können schließlich modifiziert bzw. optimiert und in weiteren Testzyklen analysiert werden.

Während der obige Versuchsansatz die Selektion eines einzelnen Antisense- Konstrukts beschreibt, ist mittels Infektion der Zellen mit pools von "Antisense" Adenoviren ein gleichzeitiges Screening vieler Antisense-Konstrukte möglich. Weiterhin kann durch die regulierbare Menge der Fusions-RNA das Verhältnis zwischen Antisense- und Target-RNA vorgegeben werden. Somit kann auch die Stärke von Antisense-Interaktionen untersucht werden.

Neben der Analyse von Herzmuskelzellen kann das System auch in allen weiteren durch Adenovirus infizierbaren Zellen angewendet werden. Das Selektionssystem kann folglich in Hochdurchsatzscreenings in Mikrotiterplatten (z. B. HeLa Zellen) oder auch in vivo (Tiermodelle) eingesetzt werden.

Claims

1. Verfahren zum Identifizieren von spezifischen RNA-Inhibitoren, gekennzeichnet durch die Schritte:

a) Einbringen mindestens eines Typs einer für mindestens ein Toxin und für mindestens ein Zielprotein, eine Zielnukleinsäure oder für Teile mindestens eines Zielproteins oder mindestens einer Zielnukleinsäure kodierenden Nukleinsäure (Fusionsgen) in eine Zelle, wobei ausgehend von dem Fusionsgen eine RNA gebildet werden kann, die sowohl für das Toxin als auch für das Zielprotein oder die Zielnukleinsäure oder Teile davon kodiert (mRNA1);

b) Einbringen eines oder mehrerer spezifischer RNA-Inhibitoren in die Zelle, wobei die Schritte a) und b) in beliebiger Reihenfolge oder gleichzeitig durchgeführt werden können;

c) Inkubieren der Zelle unter Bedingungen, die

a) die Bildung der mRNA1 ermöglichen und

b) die zur Expression des Toxins ausgehend von der mRNA1 geeignet sind;

d) Bestimmen der Vitalität der Zelle, wobei die Vitalität der Zelle ein Maß für die Toxinbildung darstellt, die durch den spezifischen RNA-Inhibitors inhibierbar ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifische RNA-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense Oligonukleotiden, dsRNA, und Ribozymen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin ein Toxin mit reversibler Wirkung ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin mindestens zwei Nukleasen enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleasen aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen und/oder Tieren stammen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleasen direkt oder über einen Linker kovalent oder nicht-kovalent miteinander verknüpft sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin mindestens zwei DNAsen oder mindestens zwei RNAsen enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin mindestens eine DNAse und mindestens eine RNAse enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin ausschließlich DNAsen oder ausschließlich RNAsen enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin RNase T1 und RNase III und/oder funktionelle Varianten davon enthält, wobei die RNase T1 vorzugsweise aus Aspergillus oryzae und die RNase III aus Escherichia coli stammt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die RNase T1 und/oder funktionelle Varianten davon N-terminal und die RNase III und/oder funktionelle Varianten davon C-terminal auf einem Polypeptid angeordnet sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin als weitere Komponente ein Protein ohne Nukleaseaktivität enthält, insbesondere Proteasen, porenbildende Enzyme, und/oder modifizierende Enzyme, insbesondere ADP-ribosylierende Enzyme, glykosylierende und/oder phosphorylierende Enzyme.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin als weitere Komponente eine Substanz enthält, welche die Sensitivität von Zellen gegenüber der Aktivität der Nukleasen, insbesondere der RNAsen, erhöht.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsgen zusätzlich ein Reportergen enthält.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsgen Bestandteil eines Vektors ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der spezifische RNA-Inhibitor dadurch in die Zelle eingebracht wird, dass eine für ihn kodierende Nukleinsäure in die Zelle eingebracht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die für den spezifischen RNA-Inhibitor kodierende Nukleinsäure Bestandteil eines Vektors ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor zusätzlich ein Reportergen enthält.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Reportergen von dem in dem Fusionsgen enthaltenden Reportergen gemäß Anspruch 14 verschieden ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmid oder ein viraler Vektor, insbesondere ein rekombinantes Adenovirus, ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle handelt, insbesondere um eine Hefe- oder Säugerzelle.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) und b) gleichzeitig ausgeführt werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) vor Schritt b) ausgeführt wird.

24. Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des spezifischen RNA-Inhibitors durch konstitutive oder regulierbare Promotoren kontrolliert wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung der mRNA1 durch konstitutive oder regulierbare Promotoren kontrolliert wird.

26. Verfahren nach den Ansprüchen 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression oder die Bildung durch einen Transkriptionsfaktor induzierbar ist.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression oder die Bildung durch das Einbringen einer für den Transkriptionsfaktor kodierenden Nukleinsäure in die Zelle und Inkubation der Zelle unter Bedingungen, die zur Bildung des Transkriptionsfaktors führen, induzierbar ist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die für den Transkriptionsfaktor kodierende Nukleinsäure Bestandteil eines Vektors ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmid oder ein viraler Vektor, insbesondere ein rekombinantes Adenovirus, ist.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor zusätzlich ein Reportergen enthält.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Reportergen nicht das gleiche ist wie das Reportergen gemäß Anspruch 14 und/oder das Reportergen gemäß Anspruch 18.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt wird und im Anschluß an Schritt b) die Bildung der mRNA1 induziert wird.

33. Nukleinsäure kodierend für ein Toxin und ein Zielprotein oder eine Zielnukleinsäure.

34. Nukleinsäure nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner einen konstitutiven oder regulierbaren Promoter enthält

35. Nukleinsäure nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein Reportergen enthält.

36. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass sie Bestandteil eines Vektors ist.

37. Nukleinsäure nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmid oder ein viraler Vektor, insbesondere ein rekombinantes Adenovirus, ist.

38. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 33 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin ein Toxin mit reversibler Wirkung ist.

39. Nukleinsäure nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleasen aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen und/oder Tieren stammen.

40. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 38 oder 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleasen direkt oder über einen Linker kovalent oder nicht-kovalent miteinander verknüpft sind.

41. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 38 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin mindestens zwei DNAsen oder mindestens zwei RNAsen enthält.

42. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 38 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin mindestens eine DNAse und mindestens eine RNAse enthält.

43. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 38 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin ausschließlich DNAsen oder ausschließlich RNAsen enthält.

44. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 38 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin RNase T1 und RNase III und/oder funktionelle Varianten davon enthält, wobei die RNase T1 vorzugsweise aus Aspergillus oryzae und die RNase III vorzugsweise aus Escherichia coli stammt.

45. Nukleinsäure nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die RNase T1 und/oder funktionelle Varianten davon N-terminal und die RNase III und/oder funktionelle Varianten davon C-terminal auf einem Polypeptid angeordnet sind.

46. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 38 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin als weitere Komponente ein Protein ohne Nukleaseaktivität enthält, insbesondere Proteasen, porenbildende Enzyme, und/oder modifizierende Enzyme, insbesondere ADP-ribosylierende Enzyme, glykosylierende und/oder phosphorylierende Enzyme.

47. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 38 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass das Toxin als weitere Komponente eine Substanz enthält, welche die Sensitivität von Zellen gegenüber der Aktivität der Nukleasen, insbesondere der RNAsen, erhöht.

48. Zelle enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 33 bis 47.

49. Zelle nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, es sich um eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine Hefe- oder Säugerzelle, handelt.

50. Testsystem, enthaltend mindestens eine Zelle nach Anspruch 48 oder 49.

51. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, enthaltend eine für ein Toxin kodierende Nukleinsäure und mindestens einer zur Klonierung geeigneten Restriktionsschnittstelle, insbesondere einer multiplen Klonierungsstelle oder eine Rekombinationskassette, zum Auffinden spezifischer RNA-Inhibitoren.

52. Verwendung einer Nukleinsäure nach den Ansprüchen 33 bis 47 zum Auffinden spezifischer RNA-Inhibitoren.