ES2865488T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento y la prevención de la inflamación - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento y la prevención de la inflamación Download PDF

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Abstract

Una trampa de polipéptido Neuropilina-1 (NRP1) soluble que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los dominios al, a2 y b1 de la NRP1 humana nativa, en donde dicha trampa de polipéptido NRP1 carece del dominio b2 de NRP1 humana nativa.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento y la prevención de la inflamación
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la inflamación. Más específicamente, la presente invención se refiere a la inhibición de la vía NRP1 para la prevención o el tratamiento de la inflamación.
Antecedentes de la invención
Las respuestas inflamatorias agudas locales son predominantemente beneficiosas y constituyen la primera línea de defensa del organismo contra la infección del huésped. Por el contrario, la inflamación sistémica aguda, tales como en el shock séptico, es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad (58). Cuando la inflamación crónica, de bajo grado persiste, puede ser el origen de varias enfermedades sistémicas que van desde la diabetes mellitus tipo II, la artritis, el cáncer, a una serie de afecciones neuroinflamatorias y más.
De todas las citocinas, receptores y otros actores que se cree que contribuyen a los procesos inflamatorios, un paradigma que se ha pasado por alto en gran medida es la influencia de las señales de guía neuronales clásicas y sus receptores. Estos incluyen la semaforina 3A (SEMA3A, por ejemplo, ARNm: NM_006080; y proteína: NP_006071 y la Figura 21) y su receptor Neuropilina-1 (NRP1,por ejemplo, ARNm: NM_001024628; y proteína: NP_001019799, NM_003873 y las Figuras 22 (isoforma 2 o b, secretada) y 26 (isoforma 1). El NRP1 se expresa tanto en células linfoides como mieloides (59, 31). Sin embargo, su papel en la inflamación se desconoce en gran medida y especialmente en el contexto de la producción de citocinas.
Las semaforinas se caracterizaron inicialmente como actores clave en la guía axonal durante la embriogénesis. Ahora está claro que el papel de las semaforinas se extiende más allá de la guía axonal e influye en los sistemas vasculares, el crecimiento tumoral y la respuesta inmunitaria. La familia de las semaforinas cuenta con al menos 21 genes de vertebrados y 8 genes adicionales en invertebrados. Todas las semaforinas contienen un -dominio SEMA de 500 aminoácidos que se requiere para la señalización. Las semaforinas de clase 3 (tal como la SEMA3A) son los únicos miembros secretados de la familia. La SEMA3A se sintetiza como un homodímero unido por disulfuro y la dimerización es esencial para la señalización.
En las neuronas, la unión de la SEMA3A a su receptor afín Neuropilina-1 (NRP1) provoca colapso citoesquelético a través de plexinas (60); el mecanismo de transducción en las células endoteliales permanece mal definido. El NRP1 tiene la capacidad particular de unirse a dos ligandos estructuralmente diferentes a través de sitios distintos en su dominio extracelular (27-29). Se une no solo a la SEMA3A (46, 47) provocando colapso citoesquelético sino también al VEGF165 (28, 29, 47, 61) mejorando la unión al VEGFR2 y aumentando así su potencial angiogénico (62). La evidencia cristalográfica reveló que el VEGF165 y la SEMA3A no compiten directamente por el NRP1, sino que pueden unirse simultáneamente a NRP1 en sitios distintos que no se superponen (63). Además, los estudios genéticos muestran que el NRP1 regula claramente los efectos del VEGF y la SEMA3A en el desarrollo neuronal y vascular (64). Finalmente, también se ha encontrado que el NRP1 se une al TGF-01 y regular su forma latente.
Por esta razón, la solicitud EP 2 497 498 describe el diseño de un modulador de la función de la SEMA3A que comprende un NRP1 soluble de longitud completa para su uso como agente terapéutico para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria celular. Mamluk y otros (Angiogenesis (2005) 8:217-227) también describen el posible uso terapéutico de un NRP1 soluble de longitud completa. De hecho, Mamluk y otros demuestran que la forma totalmente soluble de origen natural de NRP1 dirigida a la piel mediante el uso de un promotor de queratina 14 revierte el aumento de la inflamación y el edema inducidos por la sobreexpresión transgénica en las reacciones cutáneas de hipersensibilidad de tipo retardado.
El NRP1 es un receptor transmembrana de paso único con un gran dominio extracelular de 860 aminoácidos subdividido en 3 subdominios (a1a2, b1b2 y c) y un dominio intracelular corto de 40 aminoácidos (65). En las neuronas, la unión de la SEMA3A al NRP1 recluta plexinas, que transducen su señal intracelular (60) y provocan el colapso del citoesqueleto. El mecanismo de transducción en las células endoteliales permanece mal definido. El NRP1 se une a la SEMA3A (46, 47) principalmente a través de su dominio a1a2 (pero posiblemente también al b1-) (provocando colapso citoesquelético) y al VEGF165 (28, 29, 47, 61) a través de su dominio b1b2 (mejorando la unión al VEGFR2 y aumentando así su potencial angiogénico (62). Por tanto, los niveles elevados de la SEMA3A en la retina isquémica pueden participar en el forzamiento de los neovasos hacia el vítreo al colapsar y desviar las células de la punta que avanzan lejos de la fuente de la señal repelente (21).
El SNC se había considerado durante mucho tiempo un sistema inmunológico privilegiado, pero ahora está claro que el cerebro, la retina y la médula espinal están sujetos a una compleja vigilancia inmunitaria (1, 2). La actividad inmunológica en el SNC depende en gran medida de una respuesta inmunitaria innata y está presente en la salud y aumentada en enfermedades tales como la retinopatía diabética, la esclerosis múltiple, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Alzheimer. Esto es evidente en la retina, donde una respuesta inmunitaria intensificada, en gran parte basada en microglía/macrófagos, se asocia con la progresión de varias enfermedades que amenazan la vista, tales como la retinopatía diabética (RD) (3-5), la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) (6-8) y la retinopatía del prematuro (ROP) (9, 10).
Juntas, estas enfermedades de la retina representan las principales causas de pérdida de la vista en los países industrializados (6, 11, 12).
Muchas de las líneas actuales de tratamientos de enfermedades y afecciones inflamatorias sufren efectos secundarios importantes y perfiles de seguridad deficientes a largo plazo. En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de nuevas dianas farmacéuticas y métodos de tratamiento.
Resumen de la invención
Los presentes inventores han buscado determinar la función del NRP1 residente en mieloide en el contexto de la respuesta inmunitaria innata.
Los presentes inventores han determinado que la SEMA3A, el VEGF y el TGF-p actúan como potentes atrayentes para los fagocitos mononucleares (MP, por ejemplo, microglía y macrófagos) que expresan el receptor NRp1. Se demostró que la inhibición de la señalización de NRP1 en las células inmunitarias innatas da como resultado la protección contra la inflamación y el daño tisular dependiente de MP en una variedad de condiciones que implican la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata, incluidas las retinopatías proliferativas, el choque séptico y la isquemia/accidente cerebrovascular cerebral. Además, los presentes inventores han diseñado varias trampas derivadas de NRP1 solubles que inhiben la señalización de la SEMA3A y han demostrado que la inhibición de la SEMA3A reduce significativamente la respuesta inflamatoria en diversas condiciones.
En consecuencia, se describe la inhibición de la señalización de NRP1 en las células (por ejemplo, NRP1 y sus ligandos) para la prevención o el tratamiento de enfermedades y afecciones inflamatorias que implican hiperactivación (es decir, activación patológica) de la respuesta inmunitaria innata. Los ejemplos no limitantes de tales enfermedades y afecciones incluyen sepsis, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral y diversas retinopatías proliferativas.
Más específicamente, se describe un método para tratar o prevenir la inflamación que comprende inhibir la señalización celular dependiente del NRP1.
Adicionalmente, se describe un método para prevenir o reducir la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata que comprende inhibir la señalización celular dependiente del NRp1. En una modalidad, la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata comprende i) la secreción de IL-1 p y TNFa y/o activación/reclutamiento de fagocitos mononucleares (MP).
En una modalidad, la inhibición de la señalización celular dependiente de NRP1 comprende: a) reducir la expresión o actividad del NRP1; y/o b) reducir la expresión o actividad del ligando de NRP1. En una modalidad, el ligando de NRP1 es la SEMA3A, el v Eg F-165 o el TGF-p. En una modalidad particular, el ligando de NRP1 es la SEMA3A.
En una modalidad, reducir la actividad de NRP1 consiste en inhibir la unión de NRP1 al menos a un ligando de NRP1. En una modalidad, inhibir la unión de NRP1 al menos a un ligando de NRP1 comprende administrar un anticuerpo NRP1 (por ejemplo, un anticuerpo anti SEMA3A).
En otra modalidad de los métodos anteriores, reducir la actividad de NRP1 comprende administrar una cantidad eficaz de una trampa NRP1 que comprende un polipéptido NRP1 soluble o un fragmento funcional del mismo. En una modalidad particular, la trampa NRP1 es como se muestra en la Figura 19 o 20.
En una modalidad particular, la trampa NRP1 de la presente invención inhibe la unión de la SEMA3A al NPR-1 pero no inhibe sustancialmente la unión del VEGF al n RP1. La trampa NRP1 de la presente invención comprende los dominios a1, a2 y b1 del NRP1 pero no comprende el subdominio b2 del NRP1. También se describe una trampa que comprende una mutación en el dominio b1 en una posición correspondiente a la tirosina 297 de la secuencia de aminoácidos del NRP1 como se muestra en la Figura 22 que reduce o anula la unión del VEGF a la trampa. Preferentemente, la mutación cambia la tirosina en la posición 297 a una alanina.
También se describe una trampa NRP1 que a) comprende los dominios a1, a2, b1, b2 y c de NRP1; b) comprende los dominios a1, a2, b1 y b2 de NRP1; c) comprende los dominios a1, a2 y b1 de NRP1; d) comprende los dominios a1 y a2 de NRP1; e) comprende el dominio b1, en donde el dominio b1 comprende una mutación en el aminoácido correspondiente a la tirosina 297 de NRP1 que reduce o anula la unión al VEGF; f) comprende el dominio b1, en donde el dominio b1 comprende una mutación en el aminoácido correspondiente a la tirosina 297 de NRP1 que cambia la tirosina a una alanina; g) no comprende el dominio c de NRP1; h) no comprende el dominio b1 de NRP1; i) no comprende los dominios b1 y b2 de NRP1; o j) no comprende los dominios b1, b2 y c de NRP1.
En una modalidad de los métodos anteriores, la inhibición de la expresión o actividad del ligando del NRP1 comprende inhibir específicamente la expresión de la SEMA3A o la unión de la SEMA3A al NRP1. En una modalidad particular, inhibir la unión de la SEMA3A al NRP1 comprende administrar un anticuerpo anti SEMA3A.
En una modalidad particular, el método comprende reducir la expresión de NRP1 mediante la administración de un antisentido del NRP1, shRNA o siRNA.
En otra modalidad, el método comprende reducir la expresión de la SEMA3A mediante la administración de un antisentido de la SEMA3A, shRNA o siRNA.
También se describe un compuesto para la prevención o el tratamiento de la inflamación en donde el compuesto a) reduce la expresión o actividad del NRP1; o b) reduce la expresión o actividad del ligando del NRP1.
También se describe un compuesto para prevenir o reducir la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata, en donde el compuesto a) reduce la expresión o actividad del NRP1; o b) reduce la expresión o actividad del ligando de NRP1.
En una modalidad, el compuesto es: i) un anticuerpo anti SEMA3A; ii) un anticuerpo anti NRP1; iii) una trampa NRP1; iv) Un antisentido de la s Em A3A shRNA o siRNA; o v) Un antisentido del NRP1, shRNA o siRNA. En otra modalidad particular, el compuesto es un anticuerpo anti NRP1 o una trampa NRP1 y dicho compuesto no reduce sustancialmente la unión del VEGF al NRP1.
En una modalidad particular, el compuesto es una trampa NRP1. En una modalidad, la trampa NRP1 es como se muestra en las Figuras 19, 20, 27 y la Tabla 1.
También se describe una trampa NRP1 que comprende: (i) Los aminoácidos 1-856 (preferentemente, 22 a 856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (ii) los aminoácidos 1 a 583 (preferentemente 22 a 583) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (iii) los aminoácidos 1 a 424 (preferentemente 22-424) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (iv) los aminoácidos 1 a 265 (preferentemente 22 a 265) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ iD NO: 69); (v) los aminoácidos 1 a 430 y 584 a 856 (preferentemente 22-430 y 584-856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID n O: 69); (vi) los aminoácidos 1 a 274 y 584 a 856 (preferentemente 22-274 y 584 a 856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (vii) los aminoácidos 1 a 430 y 584 (preferentemente 22 a 430 y 584 a 856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69). En una modalidad particular, las trampas indicadas anteriormente comprenden una o más mutaciones para reducir la unión del VEGF o la SEMA3A como se describió anteriormente.
También se describen composiciones para i) tratar y prevenir la inflamación o ii) para prevenir o reducir la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata, que comprenden uno o más compuestos de la presente invención junto con un portador farmacéutico.
También se describe usar uno o más compuestos de la presente invención en la fabricación de un medicamento para i) tratar y prevenir la inflamación o ii) para prevenir o reducir la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata.
En un aspecto relacionado, se describe el uso de uno o más compuestos de la presente invención para i) tratar y prevenir la inflamación o ii) para prevenir o reducir la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata.
En una modalidad particular, los métodos, compuestos (por ejemplo, trampas de polipéptido NRP1, ácidos nucleicos que los codifican, vectores, células que comprenden vectores, etc.), composiciones y usos son para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias y afecciones seleccionadas del grupo que consiste en choque séptico, artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), inflamación cutánea de la piel, diabetes, uveítis, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía del prematuro, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), deterioro cognitivo relacionado con la edad/Enfermedad de Alzheimer o accidente cerebrovascular.
En una modalidad, los métodos, compuestos, composiciones y usos son para tratar o prevenir el choque séptico, la isquemia cerebral o accidente cerebrovascular.
Otros objetos, ventajas y características de la presente invención serán más evidentes después de leer las siguientes descripciones no restrictivas de modalidades específicas de la misma, dadas a manera de ejemplo solamente con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
En las figuras adjuntas:
La Figura 1 muestra que NRP1 identifica una población de microglía que se moviliza como consecuencia de una lesión vascular. (A). Representación esquemática del modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno (OIR). La primera fase (día 7-12 postnatal (P7-P12)), bajo 75 % de oxígeno, induce vasoobliteración. La segunda fase (aire ambiente) desde el día 12 a 17 postnatal (P7-P17) permite alcanzar la neovascularización prerretiniana máxima. (B, E y H) muestran gráficos FACS representativos de células (microglía) CD11b+/F4-80+/Gr-1- en las retinas colectadas en P10 (B), P14 (E) y P17 (H) de ratones WT controles en OIR y Normóxico. (C, F y I) muestra cambio de veces en el número de microglía retiniana en Normoxia (N) y OIR en P10 (C), P14 (F) y P17 (I). El número de microglía retiniana aumentó significativamente en OIR en todos los puntos analizados (C, F y I); n = 7­ 8 (Normoxia, (N)), n = 7-8 (OIR) (total de 28-32 retinas por condición; cada "n" comprende 4 retinas). (D, G y J) muestran el cambio de veces en el número de MP positivos para el NRP1 en P10 (D), P14 (G) y P17 (J). Se observó un aumento proporcional en el número de microglías positivas a NRP1 en las retinas OIR (D, G y J); n = 3-5 (Normoxia, (N)), n = 3-5 (OIR) (total de 12-20 retinas por condición; cada "n" se comprende de 4 retinas). (K). Para investigar el papel del NRP1 residente en los MP, se generaron ratones LysM-Cre/Nrp1m que tienen comprometido significativamente la expresión de NRP1 en la microglía retiniana (n = 3 (WT), n = 4 (LysM-Cre/Nrp1fl/fl, total de 12-16 retinas por condición). El panel izquierdo muestra el % de MP positivos para NPR-1 en WT (LysM-Cre/NRP1 /+) y los ratones deficientes en NRP1 en sus células mieloides (LysM-Cre/Nrp1fl/fl) de acuerdo con lo determinado por FACS (panel derecho). (L, N y P), muestran el análisis FACS en P10 (L), P14 (N) y P17 (P) para cuantificar el número de MP en las retinas de ratones LysM-Cre/Nrp1f,/fl en Normoxia y OIR. (M, O y Q) muestran el cambio de veces en el número de MP en las retinas de ratones LysM-Cre/Nrp1fl/fl en Normoxia y OIR. El análisis FACS en P10 y P14 durante la fase proliferativa de OIR (L y N) revela que el NRP1 residente en los MP es esencial para la infiltración de MP en la retina isquémica como los ratones LysM-Cre/Nrp1f,/fl no mostraron un aumento en el número de células CD11b+/F4-80+/Gr-1- en OIR en estos puntos de tiempo (M y O). En P17, los MP se infiltran independientemente de NRP1 (P, Q). n = 7-8 (N), n = 7-9 (OIR) (total de 28-36 retinas por condición; cada "n" comprende 4 retinas). (R)muestra un gráfico resumen de la acumulación de MP en la retina durante el transcurso de OIR en ratones Wt y LysM-Cre/Nrp1m. (S, T) son gráficos representativos de FACS que representan que las células Gr1-/CD11b+/F4/80+ expresan niveles altos de CX3CR1 y niveles intermedios/bajos de CD45. Las células CX3CR1 alto y CD45 bajo expresan NRP1 en las retinas de ratones WT (S) y no expresan NRP1 en retinas de ratones LysM-Cre/Nrp1fl/f,(T). Los datos se expresan como cambio de veces con relación al control ± SEM. *P<0,05, **P<0,001, ***P>0,0001;
La Figura 2 muestra que las células mieloides NRP1+se localizan en sitios de neovascularización patológica en la retina. Imágenes confocales de isolectina B4 (tinción de vasos y microglía) y monturas planas retinianas teñidas con NRP1 en P14 con mechones neovasculares en ciernes en ratones WT (A) y ratones LysM-Cre/Nrp1f/fl (G) y en P17 con mechones maduros en ratones WT (D) y ratones LysM-Cre/Nrp1m (J). Las imágenes de gran aumento revelan la colocalización de microglía NRP1-positiva (IBA1) en ratones WT con ambos mechones nacientes (B) y maduros (E) como lo confirma la reconstrucción 3D (C, D) en ratones WT. (C, F, I, L) muestran la reconstrucción 3D del tejido. Las Flechas blancas en (A, panel derecho) apuntan a mechones que brotan. Las flechas blancas en (B y E) apuntan a MP NRP1+ asociados con mechones. Los ratones LysM-Cre/Nrp1f/fl tenían menos MP y menos mechones (G-K). Para todas las IHC, se muestran imágenes representativas de tres experimentos independientes. Barras de escala (A, D, G, J): 100 pm, (B, E, H, K): 50 pm;
La Figura 3 muestra que el ligando de NRP1, la SEMA3A, se induce en pacientes que padecen retinopatía diabética proliferativa. Angiografías, funduscopías, tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) y mapas de retina tridimensionales (3D) obtenidos de pacientes seleccionados para el estudio. Los pacientes de control tenían patologías no vasculares y se compararon con pacientes con retinopatía diabética proliferativa (PDR). Los pacientes con ERM de control muestran signos de daño retiniano no relacionado con la diabetes, tal como (A, B) tensión de tracción en la vasculatura (flecha) secundaria a (C) tejido fibrótico (flecha blanca), desprendimiento de vítreo posterior (punta de flecha) y abombamiento macular (angiografía y mapa 3D). Las retinas de los pacientes con PDR tienen (E) neovascularización (recuadro) con (D) microvasos altamente permeables como lo demuestra la fuga de tinte fluorescente (recuadro), (F) microaneurismas (flechas insertadas) y (G) tejido cicatricial fibroso (flecha), indicativo de retinopatía avanzada. (H) Los pacientes con PDR muestran alguna evidencia de edema macular, incluida la formación de cistoide (punta de flecha blanca) debido a la coalescencia focal del líquido extravasado. (I) El humor vítreo analizado por ELISA muestra niveles aumentados de la proteína SEMA3A en 5 veces en los pacientes con PDR; n = 17 para controles y 17 con PDR. (J) El análisis de transferencia Western de volúmenes iguales de vítreo corrobora el aumento de la SEMA3A (~125 KDa y 95 KDa) en pacientes con PDR con respecto a los controles;
La Figura 4 muestra que los ligandos de NRP1 se inducen en la capa de células ganglionares de la retina durante la OIR. (A, B) Se colectaron las retinas de ratones WT y de ratones ko NRP1 deficientes en mieloide (LysM-Cre/Nrp1fl/fl) en condiciones normóxicas o en OIR entre P10 y P17 y se analizaron mediante RT-qPCR (los oligonucleótidos usados fueron los descritos en el Ejemplo 11, Tabla 2). La expresión del ARNm de la SEMA3A (A) se indujo a lo largo de la OIR en las retinas de los ratones WT y LysM-Cre/Nrp1fl/fl mientras el VEGF (B) fue significativamente menos inducido en los ratones ko (LysM-Cre/Nrp1fl/fl) en comparación con las retinas WT (estrellas). Los datos se expresan como un cambio de veces con relación a los respectivos controles normóxicos para cada punto de tiempo ± SEM; n = 4-7; * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. (C)Se realizó una microdisección por captura con láser (lCm ) en ratones P14 con cuidado de seleccionar zonas retinianas avasculares en OIR. (D, E) La RT-qPCR en LCM de las capas retinianas en las zonas avascular en el control y en OIR mostró una inducción del ARNm en la capa de células ganglionares (GCL) en ambos la SEMA3A (D) y el VEGF (E) durante las retinas en OIR en comparación con las retinas normóxicas. El VEGF también fue inducido en la capa nuclear interna de las retinas en OIR (E). Los datos se expresan como un cambio de veces con relación a GCL normóxico ± SEM;
La Figura 5 muestra que los MP NRP1+ no proliferan en la retina después de una lesión vascular. Histogramas representativos de FACS de células obtenidas de las retinas CD11b+/F4-80+/Gr-1-(A) y bazos (B) colectadas en P14 de ratones WT en OIR (panel derecho) y ratones de control Normóxico (panel izquierdo) inyectados con BrdU en P13. El número de células BrdU fue considerablemente mayor en los bazos, pero no cambió significativamente entre los ratones OIR y Normóxico (C). n = 4 (Normóxico, N), n = 4 (OIR) (total de 16 retinas por condición; cada "n" se compone de 4 retinas). Los datos se expresan como porcentaje de BrdU Gr-1-/ Células CD11b+/F4-80+ ± SEM;
La Figura 6 muestra que la SEMA3A y el VEGF son quimio-atractivos para los macrófagos a través de NRP1. (A, B) Se aislaron macrófagos primarios de ratones WT o ratones ko deficientes en NRP1 de mieloide (LysM-Cre/Nrp1f/f) y se sometieron a un ensayo de migración Transwell con vehículo, MCP-1 (100 ng/mL), SEMA3A (100 ng/mL) o VEGF (50 ng/mL) añadido a la cámara inferior. Se muestran imágenes representativas de células migradas teñidas con DAPI (A). La SEMA3A o el VEGF promovieron la migración de macrófagos en un grado similar al del control positivo MCP-1 (B). Para determinar que la SEMA3A y el VEGF estimulaban la quimiotaxis de macrófagos, las células se pretrataron con el inhibidor selectivo de ROCK Y-27632 (100 pg/mL) (B) que abolió la quimiotaxis. Los macrófagos de los ratones LysM-Cre/Nrp1m no respondieron a la SEMA3A o el VEGF pero sí a MCP-1 (C). Los datos se expresan como un cambio de veces con relación al control (células no tratadas); n = 6 -22; ** p <0,01, *** p <0,001. Barras de escala: 100 pm (A);
La Figura 7 muestra que los macrófagosNrp1+ promueven el crecimiento microvascular en ex vivo explantes de coroides. (A) Cuantificación e imágenes representativas de explantes de coroides aislados de ratones LysM-Cre/Nrp1+/+ y LysM-CreNrp1f/f (n = 6; p = 0,018). (B, C) Imágenes representativas de explantes de coroides de ratones LysM-Cre/Nrp1+/+ (B) y ratones LysM-Cre/Nrp1fl/f! (C) después del tratamiento con liposomas con clodronato (para reducir los macrófagos) y la posterior adición de macrófagos exógenos (Ma). (D, E) Cuantificación de brotes microvasculares coroideos de LysM-Cre/Nrp1+/+ (D) y LysM-Cre/Nrp1fl/fl (E) representado en B y C (n = 6, ns: no significativo, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001);
La Figura 8 muestra que la deficiencia de NRP1 residente en mieloides reduce la degeneración vascular y la neovascularización patológica en la retinopatía. Los ratones tipo salvaje, los ratones LysMCre/Nrp1+/+ y los ratones LysM-Cre/Nrp1f,/fl se sometieron a OIR y se colectaron las retinas en P12 y P17, se montaron en plano y se tiñeron con Isolectina B4. Los ratones LysM-Cre/Nrp1f,/fl tenían menos vasoobliteración en P12 (# 3 en A, B) y áreas avasculares reducidas (# 3 en C, D) y neovascularización prerretiniana (# 3 en E, F) en P17 en comparación con ratones control WT (# 1) o ratones control LysMCre/Nrp1+/+ (# 2). Los resultados se expresan como porcentaje del área avascular o neovascular versus el área total de la retina; n = 5 - 19. Barras de escala: B&D: 1 mm y F: 500 pm. **p < 0.01, ***p < 0.001;
La Figura 9 muestra que la administración intravítrea terapéutica de NRP1 soluble reduce la infiltración de MP y la neovascularización patológica en la retinopatía. Los ratones WT se sometieron a OIR y se inyectaron vía intravítrea en P12 con NRP1 de ratón recombinante soluble (rmNRP1 que comprende los dominios a1, a2, b1, b2 y c, véase también la Figura 19C y 20R) como una trampa para secuestrar ligandos de NRP1 inducidos por OIR. En P14, el análisis FACS reveló una disminución de más del 30 % en el número de MP retinianos en las retinas inyectadas con rmNRP1 (A). Los datos se expresan como un cambio de veces con relación al control (retinas inyectadas con vehículo) ± SEM; n = 3 - 4 (total de 12-16 retinas por condición; cada "n" comprende 4 retinas). El tratamiento con rmNRP1 disminuyó eficazmente la neovascularización patológica en P17 en comparación con los ojos inyectados con vehículo (B, C). Los resultados se expresan como porcentaje del área neovascular frente a toda el área retiniana; n = 11. Barras de escala: 500 pm. *p < 0,05, **p < 0,01;
La Figura 10 es una representación esquemática de los presentes hallazgos que ilustran que durante las retinopatías isquémicas tal como la de la diabetes, las zonas avasculares de la retina, las neuronas isquémicas y el tejido neural producen ligandos de NRP1 (SEMA3A y VEGF), que a su vez actúan como potentes agentes quimio-atractivos para la microglía proangiogénica. La microglía NRP1 participa entonces en la patogénesis de la retinopatía proliferativa;
La Figura 11 muestra que la SEMA3A se regula positivamente en varios órganos durante el choque séptico. los niveles de ARNm de la SEMA3A (paneles izquierdos) y el VEGF (paneles derechos) fueron evaluados por qRT-PCR después de sepsis inducida por LPS (15 mg/kg) en ratones. Los niveles de ARNm de SEMA3A y VEGF se normalizaron con la expresión de p-actina y se determinaron los cambios de veces en los niveles de ARNm a las 0, 6, 12 y 24 horas después de la administración de LPS. A. Cambio de veces en SEMA3A (panel izquierdo) y VEGF (panel derecho) en el cerebro de los ratones. B. Cambio de veces en SEMA3A (panel izquierdo) y VEGF (panel derecho) en los riñones de los ratones. C. Cambio de veces en SEMA3A (panel izquierdo) y VEGF (panel derecho) en los pulmones de los ratones. D. Cambio de veces en SEMA3A (panel izquierdo) y VEGF (panel derecho) en el hígado de los ratones;
La Figura 12 muestra la expresión de citocinas después de la sepsis inducida por LPS. Los niveles de ARNm de TNF-a e IL-1p se evaluaron mediante qRT-PCR después de sepsis inducida por LPS (15 mg/kg) en ratones. Los niveles de ARNm se normalizaron con la expresión de p-actina y se determinaron cambios de veces en los niveles de ARNm a las 0, 6, 12 y 24 horas después de la administración de LPS. A. Cambio de veces en TNF-a (panel izquierdo) e IL-1 p (panel derecho) en el cerebro de ratones. B. Cambio de veces en TNF-a (panel izquierdo) e IL-1 p (panel derecho) en los riñones de los ratones. C. Cambio de veces en TNF-a (panel izquierdo) e IL-1 p (panel derecho) en los pulmones de los ratones. D. Cambio de veces en TNF-a (panel izquierdo) e IL-1 p (panel derecho) en el hígado de los ratones;
La Figura 13 muestra que la SEMA3A induce la secreción de citocinas proinflamatorias en células mieloides a través de NRP1. Las células mieloides de ratones tipo salvaje y ratones con desactivación génica de NRP1 LyzM/NRP1fl/fl) se trataron con SEMA3A (100 ng/nmL) o vehículo e IL-6 (A), TNF-a (B) e IL-1 p (C) la secreción de proteínas se analizó mediante Cytometric Bead Array (CBA);
La Figura 14 muestra que la deficiencia de NRP1 en mieloide reduce la producción de citocinas inflamatorias durante la sepsis in vivo. A ratones con desactivación génica de NRP1 (LyzM/NRP1fl/fl) y a ratones de control de tipo salvaje se les administró vehículo o LPS (15 mg/kg) para inducir la sepsis. Se colectaron cerebros e hígados 6 horas después de la inyección de LPS y se extrajo el ARNm. La expresión de TNF-a (A, C) e IL-1p (B, D) se analizó mediante RT-PCR en tiempo real y los niveles se normalizaron con el nivel de expresión de p-actina;
La Figura 15 muestra que in vivo la inhibición de la actividad de NRP1 previene la degradación de la función de barrera inducida por la sepsis. A los ratones se les administró i) vehículo, ii) LPS (15 mg/kg); o iii) LPS (15 mg/kg) y una trampa NRP1 (Trampa-1, Figuras 19C y 20R pero sin un dominio FC, NP_032763, 4 ug/0,2 mg/kg, i.v.). La permeabilidad vascular en el cerebro (A), riñón (B) e hígado (C) se evaluó luego mediante el uso de un ensayo de permeabilidad con Azul de Evans (EBP);
La Figura 16 muestra que in vivo la inhibición de la actividad de NRP1 protege contra la sepsis. (A) Tasa de supervivencia de los ratones de control a los que se les administró i) una dosis alta de LPS (ip, 25 mg/kg); o ii) una trampa NRP1 (i.v., 0,2 mg/kg de Trampa-1, Figuras 19C y 20R pero sin un dominio FC, NP_032763) seguida de una dosis alta de LPS (i.p., 25 mg/kg). (B) Comparación de la tasa de supervivencia entre ratones con desactivación génica de NRP1 residentes en mieloide (LyzM/NRP1fl/fl) y ratones de control a los que se administró una dosis alta de LPS (i.p., 25 mg/kg);
La Figura 17 muestra que la administración de trampa derivada de NRP1 o deficiencia mieloide en NRP1 reduce la producción de citocinas inflamatorias en el choque séptico. A los ratones de tipo salvaje se les administró i) vehículo (n = 3), ii) LPS (15 mg/kg, n = 3) o iii) LPS y una trampa NRP1 (Trampa-1, Figuras 19C y 20R pero sin un dominio FC, n P_032763). Ratones con células mieloides deficientes en NRP1 (LyzM-Cre/Nrpfl/fl) se les administró LPS (15 mg/kg, n = 3). Se colectaron cerebros 6 horas después de la inyección de LPS y la producción de TNF-a (A) e IL-6 (B) fue medida;
La Figura 18 muestra que la administración de trampa derivada de NRP1 protege contra el accidente cerebrovascular isquémico. Los ratones se sometieron a oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO) y se les administró vehículo o trampa NRP1 y se midió el tamaño del infarto (accidente cerebrovascular) en secciones cerebrales coronales teñidas con violeta de cresilo. El área sin teñir corresponde al área dañada. (A), Secciones cerebrales coronales de ratones MCAO tratados con vehículo. (B) Secciones cerebrales coronales de ratones MCAO tratados con NRP1 Trampa-1 (véanse las Figuras 19C y 20R pero sin un dominio FC, NP_032763).
(C) Representación esquemática del tamaño medio del infarto en ratones tratados con vehículo o trampa NRP1 después de MCAO. (D) Deterioro neurológico (neuroscore) de ratones tratados con vehículo o trampa NRP1 1h después de MCAO. (E) Deterioro neurológico (neuroscore) de ratones tratados con vehículo o trampa NRP1 24 h después de MCAO;
La Figura 19 muestra un representación esquemática de la proteína NRP1 y modalidades de trampas NRP1 de la presente invención. (A). Representación de WT NRP1 que muestra el dominio de unión a la SEMA3A (principalmente a1 a2 con una pequeña contribución de b1 y el dominio de unión al VEGF (b1b2). El dominio c es el dominio MEM que se cree que contribuye a la dimerización de NRP a otros correceptores. (B-E) representaciones esquemáticas de trampas NRP1 derivadas de humano (C) y trampas NRP1 derivadas de ratón;
La Figura 20 muestra las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos de las trampas NRP1 representadas en las Figuras 19B y C. (A) secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 114) y nucleótidos (SEQ ID NO: 2) de Trampa 1/TrappeA-NRP1 completo-FC; (B) secuencia de aminoácidos de Trampa 2-NRP1-FC- A c-(SEQ ID NO: 115); (C) secuencia de nucleótidos de Trampa 2- NRP1-FC- A c-(SEQ ID NO: 4); (D) secuencia de aminoácidos de Trampa 3- NRP1-FC-A b2c-(SEQ ID NO: 116); (E). secuencia de nucleótidos de Trampa 3- NRP1-FC-A b2c (SEQ ID NO: 6); (F) secuencia de aminoácidos de Trampa 4- NRP1-FC- Ab1 b2c- (SEQ ID NO: 117); (G) secuencia de nucleótidos de Trampa 4- NRP1-FC- Ab1 b2c (SEQ ID NO: 8); (H) secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 118) y nucleótidos (SEQ ID NO: 10) de Trampa 5/Trampa I- NRP1-FC A c- corta; (I) secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 119) y nucleótidos (SEQ ID n O: 12) de Trampa 6/Trampa D-NRP1-FC A b2c-corta; (J) secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 120) y nucleótidos (SEQ ID NO: 14) de Trampa 7/Trampa C-NRP1-FC A b1b2c-corta;
(K) secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 121) y nucleótidos (SEQ ID NO: 16) de Trampa 8/TrampaJ-NRP1 completo-FC-VEGF bajo; (L) secuencia de aminoácidos de Trampa 9- NRP1-FC-A c-VEGF bajo (SEQ ID NO: 122); (M) secuencia de nucleótidos de Trampa 9- NRP1-FC-A c-VEGF bajo (SEQ ID NO: 18); (N) secuencia de aminoácidos de Trampa 10-NRP1-FC-A b2c-VEGF bajo (SEQ ID NO: 123); (O) secuencia de nucleótidos de Trampa 10-NRP1-FC-A b2c-VEGF bajo (SEQ ID NO: 20); (P) secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 124) y nucleótidos (SEQ ID NO: 22) de Trampa 11/TrampaL-NRP1-FC-A c-VEGF bajo-corto; (Q) secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 125) y nucleótidos (SEQ iD NO: 24) de Trampa 12/TrampaK-NRP1-FC-Ab2 c-VEGF bajo-corto. (R) Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 126) y nucleótidos (SEQ ID NO: 26) de Trampa 1 de ratón-Nrp1 completo-mFC. (S) Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 127) y nucleótidos (SEQ ID NO: 28) de Trampa 2 de ratón-Nrp1-mFC A c-corto. (T) Secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 128) y nucleótidos (SEQ ID NO: 30) de Trampa 3 de ratón-Nrp1-FC A b2c-corto;
La Figura 21 muestra la secuencia de la proteína precursora de la SEMA3A humana (SEQ ID NO: 31). Esta secuencia se procesa adicionalmente en forma madura. Los residuos 1-20 corresponden al péptido señal;
La Figura 22 muestra la secuencia de la proteína del receptor Neuropilina-1 humana soluble (NRP1) (por ejemplo, núm. de acceso GenBank AAH07737.1-SEQ ID NO: 65). Se muestran los dominios a1, a2, b1, b2 y c. El dominio a1 consiste en los aminoácidos 23-148; el dominio a2 consiste en los aminoácidos 149-270; el dominio b1 consiste en los aminoácidos 271-428; el dominio b2 consiste en los aminoácidos 429-590 y el dominio c consiste en los aminoácidos 591-609;
La Figura 23 muestra que las trampas SEMA3A aceleran la regeneración vascular y reducen la angiogénesis patológica en retinas de ratones isquémicos en un modelo de retinopatía inducida por oxígeno. (A) Representación esquemática del modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) que muestra las cuatro etapas principales de la retinopatía, es decir, normoxia, pérdida de vasos/vaso-obliteración, proliferación/neovascularización y regresión neovascular (NV). (B) Porcentaje medio (%) del área avascular (con relación a el vehículo) en P17 después de la inyección intravítrea de Trampa G o Trampa M marcada con histidina (Trampa G-HIS (SEQ ID NO: 38) y Trampa M-HIS (SEQ ID NO: 42)). Se muestran fotografías de retinas representativas que muestran el área avascular para cada grupo. (C) Porcentaje medio de área neovascular (con relación al vehículo) en P17 después de la inyección intravítrea de Trampa G y Trampa M. marcadas con histidina Se muestran fotografías de retinas representativas que muestran el área neovascular para cada grupo. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. n = 8-13 animales/grupo;
La Figura 24 muestra que la trampa de la SEMA3A previene la fuga vascular y el edema en las retinas diabéticas. (A). Niveles de glucosa en sangre de los ratones antes del tratamiento con estreptozotocina (STZ) (semana 0) y 3 semanas después del tratamiento con STZ (estado diabético). (B). Ensayo de permeabilidad retiniana con Azul de Evans (medido en la semana 8) en las retinas de ratones inyectadas vía intravítrea con 0,5 ug/mL de la Trampa G, Trampa M u 80 gg (1 uL) de anticuerpo anti-VEGF164 (AF-493-NA, R&D) a las 6 y 7 semanas después de la administración de STZ. (C) Ensayo de permeabilidad retiniana con Azul de Evans (medido en la semana 14) en retinas de ratones inyectadas vía intravítrea con 0,5 ug/mL de Trampa G o Trampa M o anticuerpo anti-VEGF-164 (AF-493-NA, Novus Biologicals) a las 12 y 13 semanas después del tratamiento con STZ. * p <0,05, n = 4, de 12 animales;
La Figura 25 muestra que la trampa derivada de NRP1 (anti SEMA3A y anti VEGF) reduce la neovascularización coroidea en un modelo de degeneración macular relacionada con la edad (AMD) (A). Representación esquemática del método usado para inducir la neovascularización coroidea en ojos de ratones. (B) Neovascularización coroidea el día 14 después de la quema del láser (área media de FITC/Lectina perfundida). Los ojos de los ratones se inyectaron vía intravítrea con Trampa G justo después de la quema con láser:
La Figura 26 muestra una alineación entre rata (núm. de acceso EDL96784, NP_659566), humana (SEQ ID NO: 68, núm. de acceso NM003873) y de ratón (SEQ ID NO: 67, núm. de acceso NP_032763) junto con una secuencia consenso de NRP1 (SEQ ID NO: 69). Se identifican el dominio señal de NRP1 (aminoácidos 1-21), y los dominios de unión a la SEMA3A a1 (aminoácidos 22-148, SEQ ID NO: 78), a2 (aminoácidos 149-175, SeQ ID NO: 79), dominios de unión a VEGF b1 (aminoácidos 276-428, SEQ ID NO: 80) y b2 (aminoácidos 429-589, SEQ ID NO: 81), dominio c (aminoácidos 590-859, SEQ ID NO: 82), dominio transmembrana (aminoácidos 860-883, SEQ ID NO: 77) y el dominio citoplásmico (aminoácidos 884-923); y
La Figura 27 muestra alineamientos de secuencias de proteínas entre trampas ilustrativas de la presente invención mostradas en la Figura 19 pero sin ninguna etiqueta de histidina o FC. (A). alineación de secuencias de proteínas entre trampas ilustrativas pero que carecen de los dominios de purificación de la etiqueta 6XHis (G (SEQ ID NO: 100), R (SEQ ID NO: 101), Z (SEQ ID NO: 102), AB (SEQ ID NO: 103), AC (SEQ ID NO: 104), O (SEQ ID NO: 105), Q (SEQ ID NO: 106), M (SEQ ID NO: 107), P (SEQ ID NO: 108), N (SEQ ID NO: 109), W (SEQID NO: 110), X (SEQ ID NO: 111) e Y (SEQ ID NO: 112)) de la presente invención que comprende un dominio de purificación de etiqueta 6X His. (B) alineación de secuencias de proteínas entre trampas ilustrativas de la presente invención pero que carecen del dominio FC ((A (SEQ ID NO: 100), I (SEQ ID NO: 105), D (SEQ ID NO: 107), C (SEQ ID NO:109), J (SEQ ID NO: 101), L (SEQ ID NO: 106), K (SEQ ID NO: 108), S (SEQ ID NO: 113), U (SEQ ID NO: 111), V (SEQ ID NO: 112)).
Descripción de las modalidades ilustrativas
Los presentes inventores han identificado un subconjunto de fagocitos mononucleares (MP) que responde a señales quimiotácticas locales tales como SEMA3A que se conservan entre neuronas centrales, vasos y células inmunitarias. Se demostró que los MP que expresan NRP1 ingresan al sitio de la lesión y contribuyen al (i) daño tisular y/o (ii) activación patológica de la respuesta inmunitaria innata en modelos de afecciones inflamatorias que incluyen diversas formas de retinopatías inflamatorias, proliferativas (por ejemplo, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía del prematuro y degeneración macular asociada a la edad), choque séptico e isquemia cerebral/accidente cerebrovascular.
Los inventores demostraron que las neuronas retinianas estresadas y el tejido neural tienen la capacidad inherente de modular la respuesta inmunitaria innata local a través de agentes quimiotácticos no convencionales. Se descubrió que el NRP1 en la microglía es un potente receptor quimioatractivo para la SEMA3A y el VEGF, y la inhibición de la señalización de NRP1 en células inmunitarias innatas (por ejemplo, usando trampas derivadas de NRP1 o anticuerpos anti NRP1 o anti SEMA3A) dio como resultado protección contra la inflamación y el daño tisular inducido por MP.
Se demostró que los pacientes que padecían retinopatía diabética proliferativa (PDR) en etapa tardía producían niveles elevados de SEMA3A que, de manera contraria a la intuición, actúa como un atrayente potente para MP positivos a Neuropilina-1 (NRP1). Estos MP proangiogénicos se reclutan selectivamente en sitios de neovascularización patológica en respuesta a la SEMA3A producida localmente, así como también al VEGF y el TGF-p. Además, se demostró que la SEMA3A se regula positivamente en varios órganos durante el choque séptico e induce la secreción de citocinas inflamatorias por MP. La inhibición de NRP1 también redujo la producción de citocinas proinflamatorias en la sepsis.
Finalmente, se demostró que los MP positivos para NRP1 desempeñan un papel fundamental en la progresión de la enfermedad inflamatoria. Se demostró que la inhibición/abrogación de la actividad de NRP1 dependiente de mieloide protege contra la enfermedad retiniana neovascular (degeneración vascular y neovascularización patológica), choque séptico y daños neurales secundarios a isquemia cerebral/accidente cerebrovascular.
Juntos, estos hallazgos subrayan el papel de los MP positivos para NRP1 y sus ligandos en la inflamación (y en particular en la neuroinflamación) y demuestran el beneficio terapéutico de inhibir la señalización de las células dependiente de NRP1 para limitar la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata (por ejemplo, daño tisular en el sitio de lesión por reclutamiento de microglía/macrófagos y/o inducción de la producción y/o secreción de citocinas proinflamatorias y/o fuga/edema vascular). Los presentes hallazgos encuentran aplicaciones en la prevención y el tratamiento de enfermedades y afecciones caracterizadas por inflamación sostenida (por ejemplo, crónica, persistente) o excesiva/patológica que involucra el reclutamiento de MP y la producción y secreción de citocinas proinflamatorias, tales como choque séptico, artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), inflamación cutánea de la piel, diabetes, uveítis y afecciones neuroinflamatorias tales como retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía del prematuro, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), deterioro cognitivo relacionado con la edad/enfermedad de Alzheimer y accidente cerebrovascular.
Inhibición de la actividad celular mediada por NRP1
Los presentes inventores han descubierto que inhibiendo la señalización celular dependiente de NRP1 (y en particular la señalización celular mediada por la SEMA3A), es posible proteger (prevenir o tratar) enfermedades y afecciones inflamatorias tales como las que implican la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata. En particular, la inhibición de la señalización celular mediada por NRP1 reduce el reclutamiento no deseado (patológico) de fagocitos mononucleares (MP, por ejemplo, microglía, macrófagos) y la producción/secreción de citocinas proinflamatorias que contribuyen al daño tisular (por ejemplo, aumento de la degeneración vascular, neovascularización patológica, muerte celular o daños celulares), inflamación y edema.
Por tanto, en un aspecto, la presente descripción se refiere a un método para tratar o prevenir la inflamación que comprende inhibir la señalización celular dependiente de NRP1. En un aspecto particular, la inflamación es neuroinflamación.
Como se usa en el presente documento, el término "inflamación" significa una enfermedad o afección que implica la activación de la respuesta inmunitaria innata que comprende i) el reclutamiento de fagocitos mononucleares (por ejemplo, microglía o macrófagos) que expresan el receptor NRP1 en el sitio de inflamación o lesión; y/o ii) la producción/secreción dependiente de NRP1 de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-1 p, TNF-a, IL-6). Los signos clásicos de inflamación aguda son dolor, calor, enrojecimiento, hinchazón y pérdida de función. La inflamación puede clasificarse como aguda o crónico. La inflamación aguda es la respuesta inicial del cuerpo a los estímulos dañinos y se logra mediante el aumento del movimiento de plasma y leucocitos (especialmente granulocitos) desde la sangre hacia los tejidos lesionados. Una cascada de eventos bioquímicos propaga y madura la respuesta inflamatoria, involucrando el sistema vascular local, el sistema inmunológico y varias células dentro del tejido lesionado. La inflamación prolongada (sostenida), conocida como inflamación crónica, genera un cambio progresivo en el tipo de células presentes en el sitio de la inflamación y se caracteriza por la destrucción y curación simultáneas del tejido del proceso inflamatorio. Los ejemplos no limitantes de afecciones inflamatorias que pueden tratarse o prevenirse de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen choque séptico, artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), inflamación cutánea de la piel, diabetes, uveítis y afecciones neuroinflamatorias tales como retinopatía diabética (que incluye retinopatía diabética proliferativa (PDR), degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía del prematuro, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), deterioro cognitivo relacionado con la edad/enfermedad de Alzheimer y accidente cerebrovascular.
En una modalidad particular, la enfermedad o afección inflamatoria no es una retinopatía. En otra modalidad, la enfermedad o afección inflamatoria no es retinopatía diabética. En otra modalidad, la enfermedad o afección inflamatoria no es un edema macular. En otra modalidad, la enfermedad o afección inflamatoria no es edema macular diabético.
En un aspecto relacionado, la presente descripción se refiere a un método para inhibir la hiperactivación (o activación patológica) de la respuesta inmunitaria innata que comprende inhibir la señalización celular dependiente de NRP1. Tal hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata se asocia típicamente con la activación aguda o crónica de cualquier población celular dada del sistema inmunitario (innata y adaptativa, por ejemplo, reclutamiento de células mononucleares en el órgano/tejido) más allá de los niveles requeridos para mantener la homeostasis tisular. Esto a menudo se acompaña de una mayor producción de citocinas (por ejemplo, TNF-alfa, IL-6), mayor permeabilidad vascular y puede resultar en una función tisular comprometida.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para tratar o prevenir la degeneración vascular que comprende inhibir la señalización celular dependiente de NRP1.
En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para tratar o prevenir la neovascularización patológica que comprende inhibir la señalización celular dependiente de NRP1.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para tratar o prevenir el choque séptico que comprende inhibir la señalización celular dependiente de NRP1.
En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a un método para tratar o prevenir daños neurales secundarios a isquemia cerebral/accidente cerebrovascular que comprende inhibir la señalización celular dependiente de NRP1.
Debido a que la señalización celular mediada por NRP1 (por ejemplo, el reclutamiento de MP y la producción/secreción de citocinas proinflamatorias) depende de la unión de NRP1 a sus ligandos (por ejemplo, SEMA3A, VEGF y/o TGF-P), la inhibición de la señalización celular mediada por NRP1 puede lograrse de al menos dos formas: i) dirigiendo la expresión o actividad de NRP1 directamente (mediante el uso de anticuerpos anti-NRP1, trampas derivadas de NRP1 o similares); o ii) dirigiendo la expresión o actividad de uno o más de sus ligandos (por ejemplo, SEMA3A, VEGF y/o TGF-p).
En modalidades, los métodos anteriores comprenden inhibir preferencial o específicamente la señalización celular mediada por SEMA3A. "Inhibidor preferencial" significa que el nivel de inhibición de la señalización celular mediada por SEMA3A es mayor que el de otros ligandos de NRP1 (por ejemplo, VEGF165 y TGF-beta). En ciertos aspectos, los métodos de la presente descripción sustancialmente no reducen o inhiben la señalización celular mediada por VEGF (por ejemplo, VEGF165) y/o TGF-beta que se produce a través de la interacción con NRP1. Las trampas NRP1 de la presente invención "se unen preferentemente" a un ligando sobre los demás (por ejemplo, se unen preferentemente a SEMA3A sobre VEGF). Tal interacción preferencial puede determinarse midiendo la constante de disociación (Kd) para cada ligando. En las modalidades, la interacción para un ligando (por ejemplo, SEMA3A) sobre los otros (por ejemplo, VEGF) es al menos 1,5; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 28, 20, 22, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 veces mayor o más. En modalidades, la Kd (por ejemplo, en nM) para un ligando es al menos 1,5; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 28, 20, 22, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 veces más pequeña que la Kd para uno o más de los otros ligandos (por ejemplo, VEGF).
En una modalidad, los métodos de la presente descripción comprenden la administración a un sujeto que probablemente sufra inflamación (por ejemplo, que probablemente sufra una enfermedad o afección inflamatoria). En otra modalidad, los métodos de la presente descripción comprenden la administración a un sujeto diagnosticado de inflamación (por ejemplo, que probablemente sufra una enfermedad o afección inflamatoria). En una modalidad, el sujeto es un mamífero, preferentemente, un ser humano.
Trampas NRP1
La inhibición de la señalización celular mediada por NRP1 puede lograrse mediante el uso de trampas NRP1 de la presente invención. Como se usa en el presente documento, los términos "trampa NRP1" o "trampa de polipéptido NRP1" abarcan polipéptido NRP1 soluble de origen natural (por ejemplo, tal como la isoforma b secretada por NRP1 Figura 22, SEQ ID NO: 65)) y sintético (por ejemplo, producido de forma recombinante) trampas de polipéptido NRP1 que incluyen cualquier fragmento soluble funcional de NRP1 (por ejemplo, isoforma 1 o 2 de NRP1) o cualquier variante funcional de NRP1 que compita con NRP1 endógena por la unión al ligando. En una modalidad, las trampas NRP1 no existen en la naturaleza (es decir, no se producen naturalmente) pero se "derivan" de polipéptidos NRP1 naturales (es decir, son sintéticas; por ejemplo, trampas NRP1 que comprenden el dominio extracelular de la isoforma 1 de NRP1 o una fragmento o variante del mismo). Las trampas NRP1 comprenden inicialmente un péptido señal en su extremo N-terminal (por ejemplo, los aminoácidos 1-21 (SEQ ID NO: 70) de NRP1 mostrados en la Figura 26 (por ejemplo, SEQ ID NO: 69) que se escinde tras la secreción por las células. En consecuencia, las trampas de polipéptido n RP1 carecen de los aminoácidos 1-21 cuando se administran como polipéptidos purificados o cuando se preparan como composiciones farmacéuticas que comprenden una forma purificada o sustancialmente pura. Los ácidos nucleicos que codifican las trampas NRP1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 34, 32, 34, 36, 39, 41, 43, 45, 47, etc. Véase también la Tabla 1) comprenden una secuencia de polinucleótidos en 5' que codifica un péptido señal (primeros 63 nucleótidos que codifican los primeros 21 aminoácidos en el extremo N-terminal) que permitirá a la trampa NRP1 ser sintetizada y secretada por las células. En una modalidad particular, el péptido señal corresponde a los primeros 20 aminoácidos del polipéptido NRP1 que se muestra en SEQ ID NO: 65 (Figura 22) o SEQ ID NO: 69 (Figure 26). Las trampas de NRP1 abarcan variantes funcionales de polipéptidos NRP1 de "tipo salvaje" correspondientes o fragmentos de los mismos (por ejemplo, variaciones polimórficas que se encuentran naturalmente en la población).
Las trampas de NRP1 pueden comprender o no dominios polipeptídicos adicionales (por ejemplo, dominios de purificación). En la Figura 27 se muestran trampas ilustrativas que carecen de dominios de purificación y que comprenden solo secuencias derivadas de NRP1. Los ejemplos no limitantes de trampas NRP1 que pueden usarse se dan en las Figuras 19BE, Figura 20, Figura 27 y se enumeran en la Tabla 1 más abajo.
Tabla 1: Trampas ilustrativas derivadas de NRP1 que se han preparado.
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(continuación)
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Dado que NRP1 regula claramente los efectos de sus ligandos sobre la transducción de señales y las respuestas celulares, puede ser ventajoso inhibir específicamente la unión de un ligando específico a NRP1 pero no a los demás. Por ejemplo, como se muestra en la presente descripción, en los puntos de tiempo tempranos de la enfermedad de la retina, donde los niveles de SEMA3A están elevados, los niveles de VEGF permanecen bajos y relativamente sin cambios en comparación con los controles no diabéticos. Además, en el choque séptico, SEMA3A fue el único ligando de NRP1 que tuvo un efecto a largo plazo y se mantuvo regulado positivamente por más de 24 horas después de la inducción de la sepsis. Por lo tanto, dadas las diferencias en la cinética de expresión para cada ligando y el hecho de que la neutralización de un ligando (por ejemplo, VEGF) puede ser ineficaz en ciertas condiciones (o estar asociada con efectos secundarios no deseados), inhibición específica de un ligando (por ejemplo, SEMA3A) la unión a NRP1, (pero no a la de los otros (por ejemplo, VEGF)) es ventajosa. Por lo tanto, en ciertos aspectos de los métodos de la presente descripción, la inhibición de la señalización celular mediada por SEMA3A se logra proporcionando trampas NRP1 que tienen mayor afinidad por SEMA3 que VEGF o a las que VEGF (por ejemplo, VEGF165) no se une o no se une sustancialmente.
En consecuencia, en una modalidad, el polipéptido NRP1 soluble o fragmento funcional o variante del mismo (trampa NRP1) se une a todos los ligandos naturales de NRP1 (por ejemplo, SEMA3A, VEGF y TGF-beta, por ejemplo, una trampa NRP1 soluble que comprende el dominio extracelular (por ejemplo, aminoácidos 22-856 o 22-959 de SEQ ID NO: 66 o 69), Trampa 1, (SEQ ID NO: 1) o Trampa G (SEQ iD NO: 38)- Ver también, Figuras 19 y 27 y Tabla 1). En una modalidad, la trampa derivada de NRP1 inhibe la señalización de SEMA3 y VEGF uniéndose tanto a SEMA3A como a VEGF.
En otra modalidad, la trampa NRP1 es un polipéptido que se une a SEMA3A pero no a VEGF. Por ejemplo, la trampa NRP1 puede comprender los subdominios a1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 71) y/o a2 (por ejemplo, SEQ iD NO: 72) que se unen a SEMA3A pero no a b1 (por ejemplo, SeQ ID NO: 73) y/o b2 (por ejemplo, SeQ ID NO: 74) subdominio (s) necesarios para la unión de VEGF (por ejemplo, Trampa M, (SEQ ID NO: 42), que es una trampa NRP1 de acuerdo con la presente invención, trampa N (SEQ ID NO: 44), trampa 12/trampa K (SEQ ID NO: 23), que es otra trampa NRP1 de acuerdo con la presente invención, Trampa 4 (SEQ ID NO: 7), Trampa 7/C ( SEQ ID NO: 13), véanse también las Figuras 19 y 27 y la Tabla 1). En una modalidad, la trampa derivada de NRP1 comprende los dominios a1 y a2 correspondientes a los aminoácidos 22 a 275 de la secuencia de aminoácidos de NRP1 que se muestra en la Figura 26 (por ejemplo, los aminoácidos 22-275 de SEQ ID NO: 66 o SEQ ID NO: 22-275 de SeQ ID NO: 69). La trampa NRP1 también puede comprender una mutación (por ejemplo, una deleción o sustitución) que anula o reduce significativamente la unión de VEGF a NRP1 pero no la de SEMA3A a NRP1 (por ejemplo, Trampa 8/Trampa J (SEQ ID NO: 15), Trampa 9 (SEQ ID NO: 17), Trampa 10 (SEQ ID NO: 19), que es una trampa NRP1 de acuerdo con la presente invención, Trampa 11/L (SEQ ID NO: 21), Trampa 12/Trampa K (SEQ ID NO: 23), que es una trampa NRP1 de acuerdo con la presente invención, Trampa U (SEQ ID NO: 34), que es una trampa NRP1 de acuerdo con la presente invención, Trampa R (SEQ ID NO: 46), Trampa Q (SEQ ID NO: ID NO: 48), Trampa P (SEQ ID NO: 50), que es una trampa NRP1 de acuerdo con la presente invención, Trampa X (SEQ ID NO: 54), que es una trampa NRP1 de acuerdo con la presente invención, Trampa AC (SEQ ID NO: 60), Trampa Z (SEQ ID NO: 62), véanse también las Figuras 19 y 27 y la Tabla 1). Un ejemplo no limitante de tal mutación es una sustitución en la tirosina 297 en el dominio b1 de NRP1 (por ejemplo, Y297A, Figuras 19B-D, Figura 27 y Tabla 1, por ejemplo, Trampas 8, 9, 10, 11, 12, V, R, Q, P y X). Otros ejemplos de tales mutaciones comprenden una sustitución en el ácido glutámico en la posición 319 y en el ácido aspártico en la posición 320 en NRP1 (por ejemplo, E319K y D320K tal como en la Trampa AC y Z (SEQ ID NO: 60, 62)).
En otra modalidad, la trampa NRP1 es un polipéptido NRP1 soluble o un fragmento funcional o variante del mismo que se une a VEGF pero no a SEMA3A. Por ejemplo, la trampa NRP1 puede comprender los dominios b1 (por ejemplo, Se Q ID NO: 73) y/o b2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 74) para unirse a v Eg f pero no al a1 (por ejemplo, SeQ ID NO: 71) y/o subdominio (s) a2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 72) que se unen a SEMA3A. En una modalidad, la trampa NRP1 comprende los dominios b1b2 correspondientes a los aminoácidos 276 a 589 de la secuencia de aminoácidos NRP1 que se muestra en la Figura 26 (por ejemplo, los aminoácidos 276-589 de la SEQ ID NO: 66 o 276-289 de la SEQ ID NO: 69). En otra modalidad, la trampa NRP1 puede comprender una mutación que reduce o anula la unión de SEMA3A pero no la de VEGF. Un ejemplo no limitante de tal mutación es una sustitución en la serina 346 y/o el ácido glutámico 348 de NRP1 (por ejemplo, mutaciones S346A y E348K, tal como en la trampa AB (SEQ ID NO: 58)-Ver también las Figuras 19 y 27).
En una modalidad, el polipéptido NRP1 soluble o fragmento funcional del mismo comprende o consiste en trampas como se muestra en las Figuras 19B-E, 20, 27 y Tabla 1.
En modalidades preferidas, las trampas NRP1 carecen del dominio transmembrana (por ejemplo, correspondiente a los residuos de aminoácidos 860 a 883 de las secuencias de polipéptido NRP1 mostradas en la Figura 26 (tal como SEQ ID NO: 66 y 69)) y dominio citosólico (por ejemplo, Correspondiente a los residuos de aminoácidos 884-923 de las secuencias de la isoforma 1 del polipéptido NRP1 mostradas en la Figura 26 (tal como SEQ ID NO: 66 y 69)) que se encuentran, por ejemplo, en la isoforma 1 de NRP1. En modalidades, las trampas de NRP1 carecen total o parcialmente del dominio c de NRP1. La isoforma 1 de NRP1 comprende un dominio c más grande (ver Figura 26), mientras que el de la isoforma 2 es más corto (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos VLATEKPTVIDSTIQSGIK (SEQ ID NO: 99) mostrada en la Figura 22). Particularmente, el dominio c no es esencial para la unión de SEMA3A y VEGF y, por tanto, puede excluirse de las trampas de NRP1 usadas para inhibir la señalización celular dependiente de NRP1 (o la señalización celular mediada por SEMA3A). En una modalidad, la trampa NRP1 carece del dominio c correspondiente a los aminoácidos 590 a 859 de la secuencia de aminoácidos NRP1 que se muestra en la Figura 26 (por ejemplo, los aminoácidos 590 a 859 de SEQ ID NO: 66 o SEQ ID NO: 69). En una modalidad, las trampas NRP1 carecen total o parcialmente del dominio c de la isoforma 2 como se muestra en la Figura 22 (por ejemplo, SEQ ID NO: 99). En una modalidad, las trampas de NRP1 comprenden el dominio c de la isoforma 2 de NRP1. En otra modalidad, la trampa derivada de NRP1 carece de una porción del dominio c correspondiente a los aminoácidos que se muestra en SeQ ID NO: 75.
El polipéptido NRP1 soluble o el fragmento funcional o variante del mismo de la presente invención puede comprender uno o más dominios polipeptídicos adicionales para aumentar in vivo estabilidad y/o facilitar la purificación. Por ejemplo, las trampas Nr P1 de la presente invención pueden incluir un dominio FC (o parte del mismo, tal como el dominio FC humano que se muestra en SEQ ID NO: 37) o una etiqueta de purificación (por ejemplo, una etiqueta de histidina 6X). Tales dominios polipeptídicos adicionales pueden unirse directa o indirectamente (a través de un enlazador) al polipéptido NRP1 soluble o fragmento funcional del mismo.
El polipéptido NPR1 soluble o fragmento funcional del mismo de la presente invención puede incluir opcionalmente uno o más enlazadores polipeptídicos. Tales enlazadores pueden usarse para unir uno o más dominios polipeptídicos adicionales al polipéptido soluble de la presente invención (por ejemplo, un dominio polipeptídico que aumenta la estabilidad del polipéptido in vivo y/o un dominio que facilita la purificación del polipéptido). La secuencia enlazadora puede incluir opcionalmente sitios de escisión de peptidasa o proteasa que pueden usarse para eliminar uno o más fragmentos o dominios polipeptídicos (por ejemplo, eliminación de la etiqueta de purificación antes de la administración in vivo de los polipéptidos NRP1 solubles o fragmentos funcionales de los mismos). Un ejemplo no limitante de un enlazador o dominio que permite la escisión del polipéptido y la eliminación de, por ejemplo, dominios polipeptídicos (p. Ej., dominio de purificación de etiqueta 6X his) incluye un polipéptido que comprende un sitio de escisión de proteasa TEV (por ejemplo, GSKENLYFQ'G, SEQ ID NO: 76). Se conocen muchos otros sitios de escisión de TEV y el experto conoce muchos otros sitios de escisión de proteasa/peptidasa y pueden introducirse en los polipéptidos de la presente invención para eliminar opcionalmente uno o más dominios o fragmentos polipeptídicos.
También pueden usarse enlazadores polipeptídicos para reemplazar total o parcialmente dominios que se encuentran normalmente en el polipéptido NRP1 de tipo salvaje pero que están ausentes en el polipéptido NRP1 soluble o fragmento funcional del mismo de la presente invención. Por ejemplo, en las trampas NRP1 de la presente invención, los enlazadores sintéticos pueden reemplazar total o parcialmente los dominios a1, a2, b1, b2 y c. La longitud del enlazador puede corresponder a la longitud total del dominio eliminado o a una porción del mismo. Tales enlazadores pueden aumentar el plegado, la estabilidad o la unión de proteínas a ligandos NRP1. En la Figura 19 y 20 se muestran ejemplos no limitantes de trampas NRP1 que comprenden enlazadores (por ejemplo, Trampa 2, Trampa 3, Trampa 4, Trampa 9 y Trampa 10 enumeradas en la Tabla 1). Un ejemplo no limitante de un enlazador polipeptídico útil es un polipéptido de poliarginina. Se conocen otros enlazadores en la técnica y pueden usarse de acuerdo con la presente invención.
En una modalidad, la trampa de NRP1 comprende: (i) Los aminoácidos 1-856 (preferentemente, 22 a 856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (ii) los aminoácidos 1 a 583 (preferentemente 22 a 583) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (iii) los aminoácidos 1 a 424 (preferentemente 22-424) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (iv) los aminoácidos 1 a 265 (preferentemente 22 a 265) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ iD NO: 69); (v) los aminoácidos 1 a 430 y 584 a 856 (preferentemente 22-430 y 584-856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID n O: 69); (vi) los aminoácidos 1 a 274 y 584 a 856 (preferentemente 22-274 y 584 a 856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69); (vii) los aminoácidos 1 a 430 y 584 (preferentemente 22 a 430 y 584 a 856) del polipéptido NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 69). En una modalidad particular, las trampas indicadas anteriormente comprenden una o más mutaciones para reducir la unión del VEGF o la SEMA3A como se describió anteriormente.
En un aspecto relacionado, la presente descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican las trampas NRP1 (por ejemplo, trampas enumeradas en la Tabla 1 y mostradas en las Figuras 19, 20 y 27). Tales ácidos nucleicos pueden incluirse en un vector de expresión para expresión en células. En consecuencia, la presente descripción se refiere además a vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican polipéptido NRP1 soluble o fragmentos funcionales del mismo y células que comprenden tales vectores de expresión. Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido NRP1 soluble o un fragmento funcional del mismo (es decir, una trampa derivada de NRP) de la presente invención pueden incluir una porción polinucleotídica que codifica una secuencia señal (por ejemplo, que codifica los aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO: 65, 66 o 69, o SEQ ID NO: 70) para la secreción por las células. Además, los ácidos nucleicos de la presente descripción incluyen ácidos nucleicos con y sin un codón de terminación de la traducción en su extremo 3'. El codón de terminación de la traducción puede proporcionarse, por ejemplo, mediante un vector de expresión en el que pueden clonarse los ácidos nucleicos de la presente descripción.
Como se usa en este documento, un "fragmento funcional" o "variante funcional" de NRP1 (por ejemplo, un fragmento funcional de polipéptido NRP1 soluble o polinucleótido de la presente invención tal como un n RP1) se refiere a una molécula que retiene sustancialmente la misma actividad deseada como la molécula original pero que difiere por cualquier modificación y/o sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos/nucleótidos (por ejemplo, fusión con otro polipéptido). Pueden producirse modificaciones en cualquier lugar, incluyendo la cadena principal de polipéptido/polinucleótido (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxi). Tales sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más aminoácidos o, en el caso de polinucleótidos, uno o más nucleótidos. Las sustituciones son preferentemente conservativas, es decir, un aminoácido se reemplaza por otro aminoácido que tiene propiedades físicoquímicas similares (tamaño, hidrofobicidad, carga/polaridad, etc.) bien conocidas por los expertos en la técnica. Los fragmentos funcionales de la NRP1 soluble incluyen un fragmento o una porción de un polipéptido NRP1 soluble (por ejemplo, los dominios a1 y/o a2) o un fragmento o una porción de un homólogo o variante alélica de NRP1 que retiene la actividad inhibidora, es decir, se une a SEMA3A, VEGF y/o TGF-P e inhibe la transducción de la actividad celular mediada por NRP1. Los ejemplos no limitantes de actividad celular mediada por NRP1 incluyen i) hiperpermeabilidad vascular; ii) activación y reclutamiento de MP; iii) inducción de apoptosis; iv) inducción de producción y/o secreción de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, TNF-a, IL-1P). En una modalidad, el polipéptido NRP1 es al menos 80, 85, 88, 90, 95, 98 o 99 % idéntico a la secuencia polipeptídica de la Figura 22 (isoforma 2 de NRP1, SEQ ID NO: 65) o los aminoácidos 1-859 o 22-859 de la isoforma 1 de NRP1 que se muestra en la Figura 26 (SEQ ID NO: 66 y 69). En una modalidad, el fragmento funcional NRP1 comprende subdominios a1, a2, b1, b2 y/c que son al menos 80, 85, 88, 90, 95, 98 o 99 % idénticos a los subdominios a1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 71 o aminoácidos 22-148 de SEQ ID NO: 66), a2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 72, o aminoácidos 149-275 de SEQ ID NO: 66), b1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 73 o aminoácidos), b2 (por ejemplo, SEQ ID NO: 74 o aminoácidos 429-589 de SEQ iD NO: 66) y/o c (por ejemplo, SEQ ID NO: 75 o aminoácidos 590-859 de SEQ ID NO: 66) de NRP1 como se representa en la Figura 22 o 26 (SEQ ID NO: 65 y 66 respectivamente). En una modalidad, el NRP1 es una variante funcional que incluye variaciones (sustituciones y/o deleciones conservadoras o no conservadoras) en aminoácidos que no se conservan entre NRP1 de rata, ratón y humano (ver Figura 26 y la secuencia consenso que se muestra en SEQ ID NO: 69). Preferentemente, el polipéptido/polinucleótido NRP1 o fragmento del mismo es humano.
Tabla 2: Ejemplos no limitantes de sustituciones en las trampas de polipéptido NRP1 soluble/NRPI de la presente invención.
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Anticuerpos
La actividad celular de NRP1 puede inhibirse mediante el uso de un agente que bloquea la unión de NRP1 a uno o más de sus ligandos (por ejemplo, la SEMA3A,el VEGF y/o el TGF-p). Un ejemplo de tal agente es un anticuerpo que se une a NRP1 y bloquea la unión de NRP1 a la SEMA3A, el VEGF y/o el TGF-p.
Alternativamente, la inhibición de la señalización celular mediada por NRP1 puede lograrse mediante el uso de un agente que bloquea la unión de un ligando de NRP1 al polipéptido de NRP1. Los ejemplos no limitantes de tal agente incluyen un anticuerpo que se une a la SEMA3A, el VEGF o el TGF-p y bloquea su unión respectiva a NRP1.
En un aspecto particular de la presente descripción, los anticuerpos que se dirigen a NRP1 bloquean la unión de la SEMA3A al receptor pero no interfieren sustancialmente con la unión del VEGF y/o del TGF-p a NRP1. En una modalidad, el anticuerpo anti NRP1 se une a los dominios a1a2 del polipéptido NRP1. En otra modalidad, el anticuerpo anti NRP1 se une a los subdominios a1 o a2 del polipéptido NRP1.
Como se indicó anteriormente, los anticuerpos anti SEMA3A pueden usarse para inhibir (es decir, reducir total o parcialmente) la señalización celular mediada por NRP1 bloqueando la unión de la SEMA3A a NRP1. Los anticuerpos anti SEMA3A útiles se unen al dominio SEMA de la SEMA3A y bloquean la interacción con NRP1. En modalidades, los anticuerpos anti SEMA3A usados de acuerdo con la presente descripción incluyen anticuerpos que se unen a dominios polipeptídicos de la SEMA3A que comprenden los residuos de aminoácidos 252-260, 359-366 o 363-380 de la SEMA3A. Los anticuerpos anti SEMA3A que inhiben la unión de la SEMA3A al NRP1 son conocidos en la técnica y pueden usarse de acuerdo con la presente descripción.
Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo anti NRP1" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a (interactúa con) la proteína NRP1 y no muestra una unión sustancial a otras proteínas de origen natural distintas de las que comparten los mismos determinantes antigénicos que la proteína NRP1. De manera similar, la expresión "anticuerpo anti SEMA3A", "anticuerpo anti VEGF" o "anticuerpo anti TGF-P" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente (interactúa con) una proteína SEMA3A, VEGF o TGF-p respectivamente y no muestra una unión sustancial a otras proteínas de origen natural distintas de las que comparten los mismos determinantes antigénicos que la proteína SEMA3A/VEGF/TGF-P diana.
Los anticuerpos que pueden usarse de acuerdo con la presente descripción incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados así como también quiméricos. El término anticuerpo o inmunoglobulina se usa en el sentido más amplio y abarca los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos y los fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión al antígeno o una región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F (ab')2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, de camélidos), nanocuerpos, anticuerpos de dominio único de tiburón NAR, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos también pueden referirse a restos de unión que comprenden CDR o dominios de unión a antígenos que incluyen, pero no se limitan a, regiones VH (VH, VH-VH), anticalinas, PepBodies ™, fusiones anticuerpo-epítopo de células T (Troybodies) o Pepticuerpos.
Los anticuerpos anti-NRP1/sem3A/VEGF/TGF-p humanos se han preparado previamente y también están disponibles comercialmente de diversas fuentes que incluyen Santa Cruz, AbCam y Cell Signalling.
En general, las técnicas para preparar anticuerpos (que incluyen anticuerpos monoclonales, hibridomas y anticuerpos humanizados cuando se conocen sus secuencias) y para detectar antígenos mediante el uso de anticuerpos se conocen bien en la técnica y varios protocolos son bien conocidos y están disponibles.
Inhibición de la expresión de NRP1 o de los ligandos de NRP1
Hay varios enfoques disponibles para disminuir la expresión (a nivel de ARNm o proteína) del NRP1 o sus ligandos (por ejemplo, la SEMA3A, el VEGF o el TGF-P) para inhibir la señalización celular mediada por NRP1 y así reducir la inflamación y la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata (es decir, i)la producción y/o secreción de citocinas proinflamatorias; ii) el reclutamiento de fagocitos mononucleares (MP); iii)la hiperpermeabilización vascular; y/o iv)el edema, v)el daño neuronal, la neovascularización coroidea, etc.). Un ejemplo no limitante incluyen el uso de horquilla pequeña shRNA (RNAi), antisentido, ribozimas, efectores TAL dirigidos a NRP1, SEMA3A, VEGF o Tgf-fi promotor o similar.
La expresión en células de shRNA, siRNA, oligonucleótidos antisentido o similares puede obtenerse mediante la administración de plásmidos o mediante vectores virales (por ejemplo, vector lentiviral) o bacterianos.
Por lo tanto, en modalidades alternativas, la presente descripción proporciona moléculas de shRNA antisentido y ribozimas para administración exógena para efectuar la degradación y/o inhibición de la traducción del ARNm de interés. Preferentemente, las moléculas de shRNA antisentido y las ribozimas se dirigen a la expresión de NRP1, SEMA3A, VEGF y/o Tgf-fi. Ejemplos de aplicaciones terapéuticas de oligonucleótidos antisentido incluyen: La patente de los Estados Unidos núm. 5,135,917, expedida el 4 de agosto de 1992; la patente de los Estados Unidos núm.
5,098,890, expedida el 24 de marzo de 1992; la patente de los Estados Unidos núm. 5,087,617, expedida el 11 de febrero de 1992; la patente de los Estados Unidos núm. 5,166,195, expedida el 24 de noviembre de 1992; la patente de los Estados Unidos núm. 5,004,810, expedida el 2 de abril de 1991; la patente de los Estados Unidos núm.
5,194,428, expedida el 16 de marzo de 1993; la patente de los Estados Unidos núm. 4,806,463, expedida el 21 de febrero de 1989; la patente de los Estados Unidos núm. 5,286,717 expedida el 15 de febrero de 1994; la patente de los Estados Unidos núm. 5,276,019 y la patente de los Estados Unidos núm. 5,264,423; BioWorld Today, 29 de abril de 1994, pág. 3.
Preferentemente en moléculas antisentido, existe un grado suficiente de complementariedad con el ARNm de interés para evitar la unión inespecífica de la molécula antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, tal como en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico o, en el caso de ensayos in vitro, en las condiciones en las que se realizan los ensayos. El ARNm diana para la unión antisentido puede incluir no solo la información para codificar una proteína, sino también los ribonucleótidos asociados, que, por ejemplo, forman la región no traducida 5', la región no traducida 3', la región de caperuza 5' y los ribonucleótidos de la unión intrón/exón. Un método de cribado de ácidos nucleicos antisentido y ribozima que puede usarse para proporcionar moléculas tales como inhibidores de Shc de la invención se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,932,435.
Las moléculas antisentido (oligonucleótidos) de la descripción pueden incluir aquellas que contienen enlaces de cadena principal entre azúcares tales como fosfotriésteres, metil fosfonatos, enlaces entre azúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta, fosforotioatos y aquellos con CH2--NH--O--CH2, CH2--N(CH3)--O--CH2 (conocido como metileno (metilimino) o cadena principal de MMI), CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 y O-N(CH3) -CH2 --CH2 cadena principal (donde el fosfodiéster es O--P--O--CH2). También pueden usarse oligonucleótidos que tienen estructuras de cadena principal de morfolino (patente de los Estados Unidos núm. 5,034,506). En modalidades alternativas, los oligonucleótidos antisentido pueden tener una cadena principal de ácido nucleico peptídico (PNA, a veces denominado "ácido nucleico proteico"), en el que la cadena principal del fosfodiéster del oligonucleótido puede reemplazarse con una cadena principal de poliamida en donde las bases nucleosídicas se unen directa o indirectamente a aza átomos de nitrógeno o grupos metileno en la cadena principal de poliamida (Nielsen y otros, 1991, Science 254: 1497. y patente de los Estados Unidos núm. 5,539,082). Los enlaces fosfodiéster pueden estar sustituidos con estructuras que son quirales y enantioméricamente específicas. Los expertos en la técnica podrán seleccionar otros enlaces para usar en la práctica de la descripción.
Los oligonucleótidos también pueden incluir especies que incluyen al menos una base de nucleótidos modificada. Por tanto, pueden usarse purinas y pirimidinas distintas de las que se encuentran normalmente en la naturaleza. De manera similar, también pueden efectuarse modificaciones en la porción pentofuranosilo de las subunidades de nucleótidos. Ejemplos de tales modificaciones son nucleótidos sustituidos con 2'-O-alquilo y 2'-halógeno. Algunos ejemplos específicos de modificaciones en la posición 2' de restos de azúcar que son útiles en la presente invención son Oh , SH, SCH3, F, OCN, O (CH2)n NH2 o O(CH2)n CH3 donde n es de 1 a aproximadamente 10; C1 a C10 alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo de reporteros; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Uno o más grupos pentofuranosilo pueden ser reemplazados por otro azúcar, por un imitador de azúcar tal como ciclobutilo o por otro resto que toma el lugar del azúcar.
En algunas modalidades, los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con esta descripción pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 unidades de nucleótidos. Como se apreciará, una unidad de nucleótidos es una combinación de base-azúcar (o una combinación de estructuras análogas) unida adecuadamente a una unidad de nucleótidos adyacente a través de un fosfodiéster u otros enlaces que forman una estructura principal.
En una modalidad adicional, la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo, SEMA3A o NRP1), o un fragmento del mismo, puede inhibirse o prevenir mediante el uso de la tecnología de interferencia de ARN (RNAi), un tipo de silenciamiento génico postranscripcional. El RNAi puede usarse para crear una pseudo "desactivación génica", es decir, un sistema en el que se reduce la expresión del producto codificado por un gen o región codificante de interés, dando como resultado una reducción general de la actividad del producto codificado en un sistema. Como tal, puede realizarse RNAi para dirigirse a un ácido nucleico de interés o fragmento o variante del mismo, para reducir a su vez su expresión y el nivel de actividad del producto que codifica. Tal sistema puede usarse para estudios funcionales del producto, así como también para tratar trastornos relacionados con la actividad de dicho producto. El RNAi se describe publicado, por ejemplo, en solicitudes de patente de los Estados Unidos 20020173478 (Gewirtz; publicada el 21 de noviembre de 2002) y 20020132788 (Lewis y otros; publicado el 7 de noviembre de 2002). Los reactivos y kits para realizar RNAi están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Ambion Inc. (Austin, t X, Estados Unidos) Y New England Biolabs Inc. (Beverly, MA, Estados Unidos).
El agente inicial para el RNAi en algunos sistemas es una molécula de dsRNA correspondiente a un ácido nucleico diana. Se cree que el dsRNA (por ejemplo, shRNA) se escinde en RNA de interferencia cortos (siRNA) que tienen una longitud de 21-23 nucleótidos (dúplex de 19-21 pb, cada uno con 2 nucleótidos salientes 3'). La enzima que se cree que efectúa esta primera etapa de escisión se ha denominado "Dicer" y se clasifica como un miembro de la familia RNasa III de ribonucleasas específicas de dsRNA. Alternativamente, el RNAi puede efectuarse introduciendo directamente en la célula, o generando dentro de la célula introduciendo en la célula un precursor adecuado (por ejemplo, vector que codifica precursor (s), etc.) de tal siRNA o molécula similar a siRNA. Entonces, un siRNA puede asociarse con otros componentes intracelulares para formar un complejo silenciador inducido por ARN (RISC). El RISC así formado puede subsecuentemente apuntar a un transcrito de interés a través de interacciones de emparejamiento de bases entre su componente de siRNA y el transcrito diana en virtud de la homología, dando como resultado la escisión del transcrito diana aproximadamente a 12 nucleótidos del extremo 3' del siRNA. Por tanto, el ARNm diana se escinde y se reduce el nivel de producto proteico que codifica.
El RNAi puede efectuarse mediante la introducción adecuada in vitro de siRNA sintetizado (shRNA) o moléculas similares a siRNA en células. El RNAi puede realizarse, por ejemplo, mediante el uso ARN sintetizado químicamente. Alternativamente, pueden usarse vectores de expresión adecuados para transcribir tal ARN ya sea in vitro o in vivo. La transcripción de cadenas con sentido y antisentido in vitro (codificadas por secuencias presentes en el mismo vector o en vectores separados) puede efectuarse mediante el uso, por ejemplo, ARN polimerasa de T7, en cuyo caso el vector puede comprender una secuencia codificante adecuada unida operativamente a un promotor de T7. El in vitro- ARN transcrito puede procesarse en modalidades (por ejemplo, mediante el uso de E. coli RNasa III) in vitro a un tamaño propicio para RNAi. Las transcripciones sentido y antisentido se combinan para formar un dúplex de ARN que se introduce en una célula diana de interés. Pueden usarse otros vectores, que expresan RNA en horquilla pequeños (shRNA) que pueden procesarse en moléculas similares a siRNA. Varios métodos basados en vectores y varios métodos para introducir tales vectores en las células, ya sea in vitro o in vivo (por ejemplo, terapia génica) se conocen en la técnica.
En consecuencia, en una modalidad, la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (o un fragmento del mismo, por ejemplo, soluble NRP1, trampas derivadas de NRP1, puede inhibirse introduciendo o generando dentro de una célula un siRNA o una molécula similar a siRNA correspondiente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés (por ejemplo SEMA3A o NRP1), o un fragmento del mismo, o un ácido nucleico homólogo al mismo. "Molécula similar a siRNA" se refiere a una molécula de ácido nucleico similar a un siRNA (por ejemplo, en tamaño y estructura) y capaz de provocar actividad de siRNA, es decir, de efectuar la inhibición de la expresión mediada por RNAi. En diversas modalidades, tal método puede implicar la administración directa del siRNA o la molécula similar a siRNA en una célula, o el uso de los métodos basados en vectores descritos anteriormente. En una modalidad, la molécula de siRNA o similar a siRNA tiene menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En una modalidad adicional, la molécula de siRNA o similar a siRNA tiene aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud. En una modalidad, la molécula de siRNA o similar a siRNA comprende una porción dúplex de 19-21 pb, teniendo cada hebra un saliente 3' de 2 nucleótidos. En modalidades, la molécula de siRNA o similar a siRNA es sustancialmente idéntica a un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés, o un fragmento o variante (o un fragmento de una variante) del mismo. Tal variante es capaz de codificar una proteína que tenga una actividad similar a la del polipéptido de interés.
Puede usarse una variedad de vectores virales para obtener la expresión de shRNA/RNAi en células que incluyen virus adenoasociados (AAV), adenovirus y lentivirus. Con los virus adenoasociados y los adenovirus, los genomas permanecen episomales. Esto es ventajoso ya que se evita la mutagénesis por inserción. Es desventajoso porque la progenie de la célula perderá el virus rápidamente a través de la división celular, a menos que la célula se divida muy lentamente. Los AAV se diferencian de los adenovirus en que se han eliminado los genes virales y tienen una capacidad de empaquetamiento disminuida. Los lentivirus se integran en secciones de cromatina transcripcionalmente activa y, por lo tanto, se transmiten a las células de la progenie. Con este enfoque existe un mayor riesgo de mutagénesis por inserción; sin embargo, el riesgo puede reducirse mediante el uso de un lentivirus deficiente en integrasa.
Composiciones farmacéuticas y kits
Los agentes que inhiben la señalización celular dependiente de NRP1 (es decir, inhibidores de NRP1) pueden administrarse a un sujeto humano por sí mismos o en composiciones farmacéuticas en las que se mezclan con portadores o excipientes adecuados en dosis para tratar o prevenir la enfermedad o afección objetivo o para aumentar la respuesta celular deseada.
También pueden administrarse al sujeto mezclas de estos compuestos (por ejemplo, trampa NRP1, anticuerpos, negativo dominante, péptidos inhibidores pequeños o similares) como una mezcla simple o en composiciones farmacéuticas formuladas adecuadas. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además a la cantidad del compuesto o compuestos suficiente para dar como resultado la prevención o el tratamiento de la enfermedad o afección inflamatoria diana (tales como por ejemplo, choque séptico, artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), inflamación cutánea de la piel, diabetes, uveítis y afecciones neuroinflamatorias tales como retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía del prematuro, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), deterioro cognitivo relacionado con la edad/enfermedad de Alzheimer) o para proporcionar la respuesta celular o fisiológica deseada(por ejemplo, cantidad suficiente para i) reducir el edema, ii) reducir la activación/reclutamiento de fagocitos mononucleares (por ejemplo, microglía o macrófagos), iii) reducir la producción o secreción de citocinas inflamatorias (por ejemplo, IL-1 p, TNF-a, IL-6, etc.); iv) reducir la neovascularización patológica; v) reducir la degeneración vascular, etc.,).
Como se usa en este documento, " portador farmacéuticamente aceptable " o "excipiente" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, medios fisiológicos y similares que sean fisiológicamente compatibles. En modalidades, el portador es adecuado para la administración ocular. En otras modalidades, el portador es adecuado para la administración sistémica. En otras modalidades, el portador es adecuado para la administración oral.
Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. El uso de tales medios y agentes, tales como para la aplicación ocular, sistémica u oral, es bien conocido en la técnica. Excepto en tanto cualquier medio convencional o agente sea incompatible con las trampas NRP1 de la invención, se contempla su uso en composiciones. Compuestos activos suplementarios pueden incorporarse también en las composiciones.
Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la presente solicitud se pueden encontrar en " Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
La presente descripción también se refiere a kits o paquetes comerciales para su uso en los métodos descritos anteriormente. Tales kits pueden comprender compuestos (por ejemplo, compuestos que inhiben la señalización de células NRP1, incluida la señalización de células mediada por SEMA3A como trampas, anticuerpos, shRNA, células, vectores, ácidos nucleicos) opcionalmente con instrucciones para usar el kit.
Vías de administración/formulaciones
Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, sistémica, oral y ocular (gotas para los ojos o inyecciones intraoculares). Las vías de administración preferidas comprenden gotas para los ojos e inyecciones intraoculares para afecciones oculares, oral para afecciones inflamatorias crónicas y sistémicas para sepsis y ciertas afecciones neuronales tales como accidente cerebrovascular. Las formulaciones también pueden estar en forma de formulaciones de liberación sostenida.
Las composiciones farmacéuticas, por lo tanto, pueden formularse de una manera convencional mediante el uso de uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares los cuales facilitan el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación propia depende de la ruta de administración escogida. Para una inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente, en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica.
Los compuestos pueden formularse para administración ocular, por ejemplo, gotas para los ojos o inyecciones oculares. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitarias, por ejemplo, en ampollas o en contenedores de dosis múltiples, con adición de un conservante. Las composiciones pueden tomar formas de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación como agentes para suspensión, estabilización y/o dispersión. Además, puede administrarse el fármaco en un sistema de suministro de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de célula u otro sistema de suministro (por ejemplo, para apuntar, por ejemplo, a un tejido específico (por ejemplo, Cerebro) o tipo celular ( por ejemplo, microglía o macrófagos)). Los nanosistemas y las emulsiones son ejemplos adicionales bien conocidos de vehículos o portadores de suministración para fármacos. Otro ejemplo es el sistema de suministro de Terapia Celular Encapsulada (ECT) de Neurotech, para enfermedades oculares. El ECT es un implante ocular diseñado genéticamente que permite la producción continua de proteínas terapéuticas en el ojo durante más de 2 años. Adicionalmente, la terapia es reversible simplemente retirando el implante. El implante de TEC se inserta en el vítreo a través de una sola incisión y se sutura en su lugar en un procedimiento quirúrgico ambulatorio de 20 minutos.
Dosificación eficaz
Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr su propósito previsto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para prevenir el desarrollo o aliviar los síntomas existentes del sujeto que está siendo tratado. La determinación de las cantidades eficaces está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
La dosis eficaz del compuesto inhibe la función de señalización celular de NRP1 lo suficiente para reducir o prevenir una o más respuestas fisiológicas o celulares (por ejemplo, hiperpermeabilidad vascular, fugas en la barrera hematorretiniana, edema, activación y/o reclutamiento de MP, producción y/o secreción de citocinas proinflamatorias, neovascularización, daño neuronal, etc.) o para prevenir o tratar una determinada enfermedad o afección inflamatoria, sin causar efectos adversos significativos. Ciertos compuestos que tienen tal actividad pueden identificarse in vitro mediante ensayos que determinan la inhibición dependiente de la dosis de inhibidores de señalización celular mediado por NRP1 (por ejemplo, agentes que se dirigen directamente a la expresión o actividad de NRP1 o agentes que se dirigen a la expresión o actividad (por ejemplo) de ligandos de NRP1.
Para cualquier compuesto usado en el método descrito en la presente descripción, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos celulares. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos celulares y animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluya el IC50 según se determina en ensayos celulares (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semimáxima de la función de señalización celular de NRP1, generalmente en respuesta a mediadores inflamatorios tal como 11-1 p u otro estímulo activador como hipoxia, isquemia, estrés celular, estrés ER, etc.
Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del compuesto que da como resultado la mejoría de los síntomas en un sujeto. De manera similar, una cantidad profilácticamente eficaz se refiere a la cantidad necesaria para prevenir o retrasar los síntomas en un paciente (por ejemplo, Hiperpermeabilidad vascular mediada por NRP1, visión manchada y/o borrosa, pérdida de pericitos, edema macular, hinchazón de la retina, fuga en la barrera hematorretiniana, reclutamiento de fagocitos mononucleares, producción y secreción de citocinas proinflamatorias, degeneración vascular, neovascularización patológica, daño neuronal, etc.). La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, determinando la dosis máxima tolerada (MTD) y la ED (dosis eficaz para una respuesta máxima del 50 %). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación entre MTD y ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben altos índices terapéuticos. La formulación exacta, la vía de administración y dosificación puede ser elegida por el médico individual teniendo en cuenta la afección del paciente.
La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar los niveles del compuesto activo que son suficientes para mantener los efectos moduladores de NRP1, o concentración eficaz mínima (MEC). La MEC variará para cada compuesto, pero puede estimarse a partir de datos in vitro; por ejemplo, la concentración necesaria para lograr una inhibición sustancial de la expresión o actividad de la SEMA3A (por ejemplo, unión al receptor NRP1). Las dosis necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración.
La cantidad de la composición administrada será, por supuesto, dependiente del sujeto que se trata, del peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la forma de administración y la valoración del médico que la prescribe.
Definiciones
Para mayor claridad, se proporcionan definiciones de los siguientes términos en el contexto de la presente invención.
Como se usa en este documento, el término "receptor de Neuropilina-1" o receptor "NRP1" se refiere a Neuropilina-1 y sus isoformas, y formas alélicas/polimórficas (por ejemplo, HGNC: 8004; Entrez Gene: 8829; Ensembl: ENSG00000099250; OMIM: 602069; y UniProtKB: 014786; núm. de acceso GenBank AAH07737.1, Figura 22, SEQ ID NO: 65). El NRP1 es un receptor multifuncional no tirosina quinasa que tiene la capacidad particular de unirse a tres ligandos estructuralmente diferentes a través de sitios distintos en su dominio extracelular. Se une a SEMA3A18,19 (por ejemplo, provocando colapso citoesquelético) y al VEGF165, potenciando la unión a VEGFR2 (por ejemplo aumentando su potencial angiogénico). También se une a TGF-p. Además, los estudios genéticos muestran que NRP1 regula claramente los efectos del VEGF y la SEMA3A en el desarrollo neuronal y vascular. Por lo tanto, en dependencia del ligando, la respuesta celular mediada por NRP1 varía.
La estructura básica de la Neuropilina-1 comprende 5 dominios: Tres dominios extracelulares (a1a2 (CUB), b1b2 (FV/FVIII) y c (MAM)), un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico (véanse las Figuras 19A y 22 y SEQ ID NO: 65 y 66 y 68). El dominio a1a2 es homólogo a los componentes del complemento C1r y C1s (CUB) que generalmente contienen 4 residuos de cisteína que forman puentes disulfuro. Este dominio se une a la SEMA3A. Los dominios b1b2 (FV/FVIII) se unen a VEGF. El aminoácido Y297 en el subdominio b1 es importante para la unión a VEGF ya que la sustitución de Y297 por una alanina reduce significativamente la unión de VEGF a NRP1. Existen varias variantes de empalme de isoformas y formas solubles de NRP1 que están todas abarcadas por la presente invención.
Los términos "Homología" y "homólogo" se refieren a la similitud de secuencia entre dos péptidos o dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede determinarse al comparar cada posición en las secuencias alineadas. Un grado de homología entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos es una función del número de nucleótidos o aminoácidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias. Como se usa el término en la presente descripción, una secuencia de ácido nucleico/polinucleótido es "homóloga" a otra secuencia si las dos secuencias son sustancialmente idénticas y la actividad funcional de las secuencias se conserva (como se usa en la presente, el término "homólogo" no infiere relación evolutiva). Dos secuencias de ácido nucleico se consideran sustancialmente idénticas si, cuando están alineadas de manera óptima (con espacios permitidos), comparten al menos aproximadamente un 50 % de similitud o identidad de secuencia, o si las secuencias comparten motivos funcionales definidos. En modalidades alternativas, la similitud de secuencia en secuencias sustancialmente idénticas alineadas de manera óptima puede ser al menos 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idénticas. Como se usa en este documento, un porcentaje dado de homología entre secuencias denota el grado de identidad de secuencia en secuencias alineadas de manera óptima. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40 % de identidad, aunque preferentemente menos de aproximadamente el 25 % de identidad, con cualquiera de los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en la presente descripción.
Los ácidos nucleicos sustancialmente complementarios son ácidos nucleicos en los que el complemento de una molécula es sustancialmente idéntico a la otra molécula. Dos secuencias de ácidos nucleicos o proteínas se consideran sustancialmente idénticas si, cuando están alineadas de manera óptima, comparten al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia. En modalidades alternativas, la identidad de secuencia puede ser, por ejemplo, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. La alineación óptima de secuencias para comparaciones de identidad puede llevarse a cabo mediante el uso de una variedad de algoritmos, tal como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
48:443, el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2444, y las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (tales como GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Grupo Genético de Computación, Madison, Wis., E.U.A.). La identidad de secuencia también puede determinarse mediante el uso del algoritmo BLAST, descrito en Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (mediante el uso de la configuración predeterminada publicada). El software para realizar el análisis BLAST puede estar disponible a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (a través de internet http://www. ncbi.nlm. nih.gov/). El algoritmo BLAST implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de puntuación de la palabra vecina. Los aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda aumentarse la puntuación acumulativa del alineamiento. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando se cumplen los siguientes parámetros: la puntuación de alineación acumulativa cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o más abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST puede usar por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 ( Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 ) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10 (o 1 o 0,1 o 0,01 o 0,001 o 0,0001), M = 5, N = 4, y una comparación de ambas cadenas. Una medida de la similitud estadística entre dos secuencias mediante el uso del algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P (N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos al azar. En modalidades alternativas de la invención, las secuencias de nucleótidos o aminoácidos se consideran sustancialmente idénticas si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de las secuencias de prueba es menos de aproximadamente 1, preferentemente menos de aproximadamente 0,1, con mayor preferencia menos de aproximadamente 0,01 y con la máxima preferencia menos de aproximadamente 0,001.
Una indicación alternativa de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente complementarias es que las dos secuencias se hibridan entre sí en condiciones moderadamente rigurosas, o preferentemente rigurosas. La hibridación con secuencias unidas a filtro en condiciones moderadamente rigurosas puede realizarse, por ejemplo, en NaHPO40,5 M, dodecil sulfato de sodio (SDS) al 7 %, EDTA 1 mM a 65 °C y lavado en 0,2 x SSC/SDS al 0,1 % a 42 °C (ver Ausubel y otros (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en p. 2.10.3). Alternativamente, la hibridación con secuencias unidas a filtro en condiciones rigurosas puede realizarse, por ejemplo, en NaHPO40,5 M, SDS al 7 %, EDTA 1 mM a 65 °C y lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1 % a 68 °C ( véase Ausubel, y otros (eds), 1989, supra). Las condiciones de hibridación pueden modificarse de acuerdo con métodos conocidos en dependencia de la secuencia de interés (ver Tijssen, 1993,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "OverV iew of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmico para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. Por ejemplo, en una modalidad, el compuesto de la presente invención es un RNAi antisentido o un shRNA que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de NRP1 o de la SEMA3A (preferentemente una secuencia humana).
Como se usa en la presente, el término "tratar" o "tratamiento" en referencia a enfermedades o afecciones inflamatorias (por ejemplo, retinopatías, isquemia cerebral, accidente cerebrovascular, sepsis, etc.) se refiere a una reducción/mejora en uno o más síntomas o en una respuestas fisiológicas patológica asociadas con dicha enfermedad o condición. Los ejemplos no limitantes incluyen edema, hinchazón, picazón, dolor, hiperpermeabilidad vascular; integridad de la barrera hematorretiniana, aumento de la expresión de SEMA3A, VEGF y/o TGF-beta, reclutamiento/quimiotaxis de fagocitos mononucleares, producción y/o secreción de citocinas proinflamatorias, degeneración vascular o neuronal, etc.
Como se usa en la presente, el término "prevenir" o "prevención" en referencia a enfermedades o afecciones inflamatorias se refiere a una reducción en la progresión o una aparición tardía de al menos un síntoma asociado con la enfermedad o afección.
Los artículos "un", "una" y "el/la" se usan en la presente descripción para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo.
Los términos "que incluye" y "que comprende" se usan en la presente descripción para significar, y se reutiliza de manera intercambiable con, las frases "que incluye pero no se limita a" y "que comprende, pero no se limita a".
Los términos "tal como" se usa en la presente descripción para significar, y se usa de manera intercambiable con, la frase "tal como, pero sin limitarse a".
La presente invención se ilustra en mayor detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1
Materiales y métodos (Ejemplos 2-9 y 12)
Generación de ratones LyzM-cre/Nrpfl/fl. Los ratones C57BI/6 de tipo salvaje (WT) se adquirieron en The Jackson Laboratory. Los ratónes LyzM-Cre (Lyz2tm1 (cre) lfo/J; número 004781) y ratones con n RP1 flanqueado por loxP (Nrp1tm2Ddg/J; número 005247) se compraron en The Jackson Laboratory y se alimentaron para obtener LyzM-cre/Nrpfl/fl con NRP1 deficiente células mieloides.
O2-retinopatía inducida. Ratones lactantes (WT o LyzM-Cre (Laboratorio Jackson) o LysM-Cre/Nrp1fl/fl) y sus madres adoptivas (CD1, Charles River) estuvieron expuestos al 75 % de O2 desde el día 7 postnatal (P7) hasta el día 12 y regresó al aire ambiente (52). Este modelo sirve como un sustituto de las enfermedades neovasculares oculares humanas tal como la retinopatía diabética caracterizada por una fase tardía de angiogénesis patológica destructiva (53, 54). Al regresar al aire ambiente, se desarrolla neovascularización (NV) impulsada por hipoxia a partir de P14 (26). Los ojos se enuclearon en diferentes puntos de tiempo y las retinas se disecaron para análisis FACS o análisis de ARNm como se describe. En otros experimentos, las retinas diseccionadas se montaron en plano y se incubaron durante la noche con isolectina B4 fluoresceinada (1: 100) en CaCl 1 mM.2 para determinar la extensión del área avascular o el área de neovascularización en P17 mediante el uso de ImageJ y el método SWIFT-NV (55).
FACS de retinas digeridas y bazo. Retinas de los ratones WT o LysM-Cre/Nrp1fl/fl se homogeneizaron e incubaron en una solución de 750 U/mL DNasel (Sigma) y 0,5 mg/mL de colagenasa D (Roche) durante 15 min a 37 °C con agitación suave. A continuación, los homogeneizados se filtraron con un colador de células de 70 pm y se lavaron en PBS suero bovino fetal al 3 %. Las muestras de bazo se homogeneizaron y se incubaron con 1 mg/mL de colagenasa D durante 10 min a 37 °C. Los homogeneizados se lavaron en PBS suero bovino fetal al 3 % y los sedimentos se resuspendieron y se incubaron en tampón de lisis (KCHO 10 mM3; NH 150 mM4Cl; EDTA 0,1 mM) durante 5 min a temperatura ambiente. Se incubaron suspensiones celulares (retina o bazo) con CD16/32 antirratón purificado con LEAF™ (Biolegend) durante 15 min a temperatura ambiente para bloquear los receptores Fc. Luego, las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos: FITC antirratón/CD11b humano (Biolegend), PE/CY7 antirratón Ly-6G/Ly-6C (Gr-1; Biolegend), Pacific blue™ antirratón F4/80 (Biolegend), 7AAD (BD Biosciences) e IgG2A de rata conjugada con anti-mNeuropilina-1 aloficocianina (R&D Systems) o conjugada con aloficocianina de control de isotipo IgG2A de rata (R&D Systems).
Para el análisis de la expresión de CX3CR1 y CD45, se realizó una tinción extracelular adicional utilizando los anticuerpos mencionados anteriormente complementados con Alexa Fluor 700 anti-CD45.2 de ratón (Biolegend) e IgG de cabra conjugada con ficoeritrina anti CX3CR1 de ratón (R&D Systems) o isotipo de IgG de cabra. El control FACS conjugado con ficoeritrina se realizó en un dispositivo LSRII (BD Biosciences) y los datos se analizaron mediante el uso del software FlowJo ™ (versión 7.6.5).
Inyecciones de BrdU. A los ratones de tipo salvaje sometidos a OIR o mantenidos en condiciones normóxicas se les inyectó intraperitonealmente con 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU; Sigma) a la dosis de 1 mg/ratón disuelto en PBS a P13.
Análisis de incorporación de BrdU. La tinción se realizó en las células retinianas de ratones P14 WT. Las muestras se obtuvieron como se describió anteriormente. La tinción extracelular se realizó como se describió anteriormente (CD45.2 (intermedio/bajo); Gr-1-; CD11b , F4/80 ; 7AAD). A continuación, las células se fijaron con tampón Cytofix/Cytoperm ™ (BD Biosciences) durante 30 min y se permeabilizaron con tampón Perm/Wash ™ (BD Biosciences) durante 10 min. A continuación, las células se trataron con 300 pg/mL de ADNasa durante 1 hora a 37 °C y se lavaron con Perm/Wash ™. La tinción intracelular de BrdU se realizó mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU-PE (Ebioscience) o IgG 1 k de ratón PE conjugado Isotipo Control (Ebioscience) durante 25 min a 4 °C. A continuación, las células se lavaron en Perm/Wash ™ y se resuspendieron en PBS suero bovino fetal al 3 % antes del análisis FACS en un LSRII (BD Biosciences).
Vitrectomía. Todos los pacientes diagnosticados previamente con PDR fueron seguidos y operados por un solo cirujano vitreorretiniano (FAR). Los pacientes control estaban siendo sometidos a tratamiento quirúrgico por patología no vascular (ERM (membrana epirretiniana) o MH (agujero macular)) por el mismo cirujano. En un quirófano, los pacientes se sometieron a cirugía bajo anestesia local retro/peribulbar. Se usó una solución de povidona yodada al 5 % para limpiar la piel periocular y se dejó la instilación tópica en el ojo y dentro del fondo de saco durante 5 minutos. Se realizó vitrectomía pars plana transconjuntival de tres puertos de calibre 25 a través de cánulas con válvula de calibre 25 (Alcon). Bajo visualización microscópica utilizando un sistema de visión de gran angular (Resight™, Zeiss), se colectó el vítreo sin diluir con un vitrector de calibre 25. Después de la biopsia vítrea, se abrió la línea de infusión y se realizó vitrectomía y pelado de la membrana de la forma habitual para tratar la hemorragia vítrea diabética y el desprendimiento de retina por tracción. A esto le siguió la fotocoagulación con endoláser panretiniano, el intercambio de aire y líquido y la inyección intravítrea de anti-VEGF.
Cuantificación de la proteína SEMA3A por ELISA. Las muestras de vítreo se congelaron en hielo seco e inmediatamente después de la biopsia y se almacenaron a -80 °. Las muestras se centrifugaron a 15000 xg durante 5 minutos a 4 °C antes del análisis. Los niveles de SEMA3A se cuantificaron en sobrenadantes mediante el uso de ensayos de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante (USCN Life Science Inc.).
Evaluación de los niveles de proteína SEMA3A mediante transferencia Western. Se evaluaron volúmenes iguales de fluido vítreo (20 uL) de pacientes con PDR y de controles mediante la técnica estándar SDS-PAGE para detectar la presencia de SEMA3A (Abcam).
Análisis de PCR en tiempo real. El ARN se aisló mediante el uso del kit GenElute™ Mammalian Total RNA Miniprep (Sigma) y se digirió con DNasa I para evitar la amplificación del ADN genómico. La transcripción inversa se realizó mediante el uso de la transcriptasa inversa M-MLV (Life Technologies) y la expresión génica se analizó utilizando Sybr™ Green (BioRad) en una máquina de PCR en tiempo real ABI Biosystems. Se usó p-actina como gen de referencia (véase la Tabla 2 en el Ejemplo 10 para obtener detalles sobre la secuencia de los oligonucleótidos usados.
Inmunohistoquímica. Para la visualización de la vasculatura pan-retiniana, las retinas montadas en plano se tiñeron con lectina I de Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia marcada con rodamina (Vector Laboratories, Inc.) en CaCl 1 mM.2 en PBS para vasculatura retiniana y anticuerpo anti-Neuropilina-1 de rata, (IgG de cabra; R&D Systems) e IBA1 (policlonal de conejo; Wako).
Cultivo primario de macrófagos peritoneales. Se anestesiaron ratones adultos WT o LyzMcre/NRP1fl/fl con isoflurano al 2 % en oxígeno 2 L/min y luego se sacrificaron mediante dislocación cervical. Luego, se realizó una pequeña incisión en la piel abdominal del ratón. Se estiró la piel a cada tamaño del ratón y se lavó la cavidad peritoneal con 5 mL de PBS más FBS al 3 % durante 2 min. Luego, las células recolectadas se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm, se resuspendieron en medio (DMEM F12 más FBS al 10 % y estreptomicina/penicilina al 1 %) y se colocaron en placas. Después de 1h de cultivo a 37 °C bajo una atmósfera de 5 % de CO2, el medio se cambió y las células se cultivaron durante las siguientes 24 h en las mismas condiciones antes de su uso en los ensayos de Transwell migración o de citocinas.
Ensayo de migración Transwell. Los ensayos de migración se realizaron en placas de 24 pocillos con inserciones de poros de 8 gm. En la cámara superior se añadieron macrófagos peritoneales primarios (5 x 105 células) resuspendidos en 200 gL de medio (DMEM F12 más FBS al 10 % y estreptomicina/penicilina al 1 %). 800 gL de medio con o sin factores migratorios: se añadió a la cámara inferior m Cp-1 (100 ng/mL), SEMA3A (100 ng/mL) y VEGF165 (50 ng/mL). Se permitió que las células migraran a través de la membrana del inserto durante la noche a 37 °C bajo una atmósfera de 5 % de CO2. En algunos experimentos, las células se pretrataron primero con Y-27632 (Sigma), inhibidor selectivo de ROCK (proteína serina/treonina quinasa formadora de espiral asociada a Rho) (100 gg/ml) durante 1 h a 37 °C. A continuación, los insertos se lavaron con PBS y las células que no migraban se limpiaron de la superficie superior de la membrana del inserto con bastoncillos de algodón. Luego, las membranas con células migradas se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 minutos, se lavaron dos veces con PBS y se montaron en el portaobjetos. Las células se tiñeron usando medio de montaje con DAPI (Vector Laboratories, Inc.). Luego, se fotografiaron 9 campos aleatorios por cada membrana usando un microscopio de fluorescencia invertido con un aumento de 20x y las células se contaron usando el software ImageJ.
Ensayo de explantes coroideos y brotación microvascular. Los ex vivo explantes de coroides y cuantificación de brotes microvasculares como se describió anteriormente (56). Brevemente, coroides de LysM-Cre/Nrp1+/+y LysM-Cre/Nrp1fl/fl se diseccionaron ratones (n = 6 para cada condición) poco después de enuclear los ojos. Después de sembrar coroides segmentados en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y cubrir con MatrigelTM (BD Biosciences), las muestras se trataron con medio EGM™-2, medio Eg M-2 con liposoma lleno de PBS (liposoma-PBS) o medio EGM™-2 con liposoma lleno de sal disódica del ácido diclorometilendifosfónico (liposoma-clodronato) (Sigma). El envasado de liposomas se realizó de acuerdo con (57). Doce horas más tarde, se retiraron de los pocillos los liposomas que contenían compuestos pasajeros y se lavaron con PBS. Macrófagos de cultivos de macrófagos peritoneales primarios (de LysM-Cre/Nrp1+/+ o LysM-Cre/Nrp1fl/fl ratones) a cultivos de explantes coroideos para investigar el impacto de los macrófagos en la germinación microvascular.
NRP1 recombinante soluble. Se inyectaron vía intravítrea ratones de tipo salvaje sometidos a OIR con rmNRP1 Trampa-1 (Figuras 19C y 20R, SEQ ID NO: 25) del plásmido (29) o R&D Systems en P12.
Se utilizan proteínas recombinantes. Concentración utilizada de CCL2/JE/MCP-1 de ratón recombinante (de E. coli) (R&D Systems) in vitro Concentración usada de quimera Fc SEMA3A humana recombinante 100 ng/ml (de la línea celular de mieloma murino, NS0) (R&D Systems) in vitro 100 ng/ml. -VEGF humano recombinante-165 (PeproTech) concentración utilizada in vitro 50 ng/ml.
Análisis estadísticos. Los datos se presentan como media ± s.e.m. Se utilizó la prueba T de Student y ANOVA, cuando fue apropiado, para comparar los diferentes grupos; una P <0,05 se consideró estadísticamente diferente. Para el ELISA, el análisis estadístico se realizó utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney (GraphPad Prism).
Aprobación del estudio: Muestras humanas. Obtuvimos la aprobación del protocolo clínico en humano y del formulario de consentimiento informado por el comité de ética del Maisonneuve-Rosemont Hospital (HMR) (Ref. CER: 10059) y el reclutamiento de pacientes para la toma de muestras de biopsia vitrea del núcleo local de pacientes afectados con T1DM o T2DM. Todo el procedimiento se realizó como un procedimiento ambulatorio en la sala de procedimientos menores dentro de la clínica ambulatoria del Departamento de Oftalmología de1Hospital Maisonneuve-Rosemont. Todos los instrumentos se abrieron y manipularon de manera estéril. El estudio se ajusta a los principios de la declaración Helsinki.
Aprobación del estudio: Animales. Todos los estudios se realizaron de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Montreal de acuerdo con las pautas establecidas por el Canadá. Consejo de Cuidado Animal. Los ratones C57BI/6 de tipo salvaje (WT) se adquirieron en The Jackson Laboratory. Ratones LyzM-Cre (Lyz2tm1(cre)lfo/J; número 004781) y ratones con Neuropilina 1 flanqueada por loxP (Nrp1tm2Ddg/J; número 005247) se adquirieron en The Jackson Laboratory.
Tabla 3: Características de los pacientes de vitrectomía
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Ejemplo 2
El NRP1 identifica una población de fagocitos mononucleares (MP) que se movilizan secundarios a una lesión vascular
Para determinar si los MP (fagocitos mononucleares), tales como la microglía o los macrófagos, participan en la patogénesis vascular asociada con las retinopatías proliferativas, el análisis FACS se llevó a cabo en primer lugar en las retinas de ratón completas para dilucidar la cinética de la acumulación de macrófagos/microglías a lo largo de la evolución de la retinopatía inducida por oxígeno. (OIR, Figura 1A, 75 % de oxígeno de P7-P12 (días postnatal de 7­ 12) para inducir vaso obliteración y aire ambiental hasta P17 para lograr la neovascularización prerretiniana máxima (26,33)) (Figuras 1B,E,H). Los resultados revelaron un número significativamente mayor de células microgliales/macrófagos en la retina (células Gr-1-, F4/80 , CD11b , datos no mostrados) en OIR en todos los puntos de tiempo analizados, incluido un aumento del 36 % durante la fase vaso obliterativa en P10 (P = 0,0004) (Figura 1C), un aumento del 63 % durante la fase neovascular en P14 (P <0,0001) (Figura 1F) y un aumento del 172 % durante la neovascularización máxima en P17 (P = 0,0006) (Figura 1I).
Es importante destacar que en cada punto de tiempo investigado, observamos un aumento proporcional en MP positivos para NRP1 en OIR con un aumento del 37 % en P10 (P = 0,0240) (Figura 1D), 61 % en P14 (P = 0,0196) (Figura 1G) y 155 % en P17 (P = 0,0058) (Figura 1J), lo que sugiere que esta subpoblación de MP positivos para NRP1 se estaba reclutando en la neurorretina durante la progresión de la enfermedad. Para todos los experimentos de OIR, se registraron los pesos de las crías de ratón (datos no mostrados) para determinar la salud metabólica adecuada (35).
Para establecer el papel del NRP1 residente en los MP en la retinopatía, se generó una desactivación génica específica de NRP1 mieloide cruzando ratones con Nrp1 flanqueado por loxP con ratones LysM-Cre (36) produciendo progenie LysM-Cre/Nrp1fl/fl. Los ratones resultantes mostraron un -disminución del 80 % en la expresión de NRP1 en MP retinianos en comparación con LysM-Cre/Nrp1+/+ controles de compañeros de camada (P = 0,0004) (Figura 1K). Es de destacar que los ratones dieron negativo para la mutación rd8 del gen Crb1 (37). LysM-Cre/Nrp1fl/fl los ratones no mostraron ninguna diferencia en el peso corporal, el tamaño o la actividad en campo abierto en comparación con los compañeros de camada durante el período de experimentación (de P1 a P17) (datos no mostrados) y tenían un número similar de microglía retiniana residente (datos no mostrados). Sorprendentemente, la deleción de NRP1 en las células mieloides anuló por completo la entrada de macrófagos/microglía en P10 y P14 OIR (Figura 1L-O), lo que revela el papel fundamental de este receptor en la quimiotaxis de MP durante las primeras etapas de la lesión retiniana isquémica. En P17, después de la neovascularización patológica máxima, la infiltración de MP ocurre en gran medida independiente de NRP1 (Figura 1P, Q y R). De acuerdo con una identidad microglial potencial, las células Gr1-/CD11b+/F4/80+ que expresan NRP1 identificadas anteriormente expresan niveles altos de CX3CR1 y niveles intermedios/bajos de CD45 (Figura 1S y datos no mostrados). Como era de esperar, en LysM-Cre/Nrp1fl/fl retinas, los MP altos de CD45low/CX3CR1 carecen de NRP1 (Figura 1T).
Ejemplo 3
Las células mieloides NRP1+ se localizan en lugares de neovascularización patológica en la retina
Dada la afluencia pronunciada de macrófagos/microglía NRP1+ durante la OIR, se determinó a continuación, la localización de estas células durante la progresión de la enfermedad. La inmunofluorescencia en monturas planas retinianas reveló que los macrófagos/microglía NRP1 positivos (coetiquetados con IBA1 y NRP1) estaban íntimamente asociados con mechones patológicos nacientes en P14 de OIR (Figuras 2A-C) así como también con mechones maduros en P17 de OIR (Figura 2D-F). Las flechas blancas en las Figuras 2B y 2E apuntan a MP positivos para NRP1 asociados con mechones prerretinianos. El NRP1 también se expresó por células endoteliales en el endotelio de los mechones neovasculares como se informó anteriormente (21). De acuerdo con los datos presentados en la Figura 1, los ratones LysM-Cre/Nrp1fl/fl tenían un menor número de macrófagos/microglía y una neovascularización menos pronunciada (ver más abajo para la cuantificación completa) (Figuras 2 G-K).
Ejemplo 4
La SEMA3A se eleva en el vítreo de los pacientes que sufren de retinopatía diabética
Para establecer la relevancia clínica de nuestros hallazgos sobre el papel obligado del NRP1 en la quimiotaxis de MP en la retinopatía, se determinaron las concentraciones de la SEMA3A directamente en el vítreo de pacientes que padecían PDR activa. Se obtuvieron diecisiete muestras de vítreo sin diluir de pacientes que padecían PDR y 17 de pacientes de control con patología no vascular. Las características detalladas de los pacientes se incluyen en la Tabla 1 (Ejemplo 1). Los pacientes control (20) presentaban patología no vascular y mostraban signos de daño retiniano no relacionado con la diabetes, tal como la tensión de tracción en la vasculatura (Figuras 3A,B (flecha blanca)) secundaria a tejido fibrótico y abombamiento macular (Figura 3C). Por el contrario, todas las retinas de los pacientes con PDR mostraron signos de disco (Figura 3D) o neovascularización prerretiniana (Figura 3F), con microvasos altamente permeables (fuga de colorante fluorescente) (recuadros en las Figuras 3D,G), microaneurismas (Figura 3D-G) y tejido cicatricial fibroso, indicativo de retinopatía avanzada (Figura 3G). Adicionalmente, los pacientes mostraron alguna evidencia de edema macular debido a la función comprometida de la barrera vascular, incluida la formación de cistoides (punta de flecha blanca) debido a la coalescencia focal del fluido extravasado (Figura 3H).
De acuerdo con su papel en la PDR, la detección de SEMA3A basada en ELISA reveló concentraciones 5 veces más altas de la proteína en el humor vítreo de los pacientes con PDR en comparación con el vítreo de los pacientes de control (P = 0,0132) (Figura 3I). Los resultados se confirmaron mediante análisis de transferencia Western en volúmenes iguales de vítreo donde la SEMA3A (isoformas de 125 y 95 kDa) (38, 39) estaban elevados en pacientes con PDR (Figura 3J). Por tanto, la regulación por incremento de la SEMA3A en el vitreo se induce en la patología ocular diabética.
Ejemplo 5
Los ligandos de NRP1 son inducidos en la capa de células ganglionales durante la OIR
Para obtener un perfil cinético preciso de la expresión de los dos ligandos prominentes de NRP1 en la retinopatía proliferativa, los niveles de SEMA3A y VEGF se determinaron los mensajes en el modelo de ratón de OIR. La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) en retinas completas reveló que SEMA3A fue fuertemente inducida en OIR tanto durante la fase hiperóxica (vasodegenerativa) en P10 como en la etapa isquémica/neovascular de P12 a P17 (Figura 4A). La inducción observada se produjo en las retinas de tipo salvaje y en las LysM-Cre/Nrp1fl/fl. Por el contrario, como se esperaba, VEGF las transcripciones aumentaron exclusivamente en la fase isquémica de OIR de P12 a P17 (Figura 4B). Es importante destacar que, VEGF fue significativamente menos inducido en LysM-Cre/Nrp1fl/fl en comparación con las retinas de tipo salvaje (aumentó mínimamente en P12 (P = 0,0451) y ~55 % más bajo en P14 en comparación con OIR de tipo salvaje (P = 0,0003)) (Figura 4B) indicativo de una retina más saludable.
A continuación, se realizó una microdisección de captura con láser (LCM) seguida de RT-qPCR en las capas retinianas de las zonas avasculares para identificar la fuente de SEMA3A y VEGF mensajes en OIR (Figura 4C). Ambos SEMA3A y VEGF se indujeron fuertemente en la capa de células ganglionares con VEGF también aumentando en la capa nuclear interna (Figura 4D, E). Por tanto, la fuente de ambos ligandos es geográficamente coherente con la localización de MP retinianos (Figura 2).
Ejemplo 6
Los fagocitos mononucleares (MP) no proliferan en la retina después de una lesión vascular
Para determinar si el aumento observado en NRP1 MP se debió a un influjo de la circulación sistémica o a un aumento en la proliferación de MP dentro de la retina, se investigó la proliferación retiniana local de estas células. Los ratones se inyectaron sistémicamente con BrdU a P13 (24 horas antes del sacrificio) y se llevó a cabo el análisis FACS en retinas (Figura 5A) y bazos (Figura 5B). Dentro de la retina, los MP de Gr1-/CD11b+/F4/80+ no mostraron una proliferación significativa (P = 0,4708). Se observó una proliferación considerablemente mayor en los bazos. No se observaron diferencias significativas entre Normoxia y OIR (Figura 5C). La falta de proliferación de MP en la retina sugiere que la acreción notada de MP NRP1 durante la retinopatía tiene un origen sistémico.
Ejemplo 7
La SEMA3A y el VEGF 165 movilizan MP a través de NRP1
A la luz del requerimiento de NRP1 para la movilización de células mieloides a sitios de lesión vascular (Figura 1), así como también la inducción de los principales ligandos de NRP1 en la retinopatía (Figura 3-4) y el probable origen sistémico de estas células (Figura 5), se determinó la propensión de estas señales a provocar quimiotaxis de MP. Se aislaron cultivos primarios de macrófagos de ratones de tipo salvaje y se sometieron a un ensayo de migración en cámara de Transwell Boyden. Tanto la SEMA3A (100 ng/mL) (P <0,0001) como el VEGF165 (50 ng/mL) (P = 0,0027) provocaron la quimiotaxis de macrófagos a magnitudes similares a la del control positivo MCP-1 (100 ng/mL) (P <0,0001) (Figuras 6A, B). Estos datos se validaron demostrando que Y-27632, un inhibidor selectivo ROCK (proteína serina/treonina quinasa formadora de espiral asociada a Rho) abolió sus propiedades quimiotácticas. ROCK está aguas abajo de la señalización de NRP1 (40) y se sabe que media la migración de monocitos (41). La migración de VEGF se redujo parcialmente pero no significativamente, lo que sugiere una contribución de receptores alternativos como VEGFR1 tal como se informó recientemente (33). De acuerdo con el papel de NRP1 en la quimiotaxis mediada por SEMA3A y VEGF, los macrófagos de los ratones LysM-Cre/Nrp1m respondieron de forma única a MCP-1 y no fueron movilizados por SEMA3A o VEGF (Figura 6C).
Ejemplo 8
Los macrófagos NRP1 potencian la germinación microvascular ex vivo.
Para investigar el impacto de los macrófagos que expresan NRP1 en la angiogénesis microvascular, el tejido coroideo de ratones LysM-Cre/Nrp1+/+ o de los ratones LysM-Cre/Nrp1m se aislaron y crecieron en Matrigel ™ para evaluar la germinación microvascular. En la coroides de los ratones LysM-Cre/Nrp1m brotan ~20 % menos de microvasos en comparación con los de ratones LysM-Cre/Nrp1+/+ (P = 0,018) (Figura 7A). Para investigar el papel de los macrófagos NRP1 en la promoción de la germinación microvascular, se usaron liposomas de clodronato para eliminar los macrófagos endógenos de los tejidos coroideos aislados. En explantes de los ratones LysM-Cre/Nrp1m y LysM-Cre/Nrp1+/+, los liposomas que contienen PBS (es decir, el control del vehículo) no tuvieron ningún impacto en la germinación vascular, pero los liposomas de clodronato redujeron la germinación microvascular por ~60 % (P = 0,0114 para LysM-Cre/Nrp1+/+ coroides y P = 0,0007 para LysM-Cre/Nrp1m coroides) (Figuras 7B-E). Para verificar si los macrófagos NRP1 tienen una propensión a promover la angiogénesis, se extrajeron los macrófagos peritoneales de ratones LysM-Cre/Nrp1+H o LysM-Cre/Nrp1m, y se introdujeron en cultivos de explantes de coroides que habían sido previamente tratados con liposomas de clodronato y lavados. Los macrófagos de ratones LysM-Cre/Nrp1+/+ potenciaron de fuerte manera la germinación microvascular en un 50-100 % en comparación con los macrófagos de ratones LysM-Cre/Nrp1fl/fl (P = 0,0068 para LysM-Cre/Nrp1+/+ coroides y P = 0,0491 para LysM-Cre/Nrp1fl/fl coroides) (Figuras 7D y E) e independiente del genotipo del explante coroideo.
Ejemplo 9
La deficiencia en NRP1 residente de mieloides reduce la degeneración vascular y la neovascularización patológica en la retinopatía
Dado el papel obligado de la señalización de células NRP1 en la infiltración de MP durante las primeras etapas de OIR (Figura 1), se determinó a continuación el impacto de la ablación específica de células mieloides de NRP1 en la progresión de la enfermedad. Al salir del 75 % O2 en P12, los ratones LysM-Cre/Nrp1fl/fl mostraron niveles significativamente más bajos de vasoobliteración retiniana en comparación con los controles de tipo salvaje (P = 0,0011) y LysM-Cre/Nrp1+|+ (P <0,0001) (Figuras 8A, B). Esto puede atribuirse a niveles más bajos de IL-1 p presentes en las retinas de ratones LysM-Cre/Nrp1fl/fl (datos no mostrados). Es importante destacar que en P17, cuando la neovascularización patológica alcanza su punto máximo (26), la deleción de NRP1 residente en mieloide redujo profundamente las áreas avasculares (~35 % en comparación con el tipo salvaje (P <0,0001) y ~30 % en comparación con ratones LysM-Cre/Nrp1+|+ (P = 0,0008)) (Figuras 8C, D). A su vez, se observaron reducciones significativas en la neovascularización prerretiniana destructiva asociada con la retinopatía isquémica (~36 % en comparación con el tipo salvaje (P = 0,0008) y ~34 % en comparación con ratones LysM-Cre/Nrp1+|+ (P = 0,0013)) (Figuras 8E, F).
Ejemplo 10
Preparación de Trampas neutralizantes solubles SEMA3A
Se generaron trampas de alta afinidad para inhibir/neutralizar SEMA3A. Estas trampas se derivaron de la Neuropilina 1 (NRP1) y se acoplaron opcionalmente a la etiqueta 6X-His o proteínas FC (véanse las Figuras 19, 20 y 27 y la Tabla 1). Se generaron diversas variantes que comprendían el dominio extracelular de NRP1 completo o variantes funcionales capaces de mantener la unión de SEMA3A. Se generaron trampas que contenían un dominio b1 (que se une a VEGF) y que incluían una mutación neutralizante de VEGF165. Se demostró que las trampas se expresan y secretan altamente en células humanas transformadas. Se desarrollaron protocolos simples de purificación y formulación para producir muestras de trampa para SAR y estudios de eficacia a seguir in vivo.
Métodos
Cultivo celular y material. La Neuropilina 1 humana (acceso a GenBank ™ NM_003873, SEQ ID NO: 66) se adquirió de Origene Inc. El clon de origen comprende una mutación conservadora en el aminoácido 140 que cambia la leucina por una isoleucina. Las células 293T (At CC) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero de ternera fetal al 10 %. El vector pFUSE-hlgG1-Fc1 se adquirió de InvivoGen Inc.
Clonación. El dominio extracelular de la Neuropilina-1 (residuos 1-856), o porciones del mismo, se amplificaron por PCR a partir del clon RC217035 de Origene mediante el uso de la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (New England Biolabs) y se clonaron en el EcoR1-Bglll de pFUSE-hlgG1-Fc1 en marco con la secuencia codificante de FC-1 humana. Las construcciones que codifican las versiones solubles de las trampas se generaron insertando una secuencia que codifica un sitio de escisión de proteasa TEV seguido de residuos 6X His y un codón de terminación cadena arriba de la porción que codifica FC de las correspondientes construcciones FC. Se introdujeron deleciones adicionales (b1, b1b2) o mutaciones de unión a VEGF165 (por ejemplo, Y297A) mediante el uso del kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (NEB). Todas las secuencias de las construcciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger (Genome Quebec). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las trampas ensambladas se representan en las Figuras 20 y 27.
Evaluación de la expresión de trampas en células humanas. Las construcciones que codifican las trampas de ratón y humano se transfectaron en células 293T. Las células se cultivaron durante 48 horas después de la transfección en medio FreeStyle™ 293 (Invitrogen). Se prepararon lisados celulares a partir de células 293T 48 horas después de las transfecciones. Las células se lavaron extensamente con PBS y se lisaron en tampón de lisis enfriado con hielo (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton X-100 al 1 % y glicerol al 10 %) complementado con cantidades estándar de inhibidores de proteasa (AEBSF, TPCK, TLCK, aprotinina, leupeptina, pepstatina y E64, Sigma). Los lisados celulares se aclararon mediante micro centrifugación (12000 g, 20 minutos). Las concentraciones de los lisados se determinaron mediante micro BCA estándar (Sigma). Se cargaron cantidades iguales de proteína en geles en gradiente de PAGE-SDS al 5-20 % y se transfirieron a PVDF (Amersham). Los medios acondicionados aclarados de las células transfectadas se incubaron con proteína A sefarosa (Pharmacia) o resina Talon (Clontech) para FC o etiqueta 6xHis. Las resinas se lavaron con PBS y se diluyeron en tampón de muestra 2X PAGE-SDS antes de la separación y transferencia en gel. Los anticuerpos usados en las inmunotransferencias fueron el anti-Neuropilina1 humana (Cell signaling), el anti-6X-HIS monoclonal de ratón (In Vitrogen) y el IgG reportero anti-humano, ratón y conejo ligado a HRP (BioRAD). Todos los anticuerpos se usaron a una dilución 1/2000. La señal quimioluminiscente se capturó mediante el uso de un sistema de obtención de imágenes Fuji después de la incubación de membranas con ECL (Amersham).
Trampas de expresión y purificación. Se transfectaron células 293-T con plásmidos que codifican las diversas trampas mediante los métodos de transfección estándar de precipitación de polietilamina (PEI) o fosfato cálcico. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con medio sin suero y se alimentaron con medio completo sin suero (medio Free style 293, InVitrogen). El medio acondicionado se colectó después de 60-72 horas de crecimiento en medio sin suero y se eliminó de los restos celulares mediante centrifugación en balde oscilante (2000 RPM, 20 minutos). Las trampas de FC se purificaron a partir de medios acondicionados de células 293T transfectadas mediante pase sobre proteína A o G sefarosa (Pharmacia) seguido de lavados extensos con PBS y eluciones con glicina 0,1 M pH 3,0. Las fracciones de elución se neutralizaron inmediatamente mediante la adición de 1/10 de volumen de Tris 1 M pH 8 y 1/10 de volumen de 10X PBS pH 7,4. Las trampas solubles marcadas con 6X HIS se purificaron a partir de medios acondicionados de células 293T transfectadas mediante pase sobre agarosa Talon (Clontech) seguido de lavados extensos con PBS y eluciones de imidazol escalonadas (intervalo 10 a 150 pM típicamente). Se analizaron muestras de fracciones de purificación de trampas en geles de PAGE-SDS en gradiente de 5-15 % o 5-20 %. El gel se tiñó mediante el uso del kit de tinción Safely Blue (InVitrogen).
Formulación estéril de trampas purificadas para in vivo inyecciones. Las fracciones de elución de las purificaciones de 40 mL de medio acondicionado se combinaron y se diluyeron hasta un volumen total de 10 mL en PBS. Las proteínas trampas diluidas se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de baja unión a proteínas de 0,2 uM (Progene). Las soluciones de proteína se concentraron y se intercambió tampón con PBS en dispositivos de concentración de PES estériles (Pierce, MWCO nominal 30 Kd). Muestras de trampas concentradas estériles (-30-50 uL) se analizaron y se tiñeron en PAGE-SDS como se describió anteriormente.
Ejemplo 11
Afinidad de trampas para SEMA3A Y VEGF
Producción de AP-VEGF165. la secuencia codificante de la variante 1 de VEGF165 humano (NM_001025366) se subclonó en el vector pAPtag5 (GenHunter), en marco con un dominio de fosfatasa alcalina (AP-VEGF165). Se transfectaron células HEK293T con la construcción AP-VEGF165 mediante el uso del método de transfección de polietilenimina (PEI). Después de la etapa de transfección durante la noche, las células se cultivaron durante 60 horas adicionales en medio sin suero (In vitrogen). Los medios celulares se colectaron y se concentraron en un dispositivo PES (Pierce). El ligando AP-VEGF165 concentrado se analizó en PAGE-SDS y se cuantificó mediante el uso tinción segura SimplyBlue (tecnologías Life).
Ensayos de unión Sema 3A y AP-VEGF165. Las curvas de saturación para las determinaciones de la Kd de unión a SEMA 3A o VEGF165 se obtuvieron como sigue. Los pocillos de placas de 96 pocillos de alta unión a proteínas (Maxisorp, Nunc) se recubrieron con trampas purificadas diluidas en PBS y se bloquearon posteriormente con tampón de unión (PBS que contenía caseína al 2 % y Tween 20 al 0,05 %). Los ligandos SEMA3A-FC (R&D systems) o AP-VEGF165 se diluyeron en tampón de unión en un amplio intervalo de concentraciones y se añadieron a los pocillos. Después de una incubación durante la noche, los pocillos se lavaron con PBS que contenía 0,05 % de Tween. La SEMA3a-FC unida se detectó mediante el uso de un sustrato anti-IgG humana unido a HRP (Biorad) y ECL (Pierce). Alternativamente, se detectó AP-VEGF165 unido mediante el uso del sustrato estrella CPD (Roche). La señal quimioluminiscente se adquirió en un lector TECAN. La constante de disociación Kd se determinó mediante el ajuste de curvas no lineales mediante el uso del software de prisma Graph Pad.
Se ha evaluado la afinidad relativa de las trampas de la presente invención para la SEMA3A y el VEGF. Las trampas se prepararon como se describió en el Ejemplo 10. En la Figura 19 también se proporciona una representación esquemática de las trampas probadas.
Tabla 4 Constante de disociación de la SEMA3A y el VEGF para varias trampas
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Las trampas de NRP1 solubles de la presente invención se unen más eficientemente a la SEMA3A que a al VEGF. Tal preferencia por la SEMA3A resultó sorprendente ya que se considera que la SEMA3A y el VEGF tienen normalmente la misma afinidad general por el NRP1. Una mayor afinidad por la SEMA3A puede ser ventajosa en condiciones en las que se prefiere la inhibición de la SEMA3A sobre la inhibición del VEGF y puede reducir los efectos secundarios asociados con la inhibición de VEGF.
Ejemplo 12
La administración terapéutica intravítrea de NRP1 soluble reduce la infiltración de MP y la neovascularización patológica en la retinopatía
Para determinar el potencial de traducción de los hallazgos anteriores, a continuación se empleó como trampa un polipéptido NRP1 mTrampa 1 de ratón recombinante soluble (rm) (Figuras 19C y 20R que comprenden los dominios a1, a2, b1, b2 y c de SEQ ID NO.25) para secuestrar ligandos de NRP1 inducidos por OIR. Una única inyección intravítrea de rmNRP1 en P12 condujo a una reducción del 30 % en P14 (P = 0,0282) en el número de microglías presentes en las retinas sometidas a OlR (Figura 9A). Este hallazgo da fe de la potencia de NRP1 soluble (1 pl de 50 pg/mL) para comprometer la movilización microglial. La administración intravítrea de NRP1 soluble provocó una significativa -Disminución del 40 % en la angiogénesis prerretiniana patológica en comparación con los controles inyectados con vehículo (P = 0,0025) (Figuras 9B, C). Juntos, estos datos sugieren que la neutralización de ligandos de NRP1 es una estrategia eficaz para reducir la neovascularización destructiva en la retinopatía.
Ejemplo 13
Materiales y Métodos para modelos de sepsis- Ejemplos 14 a 19
Modelo de ratón de sepsis. Los estudios se realizaron de acuerdo con las regulaciones de las Directrices canadienses para el uso de animales en la investigación del Canadian Council on Animal Care. Se suministraron inyecciones de LPS por vía intraperitoneal (i.p.) en ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad.
Ensayo de supervivencia. Para la generación de datos de supervivencia, los ratones se expusieron a una única inyección intraperitoneal de LPS a 25 mg/kg, en un volumen de casi 100 uL ajustado al peso del ratón. Luego, los ratones fueron monitoreados hasta alcanzar los puntos límite críticos definidos por el Consejo Canadiense de Cuidado Animal.
Medición de citocinas proinflamatorias. Para la evaluación de las citocinas proinflamatorias, los ratones se expusieron ip con una única inyección intraperitoneal de LPS a 15 mg/kg y se sacrificaron en varios puntos de tiempo hasta 24 horas. Se extrajeron tejidos (cerebro, hígado, riñón) y se aisló el ARNm mediante el uso del kit GenElute™ Mammalian Total RNA Miniprep (Sigma) y se digirió con DNasa I para evitar la amplificación del ADN genómico. La transcripción inversa se realizó mediante el uso de transcriptasa inversa M-MLV y la expresión génica se analizó mediante el uso de SybrGreen en una máquina de PCR en tiempo real de ABI Biosystems. Se usó p-actina como gen de referencia.
Cultivo primario de macrófagos peritoneales. Se anestesiaron ratones adultos WT o LyzMcre/NRP1fl/fl con isoflurano al 2 % en oxígeno 2 L/min y luego se sacrificaron mediante dislocación cervical. Luego, se realizó una pequeña incisión en la piel abdominal del ratón. Se estiró la piel a cada tamaño del ratón y se lavó la cavidad peritoneal con 5 mL de PBS más FBS al 3 % durante 2 min. Luego, las células recolectadas se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm, se resuspendieron en medio (DMEM F12 más FBS al 10 % y estreptomicina/penicilina al 1 %) y se colocaron en placas. Después de 1h de cultivo a 37 °C bajo un 5 % de CO2se cambió la atmósfera del medio.
Matriz de perlas citométricas (CBA). La CBA se realizó de acuerdo con las pautas del fabricante (BD Bioscience). Se aislaron macrófagos de ratones de tipo salvaje o LyzMcre/NRP1fl/fl y se sometieron a SEMA3A (100 ng/mL) o vehículo durante 12 horas y se procesaron mediante CBA.
Administración de trampas y anticuerpos anti-VEGF. El modelo experimental de sepsis de ratones se trató con NRP1 Trampa-1 humano o de ratón (Figuras 19B, C y 20A, 20R, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 83) o anticuerpo neutralizante de VEGF (R&D Systems, AF-493-NA).
Diseño experimental: 3 ratones por grupo. Grupos: 1- Vehículo, 2- LPS y 3- LPS NRP1 Trampa 1-Vehículo: NaCl, 2-LPS: 15 mg/kg; y trampa 3-LPS NRP1: Los ratones recibieron una única inyección iv de 4 ug (en un volumen de 100 uL) de trampa NRP1 de ratón recombinante correspondiente a 0,2 mg/kg, pocos minutos después de la inyección de LPS.
Ensayos de permeabilidad. Para los ensayos de permeabilidad, los ratones se expusieron por vía ip con una única inyección intraperitoneal de LPS a 15 mg/kg y se sacrificaron 24 horas después para la toma de muestras de tejido. Los cambios en la permeabilidad vascular del hígado, riñón y cerebro se evaluaron cuantificando la extravasación de Evans Blue (EB) en el tejido. Después de 24 horas, se inyectó por vía intravenosa una solución de 10 mg/mL de EB (55 mg/kg). Dos horas más tarde, los ratones fueron sacrificados y perfundidos a través del corazón con PBS. A continuación, se retiraron los tejidos, se dejaron secar a temperatura ambiente durante 24 horas y se determinaron los pesos secos. Se extrajo el EB en formamida durante la noche a 65 °C. A continuación, se midió el EB a 620 y 740 nm en un espectrofotómetro.
Análisis de PCR en tiempo real. El ARN se aisló mediante el uso del kit GenElute™ Mammalian Total RNA Miniprep (Sigma) y se digirió con DNasa I para evitar la amplificación del ADN genómico. La transcripción inversa se realizó mediante el uso de la transcriptasa inversa M-MLV (Life Technologies) y la expresión génica se analizó mediante el uso de SybrGreen (BioRad) en una máquina de PCR en tiempo real ABl Biosystems. Se usó p-actina como gen de referencia. Consulte la Tabla 3 a continuación para obtener detalles sobre la secuencia de los oligonucleótidos utilizados.
Tabla 3: Secuencias de cebadores usadas para el análisis de RT-PCR
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Ejemplo 14
La semaforina 3A se regula positivamente en varios órganos durante el choque séptico
Dado el vínculo entre SEMA3A, NRP1 y la respuesta inmunitaria innata en OIR (como se demostró en los Ejemplos 2-9 anteriores), se evaluó a continuación la implicación de la respuesta celular dependiente de NRP1 en la inflamación sistémica general. Esto se exploró por primera vez determinando la cinética de la expresión de la SEMA3A durante el choque séptico.
Se administró LPS (15 mg/kg) a ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad (n = 5) y los ratones se sacrificaron a las 0, 4, 8, 12 y 24 horas después de la administración de LPS. Se colectaron órganos clave tales como cerebro, riñón, pulmón e hígado y se aisló el ARNm. Los niveles de SEMA3A ARNm se indujeron de fuerte manera en todos los órganos analizados tan pronto como a las 6 horas después de la inyección de LPS y persistieron durante 24 horas (Figura 11 A-D). De manera similar, los niveles de expresión de otro ligando de NRP1, VEGF, también aumentaron profundamente en riñón (Figura 11B), pulmón (Figura 11C) e hígado (Figura 11D) dentro de las primeras 6 horas de choque séptico. Los aumentos en las citocinas proinflamatorias clásicas TNF-a e IL1-p aumentaron 6 horas después de la administración de LPS y disminuyeron de manera similar a ARNm de VEGF (Figura 12). Por lo tanto, de todos los mediadores de inflamación investigados, SEMA3A tuvo un perfil cinético a largo plazo y se mantuvo elevado durante al menos 24 horas después de la inducción de la sepsis. Este perfil de expresión particular para SEMA3A sugiere que su contribución al choque séptico puede ser de larga duración en comparación con otras citocinas.
Ejemplo 15
La SEMA3A induce secreción de citoquinas pro inflamatorias en células mieloides vía el NRP1
Dada la contribución de los monocitos y las células mieloides a la respuesta inflamatoria aguda y la presencia de NRP1 en las células mieloides, se determinó la contribución de SEMA3A y NRP1 residente en mieloides en la producción de citocinas inflamatorias.
Los macrófagos aislados se expusieron a SEMA3A (100 ng/mL) o vehículo y se analizó la producción de citocinas mediante Cytometric Bead Array (CBA). Los resultados presentados en la Figura 13 indican que la SEMA3A puede inducir la producción/secreción de citocinas proinflamatorias, que se sabe que contribuyen al choque séptico tal como IL-6 (Figura 13A) y TNF-a (Figura 13B). De particular importancia, una desactivación génica específica de NRP1 (LyzM/NRP1fl/fl) en células mieloides anuló la producción inducida por SEMA3A de IL-6 y TNF-a. En particular, el control tratado con vehículo LyzM/NRP1fl/fl los macrófagos mostraron una menor producción de IL-6, TNF-a e IL-1 p que los controles de tipo salvaje, destacando el papel de NRP1 residente en mieloide en la inflamación inducida por sepsis.
Ejemplo 16
La deficiencia en NRP1 residente de mieloides reduce la producción de citocinas proinflamatorias in vivo en sepsis
Debido a que el NRP1 residente en mieloide fue importante para la liberación de citocinas proinflamatorias tales como IL-6 y TNF-a in vitro, su contribución fue explorada a continuación in vivo. A ratones LyzM/NRP1fl/fl y a los ratones de control de tipo salvaje se les administró vehículo o LPS (15 mg/kg) y se colectaron cerebros e hígados 6 horas después de la inyección de LPS. El análisis de PCR en tiempo real de los niveles de TNF-a (Figuras 14A,C) e IL-1b (Figura 14B,D) reveló una fuerte caída en estas citocinas en LyzM/NRP1fl/fl. Estos resultados subrayan la profunda contribución de NRP1 y sus ligandos al desarrollo de la sepsis. in vivo.
Ejemplo 17
La inhibición de la señalización NRP1 evita la rotura de la función de barrera inducida por sepsis.
Una de las características patológicas del choque séptico severo, aunque contribuye a la insuficiencia orgánica, es el compromiso de las barreras sanguíneas (sangre y aire en los pulmones, sangre y orina en el riñón, sangre y bilis en el hígado y moléculas humorales en el cerebro). Dado el papel de SEMA3A en la ruptura de la barrera hematorretiniana (46) y los nuevos datos actuales sobre la expresión de SEMA3A durante la sepsis, se evaluó el efecto de neutralizar SEMA3A con una trampa derivada del dominio extracelular de NRP1 humano (Trampa-1, sin FC, Figuras 19B, SEQ ID NO: 83). Mediante el uso de un ensayo de permeabilidad con Azul de Evans (EBP), encontramos que en todos los órganos estudiados, específicamente, cerebro (Figura 15A), riñón (Figura 15B) e hígado (Figura 15C), se observó una reducción pronunciada en la degradación de la función de barrera inducida por LPS cuando los ratones se trataron con 4 ug de trampa derivada de NRP1 (0,2 mg/kg, iv). Estos resultados sugieren fuertemente que las trampas de NRP1 soluble y sus derivados son agentes terapéuticos convincentes para contrarrestar la sepsis.
Ejemplo 18
La trampa derivada de NPR1 protege contra la sepsis
Para determinar los beneficios terapéuticos de la neutralización de los ligandos de NRP1 o la inhibición de NRP1 durante la sepsis, se realizaron estudios de supervivencia. Se administró a ratones una dosis alta de LPS (25 mg/kg). Luego, los ratones se monitorearon y se sacrificaron éticamente, cuando se alcanzaron los puntos finales apropiados. En el segundo grupo, los ratones se inyectaron iv con 4 ug de Trampa-1 recombinante sin FC (0,2 mg/kg, Figuras 19B y 20A, SEQ ID NO: 83) seguido de inyección intraperitoneal de LPS. En el grupo de control, 5/5 ratones (100 %) murieron dentro de las primeras 30 horas (Figura 16A) después de la inyección de LPS. Por el contrario, todos los ratones tratados con la trampa seguían vivos después de 30 horas y mostraron una tasa de supervivencia significativamente mejorada después de 60 horas (3/5). Por tanto, la mortalidad se redujo del 100 % (en el grupo de control) después de 30 horas al 40 % (Figura 16A) después de 60 horas. Además, el 40 % de los ratones tratados con Trampa permanecieron vivos 80 horas después de la inyección de LPS. Así, el tiempo de supervivencia se duplicó al menos en el 60 % de los casos y casi se triplicó en el 40 % de los casos cuando se inhibió la señalización celular a través de NRP1.
Se obtuvieron resultados similares con ratones que albergaban una desactivación génica específica de NPR1 en células mieloides (Figura 16 B). La ausencia de NRP1 en las células mieloides aumentó el tiempo de supervivencia y redujo la mortalidad inducida por sepsis (3/5) del 100 % al 40 % (Figura 16B) después de 30 horas y del 100 % al 40 % después de 60 horas. También, el 40 % de los ratones NRP1 Ko permanecieron vivos 80 horas después de la inyección de LPS.
En conjunto, estos resultados destacan el valor terapéutico de inhibir la señalización celular dependiente de NRP1 en el tratamiento de la sepsis.
Ejemplo 19
La Trampa derivada de NRP1 reduce la producción de citocinas inflamatorias en el choque séptico
Dado el beneficio terapéutico de la trampa NRP1 sobre las tasas de supervivencia en el choque séptico, a continuación se determinó el impacto de la neutralización de los ligandos de NRP1 en la producción de citocinas inflamatorias durante el choque séptico. A los ratones de tipo salvaje se les administró i) vehículo (n = 3); ii) LPS (15 mg/kg) (n = 3) o iii) LPS y NRP1 Trampa 1 de ratón (sin FC, Figuras 19C SEQ ID NO: 25, pero sin región FC) y los cerebros se colectaron 6 horas después de la inyección de LPS. La inyección de NRP1 Trampa-1 redujo profundamente la producción de TNF-a (Figura 17A) e IL-6 (Figura 17B). De manera similar, los ratones con células mieloides deficientes en NRP1 (LyzM-Cre/Nrpfl/fl) (n = 3) produjeron considerablemente menos TNF-a e IL-6, lo que subraya la contribución de esta vía celular a la progresión del choque séptico.
Ejemplo 20
Materiales y métodos para el modelo de isquemia cerebral/ accidente cerebrovascular descrito en el Ejemplo 21
Los ratones usados en este estudio fueron ratones C57BI/6 machos de 2 a 3 meses de edad (22-28 g).
Modelo MCAO. El modelo de ratón MCAO se realizó mediante el uso de la técnica de sutura intraluminal descrita por Rousselet y otros (66). Brevemente, los ratones se anestesiaron en una cámara con isoflurano al 3 % en oxígeno (1 L/min) y se usó buprenorfina (0,1 mg/g de peso corporal por vía subcutánea) como analgésico. La anestesia se mantuvo durante la operación mediante el uso de isoflurano al 1,5 % en oxígeno proporcionado a través de una mascarilla. Se registró la temperatura rectal y se mantuvo estable a 37 ± 0,5 °C con una almohadilla térmica. Después de una incisión en la línea media en el cuello, se expuso la bifurcación de la carótida derecha y se ocluyó temporalmente la arteria carótida común (CCA) mediante el uso de sutura de seda 5-0. Se separó la bifurcación de la arteria carótida común interna derecha (ICA) y la arteria carótida común externa (ECA). Se colocó una sutura permanente alrededor del ECA, lo más distalmente posible, y se colocó otra sutura temporal ligeramente apretada en la ECA distal a la bifurcación. La ACI derecha se ocluyó temporalmente con sutura de seda 5-0 para evitar hemorragias. A continuación, se cortó un pequeño orificio en el ECA entre las suturas permanentes y temporales a través del cual se introdujo una sutura de monofilamento revestida con silicio 6-0 de 12 mm de largo (aproximadamente 9-10 mm se cubrió con silicio). El filamento se avanzó desde la ECA hasta el lumen de la ICA hasta que bloqueó el origen de la arteria cerebral media (MCA) en el círculo de Willis. Los animales simulados se obtuvieron insertando el monofilamento en la CCA, pero sin avanzar hacia la MCA. La sutura en la ECA se anudó firmemente para fijar el monofilamento en su posición. Treinta minutos después de la MCAO, el monofilamento se eliminó por completo para permitir la reperfusión. También se retiró la sutura temporal del CCA para permitir la recirculación de sangre. Una vez cerrada la herida, se inyectó subcutáneamente 1 mL de solución salina para evitar la deshidratación postquirúrgica. El ratón se colocó en una jaula y se mantuvo sobre la almohadilla térmica durante 1 h. Mientras tanto, cuando el ratón estaba completamente despierto de la anestesia, se verificó si tenía algunos déficits motores básicos (dar vueltas al caminar y agacharse mientras se sujetaba por la cola; indicadores del éxito de la operación) y NRP1-Trampa-1 sin CF(Figura 19B SEQ ID NO: 83) a la dosis de 0,4 ug en 125 uL de PBS se administró a la vena de la cola (aproximadamente 15 minutos después de que se hubiera iniciado la reperfusión). Los animales de control operados de la misma manera que los animales tratados con NRP1 recibieron, después de MCAO, un vehículo (PBS). Debido a que generalmente se observa pérdida de peso postquirúrgica, los alimentos triturados se colocaron en una placa de Petri para estimular la ingesta.
Determinación del volumen de infarto. Después de la evaluación neurológica (ver sección más abajo) realizada 24 h después de la MCAO, los animales se anestesiaron profundamente con isoflurano al 3 % en oxígeno (1 L/min) y se decapitaron. Los cerebros se aislaron inmediatamente y se transfirieron a isopentano enfriado en hielo seco y luego se almacenaron a -80 °C. Luego, los cerebros congelados se cortaron coronalmente en secciones de 20 pm en un criostato a -22 °C y cada 15th la rodaja se montó sobre portaobjetos de vidrio cargados positivamente. Las secciones cerebrales se tiñeron con violeta de cresilo durante 15 min. Cada sección fue fotografiada. Las áreas de infarto se delinearon sobre la base de la relativa falta de tinción en la región isquémica y se midieron mediante el uso el software NIH ImageJ. El área de infarto en cada sección se determinó como el área total del hemisferio contralateral menos el área no afectada del hemisferio ipsolateral.
Evaluación neurológica. Una hora después de la operación, así como también 24 h después de la MCAO, los animales fueron sometidos a una serie de pruebas motoras realizadas. Los exámenes y la puntuación fueron los siguientes: 0, normal; 1, flexión contralateral de la extremidad delantera o trasera al levantar todo el animal por la cola; 2, girando hacia el lado contralateral mientras camina y flexión lateral en forma de C mientras se sujeta por la cola; 4 Dar vueltas hacia el lado contralateral mientras camina y flexión lateral en forma de C mientras se sujeta por la cola con flexión de las extremidades; 5, Comatoso o moribundo. La magnitud de la puntuación neural obtenida es directamente proporcional a la gravedad del deterioro.
Ejemplo 21
La Trampa NRP1 protege contra la isquemia cerebral y el accidente cerebrovascular
Para evaluar el resultado de la neutralización de la SEMA3A en la isquemia cerebral o accidente cerebrovascular, se sometieron ratones adultos (8-12 semanas de edad) al modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO). Los detalles experimentales se proporcionan en el Ejemplo 20. Brevemente, tras la terminación de MCAO, se administró Trampa n Rp 1 de ratón (Trampa-1, sin FC), 0,4 ug en 125 uL de PBS, (Figura 19C, Figura 20R; SEQ ID NO: 25) a la vena de la cola (aproximadamente 15 min después de iniciada la reperfusión). Para visualizar el daño cerebral inducido por MCAO, las secciones cerebrales coronales se tiñeron con violeta de cresilo. En cada sección, el área sin teñir correspondía a la región isquémica del cerebro (Figura 18A). La medición de estas áreas en secciones coronales seriadas reveló que 24 h después de la MCAO, la zona infartada constituía el 48 % del hemisferio ipsolateral en ratones ocluidos en comparación con los animales operados de forma simulada cuyos cerebros no estaban lesionados. El tratamiento con NRP1 redujo el daño cerebral; el volumen de infarto del hemisferio ipsolateral se redujo en un 80 % (Figura 18B,C).
El deterioro neurológico se evaluó mediante la puntuación neurológica de la presencia de flexión de las extremidades, flexión lateral del cuerpo en forma de C y movimientos circulares. Los ratones MCAO que no mostraban un comportamiento circular y de flexión 1 hora después de la operación se excluyeron del estudio adicional (Figura 18D). En los ratones sometidos a MCAO se observó flexión de las extremidades anteriores o posteriores, flexión lateral del cuerpo en forma de C y movimientos circulares en comparación con los animales operados simuladamente. El tratamiento con NRP1 mejoró drásticamente las puntuaciones neurológicas de los ratones isquémicos en un 60 % en comparación con los ratones MCAO no tratados cuando se evaluaron 24 horas después de la cirugía (Figura 18E).
Tomados en conjunto, estos resultados muestran que la inhibición de la vía NRP1 protege contra la isquemia cerebral y el accidente cerebrovascular y reduce el deterioro neurológico asociado con la isquemia cerebral y el accidente cerebrovascular.
Ejemplo 22
Las trampas derivadas de Neuropilina mejoran la regeneración vascular y previenen la neovascularización patológica en retinas isquémicas en modelo de ratón de retinopatía diabética y retinopatía del prematuro.
La degeneración vascular patológica así como también la proliferación vascular prerretiniana se estudiaron mediante el uso del modelo de ratón bien establecido de retinopatía proliferativa inducida por oxígeno (OIR) (Smith y otros, 1994). Este modelo se basa en la retinopatía del prematuro (ROP) y se usa habitualmente como un sustituto de la proliferación (fase angiogénica) de la retinopatía diabética y la ROP.
Las madres lactantes y sus crías fueron expuestas al 75 % de oxígeno de P7 a P12. Las fases vasodegenerativa (evaluada en P12) y vasoproliferativa (evaluada en P17) están presentes y son altamente reproducibles, lo que hace que la evaluación de las intervenciones sobre la progresión de la enfermedad sea precisa y rápida. La Trampa G (SEQ ID NO: 38), o la Trampa M (que carece de los dominios b2 y c, SEQ ID NO: 42), se inyectó en el vítreo en P12 (1 uL a 0,5 ug/uL). Las retinas diseccionadas se montaron en plano y se incubaron durante la noche con isolectina B4 fluoresceinada (1: 100) en CaCl 1mM.2 para determinar la extensión del área avascular o el área de neovascularización en P17. Las áreas avasculares se determinaron en retinas teñidas con lectina como zonas desprovistas de tinción. La neovascularización se determinó como áreas de tinción de lectina saturada que delimita los penachos prerretinianos (54, 55).
Se demostró que la Trampa G mejora eficazmente la regeneración vascular en más del 40 % en comparación con el control del vehículo (Figura 23B). De manera similar, se demostró que la Trampa G inhibe la neovascularización patológica por ~45 % (Figura 23C). La Trampa-M mejoró la regeneración vascular por ~60 % (Figura 23B) e inhibió la neovascularización patológica por ~60 % en comparación con los controles del vehículo (Figura 23C). Por tanto, la Trampa M, con la unión de VEGF comprometida, previene más eficazmente la angiogénesis patológica y genera más fácilmente una mayor regeneración vascular en la retina isquémica.
Ejemplo 23
Las trampas derivadas de Neuropilina disminuyen las fugas en las retinas diabéticas.
La influencia de las trampas en la fuga/permeabilidad vascular en la retinopatía diabética también se estudió en el modelo de estreptozotocina (STZ) de diabetes tipo 1. Se administró STZ (55 mg/kg) durante 5 días consecutivos a ratones C57BL/6J de 6 semanas de edad y se controló la glucemia. Los ratones se consideraron diabéticos si su glucemia en ayunas era superior a 17 mM (300 mg/dL). A los ratones se les administró por vía intravítrea 0,5 ug (0,5 ug/uL) de Trampa G (SEQ ID NO: 38) o Trampa M (SEQ ID NO: 42) o anticuerpo anti-VEGF de ratón (AF-493-NA, de R&D) en las semanas 6 y 7 después de la administración de STZ. Alternativamente, los ratones se inyectaron vía intravítrea a las 12 y 13 semanas después de STZ y se evaluó la permeabilidad vascular a las 14 semanas. Los ratones eran hiperglucémicos/diabéticos al menos 3 semanas antes de las inyecciones intravítreas con trampas SEMA (ver Figura 24A) o anticuerpo anti VEGF. La fuga vascular retiniana se determinó mediante el ensayo de azul de Evans a las 8 semanas después de las inyecciones de STZ como sigue. La permeabilidad retiniana con Azul de Evans (EB) se realizó mediante el uso de 3 retinas por lectura. Se inyectó Evan Blue a 45 mg/kg por vía intravenosa y se dejó circular durante 2 horas antes de la extracción de la retina. La permeabilidad con Azul de Evans se cuantificó en las retinas mediante fluorimetría (absorbancia máxima de 620 nm - absorbancia mínima de 740 nm (fondo) con un TECAN Infinite® M1000 PRO. La permeabilidad con Azul de Evans (EBP) [medida en uL/(gramos * hora)] se calculó de la siguiente manera: [EB (ug)/Peso retiniano húmedo (g)]/[EB plasmático (ug/uL) * Tiempo de circulación (horas)]. La permeabilidad con Azul de Evans se expresó con relación a los controles.
Tanto la Trampa G (SEQ ID NO: 38) como la Trampa M (SEQ ID NO: 42) redujeron significativamente la permeabilidad vascular en más del 40 % (Figura 24B). El anticuerpo anti-VEGF de ratón (Af-493-NA) no previno la permeabilidad vascular en esta etapa temprana. La Trampa G fue eficaz para reducir la fuga vascular al igual que el Ab neutralizante anti-VEGF en P17 (Figura 24C), *p <0,05, n = 4, de 12 animales.
Ejemplo 24
Las trampas derivadas de Neuropilina disminuyen la neovascularización coroidal en el modelo de degeneración macular relacionada con la edad
El efecto de la Trampa G de NRP1 (SEQ ID NO: 38) sobre la neovascularización coroidea (CNV) se determinó en un modelo de ratón de degeneración macular relacionada con la edad (AMD). Para inducir la NVC y así imitar la DMAE húmeda en ratones, se realizaron coagulaciones con láser en ratones de 6-8 semanas (1-2 diámetros de disco) a partir de las papilas mediante el uso de un láser de argón (532 nm) montado en una lámpara de hendidura Coherent (400 mW, 50 ms y 50 pm) (Combadiere y otros, 2007). Después de la quema con láser, los ratones tratados se inyectaron vía intravítrea con 0,5 ug de Trampa G. Catorce días (P14) más tarde, las coroides se incidieron radialmente, se montaron en plano y se tiñeron con el marcador de células endoteliales fluoresceinado Isolectina B4 (los animales también se perfundieron opcionalmente con fluoresceína dextrano para visualizar los vasos luminales) y los volúmenes de NVC se midieron mediante microscopía confocal láser de barrido (Takeda y otros, 2009).
Se demostró que la Trampa G reduce significativamente la neovascularización coroidea el día 14 después de la quemadura con láser (Figura 25 B).
El alcance de las reivindicaciones no debe limitarse por las modalidades preferidas se muestran en los ejemplos, sino que deben interpretarse más ampliamente de manera consistente con la descripción como un todo.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una trampa de polipéptido Neuropilina-1 (NRP1) soluble que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de los dominios al, a2 y b1 de la NRP1 humana nativa, en donde dicha trampa de polipéptido NRP1 carece del dominio b2 de NRP1 humana nativa.
2. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido NRP1 soluble comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95 % de identidad con los dominios al, a2 y b1 de la NRP1 humana nativa.
3. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido NRP1 soluble comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99 % de identidad con los dominios al, a2 y b1 de la NRP1 humana nativa.
4. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho polipéptido NRP1 soluble comprende la secuencia de los dominios al, a2 y b1 de NRP1 humana nativa.
5. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho polipéptido NRP1 soluble carece del dominio c de la NRP1 humana nativa.
6. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha trampa de polipéptido NRP1 soluble comprende además un dominio de fragmento cristalizable (Fc).
7. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho dominio Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.
8. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde dicho dominio Fc está unido al extremo carboxi terminal del polipéptido NRP1.
9. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usar en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección inflamatoria que implica la hiperactivación de la respuesta inmunitaria innata.
10. La trampa de polipéptido NRP1 soluble para usar de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la enfermedad o afección inflamatoria es una afección neuroinflamatoria.
11. La trampa de polipéptido soluble NRP1 para usar de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde la enfermedad o afección inflamatoria es choque séptico, artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), inflamación cutánea de la piel, diabetes, uveítis, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía del prematuro, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), deterioro cognitivo relacionado con la edad, enfermedad de Alzheimer o accidente cerebrovascular.
12. La trampa de polipéptido NRP1 soluble para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicha trampa de polipéptido NRP1 soluble reduce i) el edema, ii) la activación/reclutamiento de fagocitos mononucleares, iii) la producción o secreción de citocinas inflamatorias; iv) la neovascularización patológica; y/o v) la degeneración vascular.
13. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha trampa de polipéptido NRP1 soluble es para administración ocular.
14. La trampa de polipéptido NRP1 soluble de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha trampa de polipéptido NRP1 soluble se formula en una composición farmacéutica con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
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