CN108165503A - 一种纤维素降解剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种纤维素降解剂及其应用，该纤维素降解剂至少包括有莫海威芽孢杆菌。莫海威芽孢杆菌可优选提取自园林废弃物。本发明通过采用莫海威芽孢杆菌替代现有技术中用于废弃物堆肥处理的细菌中厚壁菌门中的芽孢杆菌属的菌种，获得了优异的纤维素降解能力，产酶快，活性高。

Description

一种纤维素降解剂及其应用
技术领域
本发明属于园林废弃物处理领域，具体涉及一种纤维素降解剂及其应用。
背景技术
随着城市绿化建设的快速发展，以及人们对生态环境要求的提高，园林废弃物的产生量迅速增加，焚烧、填埋等非资源化的处理方式既带来了严重的环境问题，也造成了资源的浪费，已越来越不适应生态环境的要求。大多数园林废弃物含有丰富的有机质，部分地区通过堆腐使其形成基质重新应用于园林和城市绿化，对土壤有很好的改良作用，是一种变废为宝的科学手段，既减少了对环境的污染，也节约了资源，是一种适合可持续发展的处置方式。
目前，处理园林废弃物的主要模式是参照着农业废弃物的堆肥方式，然而园林废弃物相较于农业废弃物来说，园林废弃物含有更丰裕的木质纤维素，其主要结构组成成分有纤维素、木质素和半纤维素，它们主要存在于植物细胞壁的微管组织中，纤维素分子链聚集成的微纤丝相互交织镶嵌排列形成结晶相和非结晶相，这种精致紧密的晶体结构有超强的防御作用，使化学试剂难以有效接触纤维素表面或生物酶与之作用，致使纤维素难以降解，因此采用农业废弃物的传统堆肥方式显然不适宜园林废弃物。因此寻找并筛选出能够降解纤维素的微生物菌株具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明旨在提供一种纤维素降解剂及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种纤维素降解剂，其至少包括有莫海威芽孢杆菌。
优选的是，所述的纤维素降解剂，其中，所述莫海威芽孢杆菌提取自园林废弃物。
优选的是，所述的纤维素降解剂，其中，所述莫海威芽孢杆菌的提取方法为：
将园林废弃物装入已灭菌的反应容器中，加入无菌水稀释后，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上进行细菌培养，将所有培养出来的的菌株进行生物学种属鉴定，最后将莫海威芽孢杆菌用接种环挑出于牛肉膏蛋白胨培养基上再次进行培养。
优选的是，所述的纤维素降解剂，其中，所述牛肉膏蛋白胨培养基通过以下方法制得：将牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，去离子水1000mL混匀，pH调至7.2，添加琼脂粉15g/L～20g/L配制成固体培养基，并在121℃、30min灭菌。
一种如上所述的任一项所述的纤维素降解剂在纤维素降解中的应用。
一种如上所述的任一项所述的纤维素降解剂在园林废弃物处理中的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过采用莫海威芽孢杆菌替代现有技术中用于废弃物堆肥处理的细菌中厚壁菌门中的芽孢杆菌属的菌种，获得了优异的纤维素降解能力，产酶快，活性高。
附图说明
图1为葡萄糖试验的标准曲线图。
图2为五种菌株产滤纸酶活的分析图。
图3为五种菌株产CMC酶活的分析图。
图4为五种菌株产外切酶活的分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
下面列出本案一实施例的一种纤维素降解剂，其至少包括有莫海威芽孢杆菌。作为优选方案，纤维素降解剂中还可以包括有用于帮助其保存、维持活性、或帮助其淋洒于园林废弃物表面的任何形式的助剂，例如：液体培养基。
莫海威芽孢杆菌在现有技术是作为生防菌而被公众所知的，除具有抑制病原菌的生物学功能外，还具有促进植物生长的生物学功能，其定殖于植物后，能够与植物达到互利互惠的关系，究其原因则是由于植物为生防菌提供生长所必需的场所和营养等，而生防菌则通过其溶磷、固氮及产生生物活性物质等生物学功能，增强宿主植物的抗病性、抗虫性、抗旱性及生长竞争能力等。而本案首次发现莫海威芽孢杆菌还具有降解纤维素的功能。
莫海威芽孢杆菌的序列为：
CAACAAGGGTCGCCATCGAGCCGGTGACCAAGACGGTTGAATAATACATCCCAACGTGTCCTGTAGTGAGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGCTCTACGGAGGAAAGGGGGGGATCTTAGGACCTCCCGCTACAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACGCCGTGGTTAATACCCGTGGCGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCCGCTAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCGGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTCGGGTCTTCATTGACTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACTAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTATGGAATCCTGCTGAGAGGTGGGAGTGCCCGAAAGGGAGCCATAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCCAGAAAACCTATCGTAGTCCGGATCGCACTCTGCAACTCGAGTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTTCACACCGCCCGTCACACCATG。
其中，莫海威芽孢杆菌提取自园林废弃物。
其中，莫海威芽孢杆菌的提取方法为：
将园林废弃物装入已灭菌的反应容器中，加入无菌水稀释后，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上进行细菌培养，将所有培养出来的的菌株进行生物学种属鉴定，最后将莫海威芽孢杆菌用接种环挑出于牛肉膏蛋白胨培养基上再次进行培养。
其中，牛肉膏蛋白胨培养基通过以下方法制得：将牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，去离子水1000mL混匀，pH调至7.2，添加琼脂粉15g/L～20g/L配制成固体培养基，并在121℃、30min灭菌。
具体莫海威芽孢杆菌分离的实施例为：
改良高氏1号培养基：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KNO3 1.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，去离子水1000mL，pH调至7.2，添加琼脂粉15g/L～20g/L配制成固体培养基，并在121℃、30min灭菌。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，去离子水1000mL，pH调至7.2，添加琼脂粉15g/L～20g/L配制成固体培养基，并在121℃、30min灭菌。
在无菌环境下称取1.0g园林废弃物堆肥材料的样品装入已灭菌的三角瓶中，加入99mL无菌水，密封后置于培养振荡器中震荡30min，制成10-2倍的稀释液，振荡器转速200.0r/min、温度25℃。吸取1mL10-2倍稀释液，加入到装有9mL无菌水的灭菌试管中，塞紧试管塞，摇匀制成10-3倍稀释液；以同样的方法制得10-4～10-8倍的稀释液。用移液枪吸取各梯度稀释液100μL于牛肉膏蛋白胨培养基和改良高氏1号培养基上均匀涂布，进行细菌和真菌分离培养，每个梯度稀释液平行凃板3个。其中，改良高氏1号培养基用来培养真菌，牛肉膏蛋白胨培养基用来培养细菌，将所有培养出来的的菌株进行生物学种属鉴定。
莫海威芽孢杆菌来自牛肉膏蛋白胨培养基培养出的细菌中。将莫海威芽孢杆菌用接种环挑出于牛肉膏蛋白胨培养基上再次进行培养，即分离出纯的莫海威芽孢杆菌。
莫海威芽孢杆菌的纤维素降解能力分析：
挑取莫海威芽孢杆菌的单菌落用点接法接种于羧甲基纤维素钠固体培养基上，重复接种3个。培养3d后，往每个平板中加入10mL 1mg/mL的刚果红溶液，静置染色15min后倒弃刚果红染液，然后加入1mol/L NaCl溶液洗涤平板3～5次，观察菌落周围有无透明圈出现，若有出现则说明该菌株能产生纤维素酶，并采用十字交叉法量取菌落直径(d)及透明光圈直径(D)，根据透明圈与菌落的直径比来比较菌株的纤维素降解能力，即纤维素酶相对活性＝D/d。该实施例中，莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)的光圈直径D值为3.18cm，菌落直径d值为1.49cm，酶相对活性(D/d)值为2.13，表明该种菌落形态观察容易，且降解纤维素的能力较强。
纤维素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是酶的一种，在分解纤维素时起生物催化作用，可以将纤维素分解成葡萄糖。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。
上述实施例中基于CMC-Na刚果红平板筛选高产纤维素酶菌株的原理。刚果红法(congo red)是目前公认的一种比较有效分离方法。刚果红与结构中具有β-1,4-D-吡喃型葡萄糖的多糖有强烈相互作用，与β-1,3-D-葡聚糖及一些半纤维素的乳糖-葡甘露糖聚合糖存在明显相互作用。刚果红同纤维素水解后的多糖水解物形成了颜色浓郁的多聚糖-刚果红复合物沉淀，对鉴定多糖水解物具有明显的指示作用，为纤维素—刚果红培养基分离、筛选纤维素分解菌提供了理论基础。如果菌落本身可以产生纤维素酶，它周围的纤维素类物质被水解后，刚果红与水解后的多糖产物形成的红色多聚糖-刚果红复合物，经氯化钠溶液洗过以后菌落周围颜色变浅形成透明圈，而颜色浓郁的红色物质主要集中在菌落未生长区域。刚果红能与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖或葡萄糖发生这种反应。因此在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素的形成红色复合物，若培养基中的纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，最终形成红色沉淀，颜色浓郁、厚重，可被氯化钠溶液洗脱，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的清晰可见的透明圈，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。透明圈的大小和纤维素酶活性成正性关系。以纤维素培养基筛选纤维素酶生产菌的优点是，试验方法简单，筛选周期短，可以通过水解透明圈的产生情况对筛选菌株的产纤维素酶能力进行初步的判断。水解透明圈出现的早说明菌株产酶速度快，水解透明圈越大说明菌株产生的纤维素酶越多、活性越高。在试验中根据纤维素培养基中水解透明圈的出现时间以及直径的大小，可以粗略的判断菌株的产酶能力，在一定程度上降低点的筛选工作的难度。
纤维素酶作用种类的多样性取决于纤维素底物的结构复杂性，但都遵循协同作用机理，就是β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶产生协同作用将纤维素降解成为葡萄糖：内切葡聚糖酶是切断纤维素多糖链内部的无定形区域，并且打开缺口，然后随机水解β-1,4-糖苷键，产生不同长度的还原性和非还原性的纤维素多糖链末端。外切葡聚糖酶，也可称为纤维二糖水解酶，其作用是在这些纤维素链的自由末端，并且释放出葡萄糖或纤维二糖。另外，外切葡聚糖酶水解能使纤维素结晶区域的结构变得松散，使得利于内切葡聚糖酶的作用，到最后β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖和寡糖产生葡萄糖，以便解除它们对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的反馈抑制，使得这两种酶能更加有效的作用。
不同酶活的结果分析：
1.1葡萄糖标准曲线
标准葡萄糖溶液：葡萄糖在108℃烘箱内烘干30min～1h后，配置1.037g/ml浓度葡萄糖溶液，再分别取0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml葡萄糖溶液用蒸馏水稀释至2ml，加入3mlDNS试剂沸水浴10min，立即用冷水终止反应，另用0ml，在波长为540nm下测定光吸收值(OD值)，光吸收值作为纵坐标，以葡萄糖含量作为横坐标，绘制出葡萄糖标准曲线及曲线方程式。酶活力按国际单位的定义是：每min催化水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位IU。
1.2滤纸酶活的测定
取1ml菌液在6000r的离心机中离心10min，弃去沉淀，加入滤纸底物溶液。在50℃恒温水浴锅中反应1h。反应后加入3mlDNS溶液，放于沸水浴中煮沸10min，用冷水立即终止反应。在波长为540nm下测定光吸收值(OD值)。根据葡萄糖标准曲线测算滤纸酶的活性。对照为菌液沸水10min，立即冷水冷却。每个样做三个平行。
1.3CMC酶活(内切葡聚糖酶)的测定
取1ml菌液在6000r的离心机中离心10min，弃去沉淀，加入CMC底物溶液。在50℃恒温水浴锅中反应30min。反应后加入3mlDNS溶液，放于沸水浴中煮沸10min，用冷水立即终止反应。在波长为540nm下测定光吸收值(OD值)。根据葡萄糖标准曲线测算滤纸酶的活性。对照为菌液沸水10min，立即冷水冷却。每个样做三个平行。
1.4微晶纤维素酶活(外切葡聚糖酶)的测定
取1ml菌液在6000r的离心机中离心10min，弃去沉淀，加入微晶纤维素底物溶液。在50℃恒温水浴锅中反应2h。反应后加入3ml DNS溶液，放于沸水浴中煮沸10min，用冷水立即终止反应。在波长为540nm下测定光吸收值(OD值)。根据葡萄糖标准曲线测算滤纸酶的活性。对照为菌液沸水10min，立即冷水冷却。每个样做三个平行。
图1为葡萄糖试验的标准曲线图，通过图1可知，葡萄糖实验的标准曲线的方程是y＝7.9736x+0.0002(x为OD＝540，y为标准样葡萄糖浓度)测样品葡萄糖含量时，将所得到的光的吸收值代入到方程中，求得样品中葡萄糖含量。
图2为五种菌株产滤纸酶活的分析图，其中，这五种菌株分别为：A是原小单孢菌，B是伯克氏菌，C是出芽短梗菌，D是产黄霉素，E是莫海威芽孢杆菌(下同)。将菌株转接入产酶诱导培养基中，测定滤纸酶活。滤纸作为底物结构较为松散，是聚合度和结晶度都居中等的纤维材料，容易同时被内切酶和外切酶降解，再由葡萄糖甘酶分解成葡萄糖等还原糖，反映的是纤维素酶三类酶组分的协同作用的总酶活。从图2中可以看出，在接菌株后酶活力随着时间的变化呈逐步上升的趋势，3d时，酶活力达到最高值。A，E和D在第三天产酶量均达到100U以上。当培养时间超过3d后，酶活力始下降。这说明莫海威芽孢杆菌具有较强的产滤纸酶活的能力。
图3为五种菌株产CMC酶活的分析图。将菌株转接入产酶诱导培养基中，测定CMC(羟甲基纤维素)酶活。由于外切酶对纤维素链的专一性高，而内切酶的专一性较低，在降解CMC时，主要反映的是内切酶的活力。从图3中可以看出，酶活力随着时间的增加而上升，3d时，酶活力达到最高值。A，C和E在第3d天产CMC酶活均达到140U以上，其中C菌株在第3d产酶量达到150U以上。当培养时间超过3d后，酶活力始下降。这说明莫海威芽孢杆菌具有较强的产CMC酶活的能力。
图4为五种菌株产外切酶活的分析图。把菌株接到能够产酶的诱导的培养基中，从图4中可以看出，酶活力随着时间的增加而上升，B、C和E在2d时，酶活力达到最高值，A和D在第3d达到最大值。之后，酶活力始下降。这说明在纤维素降解菌的菌株转接到菌液的初期时，纤维素降解菌的菌株B和C的酶的活性增长速率相对比较高，而其他的三株纤维素降解菌的菌株的酶的活力增长速率相对缓慢。这说明莫海威芽孢杆菌具有较强的产外切酶活的能力。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
莫海威芽孢杆菌的序列为：
CAACAAGGGTCGCCATCGAGCCGGTGACCAAGACGGTTGAATAATACATCCCAACGTGTCCTGTAGTGAGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGCTCTACGGAGGAAAGGGGGGGATCTTAGGACCTCCCGCTACAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACGCCGTGGTTAATACCCGTGGCGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCCGCTAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCGGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTCGGGTCTTCATTGACTTGGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACTAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTATGGAATCCTGCTGAGAGGTGGGAGTGCCCGAAAGGGAGCCATAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCCAGAAAACCTATCGTAGTCCGGATCGCACTCTGCAACTCGAGTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTTCACACCGCCCGTCACACCATG。

Claims (6)

1.一种纤维素降解剂，其特征在于，其至少包括有莫海威芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的纤维素降解剂，其特征在于，所述莫海威芽孢杆菌提取自园林废弃物。
3.根据权利要求2所述的纤维素降解剂，其特征在于，所述莫海威芽孢杆菌的提取方法为：
将园林废弃物装入已灭菌的反应容器中，加入无菌水稀释后，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上进行细菌培养，将所有培养出来的的菌株进行生物学种属鉴定，最后将莫海威芽孢杆菌用接种环挑出于牛肉膏蛋白胨培养基上再次进行培养。
4.根据权利要求3所述的纤维素降解剂，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨培养基通过以下方法制得：将牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，去离子水1000mL混匀，pH调至7.2，添加琼脂粉15g/L～20g/L配制成固体培养基，并在121℃、30min灭菌。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的纤维素降解剂在纤维素降解中的应用。
6.一种如权利要求1-4中任一项所述的纤维素降解剂在园林废弃物处理中的应用。
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