CN101392268A - 一种获取可转化底物的木质纤维素原料预处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种获取供生物炼制、生物能源、生物医药、食品加工、轻化工产品、生物饲料及肥料生产所需可转化底物的木质纤维素原料的预处理方法，其采用具有选择性破坏木质纤维素结构的担子菌株或菌群在开放条件下对各种木质纤维素原料进行固体发酵连续预处理。经预处理后可直接或简单提取获得可转化底物，或者结合理化、生物质白腐菌降解体系复合酶法处理后获取可转化底物。本发明方法以生物降解、改性与转化生物质为主导，部分结合理化、酶法处理技术，具有可操作性强、应用范围广泛等优点。

Description

一种获取可转化底物的木质纤维素原料预处理方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种由木质纤维素原料获取能够用于多种产物转化的可转化底物的生物预处理方法。

背景技术

随着化石资源日益枯竭，寻找新的替代能源及自非石油路线获取生物炼制及轻化工原料成为研究热点，以生物质能源为主导的生物炼制、生物化工以其清洁、环保倍受重视。目前主要以淀粉类生物质如陈化粮、玉米、小麦、薯类为生物炼制、生物化工、生物医药及食品发酵、生物饲料等的主要生产原料。长期以粮食为原料涉及与人争粮争地、成本居高不下等问题，且已经危及国家粮食安全，急需寻求廉价的原料来源。因此从廉价木质纤维素原料中获取生物炼制、生物质能源、生物化工、生物医药、食品加工、生物肥料及饲料转化产物所需的可转化底物成为研究重点。

可转化底物获取主要包括两个步骤：①农、林、食品加工、制药等工农业废弃生物质中的纤维素、半纤维素的释放及酶解获取可转化糖类；②农、林、食品加工、制药等工农业废弃生物质经生物降解、改性及转化后产生的可转化底物。其中木质素、半纤维素的选择性可控降解与可转化底物廉价产生与释放、酶作用效率提高及用量减少是降低成本的关键。

农、林、食品加工、制药等工农业废弃生物质中的主要成分是木质纤维素，其结构特征对复合纤维素酶作用有十分重要的影响。研究证明，生物质木质素含量、结构多孔性(可利用的表面积)及纤维素的结晶性、是影响纤维素酶对纤维素降解的三大因素。原料中木质纤维素结构破坏、多孔性的增加和纤维素结晶度的降低可以大大增加纤维素酶的酶解效率，从而提高可转化糖的获得率。因此担子菌对木质素的降解、改性及纤维素的解聚过程是获取可转化底物的关键。通常采用理化技术来获取可发酵糖等其他底物。如物理预处理、化学预处理、物理化学预处理等，其中碱和酸预处理是应用较多的预处理方法。酸处理的作用是水解木质纤维素中的半纤维素，增加基质的多孔性，但对于纤维素水解过程中的最大屏障“木质素”作用很小且对乙醇发酵具有抑制性；相对高浓度、高温条件下的碱处理能够去除原料中部分木质素，降低纤维素水解的屏障，但存在耗能，污染及能源底物流失等不足，难以满足规模化及节能减排的需求。因此寻求一种高选择性、处理廉价便利、环境友好的生物预处理技术是获取可转化底物的关键，利用担子菌选择性降解木质素、半纤维素的特性有可能改变这一现状。担子菌预处理技术反应条件温和，不产生污染，不仅是一种环境友好技术，而且可以降低下一步反应的能耗，更为重要的是，该技术具有选择性降解秸秆组分及减少乙醇发酵抑制因子的能力，从而使生物预处理过程中可发酵糖流失及抑制乙醇发酵的问题得到解决。

担子菌生物制浆技术在造纸工业中已得到广泛的应用。研究发现，木质纤维素基质经担子菌处理后，其物理特性和化学特性显著改变，结果导致机械制浆的能耗和化学制浆的试剂用量降低。但是利用担子菌预处理减少生物质对纤维素酶反应的抗性，促进生物炼制、生物质能源等可转化底物产生却少见报道。一些饲料研究表明，经过微生物发酵后的秸秆饲料在瘤胃中更容易被消化，说明微生物处理木质纤维素原料能够改变纤维素酶反应特性。因此，担子菌对木质素的降解与对纤维素的解聚作用有可能应用于木质纤维素原料预处理获取生物燃油及生物炼制所需的可转化底物中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获取供生物炼制、生物能源、生物医药、生物材料、食品加工、轻化工产品、生物饲料及肥料生产所需可转化底物的木质纤维素原料的预处理方法。

本发明方法采用具有选择性破坏木质纤维素结构的担子菌株或菌群在开放条件下对木质纤维素原料进行固体发酵连续生物预处理。经预处理后可直接或简单提取获得可转化底物，或者结合理化、生物质白腐菌降解体系复合酶法处理后获取可转化底物。该方法以生物降解、改性与转化生物质为主导，部分结合理化、酶法处理技术，具有可操作性强、应用范围广泛等优点。

具体的木质纤维素原料包括：农作物秸秆类、林木屑及竹碎屑、藤蔓类、果壳类、植物中草药及农副产品加工后残渣类及杂草类。其中农作物秸秆类，包括稻草、玉米秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆、棉花秸秆、木薯秸秆、黄豆秸秆、葵花秸秆、芝麻秸秆、花生秸秆及油菜秸秆；林木屑及竹碎屑；藤蔓类，包括薯藤、葛藤、南瓜藤、冬瓜藤、黄瓜藤；果壳类，包括玉米苞衣、麸皮、花生壳、板栗壳及谷壳；植物中草药及农副产品加工后残渣，包括中药渣、风眼莲渣、甘蔗渣、红薯渣、土豆渣、木薯渣、莲藕渣、花生渣及果渣；杂草类。

木质纤维素原料在担子菌或菌群生物预处理之前部分进行粒度处理，其中农作物秸秆类、林木屑及竹碎屑、藤蔓类、果壳类及杂草类原料分别剪切长度为1cm～5cm的小段或者粉碎至5～40目，植物中草药及农副产品加工后残渣类原料粉碎至5～40目，优化的长度及粒度处理分别为1cm～3cm和10～30目，最优的粒度处理分别为2cm和20目。

其中，所使用的担子菌株或菌群为具有降解显著木质素、半纤维素降解作用的担子菌，包括Echinodontium sp.、Irpex sp、Trichaptumsp.、Armillariella sp.、Stereum sp.、Hygrophorus sp.、Trametes sp.、Ganoderma sp.、Polyporus sp.、Pleurotus sp.、Hydanm sp.、Phellinus sp.、Auricularia sp.、Polyporellus sp.、Lentinus.sp.、Poria sp.、Dictyophorasp.、Fomitopsis sp.、Agaricus sp.、Schizophyllum sp.、Grifola sp、Voluariella sp.。

其中利用具有选择性破坏木质纤维素结构的担子菌株或菌群在开放条件下固体发酵木质纤维素原料的连续生物预处理工艺为：将木质纤维素原料与水适当混合制成发酵基质，两者可按重量体积比1:1.5～1:3.5(W/V)混合，pH自然，将担子菌株或者菌群的固体菌种按照5％～40％(W/W)的比例接种到未灭菌发酵基质中，搅拌均匀，温度控制20℃～37℃，湿度控制75％～95％，发酵时间10d～30d；处理完毕，60％～95％(W/W)发酵原料取出进入可转化底物获取阶段，同时补加新鲜原料至原始体积，搅拌均匀循环发酵。待菌丝穿透与长满木质纤维素基质，检测可转化底物糖达到60％以上时，则进入可转化底物获取阶段。

优化的连续生物预处理工艺为：木质纤维素原料与水重量体积比例为1:2～1:2.5(W/V)，将担子菌株或者菌群的菌种按照15％～20％的比例接种到未灭菌发酵基质中，搅拌均匀，温度控制25℃～30℃，湿度控制80％～90％，发酵时间10d～20d；处理完毕，70％～85％(W/W)发酵原料取出进入可转化底物获取阶段。

更优的连续生物预处理工艺为：木质纤维素原料与水比例为1:2.5，将担子菌株或者菌群的菌种按照10％～20％的比例接种到未灭菌发酵基质中，搅拌均匀，温度控制25℃～28℃，湿度控制85～90％，发酵时间12～14d；处理完毕，80～90％(W/W)发酵原料取出进入可转化底物获取阶段。

木质纤维素原料生物预处理之后，可直接获得木质纤维素降解与改性产物、担子菌体、担子菌多糖、担子菌糖蛋白、油脂等可转化底物；或经过简单的提取工艺，包括浸泡、浓缩、分离、纯化步骤获得酸类、糖类及醛酮类可转化底物；也可结合温和酸、碱、蒸汽爆破以及生物质白腐菌降解复合酶解技术获得糖类、酸类等可转化底物。

可转化底物包括主要包括四大类：生物炼制底物；生物燃油、燃气及轻化工产品转化底物、生物炼制底物；食品及药业生物活性物质转化底物。其中生物炼制底物包括戊糖、己糖、醛、酮、酚类及有机酸；生物燃油、燃气及轻化工产品转化底物包括担子菌体、木质纤维素改性残渣以及多糖、油脂、戊糖、己糖、醛、酮、有机酸、呋喃、糠醛、LCC；食品及药业生物活性物质转化底物包括木质纤维素降解与改性产物、担子菌体、担子菌多糖、多肽、担子菌糖蛋白及次生代谢产物。生物饲料及生物肥料转化底物包括担子菌体、担子菌多糖、多肽、担子菌糖蛋白、次生代谢产物、粗纤维及糖类；生物质改性残渣，腐质酸及用于保水、缓释的木质纤维素降解产物。

本发明方法的优点在于：

1)采用担子菌株或者菌群能够对多种富含木质纤维素的农、林、药植物及工业废弃物原料进行连续开放预处理，降低预处理或者整合工艺的生产成本。

2)预处理工艺可与多种目标产物转化工艺整合如生物炼制、热化学及化学转化、生物能源转化、轻化工产品转化、食品及医药转化、生物饲料及肥料转化工艺等，能够使转化产品多元化，提高得率与品质。且对后续产物转化工艺具有促进作用。

3)木质纤维素原料经担子菌株或者菌群生物预处理后再结合理化辅助处理及生物质白腐菌降解体系复合酶法技术不仅可实现可发酵糖的最大化释放，而且可显著降低纤维素酶用量。相对常规理化处理，酸、碱试剂浓度及用量、污染程度及能耗均显著降低。

4)木质纤维素原料经担子菌株或者菌群生物预处理后同步产生除戊糖、己糖之外的可转化底物包括：生物质担子菌降解、改性及转化的其它可转化底物；担子菌生物体及其分泌、代谢产物。可用于多种目标产物的生物炼制、生物材料、药物及轻化工产品生物与化学转化、热化学转化、生物饲料及肥料生产工艺所需原料。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中的菌种均可自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买。

实施例1 担子菌或菌群固体菌种制备

将冰箱保藏的具有显著性生物质破坏能力的担子菌株如Echinodontium sp.，Trichaptum sp.，Irpex sp.及显著性降解半纤维素的担子菌株Schizophyllum sp.，Polyporellus sp，Poria sp.斜面菌株接入土豆斜面上进行活化，培养5～7d，待菌丝长满斜面后，取菌丝斜面块接入秸秆(如玉米秸秆)培养基中进培养，26℃静置培养5～7d，之后进行浅盘扩培6～8d，即得开放用固体菌种。

实施例2 担子菌或菌群连续开放处理(一)

按实施例1的方法制备菌种：Echinodontium sp.，Trichaptum sp，Irpex sp，Schizophyllum sp，Polyporellus sp.。开放条件下，将制备好的菌种分别接种至未灭菌的玉米秸秆(粉碎至20～40目)，玉米秸秆：水W/V比为1:2.5，pH自然，接种量10％(W/W))培养基混合均匀，于25～28℃下静置发酵10～14d，取出80～90％(W/W)的发酵后的基质烘干，用于可转化底物的获取；取10％～20％(W/W)过程发酵基质再添加80％～90％(W/W)新鲜渣料混合均匀发酵，连续半年循环预处理。

实施例3 担子菌或菌群连续开放处理(二)

按实施例1的方法制备菌种：Echinodontium sp.。开放条件下，将制备好的菌种与未灭菌的风眼莲渣(料渣：水W/V比为1:2.5，pH自然，接种量15％)培养基混合均匀，于25～28℃下静置发酵10～14d，取出80～90％(W/W)的发酵后的基质烘干，用于可转化底物的获取；取10％～20％(W/W)发酵后的基质再添加80％～90％(W/W)新鲜渣料混合均匀发酵，连续半年循环预处理。

实施例4 担子菌或菌群连续开放处理(三)

按实施例1的方法制备菌种：Schizophyllum sp，Echinodontium sp。开放条件下，将制备好的菌种等比例(W/W)混合后与未灭菌的红薯藤渣或者甘草渣等(料渣：水W/V比为1:2.5，pH自然)培养基混合均匀，于25～28℃下静置发酵10～14d，取出80～90％(W/W)的发酵后的基质烘干，用于可转化底物的获取；取10％～20％(W/W)过程发酵基质再添加80％～90％(W/W)新鲜渣料混合均匀发酵，连续半年循环预处理。

实施例5 担子菌或菌群连续开放处理(四)

按实施例1的方法制备菌种：：Echinodontium sp.，Trichaptum spSchizophyllum sp。开放条件下，将制备好的菌种等比例(W/W)混合后与未灭菌的玉米秸秆(剪切长度为1cm～2cm或者粉碎至10～20目，玉米秸秆：水W/V比为1:2，pH自然，接种量20％W/W)培养基混合均匀，于25℃～30℃下静置发酵15～20d，取出65％(W/W)的发酵后的基质烘干，用于可转化底物的获取；取20～30％发酵后的基质再添加70～80％(W/W)新鲜渣料混合均匀、发酵。连续半年循环预处理。

实施例6 担子菌或菌群连续开放处理(五)

将制备好的菌种：Echinodontium sp.，Trichaptum sp，Irpex sp，Schizophyllum sp，Polyporellus sp，按重量比等比例混合后与未灭菌的玉米秸秆(剪切长度为2cm～3cm或者粉碎至5～10目，玉米秸秆：水W/V比为1:3，pH自然，接种量5％W/W)培养基混合均匀，于37℃下静置发酵20d，取出60～70％(W/W)的发酵基质用于可转化底物的获取；取30～40％(W/W)发酵过程基质再添加60～70％(W/W)新鲜渣料混合均匀，发酵连续半年循环预处理。

实施例7 可转化底物的直接提取

以风眼莲渣为原料，按照实施例3的方法进行连续处理，取已发酵的基质浸泡(物料:水＝1:10)4h，浓缩5倍体积，再经过气相及液相色谱测定，结果表明，浓缩液中富含糖类、醇类、酸类等可转化底物，其中草酸的平均含量达25g/L。

实施例8 可转化底物的GLA油脂转化

以红薯藤渣为原料，按照实施例4的方法进行连续处理，取已发酵的基质，分别直接加入30％的蔗糖，灭完菌后接入15％(v/w)GLA油脂合成菌种Cunninghamella elegans，在间歇式无菌空气通入下，28℃封闭式发酵8d，其多不饱和脂肪酸平均产量达到8g/kg发酵干基质以上，其中GLA平均产量达到1.5g/kg发酵干基质，产品具有很高的医药用价值。

实施例9 可转化底物的燃料油脂转化

以玉米秸秆(20～40目)为原料，按照实施例2的方法进行连续处理，取经Echinodontium sp。发酵的基质，添加淀粉15％及20％的蔗糖灭完菌后接入15％(v/w)的油脂合成菌株Cunninghamella sp，在间歇式无菌空气通入下，28℃封闭式发酵5～7d。由此获取富含微生物油脂热值提升的原料进一步热化学转化获取生物质能或者直接作为生物质能原料。

实施例10 可转化底物的进一步热化学转化为生物质能

以玉米秸秆(10～20目)为原料，按照实施例5的方法进行连续处理，取已发酵的基质进行能谱分析，生物质C/O显著下降至1.26，有助于节能减排进一步进行热化学反应获取生物质能。

实施例11 结合碱处理获得可转化底物(一)

以玉米秸秆(5～10目)为原料，按照实施例6的方法进行连续处理，取已发酵基质与NaOH溶液(W/V)为1:10，NaOH溶液浓度为1％，75℃下处理4h，其可发酵糖转化率达到80％。较单独碱处理碱用量降低10％(W/V)，纤维素酶用量降低20％。(W/W)

实施例12 结合温和碱处理获得可转化底物(二)

以玉米秸秆(20～40目)为原料，按照实施例2的方法进行连续处理，取经Irpex sp菌株发酵基质，采用发酵基质：碱液(W/V)为1:20，碱液为NaOH/H₂O₂，浓度为0.176％，常温下处理24h，其可发酵糖转化率达到80％。较单独碱处理碱用量降低20％，纤维素酶用量降低30％。

实施例13 结合碱处理获得可转化底物(三)

以玉米秸秆(5～10目为原料，按照实施例6的方法进行连续处理，取已发酵基质，采用发酵后的基质：碱液(W/V)为1:10，碱液为石灰水，添加量为0.5g/g干基质(W/W)，常温下处理2周，其可发酵糖转化率达到90％。较单独碱处理碱用量降低20％，纤维素酶用量降低20％。

实施例14 结合酸处理获得可转化底物

以甘草渣为原料，按照实施例4的方法进行连续处理，取已发酵基质，采用发酵基质：酸液(W/V)为1:10，酸液为硫酸，浓度为2％，100℃处理2h，其可发酵糖转化率达到80％。较单独碱处理碱用量降低15％，纤维素酶用量降低20％。

实施例15 结合蒸汽爆破处理获得可转化底物

以玉米秸秆(5～10目)为原料，按照实施例6的方法进行连续处理，取已发酵基质，采用发酵基质：溶液(W/V)为1:5，溶液为硫酸，浓度为1％，1.5Mpa，160℃处理5min，其平均可发酵糖转化率达85％。

实施例16 结合纤维素酶法处理获得可转化底物

以红薯藤渣为原料，按照实施例4的方法进行连续处理，取已发酵的基质，采用发酵基质：水溶液(W/V)为1:20，生物质白腐菌降解液30％，复合纤维素酶用量为8IU/g秸秆，48℃酶解48h，其平均可发酵糖转化率达到60％以上。

实施例17 结合温和碱处理及纤维素酶法处理获得可转化底物

以玉米秸秆(20～40目)为原料，按照实施例2的方法进行连续处理之后，取经Trichaptum sp菌株发酵的基质先进行温和碱处理，处理条件为：固液比(W/V)为1:25，NaOH浓度为0.1％，H₂O₂浓度为1％，室温处理20h；再进行生物质白腐菌降解液30％复合纤维素酶解，酶解条件为：固液比为1:20，纤维素酶用量为5IU/g秸秆，48℃酶解48h，其可发酵糖转化率达到75％以上较单独碱处理碱用量降低20％，纤维素酶用量降低30％。

Claims (10)

1、一种木质纤维素原料的预处理方法，其特征在于采用具有选择性破坏木质纤维素结构的担子菌株或菌群在开放条件下对各种木质纤维素原料进行固体发酵连续处理。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述担子菌选自Echinodontium sp.、Irpex sp、Trichaptum sp.、Armillariella sp.、Stereumsp.、Hygrophorus sp.、Trametes sp.、Ganoderma sp.、Polyporus sp、Pleurotus sp.、Hydanm sp.、Phellinus sp.、Auricularia sp.、Polyporellussp、Lentinus.sp.、Poria sp.、Dictyophora sp.、Fomitopsis sp.、Agaricussp.、Schizophyllum sp.、Grifolasp、Voluariella sp.中的一种或多种。

3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述预处理的方法是将木质纤维素原料与适量水混合为发酵基质，将担子菌株或者菌群的菌种按照5％～30％的比例接种到发酵基质中，搅拌均匀，温度控制20℃～37℃，湿度控制75％～95％，发酵时间10d～30d。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵结束后，取出70％～95％(W/W)发酵后的基质用于获取可转化底物，取出5％～30％(W/W)发酵后的基质补加到新鲜原料至原始体积，搅拌均匀循环发酵。

5、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述固体发酵连续处理的方法是将木质纤维素原料与水W/V为1：2.5混合制成发酵基质，将担子菌株或者菌群的菌种按照15％～20％(W/W)的比例接种到未灭菌发酵基质中，搅拌均匀，温度控制25℃～30℃，湿度控制80％～90％，发酵时间10d～20d；处理完毕，80％～90％(W/W)已发酵基质用于获取可转化底物，取出15％～20％(W/W)过程中发酵基质补加到新鲜原料至原始体积搅拌均匀循环发酵。

6、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料选自：农作物秸秆类，包括稻草、玉米秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆、棉花秸秆、木薯秸秆、黄豆秸秆、葵花秸秆、芝麻秸秆、花生秸秆及油菜秸秆；林木屑及竹碎屑；藤蔓类，包括薯藤、葛藤、南瓜藤、冬瓜藤、黄瓜藤；果壳类，包括玉米苞衣、麸皮、花生壳、板栗壳及谷壳；植物中草药及农副产品加工后残渣类，包括中药渣、风眼莲渣、甘蔗渣、红薯渣、土豆渣、木薯渣、莲藕渣、花生渣及果疏渣；杂草类。

7、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括在发酵前对木质纤维素原料进行片段或者粒度处理。

8、如权利要求7所述的方法，其特征在于所述片段或者粒度处理是将木质纤维素原料剪切为1cm～5cm的小段或者粉碎至5～40目。

9、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵结束后，发酵后的基质直接或经过简单的提取工艺获得可转化底物，或者再结合酸、碱、蒸汽爆破以及生物质白腐菌降解液复合纤维素酶解技术获得可转化底物。

10、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，可转化底物分别用于：生物炼制底物；生物燃油、燃气、生物材料及轻化工产品转化底物；食品及药物生物活性物质转化底物；生物饲料及生物肥料转化底物，

其物质类型包括：木质纤维素降解与改性产物，包括木质纤维素残渣、粗纤维，戊糖、已糖、醛、酮、酚、有机酸、呋喃、糠醛和LCC；木质纤维素转化产物，包括担子菌体、担子菌多糖、多肽、担子菌糖蛋白及次生代谢产物。