CN109112172A - 一种微生物酶解糖化秸秆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种微生物酶解糖化秸秆的方法。本发明所述方法将里氏木霉和哈茨木霉分别接种至特定发酵培养基中发酵培养，接种6‑24h后加入苎麻秸秆继续发酵培养，发酵完成后分别获得里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液；同时对用于酶解糖化的秸秆进行预处理；然后将预处理后的用于酶解糖化的秸秆与柠檬酸‑柠檬酸钠的缓冲液混合均匀，在其中添加里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液酶解糖化。本发明以苎麻浸出液作为发酵培养基的基质，同时优化其中的组分和辅以苎麻秸秆加以发酵生产发酵酶解液，在后续的酶解糖化阶段采用里氏木霉和哈茨木霉的混合发酵酶解液进行酶解糖化，提高了酶解效率和还原糖的产量。

Description

一种微生物酶解糖化秸秆的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种微生物酶解糖化秸秆的方法。
背景技术
我国是一个农业大国，农作物秸秆年产生量随着粮食产量的增加逐年增加，秸秆本身密度低，灰分含量和木材相比偏高，在土壤中降解速度慢，因此大部分被直接就地燃烧处理，造成严重的空气污染，同时也是一种极大的资源浪费。
在木质纤维素利用研究中，以纤维素酶为主的酶解法被认为是木质纤维素转化为单糖比较有发展和应用前景的方法之一。由于天然木质纤维原料复杂的物理结构，以及碳水化合物与木质素之间的物理和化学联接，妨碍了酶高效作用于纤维素底物，导致原料酶解至可发酵单糖的转化率较低。因此将木质纤维素转化为可发酵单糖一般需经过2个典型步骤：(1)预处理，以增加酶的可及性或微生物对多糖成分的可消化性；(2)将纤维素和半纤维素酶水解为可发酵的还原糖，称为酶解糖化。
目前秸秆酶解糖化主要用商品化的纤维素酶，导致糖化成本较高，并且还原糖产量也不高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微生物酶解糖化秸秆的方法，使得所述方法能够提高酶解糖化的效率，提高还原糖的产量。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种微生物酶解糖化秸秆的方法，包括：
步骤1、将里氏木霉和哈茨木霉分别接种至发酵培养基中发酵培养，接种6-24h后加入苎麻秸秆继续发酵培养，发酵完成后分别获得里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液；
所述发酵培养基包括葡萄糖、(NH4)2SO4、尿素、蛋白胨、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、Tween和苎麻浸出液；所述苎麻浸出液由苎麻水煎提取获得；
对用于酶解糖化的秸秆进行预处理；
步骤2、将预处理后的用于酶解糖化的秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液混合均匀，在其中添加里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液酶解糖化。
针对现有商用纤维素酶酶解糖化的效率低和还原糖产量低的问题，本发明通过调整发酵培养基的组分，并选择特定的微生物发酵酶液组合酶解糖化，提高了酶解糖化的效率和还原糖产量。
其中，所述苎麻浸出液具体的水煎提取为按照苎麻和沸水60-100g：1L的比例水煎提取，然后离心取上清，获得苎麻浸出液；其中的苎麻和沸水比例可以等比例变换调整。所述苎麻秸秆使用量为10-60g；在本发明具体实施方式中，具体可选为30g。
作为优选，所述发酵培养基为：葡萄糖0.5-2g/L、(NH4)2SO4 1.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO41-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO40.04-0.16g/L、FeSO40.0025-0.01g/L、MnSO4 0.0008-0.0032g/L、ZnSO40.0007-0.0028g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween 1-4滴/L，余量苎麻浸出液。
在具体实施过程中，可任意选择如下发酵培养基：
(1)葡萄糖0.5g/L、(NH4)2SO4 1.1g/L、尿素1g/L、蛋白胨0.5g/L、KH2PO44g/L、CaCl20.15g/L、MgSO4 0.16g/L、FeSO4 0.0025g/L、MnSO4 0.0032g/L、ZnSO4 0.0007g/L、CoCl20.0074g/L、Tween 1滴/L，余量苎麻浸出液；
(2)葡萄糖1g/L、(NH4)2SO4 2.2g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1g/L、KH2PO42g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4 0.08g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.0016g/L、ZnSO40.0014g/L、CoCl20.0037g/L、Tween 2滴/L，余量苎麻浸出液；
(3)葡萄糖2g/L、(NH4)2SO4 4.4g/L、尿素0.25g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO41g/L、CaCl20.6g/L、MgSO4 0.04g/L、FeSO4 0.01g/L、MnSO4 0.0008g/L、ZnSO40.0028g/L、CoCl20.00185g/L、Tween 4滴/L，余量苎麻浸出液；
(4)葡萄糖1.5g/L、(NH4)2SO4 3g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1.5g/L、KH2PO43g/L、CaCl20.2g/L、MgSO4 0.1g/L、FeSO4 0.006g/L、MnSO4 0.0025g/L、ZnSO40.001g/L、CoCl2 0.0025g/L、Tween 3滴/L，余量苎麻浸出液。
作为优选，接种12h后加入苎麻秸秆继续发酵培养；所述发酵培养的温度为25-30℃；在具体实施过程中可以选择为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，也可在25-30℃范围内波动；所述继续发酵培养的天数优选为1-4天。
对于秸秆的预处理，可采用木质纤维素原料酶解糖化领域常规的预处理方法，在本发明中可采用如下方式预处理：
将秸秆粉碎，用碱和双氧水的混合溶液处理，过滤，用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后干燥至恒重，得到预处理后的秸秆。
更为具体的预处理方式为：
将秸秆粉碎，与碱和双氧水的混合溶液按质量体积比1g:18～22mL(优选为1g:20mL)混合，在40-60℃条件下处理20-30h(优选为50℃处理25h)，过滤，用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后干燥至恒重，得到预处理后秸秆；所述混合溶液中碱的质量浓度为2.5～4％(优选为3％)，优选强碱，如氢氧化钠，双氧水的体积浓度为0.5％。
作为优选，所述秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液按质量体积比计，比例为1g：(40-50)mL或1kg：(40-50)L，或者在所述比例下进行任何形式的转换，更具体地为，1g：45mL或1kg：45L。
作为优选，所述里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液的体积比为(1-3):(1-3)，在本发明具体实施方式中可选择1:3、1:1或3:1；所述里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液的总用量与预处理后秸秆的体积质量比为(15-30)mL：1g或(15-30)L：1kg，或者在所述比例下进行任何形式的转换，更为具体地为20mL：1g或20L：1kg。
在本发明中，用于酶解糖化的秸秆优选为麻类秸秆，例如苎麻秸秆、红麻秸秆、亚麻秸秆、大麻秸秆或它们任意混合物。
作为优选，所述酶解糖化为在45-55℃的条件下酶解糖化40-60h；可具体为在50℃的条件下酶解糖化50h。
为了抑制酶解后期滋生的细菌消耗生成的还原糖，本发明还可加入防腐剂，如NaN3，所述防腐剂的添加量为预处理后的用于酶解糖化的秸秆质量的0.01-0.02％。
本发明通过设立多种对照发酵培养基，接种里氏木霉和哈茨木霉进行发酵产酶对比试验，结果显示，无论通过CMC酶活检测，还是滤纸酶活检测和β-葡萄糖苷酶活检测，经过本发明发酵培养基培养过的里氏木霉和哈茨木霉，所生产的的纤维素酶酶活均显著高于各对照发酵培养基，这为后面的高效酶解糖化奠定了基础。同时，总量相同的混合发酵酶液比其他单一发酵酶液和市售纤维素酶在纤维素酶酶活上更高，这说明两种发酵液的组合带来了较为显著的优势。
此外，本发明还以不同发酵酶液和市售纤维素酶作对比，对最终酶解糖化的还原糖产量进行统计，在相同来源和质量的秸秆前提下，添加本发明里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液的处理，能够明显提高还原糖的产量。
由以上技术方案可知，本发明以苎麻浸出液作为发酵培养基的基质，同时优化其中的组分和辅以苎麻秸秆加以发酵生产发酵酶解液，在后续的酶解糖化阶段采用里氏木霉和哈茨木霉的混合发酵酶解液进行酶解糖化，提高了酶解效率和还原糖的产量。
具体实施方式
本发明公开了一种微生物酶解糖化秸秆的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在里氏木霉或哈茨木霉接种发酵培养基之前，一般会先接种至种子培养基活化，制成种子液接种，例如可以采用PDA培养基加葡萄糖作为种子培养基，如下：
配置PDA培养基(取去皮马铃薯200g，切成小块，加1000mL水煮沸20min。滤去马铃薯块，并将滤液补足至1000mL。添加葡萄糖20g，溶化后分装，115℃，灭菌30min)，接种里氏木霉或哈茨木霉斜面菌种(20-30mm2每块，接种2-3块，150-170r/min，25-30℃摇床上培养1-2天。
本发明还提供了一种种子培养基，即葡萄糖0.5-2g/L、玉米粉15-60g/L、(NH4)2SO41.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl20.15-0.6g/L、MgSO40.04-0.16g/L、FeSO40.0025-0.01g/L、MnSO40.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween1-4滴/L，余量水；然后接种里氏木霉或哈茨木霉斜面菌种(20-30mm2每块，接种2-3块，150-170r/min，25-30℃摇床上培养1-2天。
将所制备的种子液以10-20％的接种量接种至发酵培养基发酵产酶。所用里氏木霉和哈茨木霉菌种均可通过市售途径获得，比如购自于CICC。
在本发明各项对比试验中，各组除去应有的差别外，其余试验环境和材料保持一致。
以下就本发明所提供的一种微生物酶解糖化秸秆的方法做进一步说明。
实施例1：本发明所述方法中的发酵培养基
(1)葡萄糖0.5g/L、(NH4)2SO4 1.1g/L、尿素1g/L、蛋白胨0.5g/L、KH2PO44g/L、CaCl20.15g/L、MgSO4 0.16g/L、FeSO4 0.0025g/L、MnSO4 0.0032g/L、ZnSO4 0.0007g/L、CoCl20.0074g/L、Tween 1滴/L，余量苎麻浸出液；苎麻秸秆为10g；
(2)葡萄糖1g/L、(NH4)2SO4 2.2g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1g/L、KH2PO42g/L、CaCl20.3g/L、MgSO4 0.08g/L、FeSO4 0.005g/L、MnSO4 0.0016g/L、ZnSO40.0014g/L、CoCl20.0037g/L、Tween 2滴/L，余量苎麻浸出液；苎麻秸秆为30g；
(3)葡萄糖2g/L、(NH4)2SO4 4.4g/L、尿素0.25g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO41g/L、CaCl20.6g/L、MgSO4 0.04g/L、FeSO4 0.01g/L、MnSO4 0.0008g/L、ZnSO40.0028g/L、CoCl20.00185g/L、Tween 4滴/L，余量苎麻浸出液；苎麻秸秆为40g
(4)葡萄糖1.5g/L、(NH4)2SO4 3g/L、尿素0.5g/L、蛋白胨1.5g/L、KH2PO43g/L、CaCl20.2g/L、MgSO4 0.1g/L、FeSO4 0.006g/L、MnSO4 0.0025g/L、ZnSO40.001g/L、CoCl2 0.0025g/L、Tween 3滴/L，余量苎麻浸出液；苎麻秸秆为60g。
其中，苎麻浸出液的制备方法为将60-100g苎麻加入1L沸水中，提取2小时，反应结束后离心取上清，即为苎麻浸出液。
实施例2：发酵酶解液酶活对比试验
1、试验培养基
发酵培养基1(g/L)：葡萄糖1；苎麻秸秆30；(NH4)2SO4 2.2；尿素0.5；蛋白胨1；KH2PO4 2；CaCl2 0.3；MgSO4 0.08；FeSO4 0.005；MnSO4 0.001 6；ZnSO4 0.0014；CoCl20.0037；Tween-80 2滴/L，加水至1L；
发酵培养基2(g/L)：葡萄糖1；苎麻秸秆30g；(NH4)2SO4 2.2；尿素0.5；蛋白胨1；KH2PO4 2；CaCl2 0.3；MgSO4 0.08；FeSO4 0.005；MnSO4 0.001 6；ZnSO4 0.0014；CoCl20.0037；Tween-80 2滴/；加苎麻浸出液至1L；
发酵培养基3(g/L)：葡萄糖1；(NH4)2SO4 2.2；尿素0.5；蛋白胨1；KH2PO4 2；CaCl20.3；MgSO4 0.08；FeSO4 0.005；MnSO4 0.001 6；ZnSO4 0.0014；CoCl2 0.0037；Tween-80 2滴/L；加苎麻浸出液至1L；接种12h后加入30g苎麻秸秆；
发酵培养基4(g/L)：葡萄糖1；(NH4)2SO4 2.2；尿素0.5；蛋白胨1；KH2PO4 2；CaCl20.3；MgSO4 0.08；FeSO4 0.005；MnSO4 0.001 6；ZnSO4 0.0014；CoCl2 0.0037；Tween-80 2滴/L；加水至1L；接种12h后加入30g苎麻秸秆；
发酵培养基5(g/L)：葡萄糖1；(NH4)2SO4 2.2；尿素0.5；蛋白胨1；KH2PO4 2；CaCl20.3；MgSO4 0.08；FeSO4 0.005；MnSO4 0.001 6；ZnSO4 0.0014；CoCl2 0.0037；Tween-80 2滴/L；加苎麻浸出液至1L；接种12h后加入30g玉米秸秆。
发酵培养基6(g/L)：葡萄糖1；微晶纤维素30；(NH4)2SO4 2.2；尿素0.5；蛋白胨1；KH2PO4 2；CaCl2 0.3；MgSO4 0.08；FeSO4 0.005；MnSO4 0.001 6；ZnSO4 0.0014；CoCl20.0037；Tween-80 2滴/L；加水至1L；
发酵培养基7(g/L)：葡萄糖1；麦麸30；(NH4)2SO42.2；尿素0.5；蛋白胨1；KH2PO42；CaCl20.3；MgSO40.08；FeSO40.005；MnSO40.0016；ZnSO40.0014；CoCl20.0037；Tween-802滴/L；加水至1L。
2、发酵方法
黑暗环境下，发酵温度介于25-30℃，各组发酵温度一致，发酵时间均为4天，涉及苎麻浸出液的制备方法一致；
3、酶活检测方法
(1)CMC纤维素酶活测定(主要代表内切β-1.4-葡聚糖的活力)
将CMC至于pH5.0柠檬酸柠檬酸钠缓冲液中，配制成0.5％(w/v)反应底物溶液。取0.5mL粗酶液加入1.5mL底物混匀后于50℃反应1h。反应结束后添加3mL DNS溶液混匀后沸水浴15min，显色反应结束后测其吸光值。
CMC酶活定义为每1min从底物中释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
(2)滤纸酶活(FPA)测定方法(滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力，是衡量菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现)
取适当稀释的上清液0.5mL,以50mg新华滤纸条为底物,加pH4.8的醋酸缓冲液,以不加底物为对照,55℃反应60分钟,取出加2mLDNS溶液,沸水浴中保持5分钟,流水冷却,定容至15mL,混匀,在545nm处比色测OD值。酶活定义为每1min从底物中释放出1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位。
(3)β-葡萄糖苷酶活性(β-G)测定方法
取适当稀释的上清液0.5mL,加入浓度1％的水杨素溶液,再加pH[4.8的醋酸缓冲溶液,55℃反应30min,后面步骤同滤纸酶活测定。
4、试验结果
(1)里氏木霉
表1
(2)哈茨木霉
表2
(3)里氏木霉和哈茨木霉的混合发酵酶解液
按照发酵培养基3分别接种里氏木霉和哈茨木霉制备发酵酶解液，对比市售纤维素酶产品(sigma，按要求稀释30倍使用)、单一菌种发酵酶解液和混合发酵酶解液的纤维素酶酶活，结果见表3；
表3
由表1-3可以看出，无论通过CMC酶活检测，还是滤纸酶活检测和β-葡萄糖苷酶活检测，经过本发明发酵培养基培养过的里氏木霉和哈茨木霉，所生产的的纤维素酶酶活均显著高于各对照发酵培养基；
同时，总量相同的混合发酵酶液比其他单一发酵酶液和市售纤维素酶在整体酶活上更高，这说明两种发酵液的组合带来了较为显著的优势。
实施例3：酶解糖化对比试验
1、麻类秸秆的预处理
将麻类秸秆粉碎(苎麻、大麻和红麻)，与氢氧化钠和双氧水的混合溶液按质量体积比1g:20mL混合，在50℃条件下处理25h，过滤，用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后干燥至恒重，得到预处理后麻类秸秆；所述混合溶液中氢氧化钠的质量浓度为3％，双氧水的体积浓度为0.5％。
2、酶解糖化
将预处理后的麻类秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液按质量体积比1g：45mL混合均匀，在其中添加实施例2表3中的各发酵酶解液和0.015％NaN3，各组发酵酶液的总用量与预处理后秸秆的体积质量比为20mL：1g，每组麻类秸秆均为0.16g；
在50℃的条件下酶解50h，完成麻类秸秆的酶解糖化；反应后过滤，测定滤液中还原糖含量。还原糖含量测定方法采用3,5－二硝基水杨酸比色法。结果见表4。
表4
还原糖含量(mg/g麻类秸秆)
市售纤维素酶(sigma，稀释30倍取8毫升) 189
里氏木霉发酵液共8毫升 174
哈茨木霉发酵液共8毫升 187
里氏木霉和哈茨木霉发酵液1:1比例混合共8毫升 209
里氏木霉和哈茨木霉发酵液3:1比例混合共8毫升 264
里氏木霉和哈茨木霉发酵液1:3比例混合共8毫升 296
由表4可以看出，本发明所述方法能够提高酶解糖化的效率，提高还原糖的含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微生物酶解糖化秸秆的方法，其特征在于，包括：
步骤1、将里氏木霉和哈茨木霉分别接种至发酵培养基中发酵培养，接种6-24h后加入苎麻秸秆继续发酵培养，发酵完成后分别获得里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液；
所述发酵培养基包括葡萄糖、(NH4)2SO4、尿素、蛋白胨、KH2PO4、CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、Tween和苎麻浸出液；所述苎麻浸出液由苎麻水煎提取获得；
对用于酶解糖化的秸秆进行预处理；
步骤2、将预处理后的用于酶解糖化的秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液混合均匀，在其中添加里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液酶解糖化。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖0.5-2g/L、(NH4)2SO4 1.1-4.4g/L、尿素0.25-1g/L、蛋白胨0.5-2g/L、KH2PO4 1-4g/L、CaCl2 0.15-0.6g/L、MgSO4 0.04-0.16g/L、FeSO4 0.0025-0.01g/L、MnSO4 0.0008-0.0032g/L、ZnSO4 0.0007-0.0028g/L、CoCl2 0.00185-0.0074g/L、Tween 1-4滴/L，余量苎麻浸出液。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为25-30℃。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述继续发酵培养的天数为1-4天。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述对秸秆进行预处理为：
将秸秆粉碎，用碱和双氧水的混合溶液处理，过滤，用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后干燥至恒重，得到预处理后的秸秆。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述秸秆与柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液按质量体积比计，比例为1g：(40-50)mL或1kg：(40-50)L。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液的总用量与预处理后秸秆的体积质量比为(15-30)mL：1g或(15-30)L：1kg。
8.根据权利要求1、5、6或7所述方法，其特征在于，所述用于酶解糖化的秸秆为麻类秸秆。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述里氏木霉发酵酶液和哈茨木霉发酵酶液的体积比为(1-3):(1-3)。
10.根据权利要求所述1所述方法，其特征在于，所述酶解糖化为在45-55℃的条件下酶解糖化40-60h。
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